You are on page 1of 29

Comparación Técnico Económico de Tres Métodos de Extracción

de ADN para Determinar el Huanglongbing de los Cítricos

8vo CONGRESO SODIAF
Andrea Féliz; Xiomara Cayetano; Deisy Hernández; Luis A. Matos

Punta Cana, Higüey, Rep. Dominicana
Octubre 2018
INTRODUCCION

El Huanglongbing (HLB) es la enfermedad mas importante de los
cítricos en la República Dominicana, distribuido a nivel nacional.

Ha ocasionado reducción considerable en los rendimientos, pérdida
o muerte económica de plantaciones.
Pero otras áreas de siembra se han implementado en el país

El HLB está asociado a la bacteria Candidatus Liberibacter
asiaticus y es transmitida por Diaphorina citri y por injertos.
INTRODUCCION.

 Los cítricos son cultivados en grandes superficies, lo que requiere
análisis de muchas muestras, lo que requiere la inversión de muchos
recursos en análisis para detección de la enfermedad Huanglongbing
(HLB).

Es importante contrastar la eficiencia y el costo de los métodos de
extracción de Ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ya que estos
constituyen un paso fundamental en el diagnostico por la técnica
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que es la técnica mas
confiable para la detección de la enfermedad del HLB.
INTRODUCCION

El único método aprobado para el diagnostico del HLB es mediante
la técnica molecular reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Requiere de protocolos de extracción del ADN eficientes, ya que la
bacteria se distribuye de forma irregular en la planta.
Existen diferentes protocolos de extracción de ADN, los cuales
varían en sus componentes, en el cuidado que se debe tener en su
manejo y en los costos.
INTRODUCCION

La finalidad de este trabajo es proporcionar un servicio de
diagnóstico de alta calidad, confiable y ya menor costo
para poner a disposición en los programas de certificación
de materiales sanos para la siembra, disminuir el riesgo de
diseminación de la enfermedad.
objetivos

Determinar la presencia del Candidatus Liberibacter
asiaticus, que causa el Huanglongbing de los cítricos con
los protocolos de extracción de ADN, Kit QIAGEN, Acetato
de Potasio y CTAB.

 Determinar el análisis económico de los protocolos
Materiales y métodos
Ubicación:
Centro de tecnologías Agrícolas (CENTA) – IDIAF
Laboratorio de Virología.
Pantoja, Provincia Santo Domingo.

Colecta de muestras: Plantación de naranjas, Villa
Altagracia, se eligieron 10 plantas que mostraban
sintomas asociado al HLB,
Materiales y métodos….

Muestras colectadas:

Se tomaron 10 muestras de hojas, de 10
plantas de naranjas, con síntomas
asociados al HLB los cítricos, Se
tomaron 15 hojas por planta.

Las muestras se etiquetaron, se
refrigeraron nevera portátil y se
transportaron al laboratorio.
Materiales y métodos…..

Preparación de las muestras:

De cada muestra se pesaron 0.38 gramos
dela nervadura central de las hojas,
cortada en porciones pequeñas.
Materiales y métodos…..
Los tejidos fueron mezclados y divido en:

 0.10g / muestra para la extracción con el
kit comercial Qiagen.

0.10g / Para la extracción con CTAB

0.18g/ Para la extracción con Acetato de
Potasio
Materiales y Métodos…..

Protocolos utilizados extracción de ADN:

Kit de extracción de Planta Qiagen

Acetato de Potasio

 Bromuro de hexadeciltrimetilamonio CTAB)
Materiales y Métodos…..
Componentes de cada protocolo de extracción
Método CTAB Método Acetato de Potasio Kit Comercial QIAGEN
NaCL 0.7 M Tris-base Buffer AP1
CTAB 1% EDTA RNase A
Tris- HCL (pH 8)50mM NaCl Buffer AP2
EDTA 10 Mm Sodium Dodecyl Sulfate Buffer AP3/E
Mercaptethanol 0.2 % Acetato de Potasio Buffer AW
Cloroformo Ácido Acético Buffer AE
Alcohol Isoamilico Agua ultra pura
Isopropanol Alcohol Iso propílico
Etanol Etanol al 70%
Agua ultra pura
Agua ultrapura
Materiales y Métodos…..

La extracción de ADN:

Se realizó de acuerdo a los pasos descrito
en cada protocolo

Kit de extracción de Planta Qiagen

Acetato de Potasio

 Bromuro de hexadeciltrimetilamonio
CTAB)
Materiales y Métodos…….

La Pureza y calidad del ADN en la relación de absorbancia 260/280 nm
se determino utilizando un NanoDrop.
Materiales y Métodos……
• Para determinar la presencia del HLB
• Análisis por Reacción en cadena de la polimersa (PCR).
Mezcla para PCR Programa HLB
• Green Taq Mix 12.5µl
Desnaturalización: 1 minuto
• Fwd primer (10µl) 2µl a 94 ºC
• Rev primer (10µl) 2µl 30 ciclos de: 30 segundos a
94 ºC
• dH2O 10µl 45 segundos 55 ºC, 1 minuto
a 72 ºC
• Total 26.5 10 minutos a 72 ºC
Cont. Materiales y Métodos

Análisis por Reacción en cadena de la polimerasa
(PCR).
.
Análisis de electroforesis:
Geles de agarosa al 1 % en un bufferTBE al 1%.
45 minutos

Visualización: Translumindor

Transluminador

Fotodocumentación
Materiales y Métodos…….
.
Para determinar el costo RD$ de los diferentes métodos de
extracción de ADN, se tomaron los precios actualizado de cada
componente químico y los materiales de cada protocolo.

Luego sumamos la cantidad de reactivo y material utilizado en la
extracción de ADN de una muestra.
RESULTADOS
Resultados de la amplificación usando el ADN extraído con
Acetato de Potasio
Resultados de la amplificación usando el ADN extraído con el Kit
Qiagen
Resultados de la amplificación usando el ADN extraído con el
CTAB
Resultados
Pureza y calidad del ADN en la relación de absorbancia
260/280
Muestra N0. Kit comercial QIAGEN CTAB Acetato de Potasio
1 1.6 1.5 1.6
2 1.8 1.7 1.8
3 1.8 1.6 1.8
4 1.6 2.1 1.7
5 1.7 1.8 1.8
6 1.8 1.8 2.3
7 1.8 1.8 1.8
8 1.8 1.8 1.8
9 1.8 1.4 1.7
10 1.8 2.3 1.5
Costo extracción de ADN con Kit comercial QIAGEN

Reactivos y materiales Cantidad / muestra Precio RD$
Todos los buffers 2785 μl 786.00
Bolita de cerámica 1 25.00
Tubo de 1 20.30
Microcentrifuga
Tubo Eppendorf 1 2.13
Punta de Micropipetas 7 22.19
Guantes 5 pares 25.00
Total RD$ 880.62
Costo extracción de ADN con el protocolo CTAB

Reactivos y materiales Cantidad / muestra Precio RD$
Todos los buffers 3700 μl 24
Bolita de cerámica 1 unidad 25
Tubo de Microcentrifuga 1 unidad 20.3
Tubo Eppendorf 2 4.26
Punta de Micropipetas 7 22.19
Guantes 5 pares 25
Total RD$ 120.75
Costo extracción de ADN con el protocolo Acetato de Potasio

Reactivos y materiales Cantidad / muestra Precio RD$
Todos los buffers 2700 μl 10.44
Bolita de cerámica 1 25
Tubo de Microcentrifuga 1 20.03
Tubo Eppendorf 2 4.26
Punta de Micropipeta 7 22.19
Guantes 5 pares 25
Total RD$ 106.92
Costo de extraccion de ADN/ Método
Método o Protocolo Costo RD$
Acetato de Potasio 106.92
CTAB 120.75
Kit Comercial QIAGEN 880.62
Conclusión

Los resultados indican que aunque hay mejor
calidad del ADN con el Kit comercial Qiagen según
las lecturas del NanoDrop, los productos de PCR son
similares.
En términos de bioseguridad el método de Acatado
de Potasio representa el menos peligro para los
analistas.
La diferencia en los costos entre los tres métodos,
no representan necesariamente una limitante para
ser usados y todo depende del propósito de la
extracción y los pasos subsiguientes .
AGRADECIMIENTOS

CONSEJO DE INVESTIGACIONES AGROPECUARIAS
Y FORESTALES, CONIAF.

COMITÉ TECNICO DEL CENTA

LOS INVESTIGADORES
• Gracias por su atención