INTRODUCCION

 Desde la última mitad del siglo xx se ha producido

un espectacular progreso en el conocimiento sobre
el material genético humano: se han caracterizado
los cromosomas, se ha identificado la secuencia
completa del genoma y se ha relacionado un gran
número de alteraciones de la estructura y
secuencia del ADN con todo tipo de
enfermedades, tanto hereditarias como no
hereditarias (especialmente asociadas a cáncer).
 Estudios Cromosómicos
 Cariotipo :
Conjunto de cromosomas de una
célula agrupados por pares homólogos
y dispuestos según un orden
preestablecido.

• Estudios cromosómicos de bandeo

extendido :
Los estudios de bandeo extendido o de "alta
resolución" comprenden el estudio de los
cromosomas con una resolución más alta que la
del análisis cromosómico estándar mencionado
anteriormente Los cromosomas están dispuestos
de manera tal que se alargan un poco, por lo
que se pueden ver más bandas. Esto permite
observar partes más reducidas del cromosoma
e identificar, de este modo, anomalías
cromosómicas estructurales más pequeñas que
no pueden ser vistas en un análisis de rutina.
  Hibridación fluorescente in situ
(su sigla en inglés es FISH).
La hibridación fluorescente in situ es
una técnica de laboratorio que
determina cuántas copias de un
segmento específico de ADN
existen en una célula. También se
utiliza para identificar cromosomas
con estructuras anómalas.

• Análisis de microarreglo cromosómico

(CMA, por sus siglas en inglés

El CMA es un nuevo análisis que se utiliza

para detectar desequilibrios cromosómicos
a una resolución mayor que las técnicas
cromosómicas estándar actuales o las
técnicas FISH.
TECNICAS DE ESTUDIO
CROMOSOMICO
Citogenética
Convencional
Concepto:
 Parte
de la genética que estudia apariencia
microscópica de cromosomas.

 También anomalías en las enfermedades.

 Nosayuda a comprender mecanismos implicados

en su patogenia
 CITOGENÉTICA MOLECULAR
CONCEPTO: QUE PODRÍA DEFINIRSE COMO
LA FUSIÓN ENTRE LA CITOGENÉTICA
CLÁSICA Y LA BIOLOGÍA MOLECULAR
FINALIDAD: PERMITE LA DETECCIÓN DE
A LT E R AC I O N E S C RO M O S Ó M I C A S
NUMÉRICAS Y/O ESTRUCTURALES
SUBMICROSCÓPICAS, RESPONSABLES DE
D IFE R E N T E S PATO LO G ÍA S D E O R IG E N
GENÉTICO IMPOSIBLES DE DIAGNOSTICAR
CON LAS TÉCNICAS DE CITOGENÉTICA
CONVENCIONAL.
 fish
técnicas
N. fish
cgh
 PRIONEROSY DESARROLLASORE

Pardue y Gall descubrió el

bandeo por denaturalización
1969

Caspersondescubrió técnicas de
fluorescenciacomo la quinacrina
(1970) mas conocidos como
bandeos
La verdadera revolución en el campo de la
citogenética se dio en los últimos 15 años con
el desarrollo de microscopios y tecnicas
relacionados con estos asi mismo desarrollo
de métodos rápidos y precisos para la
marcación y detección de sondas, así como la
utilización de software especializado para el
tratamiento de imágenes, darían un gran
empuje a las técnicas modernas basadas en
la llamada hibridación in situ fluorescente o
FISH
 CITOGENÉTICA MOLECULAR

HIBRIDACIÓN IN SITU (CISH, FISH)

Utilidad:
*Detectar y localizar secuencias específicas de ADN o ARN

Uso:
*Preparaciones cromosómicas
*Extensiones celulares
*Cortes de tejido
*Cortes ultrafinos (Microscopia electronica)
 Sondas centroméricas están formadas por una
secuencia repetitiva de ADN que hibrida con el
ADN de la región centromérica del cromosoma.
Éstas permiten detectar alteraciones cromosómicas
numéricas (monosomías o trisomías)

 Sondas de pintado cromosómico están formadas

por una batería de sondas que en su conjunto
hibridan con todo el cromosoma. Dichas sondas
permiten visualizar alteraciones citogenéticas
numéricas y estructurales.

 Lassondas de secuencia única o locus especifico

hibridan con el ADN de una región genómica
concreta, correspondiente a un gen o a una banda
cromosómica. Con ellas es posible detectar
alteraciones numéricas y estructurales
 Las técnicas M-FISH o SKY se basan en la cohibridación de 24
sondas de pintado cromosómico marcadas con fluorescencia
sobre metafases.

 El resultado de la hibridación permite visualizar

simultáneamente cada par cromosómico de un color
diferente.

 Determina de forma inequívoca cariotipos complejos y

cromosomas no identificables con las técnicas de bandeo.

 Limitación en aquellas patologías con un índice proliferativo

bajo debido a la necesidad de obtener células en división.

 No permiten el reconocimiento de algunos puntos de rotura

como aquellos asociados con deleciones, inserciones,
adiciones y translocaciones de pequeño tamaño (inferiores a
10 Mb
Tecnica:
Marcar el ADN de cada cromosoma con uno o varios fluorocromos, de
manera que el espectro de emisión de cada cromosoma sea único y
diferenciable de los demás.

Esta técnica, por tanto, pinta a cada cromosoma de un color.

Con el "cocktail" de 24 sondas de pintado cromosómico obtenido tras el
marcaje, se hibrida sobre los cromosomas de las metafases del tumor,
el cromosoma anómalo aparecerá no uniforme, sino con los colores de los
cromosomas que intervienen en la translocación.

Por tanto, es una forma de realizar un cariotipo, pero teñido no con bandas
G sino con colores, de forma que podamos clasificar las alteraciones de
forma unívoca.

El cariotipo multicolor se ha mostrado muy útil en neoplasias hematológicas,

donde no es difícil obtener metafases tumorales.
 En los últimos años se ha descrito la técnica
de multibanding-FISH o “cross species color
banding (RxFISH), técnica similar a las de M-
FISH o SKY, que permite la generación de un
patrón de bandas de distintos colores para
cada par de cromosomas homologos. Su
principal ventaja es que permite detectar
inversiones y traslocaciones entre
cromosomas homólogos, sin embargo, su
principal limitación es que un mismo color
puede estar en regiones de distintos
cromosomas y esto dificulta poder conocer
la región cromosómica que está implicada.
 HIBIDACION GEENOMICA
COMPARATIVA (CGH)
La hibridación genómica
comparada o CGH (de sus
siglas en inglés Comparative
Genomic Hybridization) es
una técnica citogenética
mediante la cual es posible
identificar y analizar
alteraciones genéticas del
tipo de ganancia o pérdida de
material genético en una
muestra de DNA en
comparación con una
muestra de referencia.
 METODO
Se basa en la hibridación con fluorescencia de doble color marcando ADN con
fluorocromos distintos. Normalmente se marca con rojo al ADN de referencia o
control y con verde al ADN que se esta estudiando.

Luego de la marcación, se
realiza una hibridación
competitiva entre los ADN
de control y estudio sobre
metafases normales en
presencia de ADN Cot 1
humano cuya función es
suprimir las secuencias
repetitivas de ADN.

Se realiza un análisis
mediante un microscopio
de fluorescencia
cuantificando las
proporciones de colores
verde y rojo en los
cromosomas.
VENTAJAS:
- Requiere poco ADN
- Permite análisis de neoplasias con un bajo índice de
proliferación
- Posee una tasa de detección muy alta llegando a detectar
pequeñas deleciones y duplicaciones en el ADN

DESVENTAJAS
- No detecta translocaciones reciprocas ni Robertsonianas
- No detecta inversiones
- No detecta mutaciones puntuales
- El mosaicismo afecta la detección de cambios
 La finalidad de esta técnica es la comparación de DNA genómico de
dos muestras en condiciones distintas (normalmente una es el
control y otra el test), sin necesidad de pasar por un cultivo celular
previo al análisis.

 El CGH permite, por ejemplo, la exploración de los 46 cromosomas

humanos en un solo ensayo experimental, para el estudio de
posibles duplicaciones o deleciones, incluso a escala microscópica,
lo que además permite la identificación de genes o regiones
cromosómicas responsables de un fenotipo determinado.

 En consecuencia, el CGH tiene un amplio uso en estudios genéticos

preimplantacionales y prenatales así como estudios del cáncer o en
biotecnología animal para el estudio de variaciones en el número de
copias (CNV).
CONCLUSIONES
 Gracias al avance vertiginoso de la citogenética molecular de alta resolución, hoy se
dispone de un gran arsenal de herramientas destinadas al estudio estructural y
funcional de los genomas. El constante adelanto en la tecnología de los equipos de
microscopía, así como el desarrollo de métodos de marcación y detección cada vez
más sensibles, hacen presagiar un futuro promisorio para las técnicas de hibridación in
situ sobre ADN en los campos de la genómica y la post-genómica.

 Dentro de las nuevas técnicas que se están aplicando para la detección de

secuencias en plantas, aquella conocida como PRINS (por primed in situ labeling)
ofrece una elevada sensibilidad de detección respecto de la FISH convencional
(Kubaláková et al., 2001). Esta técnica se basa en la hibridación de sondas no
marcadas sobre el ADN cromosómico, seguida de una amplificación enzimática vía
PCR, en presencia de nucleótidos marcados con fluorescencia. De otro lado, la
disponibilidad actual de una amplia gama de fluorocromos, permite la coloración
simultánea de diferentes cromosomas en un solo experimento de hibridación. Si bien
esta técnica, llamada mcGISH (por multicolor GISH), ha sido ampliamente utilizada en
el análisis del genoma humano y otras especies de mamíferos (Langer et al., 2004), su
aplicación en plantas es aún limitada (Lysak et al., 2003). A estas nuevas metodologías
se suma la posibilidad técnica de poder aislar cromosomas enteros o partes de un
cromosoma con el fin de obtener librerías específicas de utilidad para el aislamiento de
secuencias y genes de interés presentes sobre un cromosoma particular.