TEHNICI MODERNE ÎN

BIOLOGIA CELULARĂ

1
STUDIUL PROCESELOR
CELULARE

2 aspecte:
Tehnici si metode adecvate de urmărire a
fenomenelor celulare
Modelarea experimentală a fenomenelor
celulare

2
MODALITĂŢI DE STUDIU
1.     in vivo

2.     in situ

3.     in vitro

3
MODALITĂŢI DE STUDIU
in vivo - cand celulele sau organele ale carui
celule dorim sa le studiem sunt abordate in
organismul intact.

Avantaje: rezultatele obţinute sunt edificatoare

pentru procesul studiat la nivel de organism
Dezavantaje: rezultatele experimentelor sunt dificil
de interpretat datorită influenţelor celorlalte
componente ale organismului

4
MODALITĂŢI DE STUDIU
in situ – cand organul de interes este
mentinut la locul sau in organism dar sunt
controlate unele influente cum sunt cele
nervoase sau endocrine

Avantaje: se pot studia variaţiile procesului

în condiţii controlate
Dezavantaje: nu se poate identifica rezultatul
cu cel în vivo
5
MODALITĂŢI DE STUDIU

in vitro – cand organul , ţesutul sau

celulele sunt izolate din organism
Avantaje: se permite un control riguros
al experimentului.
Dezavantaje: nu se poate garanta
obţinerea aceloraşi rezultate in vivo.

6
Tehnici in vitro

Baia de organ

Cultura de celule

7
Baia de organ
- permite menţinerea viabilităţii unor fragmente de
organ sau ţesuturi.
-variate în funcţie de organul supus experimentului
- asigură o temperatura constantă , oxigenarea
materialului biologic , posibilitatea control ării
compoziţiei mediului din baie şi culegerea de
date funcţionale şi eşantioane

8
Culturi de celule - Etape
 Digestia enzimatica a tesutului cu obtinerea
unei suspensii de celule
  Izolarea unei populaţii celulare pure
  Insămânţarea în flacoane de cultură sau plăci
Petri obţinându-se astfel o cultură primară
 Pasarea - resuspendarea celulelor din cultura
primara urmată de de reînsămânţarea în flacoane
de cultură sau plăci Petri obţinându-se culturi
secundare

9
Culturi celulare - Evoluţie
1.    Faza de lag sau de inducţie - celulele îşi
refac suprafaţa şi se acomodează cu mediul
de cultură
2.   Faza exponenţială - celulele se divid rapid,
exponenţial
3.   Faza staţionară - numărul de celule rămâne
constant. In această fază se efectuează pasarea
4. Faza de declin - scăderea nr. de celule
datorită îmbătrânirii şi morţii .
10
Medii de cultură - Componente
1.  Amimoacizi şi vitamine
2. Săruri – necesare menţinerii echilibrului
ionic şi pH mediului de cultură
3. Glucoza pentru necesarul energetic
4.  Ser fetal
5. Antibiotice
6. Rosu fenol ca indicator de pH

11
1. Morfologia si morfometria
2. Citometria in flux
3. Fractionarea celulara
4. Citochimia si citoenzimologia
5. Imunocitochimia
6. Fluorescenta si imunofluorescenta
7. Microfiziologia si microinjectia
8. Radioautografia
9. Metode biochimice
10. Tehnici si metode de biologie moleculara
12
MORFOMETRIA
- utilizează un analizor de imagine.
- se stabileşte criteriul dupa care se va efectua
analiza, precum şi limitele maximă şi minimă
ale acestuia
- Rezultat: diferite populaţii celulare.

Rezultatul analizei cantitative este afisat sub

forma unei histograme.

13
Citometria în flux
- permite analiza şi separarea celulelor pe
baza unor caractere morfologice şi
biochimice
Oferă informaţii asupra :
1.     mărimii relative a celulelor
2.     granularităţii interne (neomogenitatea
internă citoplasmatică) relativă
3.     intensitatea relativă a fluorescenţei.
14
Citometria în flux - utilitate
1.     măsurarea caracteristicilor fizice ale
celulei
2.     identificarea si separarea populaţiilor
de celule sanguine ( granulocite,
monocite , limfocite T sau B)
3.     măsurarea cantităţii de ADN din celulă
4.     măsurarea cantităţii intracelulare de Ca
5.     masurarea pH-ului intracelular
 
15
Citometria in flux

16
Fracţionarea celulară

- tehnică ce permite izolarea diferitelor

elemente ultrastructurale si biochimice
ale celulelor

17
Fracţionarea celulară - Etape
   Omogenizarea –distrugerea integrităţii
tisulare şi apoi celulare cu obţinerea unei
suspensii de organite şi membrane
veziculate în mediul de omogenizare

Separarea prin centrifugare şi/ sau

ultracentrifugare

18
OMOGENIZAREA

a.   prin soc osmotic. Diferenţa de osmolaritate

între mediul i.c. si cel e.c. duce la umflarea
celulelor pana la ruperea membranelor.
b.   prin ultrasonicare – presupune ruperea
membranelor sub acţiunea undelor ultrasonice
c.    cu omogenizatoare se realizeaza sub acţiunea
forţelor de frecare şi torsiune care contribuie la
ruperea membranelor.

19
SEPARAREA
     diferenţială – cand organitele se depun
la baza tubului , în ordinea densităţii lor
prin centrifugari repetate la forţe din ce în
ce mai mari
 în gradient de densitate –printr-o
singură centrifugare la forţe suficient de
ridicate se obţin organitele ca fracţii
separate .

20
 S e p a ra re a c o n s t it u e n t ilo r
c e lu la ri p rin v it e z e d e c e n t ri-
f u g a re c re s c a n d e

P u ri f i c a re in
g ra d ie n t
d e d e n s ita t e

M e m b ra n e
M it o c o n d ri i c e lu la re
G o lg i
Liz o z o m i
N U C LE I m ic ro s o m i
U lt r a s o n ic a r e

R ib o s o m i re t ic u l e n d o p la s m ic

21
 AUTORADIOGRAFIA
 -tehnica de investigare celulară ce permite
identificarea morfologică şi ultrastructurală a unor
compuşi radioactivi.

trasori radioactivi :
- aminoacizi, glucide, nucleotide Marcarea unor
- fosfat sau sulfat radioactiv
componente
celulare
receptori sau
- liganzi radioactivi specifici anticorpi radioactivi
22
METODE BIOCHIMICE

ELECTROFOREZA
IMUNOELECTROFOREZA
TRANSFERUL ELECTROFORETIC

23
ELECTROFOREZA
PRINCIPIU: particulele încărcate electric
migrează într-un mediu vâscos , sub
acţiunea unui câmp electric.

Aplicaţii practice: studiul proteinelor şi a

acizilor nucleici.

24
ELECTROFOREZA
PROTEINELOR
a.    unidimensională , cand migrarea se
realizează în gel într-o singură direcţie
b.    bidimensională , când migrarea se realizează
succesiv în două direcţii

Aplicaţii practice – electroforeza unidimensională

 SDS – PAGE
 FOCALIZAREA IZOELECTRICA

25
ELECTROFOREZA SDS-PAGE
-realizează separarea proteinelor dintr-un
amestec pe baza gabaritului molecular
direct proporţional cu masa moleculară.

Principiu: adsorbţia dodecilsulfatului de

sodiu unitar pe proteine, realizând o
densitate de sarcină negativă uniformă.

26
ELECTROFOREZA SDS-PAGE

27
Focalizarea izoelectrica
- separarea proteinelor dintr-un amestec se
face pe baza punctului lor izoelectric.

Principiu: migrarea proteinelor în funcţie de

punctul izoelectric, până în zona cu pH-ul
identic cu cel al punctului lor izoelectric,
unde devin neutre oprindu-şi miscarea.

28
Focalizarea izoelectrica

B e n z i p r o t e i c e la p u n c t u l iz o e l e c t ri c

29
Electroforeza bidimensionala
-migrarea proteinelor în două direcţii :
1.     in prima direcţie în funcţie de punctul lor
izoelectric - FOCALIZARE IZOELECTRICA
2.     a doua direcţie - SDS – PAGE , în funcţie de
greutatea moleculară a proteinelor.

Rezultatul se prezinta sub forma unei hărţi cu

proteinele separate în planul gelului.

30
Electroforeza bidimensionala
E l e c t r o f o r e z a l a p u n c t iz o e le c t r ic

SD S-

31
IMUNOELECTROFOREZA
 - o variantă a electroforezei ce combin ă migrarea
în câmp electric a proteinelor cu realizarea unei
reactii imune de tip Ag-Ac

Reactia imuna:
-dupa terminarea migrarii electroforetice,
-concomitent (imunoelectroforeza în rachetă) -
apreciere cantitativă a Ag (= suprafaţa descrisă de
linia de precipitare cu linia de start).
32
IMUNOELECTROFOREZA

33
TRANSFERUL
ELECTROFORETIC
-metodă de extragere a proteinelor separate
electroforetic dintr-un gel , cu adsorbirea
lor pe niste hârtii cu proprietăţi speciale.

Proteinele suferă reacţii de recunoaştere

specifică prin intermediul unor
interacţiuni de tip receptor – ligand sau Ag
– Ac.
34