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Universidade Fernando Pessoa

Ciências Farmacêuticas
Imunologia

Imunocitoquímica para deteccão de linfocitos T


em amostra de sangue periférico

Docente: Professora Doutora Sandra Soares

Discentes:
Catarina Oliveira......................n.º 17182
Elisabete Ramos......................n.º 13067
Isabel Cardeal .........................n.º 14133
Maria Sofia Bucho …….………nº 16543
Imunocitoquímica
Localização de proteínas numa célula ( ou população de células)

Fundamento da técnica utilização de anticorpos específicos contra proteína


(antigénio) que se pretende identificar e localizar

Neste trabalho
identificar e detectar linfócitos T em sangue periférico

receptores específicos CD3


Princípio da Técnica
Anticorpo especifico antigénio Observação microscópica
liga-se

Dois métodos
- Directo (anticorpo primário marcado)

- Indirecto ( anticorpo primário e anticorpo secundário marcado)

anti – CD3 contém anticorpo que reconhece


(reconhece o antigénio) anticorpo primário
Princípio da Técnica
Utilização :
- anticorpo primário (anti-CD3) para reconhecimento
- anticorpo secundário biotinilado (anti-anti-CD3) do antigénio

Enzima ---- Streptavidina peroxidase que reage com a biotina

Liga-se ao substracto cromogénio (DAB)

Coloração castanha
(quando ocorre degradação do substrato
pela enzima)
Procedimento
Material e Reagentes

Material Reagentes
•Algodão •Álcool
•Lanceta •Solução metanol/acetona (50/50)
•Lâmina •Solução PBS
•Pipeta de Pasteur •Bloqueador das peroxidases endógenas
•Gobelé •Soro proteico (UV protein block)
•Micropipeta de 50 µl, 100 µl, 200 µl, 400 µl •Anticorpo primário (anti-CD3) Santa Cruz
e respectivas pontas Biotechnology – diluição 1 /10000
•Recipiente para despejos bio-perigosos •Anticorpo secundário biotinilado
(biotinylated secondary antibody)
•Microscópio •Streptavidina Peroxidase (HRP)
•Tubo Falcon •Solução de DAB (DAB
Chromogen/substract kit high contrast –
Scytek Laboratorics)
•Estufa •H2O2 a 3% (Lote 09216)
•Eppendorfs
Procedimento

Fazer esfregaços com uma gota de sangue e


secar;
• Para ter células necessárias para o procedimento

Fixar com uma solução de metanol/acetona (2min à


ºC ambiente)
• Para não haver a perda de células durante o ensaio

Lavar com PBS 2x

• Para remover o excesso da solução de fixação

Bloquear as peroxidases endógenas, com solução


a 3%, durante 10min
• Durante o procedimento. Vão-se querer usar, apenas, as
peroxidases endógenas. Se não fossem removidas haveria
problemas nos resultados.
Procedimento

Lavar com PBS


• Remoção do excesso da solução bloqueadora

Incubar em soro proteico (UV protein block) durante


5 min à ºC ambiente
• Para haver o bloqueio os locais Fc, de forma a que, quando se
adicionar o 1º anticorpo, este não se ligue por esses locais ao
receptor da célula T, mas sim com os seis sitios variáveis.

Lavar 1x com PBS


• Retirar o excesso de reagente

Incubar o esfregaço com anticorpo primário (anti-


CD3) durante 15 min (preparado previamente) à ºC
ambiente
• Para que este anticorpo se ligue ao receptorda célula T – CD3 e
deixa-se a temperatura ambiente durante 15 minutos para se dar
a reacção.
Procedimento

Lavar com PBS 2x


• Para retirar o excesso de anticorpo primário

Incubar no anticorpo biotinilado (biotinylated


secondary antibody) durante 10 min à ºC ambiente
• Este anticorpo (anti-anti-CD3) vai-se ligar ao anticorpo primário. É
biotinilado, o que vai originar uma cor amarela. É necessário
tempo para se dar a reacção.

Lavar em PBS 2x
• Para retirar o excesso de anticorpo secundário.

Incubar com Streptavidina Peroxidase (HRP) – 10


min à ºC ambiente.
• A avidina peroxidase vai-se ligar à biotina do anticorpo secundário
biotinilado.
Procedimento

Lavar com PBS 2x

• Retirar o excesso de reagente.

Revelar no cromogénio DAB durante 5 minutos

• DAB é o substracto para a avidina peroxidase, que se ligou à


biotina do anticorpo secundário. Havendo esta ligação, ocorre
uma coloração castanha do linfócito T que será observada ao
MOC.

Lavar com PBS 2x

• Para retirar o excesso de DAB adicionado anteriormente.


Procedimento

Contrastar com Hematoxilina durante 3 minutos

• Cora os linfócitos B de azul.

Lavar com H2O2 para melhor diferenciação

Observar ao MOC
Avidina Peroxidase DAB

Cor castanha

Biotina

2º anticorpo (anti-anti-CD3) biotinilado

1º anticorpo (anti-CD3)

Receptor Linfócito T (CD3)


Resultados
Discussão e
Conclusão
Discussão e Conclusão

 De acordo com os resultados obtidos, não foi possível identificar a


presença de linfócitos T.

 Este facto pode estar associado a uma incorrecta execução da técnica,


relativamente ao procedimento do esfregaço sanguíneo, que ficou muito
espesso.
Discussão e Conclusão

 Pode também dever-se a um incumprimento dos


tempos de espera relativamente aos reagentes
utilizados, nomeadamente dos marcadores.

 Uma má coloração das células, constitui também um


motivo para a obtenção de tais resultados, pois pode
ser difícil ou até mesmo impossível identificar e detectar
as células T.
Bibliografia
Bibliografia

 Weir, Donald M., Stewart. John., Imunologia básica aplicada, 8ª edição.


 Abbas, et. al., Cellular and Molecular Immunology, 2000.
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Janeiro, Guanabara Koogan
 http://www.ichworld.com/immunocytochemistry.htm