Professional Documents
Culture Documents
BIOLOGIA CELULARĂ
1
STUDIUL PROCESELOR
CELULARE
2 aspecte:
Tehnici si metode adecvate de urmărire a
fenomenelor celulare
Modelarea experimentală a fenomenelor
celulare
2
MODALITĂŢI DE STUDIU
1. in vivo
2. in situ
3. in vitro
3
MODALITĂŢI DE STUDIU
in vivo - cand celulele sau organele ale carui
celule dorim sa le studiem sunt abordate in
organismul intact.
4
MODALITĂŢI DE STUDIU
in situ – cand organul de interes este
mentinut la locul sau in organism dar sunt
controlate unele influente cum sunt cele
nervoase sau endocrine
6
Tehnici in vitro
Baia de organ
Cultura de celule
7
Baia de organ
- permite menţinerea viabilităţii unor fragmente de
organ sau ţesuturi.
-variate în funcţie de organul supus experimentului
- asigură o temperatura constantă , oxigenarea
materialului biologic , posibilitatea control ării
compoziţiei mediului din baie şi culegerea de
date funcţionale şi eşantioane
8
Culturi de celule - Etape
Digestia enzimatica a tesutului cu obtinerea
unei suspensii de celule
Izolarea unei populaţii celulare pure
Insămânţarea în flacoane de cultură sau plăci
Petri obţinându-se astfel o cultură primară
Pasarea - resuspendarea celulelor din cultura
primara urmată de de reînsămânţarea în flacoane
de cultură sau plăci Petri obţinându-se culturi
secundare
9
Culturi celulare - Evoluţie
1. Faza de lag sau de inducţie - celulele îşi
refac suprafaţa şi se acomodează cu mediul
de cultură
2. Faza exponenţială - celulele se divid rapid,
exponenţial
3. Faza staţionară - numărul de celule rămâne
constant. In această fază se efectuează pasarea
4. Faza de declin - scăderea nr. de celule
datorită îmbătrânirii şi morţii .
10
Medii de cultură - Componente
1. Amimoacizi şi vitamine
2. Săruri – necesare menţinerii echilibrului
ionic şi pH mediului de cultură
3. Glucoza pentru necesarul energetic
4. Ser fetal
5. Antibiotice
6. Rosu fenol ca indicator de pH
11
1. Morfologia si morfometria
2. Citometria in flux
3. Fractionarea celulara
4. Citochimia si citoenzimologia
5. Imunocitochimia
6. Fluorescenta si imunofluorescenta
7. Microfiziologia si microinjectia
8. Radioautografia
9. Metode biochimice
10. Tehnici si metode de biologie moleculara
12
MORFOMETRIA
- utilizează un analizor de imagine.
- se stabileşte criteriul dupa care se va efectua
analiza, precum şi limitele maximă şi minimă
ale acestuia
- Rezultat: diferite populaţii celulare.
13
Citometria în flux
- permite analiza şi separarea celulelor pe
baza unor caractere morfologice şi
biochimice
Oferă informaţii asupra :
1. mărimii relative a celulelor
2. granularităţii interne (neomogenitatea
internă citoplasmatică) relativă
3. intensitatea relativă a fluorescenţei.
14
Citometria în flux - utilitate
1. măsurarea caracteristicilor fizice ale
celulei
2. identificarea si separarea populaţiilor
de celule sanguine ( granulocite,
monocite , limfocite T sau B)
3. măsurarea cantităţii de ADN din celulă
4. măsurarea cantităţii intracelulare de Ca
5. masurarea pH-ului intracelular
15
Citometria in flux
16
Fracţionarea celulară
17
Fracţionarea celulară - Etape
Omogenizarea –distrugerea integrităţii
tisulare şi apoi celulare cu obţinerea unei
suspensii de organite şi membrane
veziculate în mediul de omogenizare
18
OMOGENIZAREA
19
SEPARAREA
diferenţială – cand organitele se depun
la baza tubului , în ordinea densităţii lor
prin centrifugari repetate la forţe din ce în
ce mai mari
în gradient de densitate –printr-o
singură centrifugare la forţe suficient de
ridicate se obţin organitele ca fracţii
separate .
20
S e p a ra re a c o n s t it u e n t ilo r
c e lu la ri p rin v it e z e d e c e n t ri-
f u g a re c re s c a n d e
P u ri f i c a re in
g ra d ie n t
d e d e n s ita t e
M e m b ra n e
M it o c o n d ri i c e lu la re
G o lg i
Liz o z o m i
N U C LE I m ic ro s o m i
U lt r a s o n ic a r e
R ib o s o m i re t ic u l e n d o p la s m ic
21
AUTORADIOGRAFIA
-tehnica de investigare celulară ce permite
identificarea morfologică şi ultrastructurală a unor
compuşi radioactivi.
trasori radioactivi :
- aminoacizi, glucide, nucleotide Marcarea unor
- fosfat sau sulfat radioactiv
componente
celulare
receptori sau
- liganzi radioactivi specifici anticorpi radioactivi
22
METODE BIOCHIMICE
ELECTROFOREZA
IMUNOELECTROFOREZA
TRANSFERUL ELECTROFORETIC
23
ELECTROFOREZA
PRINCIPIU: particulele încărcate electric
migrează într-un mediu vâscos , sub
acţiunea unui câmp electric.
24
ELECTROFOREZA
PROTEINELOR
a. unidimensională , cand migrarea se
realizează în gel într-o singură direcţie
b. bidimensională , când migrarea se realizează
succesiv în două direcţii
25
ELECTROFOREZA SDS-PAGE
-realizează separarea proteinelor dintr-un
amestec pe baza gabaritului molecular
direct proporţional cu masa moleculară.
26
ELECTROFOREZA SDS-PAGE
27
Focalizarea izoelectrica
- separarea proteinelor dintr-un amestec se
face pe baza punctului lor izoelectric.
28
Focalizarea izoelectrica
B e n z i p r o t e i c e la p u n c t u l iz o e l e c t ri c
29
Electroforeza bidimensionala
-migrarea proteinelor în două direcţii :
1. in prima direcţie în funcţie de punctul lor
izoelectric - FOCALIZARE IZOELECTRICA
2. a doua direcţie - SDS – PAGE , în funcţie de
greutatea moleculară a proteinelor.
30
Electroforeza bidimensionala
E l e c t r o f o r e z a l a p u n c t iz o e le c t r ic
SD S-
31
IMUNOELECTROFOREZA
- o variantă a electroforezei ce combin ă migrarea
în câmp electric a proteinelor cu realizarea unei
reactii imune de tip Ag-Ac
Reactia imuna:
-dupa terminarea migrarii electroforetice,
-concomitent (imunoelectroforeza în rachetă) -
apreciere cantitativă a Ag (= suprafaţa descrisă de
linia de precipitare cu linia de start).
32
IMUNOELECTROFOREZA
33
TRANSFERUL
ELECTROFORETIC
-metodă de extragere a proteinelor separate
electroforetic dintr-un gel , cu adsorbirea
lor pe niste hârtii cu proprietăţi speciale.