You are on page 1of 77

Aspectos moleculares que vinculan al

estrés oxidativo, la diabetes y las
malformaciones congénitas

Ing. Química Sonia Clapés Hernández
Profesora e investigadora del
Departamento de Bioquímica del
Instituto de Ciencias Médicas de la
Habana Cuba
E-mail: sclapes@infomed.sld.cu
DISTRIBUCION DE DIABETES MELLITUS EN EL MUNDO
SITUACIÓN EN CUBA
Tasa* de fallecidos por diabetes en
años seleccionados
21.3

16.5
15.1
12.5
9.9847

1973 1981 1993 2003 2 004
* tasa por cada 100000 habitantes
Cuba tiene un registro nacional
de malformaciones congénitas
(RECUMAC)
La frecuencia de defectos congénitos en el
periodo desde 1985 hasta el 2006 es del 2 %

Se han examinado al nacimiento los defectos
congénitos del 50 % de todos los recién
nacidos vivos del país desde su inicio hasta
el año 2006.
Desde el año 2003 la cobertura del registro es
de 95% de todos los nacimientos

Se diagnosticaron 12 697 recién
nacidos con defectos congénitos.
ESTADÍSTICAS* DEL REGISTRO DEL
HOSPITAL RAMÓN GONZÁLEZ CORO

2 740 nacimientos continuos en Madres con
Diabetes. 1973-2002
Gestacionales 3,4%
Pre-Gestacionales 8,7%
De 170 mujeres Con Control Previo a la
concepción----- 2,9% de malformaciones.
De 1134 Sin Control Pre-concepcional 9,3%
de Malformaciones
*Datos aportados por Dr. Lemay Valdés y colaboradores
Tasa de malformaciones en modelos
animal y humano de diabetes
comparado con embarazo no
ENTRE EL 4diabético
Y EL 12 % DE LAS
EMBARAZADAS DIABÉTICAS TIENEN HIJOS
MALFORMADOS
Lo que significa un incremento de
3-5 veces Kucera 1991,Mills 1982, Aberg
2001

3-8 veces Casson 1997, Dunnne 1999
2-3 veces Menegola 1999
Disminución de la frecuencia de defectos
congénitos en Cuba

1996..........................................1.5 %
1997..........................................1.7 %
1998-1999.................................1.1 %
2000-2006.................................1.05 %
Pero no los
defectos en
embarazadas con
diabetes
DEFECTOS CONGENITOS

EN EMBARAZADAS DIABETICAS
PRINCIPALES MALFORMACIONES ENCONTRADAS EN
DESCENDIENTES DE MADRES DIABÉTICAS

Principales:
• Defectos de cierre del tubo neural.
• Defectos cardiacos
Otros
• Defectos de reducción de extremidades.
• Apéndices preariculares
• Hidrocefalias y otras malformaciones del desarrollo
cerebral.
• Hipospadias

Anders Aberg , Lena Westbom , Bengt Kallen. Early Human Development 61 (2001)
85–95
COMPLICACIONES DE LA DIABETES
ESTADISTICAS DE RIESGO PARA PACIENTES
DIABETICOS.

Comparado con las personas
supuestamente sanas los diabéticos
padecen:

• 25 veces más de ceguera

• 20 veces más de complicaciones renales.

• 20 veces más de amputaciones de miembros
inferiores.
• De 2 a 6 veces más de riesgo coronario y daño
cerebral por isquemias.
•Riesgo de malformaciones en la descendencia entre3-
5 veces
DIABETES y Trastornos reproductivos
MALFORMACIONES EMBRIONARIAS

ALTERACIONES FETALES

ALTERACIONES PLACENTARIAS

ABORTOS ESPONTÁNEOS

MORBI/MORTALIDAD PERINATAL

ALTERACIONES EN LA PROGENIE
En los hijos de gestantes diabéticas se
han encontrado además
Disrupciones vasculares

Defectos del desarrollo fetal
Defectos del desarrollo fetal

Defectos de la migración de células
craneales de la cresta neural

Origen genético:
Alelos teratogénicos
Disrupciones vasculares

Se produce por defectos de angiogénesis :
• angiogénesis aberrante,
• insuficiente,
• excesiva.
LOS DEFECTOS INVOLUCRAN A
PRÁCTICAMENTE TODOS LOS
ÓRGANOS Y SISTEMAS, POR
LO QUE NO EXISTE UN PATRÓN
DE MALFORMACIONES
DEFINIDO

¿EXISTE UNA ÚNICA
SUSTANCIA CON ACCIÓN
TERATOGÉNICA EN LA
CIRCULACIÓN MATERNA?
La teratogenicidad de la
diabetes se vinculó por primera
vez con el estrés oxidativo en
1990 por un investigador sueco
llamado Ulf. J. Eriksson.
¿ POR QUÉ SE CONSIDERA A LA
DIABETES MELLITUS COMO UN
SÍNDROME TERATOGÉNICO?
1- Altas tasas de malformaciones en descendiente de
mujeres DPG. se han vinculado a:
• El tiempo de evolución de la diabetes antes de la concepción.
•El control metabólico previo y durante el embarazo.

2- Los efectos teratogénicos se han reproducido in vitro con
similares tasas de malformaciones
¿ Por qué se considera a la diabetes mellitus
como un síndrome teratogénico?
(continuación)
3-Tanto las embarazadas diabéticas como sus
fetos poseen bajos niveles de antioxidantes
y elevados indicadores de daño a
biomoléculas
4- El desarrollo anormal de células de la
crestal neural se previene con
antioxidantes.
¿ Por qué se considera a la diabetes mellitus
como un síndrome teratogénico?
(continuación)

5-La expresión del gen pax 3 disminuye en
embriones de ratas diabéticas.
6- Se modifica la expresión de genes
vinculados con apoptosIs como p53(+),
Akt(-) y Bax(+).
7-Las ERO - incremetadas en el estado
diabético- pueden activar factores
nucleares como el NF-kB y AP-1 de los
cuales se sabe que participan en la
proliferación celular, diferenciación y
8- malformaciones
+ Vit E
Diabéticas
preñadas

malformaciones

Diabéticas
+ Vit E
preñadas
=
+ Vit E Tasa de
malformaciones
Diabéticas Preñadas
preñadas No
diabéticas
Aspectos moleculares que
predisponen al embrión al estrés
oxidativo
• La expresión de los transportadores de
glucosa condiciona el equilibrio entre la
concentración sérica de glucosa de la
madre y la del embrión( Glut2 de alta Km
y Glut 1,3 y 8 de baja Km)
•Carencia de tejido vascular que hace
que el medio sea casi hipóxico(2-8% O2
embrión vs 20% madre)
•Baja expresión de antioxidantes
HIPERGLUCEMIA

??
Acidos Hipergluce
grasos
mia
Libres

DAÑO
MITONCONDRIA
L

ESTRÉS
OXIDATIVO

Activación de NF-
kB
Activación de NF-
kB
P38 MAPK
JNK

AGE PKC Citoquin
as

DISFUNCIÓN DE CÉLULAS RESISTENCIA A INSULINA
Beta

COMPLICACIONES DE LA DIABETES
Estrés Oxidativo

O2-´
Alteración del transporte de electrones

Incrementa la producción de superóxidos

Peroxidación de lípidos

Expresión de Caspasas

Apoptosis Disminución de la producción de ATP

Estrés oxidativo y nitrosativo en la sepsis. Med Intens 2005, Vol 29 (03); 159-65.
NF-kB un blanco primario para la
activacion por hiperglicemia.

• Un blanco intracelular es el factor NF-kB
Puede activarse por estímulos exógeno y
endogenos incluso la hiperglicemia, FFA
( ácidos grasos libres ) elevado, ROS, TNF
IL-l y otro citokinas del proinflamatorio.
Citocinas Citoplasma p50
p65 Núcleo
Ác. Grasos ox
uq p50
Lipoprot. ox IκB P p65
EROS O2 P

O2 H2O2 p50 uq
SOD P
p65 IκB P
PKa Ubiquitinización
p50 (Ligasa E3)
p50
p65 IκB P
p65 IκB P
ICAM-1, VCAM-1, E-Selectina
iNOS
IL-1, TNF, IL-6, IL-8

Factores de crecimiento Mn SOD
MCP-1
Actividad de Proteína
Quinasa C (PKC)

Factores de trascripción
(NF-kB, AP-1)
Fosforilación de residuos
de tirosina
Quinasas (MAP,ERX)
Especies Fosforilación de residuos
Reactivas Implicados de ser/thr
en
del oxígeno
Activación de ciclinas
dependientes
de AMP
Expresión de moléculas
de adhesión celular
EN CONDICIONES
Activación de proteasas
NORMALES
y endonucleasas
Síntesis y reparación de
ADN
Equilibrio
Especies Reactivas Mecanismos de
de Oxígeno defensa antioxidante

Sistema Sistema
oxidante antioxidante

Desequilibrio: Estrés oxidativo
Daño a las biomoléculas
Pérdida de funciones y Muerte Celular
Estrés oxidativo
La mayor consecuencia
del desequilibrio entre
radicales libres y
antioxidantes es la de
dañar a los ácidos
nucleicos, lípidos y
proteínas que
producirán un daño
oxidativo a la célula
Producción de radical superóxido por la cadena de transporte
electrónico mitocondrial

ATP
Sintetasa

Calor
La producción de radical superóxido en la
mitocondria es estimulada por las cuatro vías

Vía del Poliol

Vía de la hexosamina

Gliceraldehido 3P
Incremento de PKC

1,3 Difosfoglicerato Formación de AGE

LAS QUE SE HAN COMPROBADO QUE CONDUCEN A MFC EN EXPERIMENTOS
CON MODELOS DE DIABETES
En presencia de antioxidantes que
atrapen el radical como Mn SOD

Vía del Poliol

Vía de la hexosamina

Gliceraldehido 3P

Incremento de PKC

1,3 Difosfoglicerato
Formación de AGE
EFECTOS DE LA ACTIVACION DE LA VIA DEL POLIOL

ERO

Aldehídos
Aldosa Alcoholes
Tóxicos
Reductasa Inactivos
Glucosa Fructosa
Sorbitol
incremen
tada

Disminución
Glutation
Reductas
de GSH
a
La inhibición de
la PKC

INTERFIERE CON
SEÑALES QUE
PARTICIPAN EN LA
MORFOGÈNESIS
CAMBIOS EN LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA SON EVIDENCIAS
DE TRASTORNOS EN LA MORFOGÈNESIS MÀS QUE
CAUSAS DE ELLA
Implicaciones del incremento de la actividad
de la PKC inducido por la hiperglucemia

Hiperglucemia

ERO

Cambios en Expresión de
flujo Permeabilidad Oclusión vascular y genes Múltiples
sanguíneo vascular capilar proinflamatorios efectos
Ácido Araquidónico

PGE2

Principal prostaglandina en la
organogénesis que se expresa
muy tempranamente en el
embrión
CAMBIOS EN EL ESTADO DE
FOSFORILACIÓN DE
RECEPTORES en cascadas de
señales como la de la insulina
modifica las señales de los
factores de crecimiento

responsable
de la
resistencia a
la insulina
IMPLICACIONES DEL INCREMENTO DE
LA VÍA DE LA HEXOSAMINA
Glucosa 6P
Glucosamina 6P NADP
G6PDH
inhibe Act. NADPH
G6PDH 6 Fosfogluconolactona

Ribulosa 5 fosfato

GSSG Gred 2 GSH

2 NADPH 2 NADP

HSP GSH EO
INDUCE
REGULACIÓN
NEGATIVA DEL
GEN Pax 3

También conduce a glicosilación de factores de
transcripción en sitios donde se debe producir
fosforilación por lo que se transcriben genes de las
proteínas PAI-1 y TGF-β1
ALTAS
CONBCENTRACIONES DE
GLUCOSA

INHIBICION DEL GEN Pax 3

ACTIVA SEÑALES
APOPTOTICAS COMO
ACT. DEL Gen de p53
Bajo estrés Alto estrés
oxidativo

La activación de p53 provoca señales diferentes en dependencia
de los niveles de sobre expresión que se produzcan
OTRAS EVIDENCIAS
EXPERIMENTALES
PAX 3 regula el cierre de tubo neural inhibiendo
apoptosis dependiente de p53
Embriones de ratas en día de cultivo 10,5.

Izquierda cultivado en
medio con alta
concentración de glucosa,
se muestran múltiples sitios
apoptóticos
Derecha cultivo en
condiciones normales.

Inhibición del
Ensayo TUNEL para visualizar células Pax 3 conduce
apoptóticas
a apoptosis

M. R.Loeken GENES & DEVELOPMENT 16:676–680 © 2002
¿CÓMO EXPLICAR ESTOS
RESULTADOS?
Fracaso en
la reparación CONSECUENCIAS A CORTO
PLAZO

METABOLISMO
DISFUNCIÓN MUERTE Y CRECIMIENTO
FISIOLÓGICA CELULAR ANORMAL

Disminución en
la proliferación Inestabilidad Afectaciones Afectaciones
celular genómica en vías de en la expresión
señalización de proteínas y
genes

CONSECUENCIAS A LARGO PLAZO
Fracaso en
la reparación

CONSECUENCIAS A CORTO PLAZO

CONSECUENCIAS A LARGO
PLAZO

ENVEJECIMIENTO ENFERMEDAD

CÁNCER
Radiación Ionizante

Inestbilidad
Cenomica

Efecto Nuevos Arreglos
Bystand ERO Cromosomicos

Citoquina Citoquina

ROS
Efecto
Inductor de
Muerte
Apotosis
¿ESPECIES REACTIVAS DEL
OXÍGENO COMO SUSTANCIAS
CON ACCIÓN CLASTOGÉNICA?
¿CUALES SON LAS SUSTANCIAS
CONOCIDAS COMO FACTORES
CLASTOGÉNICOS?
SON PRODUCTOS DE SECRECIÓN
DE LOS ELEMENTOS CELULARES
QUE SE PRODUCEN COMO
RESULTADO DEL EFECTO DE LA
RADIACIÓN Y DAÑO CELULAR ASÍ
COMO DE LA SOBREPRODUCCIÓN
DEL RADICAL SUPERÓXIDO.
Partricipación del Estrés Oxidativo
en el desarrollo del Cancer
Especies antioxidantes
liberadas por células
inflamatorias

O2 • -
Neutrófilo
H2O2
HOCl La continua producción de

NO oxidantes en el sitio de
inflamación puede causar
ONOO -
Eosinophil •
cáncer
NO2

HO
1
O2

Macrophage
Shacter, E., and Weitzman, S.A., 2002. Oncology 16:217.
Las ERO están involucradas en la inestabilidad
genética
EN RESUMEN
ESPECIES
HIPERGLUCEMIA REACTIVAS
EN EXCESO

O2-
MUTACIONES
ACTIVACIÓN DE
DAÑO EN ADN
MITOCONDRIA FACTORES
L NUCLEARES

APOPTOSI
Modulación de la expresión
de genes como el PAX 3.
S
Este regula factores de
transcripción relacionados
con cierre del tubo neural.
DISMORFOGÉNESIS
RESULTADOS
OBJETIVOS
1. Evaluar indicadores de estrés oxidativo en
embarazadas con diabetes
2. Evaluar daño oxidativo e integridad cromosómica en
ADN nuclear

CARACTERÍSTICA DE LA
MUESTRA
Tres grupos
DE Embarazadas con diabetes
(pregestacional y Gestacional)
D Diabéticas en edad fértil
E Embarazadas sanas
TODAS LAS GESTANTES EN TERCER
TRIMESTRE
HIPÓTESIS
EL INCREMENTO EN MEDIADORES
INFLAMATORIOS Y ESPECIES REACTIVAS DEL
OXÍGENO QUE CIRCULAN DE FORMA
CONSTANTE EN LAS EMBARAZADAS CON
DIABETES PRODUCIRÁN ALTOS ÍNDICES DE
RUPTURAS CROMOSÓMICAS Y DAÑO
OXIDATIVO AL ADN
LAS EMBARAZADAS CON DIABETES TIENEN
MAYOR ÍNDICE DE DAÑO OXIDATIVO AL ADN Y
FRAGILIDAD CROMOSÓMICA
Indicadores de niveles de antioxidantes

Grupo DE D E

Media ± DS Media ± DS Media ± DS

SOD (U/ml) 15.596 ± 9.377 14.119 ± 7.574 13.210 ± 8.284

GSH 5.927 ± 3.817 5.615 ±3.066 7.035 ± 3.915 *
(nmol/100ml)

Catalasa 0.089 ± 0.056 0.209 ± 0.314 * 0.070 ± 0.080
(U/ml/min)

P<0,05
Correlación entre tiempo de evolución de la
diabetes y niveles de proteínas carboniladas

Scatterplot (Spreadsheet1 10v *142c)
Var1 = -1,5715+0,6023*x

Prot. Ox.
Var1

43,0048

23,3414

10,0851
0,7165

1 11 21 T Ev ol

Var2

r=0,71
Correlación entre los valores de GSH y el Tiempo de
Evolución de la diabetes

Scatterplot (Spreadsheet16 10v *46c)
y= 4.1459-0.1547x
GSH = 4,1459-0,1547*x
7

6

5

4
GSH

3

2

1

0

-1
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

T EVOL

r=0,47
Influencia del tiempo de evolución en los
resultados de daño a biomoléculas
Proteínas
MDA Carboniladas
Grupo DE D DE D

1.1804 0.7662 3.4615 4.1137
T Evol< 10

1.1956 1.1044 † 4.5728 * 5.0570
T Evol >10

6,00

5,00 *
4,00

3,00
T Evol< 10

2,00 † T Evol >10
1,00

0,00

MDA Prot.
Resultado del estudio citogenético

SE UTILIZÓ UNA TÉCNICA DE CONTEO DE RUPTURAS
CROMOSÓMICAS Y SE RECONOCEN QUE UN PACIENTE TIENE
FRAGILIDAD CROMOSÓMICA SI TIENE MÁS DE 6 METAFASES
CON RUPTURAS

Total Casos + % Casos - %
DEP 20 12 60.00 8 40.00

DEG 12 5 41.00 7 59.00
Total 32 17 53.12 15 46.88
CASOS CON FRAGILIDAD CROMOSÓMICA
Casos con fragilidad (Número de (ÍNDICE DE RUPTURA MAYOR DE 4) EN
rupturas mayor que 4) en cada CADA GRUPO
grupo

59.10%
55% 100%
80%
60%
40%
6.60%
20%
0%
DE DEG DEPG
DE D E D DE DEG DEP D E
DAÑO OXIDATIVO AL DNA
NIVELES DE DAÑO AL ADN EXPRESADO COMO
% DE ADN EN LA COLA
206,86
*
169,66 *
158,71

DE D E
DE Diabéticas Embarazadas
P<0.05
D Diabéticas
E Embarazadas sanas
Rupturas cromosómicas presentes en metafases de
linfocitos en cultivos provenientes de mujeres con
diabetes

CE
DF
METAFASE DE EMBARAZADA DIABÉTICA CON RUPTURAS

Las rupturas son de
tipo cromatídico
LAS RUPTURAS DEBEN HABERSE
PRODUCIDO EN LA FASE G2 DEL
CICLO CELULAR

LO CUAL ES CARACTERÍSTICO DE LAS SUSTANCIAS CON
ACIVIDAD CLASTOGÉNICA
HIPÓTESIS HA SIDO CONFIRMADA

EL ESTADO DIABÉTICO
CARACTERIZADO POR
PRODUCCIÓN CONTINUA DE ERO
INDUCE DAÑO AL ADN
El control
preconcepcional de
la embarazada con
diabetes y la
administración de
AO puede disminuir
la tasa de MFC en
diabetes
“Nunca consideres el estudio como una obligación,
sino como una oportunidad de penetrar en el bello
mundo del saber”.
Albert Einstein ( 1879 – 1705 )

Para ellos trabajamos…
porque ellos son los que
saben querer…son la
esperanza del mundo
José Martí (1853-1895)
INTEGRANTES

ICBP Victoria de Centro Nacional Hospital
Girón de Genética Ginecológico Ramón
Sonia Clapés Médica González Coro
Anay Marquetti Damarys García Lemay Valdés
Tania Castro Araceli Lantigua Osvaldo Santana
Anduriña Barrios Miriam Robaina
Magdalena Coello
MUCHAS GRACIAS