AYllMA TEKNIKLElI

AFINITE KlOMATOGlAFI$I
NIHAN YUlT$E\El
J¨J1J8JJ19
KlOMATOGlAFI
· Kromatografi. bir kar·s·mdaki bilesikleri birbirinden
ay·rmak \e maddeleri saflast·rmak icin kullan·lan
bir tekniktir. Özellikle fiziksel \e kimyasal nitelikleri cok
benzeyen maddelerin ayr·lma islemlerinde. kromatografi
yönteminin kullan·m· ile basar·l· sonuclar elde
edilmektedir.
· Kromatografi tekniginde yararlan·lan temel prensip bir
kar·s·mdaki cesitli maddelerin bareketli bir faz
yard·m· ile sabit bir faz üzerinden gecirilmeleri \e bu
gecis s·ras·nda farkl· b·zlarla bareket
edebilmeleridir.
KlOMATOGlAFI ISLEMI
· A \e L maddelerinden olusan kar·s·m· sabit
fazla birlikte kolonun baslang·c bölgesine
uygulan·r \e bareketli faz(s·\· \eya gaz|
akmaya b·rak·l·r. Laz· kromatografi
tiplerinde de madde kar·s·m· bareketli faza
kar·st·r·larak uygulan·r. Numunede
bulunan bilesimler farkl· yürüme \eya bareket
b·zlar·na göre bareketli faz icerisinde
ilerlerler.
Kromatografi tekniginin temelinde üc ana
unsur yer al·r.
$abit faz: Lu faz daima bir kat· \eya bir kat·
destek üzerine emdirilmis bir s·\· tabakas·ndan
olusur.
Hareketli faz: Lu faz daima bir s·\· \eya gazdan
olusur.
$abit faz. bareketli faz \e kar·s·m·nda yer alan
maddeler aras·ndaki etkilesimin türü: Kromatografide
yüzey tutunmas· \eya adsorpsiyon ile cözünürlük
olgular· temel etkilesim türlerini olustururlar. Sayet
basit faz bir kat· ise. kar·s·mdaki maddelerle sabit
faz aras·nda yüzey tutunmas·(adsorpsiyon| etkilesimi
gerceklesir.
@esitli kromatografik yöntemler \ard·r.
Lunlardan baz·lar·; KOLON
KlOMATOGlAF$. Ince tabaka
kromatografisi (lTK|. Kag·t
kromatografisi. Gaz kromatografisi. Iyon
degisimi kromatografisi. `el gecirgenlik
kromatografisi. Yüksek bas·ncl· s·\·
kromatografisi. Ilgi kromatografisidir.
Kolon Kromatografi Tipleri
W`el filtrasyonu bQyQklQk
Wyon excbange yQk
WAffinite (balanma|
WAdsorbsiyon (HlLC| fazlar
aras·ndaki zQnQrlQk fark·
Kolondaki dolgu maddesi \e seilen elQsyon
metoduna gre grupland·r·l·r:
Affinite Kromatografisi
Lir eit iyon deiim kromatografisidir. $abit
faz·n Qst yQzeyine L maddesine kar· afinitesi
olan fakat dier bQtQn maddelere kar· ilgisiz
olan A maddesi ile adsorbe edilirse (ko\alent
balanmas·n· salamak suretiyle| L maddesi A ya
s·k·ca balanmas· salanarak belirgin bir ay·rma
gerekletirilebilir. $onra baska bir element
yard·m· ile L maddesi sabit fazdan zQlebilir.
Lu metotla kompleks kar··mlardan belirli bir
maddeyi kQQk miktarlar balinde
ay·rmak mQmkQn olur.
$eciciligi fazla olan
bu yöntem.
kromatografik ay·rma
tekniklerinin en
yenisidir.
· Anti|en Antikor
· Enzim $ubstrat
· leseptör Ilac
gibi oldukca spesifik
etkilesimlere dayan·r.
Affinite Kromatografisi
Enzim. bormon.\b spesifik proteinlerin saflat·r·lmas·nda
kullan·l·r.Kolonun dolgu maddesine. (dekstran. poliakrilamid. selQloz
\b| spesifik protein ile kompleks yapabilen bir ligand balan·r
Ligand bal·
boncuk
spesifik
protein
dier
proteinler
Tampon ak··
$erbest
proteinler
ligand-protein
kompleksi
Affinite Kromatografisi
glukoz-protein
kompleksi
boncuk
serbest
protein
boncuk
la\e
glukoz(G|
Ligand ile kompleks yapan spesifik protein.kat· destee balanarak kolonda
tutulurken; serbest proteinler kolonu terkederler
Lal· protein. daba sonra. pH deiiklii / tuz zeltileri \eya ligand ila\esiyle
kolondan elde edilir.
Crnek:
Adsorpsiyon- yüzeye tutunma- prensibinin uyguland·g·
afinite kromatografisi. kromatografik tekniklerin b·zla
gelismekte olan bir dal·d·r. Afinite kromatografisi
biyomoleküllerin biyolo|ik esas·na dayal· olan bir yöntemdir.
Lu yöntem. enzim substrat gibi biribiri ile spesifik etkilesen
moleküllerdeki etkilesim temel al·narak gelistirilmistir.
Afinite kromatografisinde s·kl·kla kullan·lan biyolo|ik
etkilesimler antikor-anti|en. enzim-kofaktör gibi moleküllerin
etkilesimine benzer.
Afinite kromatografisi; metal-selat. moleküler bask·lama.
lektin. membran bazl·. immuno-afinite \e boya-ligand afinite
kromatografisi gibi bir cok türü olan etkili bir ay·rma
yöntemidir.
Afinite kromatografisi protein ile spesifik ligandlar·n.
tersinir (adsorpsiyon-desorpsiyon| etkilesimine
dayanmaktad·r. Lu etkilesimler elektrostatik ya da \an
der Vaals. bidro|en bag· gibi bidrofobik etkilesimlerdir.
Genelllikle kat· olarak secilen destek materyel yüzeyine.
ko\alent etkilesimlerle ligand ad· \erilen \e
kar·s·mdan ayr·lmas· istenen bilesene ilgisi olan
secici gruplar baglan·r. Ayr·lmas· istenen protein
kat· yüzey üzerine optimum kosullarda adsorplanarak
kar·s·mdan uzaklast·r·l·r. lrotein ile ligand
aras·ndaki etkilesimler uygun a|anlar yard·m· ile yok
edilerek proteinin yüzeyden desorpsiyonu saglan·r.
Löylece coklu islem basamag·na gerek kalmadan tek
basamakta yüksek safl·kta ay·rma gerceklesir.
Ligand olarak enzim. antikor. aminoasit. nükleik
asit \e oligopeptit gibi cesitli moleküller
kullan·larak bircok destek materyal dizayn
edilmistir. Ancak bu moleküllerin \e uygulanan
teknigin maliyeti yüksektir. Loya-ligand afinite
kromatografisinin dikkat cekici \e önemli yan·
bu dogal moleküllerin alternatifi olarak ligand
yerine boya kullan·lmas·d·r. Loya ligandlar
bircok proteine. ayn· dogal moleküllerde oldugu
gibi spesifik olarak baglanabilmektedir.
Uygulanabilirligi maliyeti \e boyan·n destek
materyal yüzeyine kolay tutunup. kal·c·
olmas·ndan dolay· da tercib edilen bir yöntemdir.
Kullan·lan boyalar tekstil boyas· olarak bilinen
oldukca ucuz \e uygun cal·sma imkan· saglayan
materyallerdir. Loya yerine enzim gibi protein
yap·l· biyolo|ik moleküllerin baglanmas· bem
daba zor bir teknigi bem de maliyeti beraberinde
getirir. Lunun yan·nda protein tabanl· bu tip
maddelerin islem sürensince bozunma riski de
yüksektir. Lu nedenle boya-ligand afinite
kromatografisi kullan·sl· \e \erimli bir uygulamaya
sabiptir.
Karbonik anbidraz l \e llnin izolasyonunda en cok
kullan·lan yöntem afinite kromatografisidir. Ilk defa
19¨J lerde uygulanmaya baslam·s olan bu yöntemle
sonralar· karbonik anbidraz l \e ll izoenzimleri
basar·l· bir sekilde birbirinden ayr·labilmistir. Lu
yöntemlerde destek maddesi olan |ele enzimin güclü bir
sekilde bagland·g· inbibitörleri tak·lmakta \e enzimin
bu moleküller arac·l·g·yla kolonda tutulmas·
saglanmaktad·r. Karbonik anbidraz lllün afinite
kromatografisinde kullan·lan inbibitörlere
baglanmas·n·n cok zay·f olmas·ndan dolay· bu
izoenzim önceleri farkl· yöntemlerle izole edilmistir.
$onralar· bu izoenzimin p-aminobenzen sülfonamide
yeteri derecede bagland·g· gösterilmis \e bu inbibitör
kullan·larak enzim afinite kromatografisi ile izole
edilebilmistir.
Lenzer sekilde membrana bagl· bir izoform olan karbonik
anbidraz l\te p-aminobenzen sülfonamid afinite kromatografisiyle
izole edilmistir. Mitokondriyel bir enzim olan karbonik anbidraz
\ izolasyonunda. mitokondrilerin bütün sitosolik bilesenlerden
ayr·lmas·n· takiben dondurucuda bekletilip santrifü|lenmesi \e
elde edilen tamamen cözünür durumdaki mitokondriyel matriks.
p-aminobenzen sülfonamidin CM Liogel Aya tak·lmas·yla
baz·rlanm·s |elin bulundugu kolondan gecirilmistir. Daba sonra
enzim sodyum azidür (NaN| ile elue edilerek basar·l· bir
sekilde izole edilmistir. $alg·lanan bir enzim olan karbonik
anbidraz \l. inbibitörlerle karbonik anbidraz llye benzer sekilde
etkilesmektedir \e bu nedenle afinite kromatografisi izolasyon
amac·yla rabatl·kla kullan·labilmistir. Lu maksatla p-
aminobenzen sülfonamid afinite kromatografisi uygulanm·st·r.
Memeli izoenzimlerinin baricinde diger karbonik anbidraz
izoformlar· da özellikle p-aminobenzen sülfonamid kullan·larak
afinite kromatografisiyle izole edilebilmektedir.
Farkl· kullan·m alanlar·na bir
örnek
Sabancìlar ve ark. (2007), yaptìklarì
çalìsmada Denizli Narìndan PFO enzimi
Afinite Kromatografisi yardìmì ile saflastìrmìs
ve karakterizasyonunu yapmìslardìr.
Denizli narìndan saflastìrìlan polifenol
oksidaz enzimi afinite kromatografisi
kullanìlarak 67 kat saflastìrìlmìstìr.

 .

 .

7+5/* *5-. 65*6-*/*51*5*1*5.75 C.9./6...*5*5**7.51*5.0.+8 0.. .-.5.5+5+5-.+.52 +. -.8*. ...5-..-.35.63+5 *5 -*..*--..5-.56*/* 75*8** +57..-5  W 52*7205*/7. 52*7205*/ 7..+* *5628*5..5*5* .5-5 .-.7 .*6*7. *5*9.*--. 7*--..59.7..6*+7+5/*Q.!#! W 52*7205*/ +5*5 -*+.

.

.*1*5.9.5-.28 **5 6*+7 /**+57.5 .228+* *0 +0. .56-.7/*. .!#!  W 9.7/** *5 75*5*808*5 88..*--.7 1*5*05..1*5.5. +88*+.*5 1*5.-..-.6.5. 808*59.*0*  ***+5*5 *52*7205*/ 73.*--..7/* 699.5/*5Q5Q.5-.1*5.

*0*-* 28 85  "*+7/* 1*5.7878*6 *-625362 .528 78585*5  *.5*5*6-*.7..**-625362.. Q. 7.67.5. *5 -**--.5.-. 7Q5Q52*7205*/-.7/*8/*-**+5699.7 +*67/*+5*76.*+5*7 -.QQ5Q 208*57.7/*9... 5 .-5 +5697*+**6-* 28 85  *5..7.7.*5 -*.Q ** 8685.52*7205*/7.  0...5** *--.6*+7 /**5*6-*Q.. 7Q5.5*5  "*+7/*8/*-**+5*79.7878*69..5.Q.

652*7205*/6 .@..50.+*669 52*7205*/6  052*7205*/6-5 .7*+** 52*7205*/6 # * 7 52*7205*/6 *52*7205*/6  2 -.0.59*5-5  8*5-*+**5 !#! "  ..6752*7205*/7. 52*7205*/6 Q6.

2252*7205*/#3..5 22-*-208*--...1*0.72-8*05. Q W//7.6. +* ** W-625+62   /**5 *5*6-*QQ5Q/*5 .0583*-55 W.Q62 ./75*628 +QQQ W 2..69.

5+5 *--..+5 "25*+*6*+5.//7..7 *5-...50+5*5* 0.5+Q7Q*--.6. 29*.  52*7205*/6-5 "*+7 /*Q67Q.6 2*/**7- .*5 */7.7 +* **66* **685.*+* **66* **5*+.52*7205*/6 5.*--. 75.6. *5*QQ285 . *--.6* 6.5.-56.*-625+..66*+7/*-*Q..*5 06 2**--.QQ7*5*51*-.7.727*23. 72-.5.*--.+5 8.6*5 *5-*+.

.6-5  W W W 7.375 * 0+2-8*63. .7. /**2* +87.".. 725  "8+675*7 !. 52*7205*/*5* 7.5.6/ .-**5 .6. .5.

6..Q2 9+ 63.67 3527.6/ 3527.56*/* 75*6-* 8*5 228-208*--.+50*-+* *5 #*32*  0*.//7.675* 32*5*.5+.23. ".5 3527.. 23.6*3*+..5 .6.52*7205*/6  1252 9+ 63.6 0*-+*  +2.8 63.3527.  -.5 - .6/3527.6/3527..

 23.673527.5.5+.6. 082 3527. . 52*7205*/6 0*-.+* **5*22-* 787885.5 * 3527.. 082  +2..67 3527.23. *7-.67. . 22-*.-5 C5.-.7. -*1*625* 3-.//7.6 *9.-.52287.    78.*0*.8 6.*9.5+.59.6*3*63.8 +2.5.6.6/3527.

5-.5+22.+2* 0*-*/7.5  /7.52*7205*/6 +22.Q. 2.68+675*70++5+5.52*7205*/6 52*7205*/7. 75 75  /7.52*7205*/6.7.Q.7. .-5  87.7+5*5* 7.7 .7* .51* 0.5*725 *7.7878* 35...52*7205*/6-.-625362 Q..5+*6**  .6*6*-**2*+57.. .6/.**5*0.6+808*-  */7.7.2*+5-*-5 /7.63.+..Q.*7 2. .6*8**+22 .-5 .+5*+* 82 */7. 52*7205*/60++527Q5Q 2*. . 7. 2/*750+2. .Q.7.7.9. .5 .

.3527.-.**-*7.062* 6.3527. .-. *5 -**5*667.0583*5+* *5 5*667./7.5. +*6**7*Q6.7.625362 .+*6** *0.0*- *5*6-*.0*-*-9.5-5  .Q.6/0*-*5  7.75267*7*-*%* -.5.5.. . ...7. .7.23782 8*5-**-6253**5* *5 -*8** 755 527.6*/7**5*0..+..2 .-.5808***5*5-.Q.*72*5*6.. ..5.5.63.7.9. .52*7205*/63527..7.62536286* *5  .5..  29*.Q.565 *-625362 -.*7.-.5..+* 0+1-52/2+..5&**6 1-52. *7Q.5. 5 .28 ..7.67. -***7*-5 8..

.

5*7/2*5*0*- . *679.9.5 8**5*+52-.+2*8**6-5 2*0*-*5 +523527.59.7.*7.Q.0*-2*5*.. 52*7205*/6-*7. *-2 *2.5*7.- 75 .5.67.6/2*5*+* **+.7Q6.*+82. 72.5-.5*-* .-5 . *.808** 7.Q..* +8-2 *2.Q.75 2* 0*-*/7.3770+.2-8 8 0+63. *725 *2*67 Q.2023.Q..

808* **6* ** *7.+2*-..6Q5.*.7*+*+873 *--. *3+222. *7..5*+.67+2*62*5*+.-5  8**+2**57.5+* **61.7+.5-.$08**+5 *.-. 1.89.5*Q. 0.75 8.+28*56-..0+3527.5 +5808*** 6*1375 .5-5 2*.5*. Q6.9.2*787883 *.-..+2* 0*-*/7. -*1*25+57.755 88*-*3527.5.67.5 .79.6.Q..+57.-. 2*6-*-2*-*7.1. 52*7205*/68* 9.5. 2-8*8.

*/7./* .2 8**7.*5+2*1-5*9.52*7205*/6-5  -.2*628-*.

..+* *- 1+75.2.52*7205*/6.2. +* **62*/2*6-*-2*+8 2..5/*57.5.7.+ 75 .57**7*9... +82.5-..62*.. 625**5*5+2*1-5*9..67.+* *- 067.808***+* * 2*+87.*5*+ 75 8 7.- 75  "25**5+82..2.-.. *22-*7878*6 6* **7*-5 *5+2*1-5*Q*/7.. ..5 9.*--.-.6Q/2*-.+5+5-. .-.5-.3 *2+.5.-.5 +* *5+5 .5-. .5.5*5*.Q. 52*7205*/6-.*/7.0QQ +5 .+81+75 8**5*...-.8**1+75.

-.- 75 "*0**+5.3 *2+..2.7**.5 75 *1*625* .-.-.3 *2+. 2.52*7205*/6...6Q/2*-*/7.-59..*5*1*7*8**+ 75 8*6*7*3 *2+.-.51*5.*/7.2**5+2*1-5* %2*628-* 722-5.5*5+2*1-5* 2/25*5-*.+* *5+5 .62-8*-Q5 * .-.... .-.-2-858.8.QQ5-858-*722-5..*5+2*1-5*..5.52*7205*/62*62 **.. .6Q/2*-8**5* */7.5 .5 .6Q/2*-*/7...+8.-.7.52*7205*/6.-5 .736*75/Q. *5*67*+...5.7.7.5-.+88-8 822-*0.+.... .69.-.6Q/2*-20.8-*+.2.2..*7**6* 1*5* .- 75 722-5.2**5+2 *1-5*% 1+75.+5.*756  3 *2+.5+Q7Q67262+.+5**+* +52/252**5+2 *1-5*%7.- ..+.52*7205*/6808* 75  .. .-..

7  .1.03.1.1.3! 032 1390742.18.7.7    .947.7 3/.0.7/ 7 033.843:3:. .7.18 :.3541034 48/.38.7.7 3/. 9 7 2 9 7 .032.98. 9 72  .3.7/ 2 08./.*58****5*+5 5.1390742.52 .0. 9 7 .947.3 . $.-.59 . 2..907.