Tehnica PCR

.‡ Reactia de polimerizare in lant PCR (polimerase chain reaction) are la baza o tehnologie in vitro care imita capacitatea naturala de replicare a ADN. ‡ Tehnica consta in generarea rapida a unor copii multiple a unei secvente nucleotidice tinta (ADN sau ARN) dintr-o gena de interes sau un patogen specific.

O enzima care faciliteaza sinteza lantului complementar de acid nucleic (ADN polimeraza Taq pentru o tinta ADN sau RTth ADN polimeraza pentru o tinta ARN) .‡ Amplificarea se realizeaza intr-un analizor special.ADN sau ARN tinta: extras din proba in cursul etapei de prelucrare . iar amestecul de reactie trebuie sa contina urmatoarele elemente: .

. marcand inceputul si sfarsitul regiunii care trebuie sa fie amplificata. ei servesc ca punct de plecare pentru sinteza lantului complementar cu ajutorul ADN polimerazei. .Cofactori enzimatici: Mg2+ si/sau Mn2+ .Primeri (P1 si P2): sunt secvente scurte de20-30 nucleotide.

dCTP si dUTP): folosite pentru sinteza noii catene ADN prin atasarea lor la capatul primerilor. dGTP.Amperaza: enzima care promoveaza amplificarea selectiva a tintei si distrugerea produsilor de contaminare din cursul reactiilor de amplificare anterioare .Deoxinucleotidele (dATP. ..

Hibridizarea primerilor 3. Elongatia .Denaturarea 2.Reactia PCR se desfasoara in 3 etape: 1.

de care se vor lega apoi primerii ‡ La sfarsitul acestei etape in mediul de reactie vor fi prezente doua lanturi ADN monocatenare . timp de 20-30 de secunde ‡ ADN-ul dublu catenar este desfasurat in doua lanturi complementare.DENATURAREA ADN-ULUI ‡ 94-98 ºC.

HIBRIDIZAREA PRIMERILOR ‡ Se scade temperatura la 50-65 ºC. timp de 2040 de secunde ‡ Primerii sunt in exces in mediul de reactie ‡ Se vor atasa complementar la capetele 3¶ ale celor 2 catene .

pe baza regulii complementaritatii .ELONGATIA ‡ Temperatura depinde de ADN-polimeraza (de obicei 72ºC) ‡ ADN-polimeraza: ± Se leaga de lantul hibrid ± ÄCiteste´ secven a lantului ADN-tinta ± Alungeste primerii prin adaugarea de dNTP.

Procesul global de amplificare este divizat in 3 faze: . nu se mai formeaza alti produsi de amplificare. .Lineara: pe masura ce componentele reactiei sunt consumate. . .Exponentiala: la fiecare ciclu se dubleaza cantitatea de amplicon ADN.Platou (end-point): reactia este stopata. se produce o incetinire a reactiei iar produsii PCR incep sa se degradeze. iar daca faza se prelungeste mult produsii PCR vor suferi o degradare importanta.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful