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Cromatografía Líquida

de alta eficiencia (HPLC)


Darlyn Natalia Gaitan
Michelle Viviana Leon
Contenido

✓ Objetivos
✓ Metodología
✓ Resultados
✓ Muestra de cálculos
✓ Análisis de resultados
✓ Conclusiones
✓ Bibliografía
Objetivos

Generales
● Conocer el manejo de un cromatógrafo de HPLC
● Evaluar la influencia de los parámetros cromatográficos sobre la separación y la
cuantificación de una mezcla de acetaminofén-cafeína

Específicos
● Aplicar el método del estándar externo para cuantificar la mezcla acetaminofén y
cafeína mediante HPLC
● Evaluar la influencia de la separación de la mezcla acetaminofén-cafeína empleando
una elución isocrática
Metodología

Preparar 100 mL Preparar 5 soluciones


Preparar una Preparar solución de acuerdo a la
de una solución solución estándar
CURVA DE CALIBRACION estándar de cafeína composición mostrada
95:5 de metanol de acetaminofén
ESTANDAR EXTERNO 0,1 mg/mL en la tabla x
grado HPLC y acido 0.5 mg/mL
acético glacial

Inyectar en el
cromatógrafo

Pesar X mg Tomar 2
Pesar y y Filtrar por mL del
Llevar a
pulverizar dos disolverlos membran filtrado y
MUESTRA PROBLEMA balón de 25
tabletas de con la a de 0,45 llevar a 10
mL y aforar
dolex forte solución de µm mL con
solventes fase móvil
Metodología
Equipo empleado Agilent Infinity ®
Inyector Loop
Detector 275 nm y 245 nm
Columna 2,1 mm x 10 cm Fase estacionaria L7 de 3,5 µm
Temperatura 45 ± 1°C
Flujo 0,5 mL/min
Volumen de inyección de las soluciones 5 µL
Volumen Inyeccion Solucion Problema 5 µL
Agua, metanol, ácido acético glacial
Elución Isocrática
(79,2:19,8:1).
Tipo de cromatografía Fase reversa
Separación Reparto

Tabla # 1 Sistema cromatográfico empleado para llevar a cabo la cuantificación por


medio de HPLC
Metodología

Alícuota Concentración
estándar Volumen acetaminofén/
Solución
acetaminofén/ final (mL) cafeína
cafeína (mL) (mg/mL/mg/mL)
Tabla# 2. Composición
1 0,5/0,25 10 0,025/0,0025 soluciones para la
2 1,0/0,5 10 0,05/0,005 curva de calibración

3 2,0/1,0 10 0,1/0,01
4 3,0/1,5 10 0,15/0,015
5 4,0/2,0 10 0,2/0,02
Resultados

Figura # 1:
cromatograma
para el primer
punto de la
curva de
calibración
Resultados

Figura # 2:
cromatogram
a para el
segundo
punto de la
curva de
calibración
Resultados

Figura # 3:
cromatograma
para el tercer
punto de la curva
de calibración
Resultados

Figura # 4:
cromatograma
para el cuarto
punto de la
curva de
calibración
Resultados

Figura # 5:
cromatograma
para el quinto
punto de la
curva de
calibración
Resultados

Figura # 6:
cromatogram
a para la
muestra
problema de
Dolex Forte
Resultados

Masa de estándar Concentración de Concentración de Masa de dolex forte Concentración de Concentración


de acetaminofén solución madre solución madre (mg) solución madre solución final de
(mg) estándar de estándar de cafeína estándar de dolex dolex forte
acetaminofén (mg/mL) forte (mg/mL) (mg/mL)
(mg/mL)

25,4 0,5 0,1 12,4 0,5 0,01

Tabla # 3: datos para las soluciones


madres de HPLC
Resultados
Puntos en la curva Concentración Concentración Altura del pico Altura del pico área del pico área del pico
de calibración acetaminofén cafeína acetaminofén Cafeína acetaminofén cafeína

1 0,025 0,00254 387,51169 4,57934 1527,49182 20,39875

2 0,05 0,00508 621,83685 8,77422 2459,18335 38,97358

3 0,1 0,01016 1061,48706 17,96128 4212,53809 82,85500

4 0,15 0,01524 1555,93518 19,23639 6221,90771 89,31045

5 0,2 0,02032 1915,66101 21,89113 7699,44775 98,17019

MP 824,53857 17.40564 3285.15991 77.78870

Tabla # 5: Datos de alturas y concentraciones obtenidos para el


detector de 245nm
Resultados
Resultados
Resultados

Puntos en la curva Concentración Concentración Altura del pico Altura del pico área del pico área del pico
de calibración acetaminofén cafeína acetaminofén Cafeína acetaminofén cafeína

1 0,025 0,00254 90,72707 15,66899 358,27618 70,94846

2 0,05 0,00508 145,46506 30,11872 574,74310 136,22322

3 0,1 0,01016 248,45569 60,33674 984,06213 272,81683

4 0,15 0,01524 366,45956 64,42300 1458,32532 291,10529

5 0,2 0,02032 457,01981 74,87911 1826,87097 340,01111

MP -- -- 192,86531 59,55902 768,29541 271,13007

Tabla # 4: Datos de alturas y concentraciones obtenidos para el


detector de 275nm
Resultados
Resultados
Resultados
Resultados
Concentración obtenida mg
Altura mg/mL
mg obtenidos
esperados %

acetaminofe 275 0,0725 518,72 500 103,74


n
245 0,0729 521,39 500 104,28

cafeína
275 0,0139 99,24 65 152,68 Tabla # 6:
Resultados de la
245 0,0137 97,96 65 150,70 concentracion de
% en cafeina y
Concentración obtenida mg
mg obtenidos acetaminofen para
ABC mg/mL esperados muestra
la muestra
acetaminofe 275 0,0729 521,62 500 104,32 problema a 275 y
n 245 nm
245 0,0731 523.13 500 104,62

cafeína
275 0,0139 99,90 65 153,69
245 0,0134 95,57 65 147,04
Resultados
Punto en la curva Tiempo de Tiempo Altura del Ancho Tiempo Factor de Número Altura de platos Resolución
de calibración retención muerto pico de base de capacidad de platos teóricos
(min) (min) (mAU) (min) retención teóricos (mm)
corregido
(min)

1 0,855 0,645 387,51169 0,0600 0,210 0,3256 3249,00 0,0308 9,5312

2 0,856 0,645 621,83685 0,0621 0,213 0,3302 3040,07 0,0329 9,4072

3 0,854 0,646 1061,48706 0,0603 0,210 0,3251 3209,23 0,0312 9,3928

4 0,856 0,645 1555,93518 0,0607 0,213 0,3302 3181,93 0,0314 9,3201

5 0,855 0,645 1915,66101 0,0609 0,210 0,3256 3153,68 0,0317 9,4582

MP 0,855 0,645 824,53857 0,0605 0,210 0,3256 3195,52 0,0313 9,5023

Promedio 0,855 0,645 1053,66 0,0608 0,211 0,3271 3171,57 0,0316 9,4353

Desviación 0,0075 0,0004 579,27 0,00073 0,0015 0,0024 71,70 0,00072 0,0775
estándar

Tabla # 9: Parámetros cromatográficos obtenidos para el acetaminofén detectado


a 245 nm
Resultados
Punto en la Tiempo Tiempo Altura del Ancho Tiempo de Factor de Número de Altura de Resolució
curva de de muerto pico de base retención capacidad platos platos n
calibración retención (min) (mAU) (min) corregido (min) teóricos teóricos
(min) (mm)

1 1.465 0,645 4,57934 0,0680 0,820 1,271 7426,38 0,0135 9,5312

2 1,467 0,645 8,77422 0,0678 0,822 1,274 7490,67 0,0133 9,4072

3 1,465 0,646 17,96128 0,0698 0,819 1,268 7048,30 0,0142 9,3928

4 1,466 0,645 19,23639 0,0702 0,821 1,273 6977,72 0,0143 9,3201

5 1,466 0,645 21,89113 0,0683 0,821 1,273 7371,34 0,0136 9,4582

MP 1,466 0,645 17,40564 0,0681 0,821 1,273 7414,70 0,0135 9,5023

Promedio 1,465 0,645 14,9747 0,0687 0,821 1,272 7288,19 0,0137 9,4353

Desviación 0,00075 0,0004 6,7429 0,0010 0,00103 0,0022 217,69 0,00041 0,07756
estándar 2

Tabla # 10: Parámetros cromatográficos obtenidos para la cafeina detectado a


245 nm
Resultados
Punto en la curva de Tiempo de Altura del pico Ancho de Número de platos Altura de Resolución
calibración retención (mAU) base(min) teóricos platos
(min) teóricos (mm)

1 0,855 90,72707 0,0601 3238,19 0,0309 9,4647

2 0,856 145,46506 0,0621 3040,07 0,0329 9,3354

3 0,854 248,45569 0,0602 3219,90 0,0311 9,4729

4 0,856 366,45956 0,0604 3213,61 0,0311 9,4501

5 0,855 457,01981 0,0606 3184,98 0,0314 9,4290

MP 0,855 192,86531 0,0605 3195,52 0,0313 9,4290

Promedio 0,855 250,16542 0,0607 3182,05 0,0315 9,4302

Desviación 0,00075 138,55111 0,00073 72,01208 0,00073 0,04980


estándar

Tabla # 7: Parámetros cromatográficos obtenidos para el acetaminofén detectado


Resultados
Punto en la curva de Tiempo de Altura del pico Ancho de Número de platos Altura de Resolución
calibración retención (mAU) base(min) teóricos platos teóricos
(min) (mm)

1 1,465 15,66899 0,0688 7254,68 0,0138 9,4647

2 1,467 30,11872 0,0688 7274,50 0,0137 9,3354

3 1,465 60,33674 0,0688 7254,68 0,0138 9,4729

4 1,466 64,42300 0,0687 7285,75 0,0137 9,4501

5 1,466 74,87911 0,0690 7222,53 0,0138 9,4290

MP 1,466 59,55902 0,0691 7201,65 0,0139 9,4290

Promedio 1,466 50,83093 0,0689 7248,96 0,0138 9,4302

Desviación estándar 0,00075 22,78138 0,00015 31,64811 0,00008 0,04980

Tabla # 8: Parámetros cromatográficos obtenidos para el cafeína detectada a 275


nm
Análisis de resultados

Sistema de idoneidad :

Tanto para las dos longitudes de onda como para ambos analitos se obtuvo valores de factor de capacidad
dentro del rango establecido por la USP (1-15), por lo que puede inferirse que la retención de los
componentes en la fase estacionaria es la indicada, además gracias a que se encontró una resolución que
presenta valores mayores a 2 puede deducirse que la eficiencia de la columna es del 100%, obteniendo
como resultado una buena separación de los componentes de la muestra, lo que indica que se empleó una
temperatura adecuada, así mismo se observa que el número de platos visto como el número de equilibrios
teóricos del soluto en la FE y la FM, es mayor a 2000 siendo una buena cifra de acuerdo con el mínimo
ideal, lo que indica que no solo se tenía una fase estacionaria adecuada sino también, una buena
velocidad de flujo. Los valores obtenidos para el factor de capacidad k’ (todos mayores a 1) se encuentran
dentro del rango descrito por la USP, además, aun sin ser tan altos, el resto de parámetros no se ven
afectados, por lo que no se considera necesario aumentar este por medio de temperatura u otro método.
Análisis de resultados

Cafeína
Acetaminofen
Al ser cromatografía en fase reversa obtenemos un tiempo de retención mayor para la
molécula menos polar (cafeína), razón por la cual el primer pico es atribuido al
acetaminofén, quien interactúa menos con la fase estacionaria y es arrastrado más
fácilmente por la fase móvil (polar); además se realizó una evaluación a 275 y 245 nm,
para el acetaminofén obtenemos un valor adecuado a 245, por lo que presenta una
meseta en la cual puede darse linealidad de la Ley de Lambert Beer:

Figura # 15: espectro de absorción


del acetaminofén tomado de :
http://www.omicsonline.org/JABTimag
es/2155-9872-3-151-g002.gif
Mientras que la cafeína tiene una mejor absorción a longitudes de
onda entre 240 y 260, por lo que también se debía obtener un buen
cumplimiento de dicha ley a 245 nm:

Figura # 16: espectro de absorción


de la cafeína tomado de :
https://upload.wikimedia.org/wikipedi
a/commons/0/02/SpUV-cafeine.PNG
Análisis de resultados

Gracias a lo anteriormente mencionado se obtuvo que el acetaminofén


cumple los parámetros de la cantidad de principio activo en la
formulación de la farmacopea, pues todos los valores obtenidos se
encuentran dentro de un rango entre 90 y 100%; sin embargo se
tiene que la cafeína está por encima de dicho rango, esto debido a
que la curva de calibración empleada para la determinación de esta
no posee los parámetros de linealidad adecuados, dicho error,
pertinente a la preparación de los puntos que la componen puede ser
arreglado por medio de tratamiento estadístico y la aplicación de la
prueba t student, los errores atribuibles son de tipo experimental.
Conclusiones

● Respecto a los parámetros de idoneidad se considera que el sistema


cromatográfico utilizado para el análisis llevado a cabo es el adecuado.
● Los valores reportados de acetaminofén cumplen con lo definido por la USP al
estar en un rango de 90 - 110%, sin embargo la cafeína se sale de dichos
parámetros, por lo que no se recomendaría su uso, sin embargo es importante
realizar un nuevo análisis por los problemas presentados a lo largo de la
práctica.
● El sistema cromatográfico resulta vital a la hora de realizar una cuantificación
acertada, es necesario que se encuentre en buen estado y que se reduzcan al
mínimo los errores del equipo, tales como vacíos en la fase estacionaria o
daño de alguno de los componentes del sistema; esto con el fin de evitar
hombros o desdoblamientos en las señales del cromatograma.
Bibliografía

- [1] Skoog, Douglas A., and Donald M. West. Principles of instrumental


analysis. Vol. 158. Philadelphia: Saunders College, 1980.
- [2] USP 30- NF 25 The USP Pharmacopeial convention.
- [3]Crawford Scientific; “Incidencias y Mantenimiento en HPLC”; Grupo
Biomaster 2009.