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Centro de Estudos Superiores de Zé Doca

Métodos Biofísicos de análise


quantitativa de
substâncias biológicas

Profª Darleila Costa


Métodos de análise quantitativa de
substâncias biológicas

 As substâncias biológicas são multicomponentais;


Ex: plasma sanguíneo possui mais de mil substâncias entre água, íons (Na+, K+, Cl-,
HCO3-) e diversas moléculas (glicose, uréia, creatinina, colesterol, lipídios, hormônios, etc.)

 Estudar a composição qualitativa e quantitativa desses sistemas é


indispensável;

 Métodos biofísicos de estudo: permitem separar e identificar esses


componentes, além de permitir o estudo de suas propriedades de
estrutura e função.
Métodos de análise quantitativa de
substâncias biológicas

O uso da cor como um indicador de concentração por meio de


instrumentos chamados colorímetros vem sendo feito na química
analítica há um longo tempo e chama-se de colorimetria;

Procedimentos fotométricos: baseiam-se na medida direta da


intensidade da cor produzida por uma determinada concentração da
solução em estudo com a intensidade de uma solução conhecida.
Métodos de análise quantitativa de
substâncias biológicas

 Essa análise deve ser feita numa determinada região do espectro


luminoso e caracteriza-se pela medida da absorção ou da
transmissão da luz;

 A fotometria não se limita à porção visível do espectro luminoso,


sendo também, aplicável na absorção de energia radiante em
comprimentos de onda () desde o ultravioleta até o infravermelho;

 Os instrumentos utilizados em fotometria são os fotocolorímetros e


espectofotômetros.
Espectrofotometria
Espectrofotometria
• Por meio da espectrofotometria, componentes desconhecidos
de uma solução podem ser identificados por seus espectros de
cor.
• É o método de análises ópticas mais usado nas investigações
biológicas e físico-químicas;

• O espectrofotômetro é um instrumento que compara a radiação


absorvida ou transmitida por uma solução. Um feixe energia
atravessa a solução e a sua absorção oferece informações
sobre a qualidade e quantidade dos componentes do sistema.
PRINCÍPIO DE LAMBERT-BEER
Imagine a seguinte situação:

Uma mãe prepara o café da manhã do filho. Como está muito apressada,
coloca 2 colheres de achocolatado no leite, e não 5 como o filho gosta.
O garoto reclama:
- E aí, mãe, vai regular o Nescau?

Como o garoto sabe, mesmo antes de beber o leite, que a mãe colocou
menos achocolatado que as 5 colheres que sempre coloca?
PRINCÍPIO DE LAMBERT-BEER
Pense um pouco...
PRINCÍPIO DE LAMBERT-BEER
Imaginemos outra situação... Observe a figura abaixo:

Quanto mais concentrada uma solução, maior a


quantidade de soluto por unidade de volume dessa
solução.
PRINCÍPIO DE LAMBERT-BEER

Se a solução apresenta cor, podemos concluir que


quanto mais concentrada uma solução colorida, maior
a intensidade da cor dessa solução.

Princípio de Lambert-Beer diz que:

A cor de uma solução depende diretamente da


concentração de soluto nessa solução.
PRINCÍPIO DE LAMBERT-BEER

Vamos organizar os béqueres abaixo seguindo a ordem da solução menos


concentrada para a solução mais concentrada?

Observamos que foi mais difícil decidir quem é mais


concentrado entre os béqueres A, D e G. Concordam?
PRINCÍPIO DE LAMBERT-BEER

Se a concentração for muito elevada, o princípio


de Lambert-Beer perde a sua validade e fica difícil
identificar, com certeza, a intensidade da cor da
solução.

Então, como medir a intensidade da cor de forma


mais confiável?
Espectrofotometria
DEFINIÇÃO:

É uma método biofísico de análise através do qual é possível se determinar


a concentração de espécies químicas mediante a absorção de energia radiante
(luz), na faixa compreendida entre o ultravioleta e o infravermelho.

Ou, considerando o que foi mostrado:

É uma técnica através da qual, utilizando um espectrofotômetro,


podemos saber qual a absorbância de uma dada amostra e,
conseqüentemente, inferir sobre sua concentração.
Espectrofotometria
• Conceitos fundamentais:
A energia de radiação é medida em nm (nanômetros) - Letra grega
λ (lambda) = comprimento de onda;
 A faixa mais utilizada do espectro vai do ultravioleta (200nm) até o
infravermelho curto (1.000 nm);
 Faixa visível (percebida pelo olho humano): 400 a 750nm;
Cor: “sensação psicofísica” que associados a um comprimento de
onda predominante;
Branco (mistura de cores que se anulam): reflete as todas as cores;
Negro : absorve todas as cores
ESPECTRO DE LUZ
A luz, dependendo de seu comprimento de onda, pode ser invisível
ou visível aos nossos olhos.
ESPECTRO DE LUZ
λ Região do Espectro Cor
< 380nm Ultra – Violeta Invisível
380-440 Visível Violeta
440-500 Visível Azul
500-580 Visível Verde
580-600 Visível Amarelo
600-620 Visível Laranja
620-750 Visível Vermelho
750-2000 Infra - Vermelho Invisível
Espectrofotometria
Espectrofotometria Óptica
- Comprimento de onda corresponde a luz ultra-violeta ou visível;
-Faixa entre aproximadamente 180 a 800 nm.
Espectrofotometria
Conceitos fundamentais:
• Transmitância: é a fração da luz incidente em um comprimento de
onda específico, que passa por uma amostra de matéria. É a razão
entre a intensidade da luz transmitida e a intensidade da luz
incidente;

• Absorbância: É a capacidade do material em absorver radiações


em frequência específica. A absorbância de uma substância em
solução é diretamente proporcional a sua concentração e a
espessura que a luz atravessa.

• O melhor comprimento de onda para uma determinada solução é


aquele no qual há maior absorção e, portanto, menor transmissão
de luz; ou seja: maior absorbância e menor transmitância.
Espectrofotometria
• A transmitância relaciona-se com a concentração, porém, de
forma não linear. Para fins práticos, ela se mostra, portanto, de
difícil aplicabilidade . Por essa razão, utiliza-se a absorbância
Absorção de Radiação

• Os comprimentos de onda que uma certa substância


absorverão são característicos da sua estrutura, diferindo de
substância para substância.

• Ex:
– DNA e RNA = 260nm
–Proteínas = 280nm
–Células bacterianas= 600nm
Espectrofotometria

É um instrumento que serve para medir a intensidade da luz em


função de um comprimento de onda específico.
Consiste em uma fonte de luz que emite luz em um determinado
comprimento de onda ().
Funcionamento de um espectrofotômetro

–A fonte de luz tem seu feixe localizado pelo colimador (C) e é fracionada (decomposta) sobre um
prisma de quartzo ;

–Uma fenda seletora escolhe uma porção desse espectro como Luz Monocromática (Luz MC) que
passa através da cubeta que contém a solução onde parte será absorvida e parte será transmitida;

–A fotocélula acoplada ao galvanômetro mede a luz transmitida;

–A diferença é a luz absorvida ;

–A absorbância será proporcional à concentração da substância da cubeta.


Funcionamento de um espectrofotômetro de luz
visível e ultravioleta

https://www.youtube.com/watch?v=R4ZT3g2-Ryg

https://www.youtube.com/watch?v=EYRmnC7RdNQ&t=11s
Amostra absorve a luz amarela, deixando passar as outras cores. Então
aparece uma mistura dessas cores, a cor rosa.
Componentes do espectrofotômetro

(a) fonte de luz, (b) colimador, (c) prisma ou rede de difração, (d) fenda seletora (e) cubeta
contendo solução, (f) detector, (g) leitor.
Componentes do espectrofotômetro

Fonte de luz
A fonte de energia eletromagnética precisa fornecer radiação estável e com
intensidade razoavelmente constante por toda a faixa de λ na qual se pretende
usar. Devido a essas exigências, geralmente utiliza-se um lâmpada para a região
do visível e do IV e outra lâmpada para o UV.

 radiação visível e IV :a lâmpada incandescente de tungstênio;

 radiação UV: lâmpadas fluorescentes de hidrogênio e hélio.


Componentes do espectrofotômetro
Prisma ou rede de difração: Seleção do Comprimento de Onda (λ)
Diferentes λs viajam com velocidades diferentes através da matéria,
sendo que λs menores sofrem mais difração do que λs maiores.

Fendas e lentes

Existem nos espectrofotômetros várias lentes e fendas,


que tem como objetivo colimar eselecionar os feixes de
luz apropriados
Componentes do espectrofotômetro
Cubeta
A característica fundamental da cubeta é que ela seja transparente à radiação.

Espectrofotometria de Luz Visível


–Cubeta de Vidro ou Plástico

Espectrofotometria de Luz Ultra- Violeta


–Cubeta de Quartzo

Cubeta em Quartzo

Cubeta descartável
Cubeta em vidro Óptico
Cubeta 2 faces escuras
Detectores
Existem várias formas de se detectar ondas eletromagnéticas, sendo que todas
estão baseadas na conversão da energia radiante em energia elétrica, que podem
então ser detectados por um equipamento convencional.

-Células Fotovoltaicas
-Células Fotoelétricas
Padrão branco em espectrofotometria
Quando um feixe de luz monocromática atravessa uma cubeta de
espectrofotômetro, parte da luz sofre refração, reflexão, absorção pelos
reagentes e outras interações indesejáveis.

Para eliminar tais interferências, deve-se zerar o aparelho com uma solução
que é denominada “branco”.

O branco deve conter todos os constituintes do sistema, exceto a amostra a


ser estudada.

A cada conjunto de determinações, bem como após alterar o comprimento de


onda, o aparelho deve ser sempre zerado e calibrado com o tubo que contém
o branco.
Fator de calibração e curva de calibração
A principal finalidade de uma medida espectrofotométrica, nas regiões do
ultravioleta e visível, é avaliar quantidades. Assim, é extremamente
importante efetuar uma rigorosa calibração visando obter resultados exatos.
Para obter-se uma curva de calibração alguns aspectos devem ser
considerados como: a escolha de uma solução padrão, o estabelecimento de
um branco adequado e a seleção da área espectral.

Uma solução padrão apresenta concentração exata de uma substância


conhecida, que servirá como referência na determinação fotométrica de
concentrações desconhecidas desta mesma substância. Uma solução
padrão tem grande importância no preparo da curva de calibração.
Curva padrão

Sucessão crescente ou decrescente de pontos obtidos da relação entre A


concentração da espécie padrão pela sua intensidade de sinal proveniente do
sistema de detecção.
O mais importante do gráfico é a equação
de 2º grau, da qual se pode calcular a
concentração.

O gráfico disponibiliza também o valor de


R² que é o valor do coeficiente angular.

Quanto mais próximo de 1 for o valor de


r2 , Melhor será a reta descrita pela
regressão linear dos pontos. Procurar
obter retas com r≥ 0,99
A quantificação requer que se conheça a dependência entre a
resposta medida e a concentração do analito. A linearidade é obtida por
padronização interna ou externa e formulada como expressão
matemática usada para o cálculo da concentração do analito a ser
determinado na amostra real. A equação da reta que relaciona as duas
variáveis é:
y = ax+b
sendo:
y = resposta medida (absorbância);
x = concentração;
a = inclinação da curva analítica = sensibilidade;
b = interseção com o eixo y, quando x = 0.
Como criar uma curva de calibração ABS no Excel
Selecione nos tipos de gráficos Dispersão:
Em Dispersão selecionar a opção com linhas suaves e marcadores – Comparar pares de valores
que representam uma função. Também pode ser encontrado como Dispersão – f(x).
O gráfico será montado automaticamente. Após isso vá em
Layout do gráfico e clique nas setas até encontrar um modelo fx.
Clique nele.
Clique com o botão direito do mouse e escolha
a opção: Adicionar linha de tendência.

Em seguida abrirá outra tela e nela você


escolherá a opção linear;

Escolha também as opções Exibir Equação no


gráfico e Exibir valor R-quadrado no gráfico.
Calcular as concentrações a partir dos
valores de absorbância encontrados
R² = 0,889
Coeficiente angular = 88,9%

Equação
y = 0,0189x - 0,0743

y = resposta medida (absorbância)


x = concentração

Calcule a concentração de acordo com os seguintes valores de absorbância


encontrados: 0,5; 0,9; 0,35 e 0,89