Noes bsicas de Citometria de Fluxo

O que um Citometro de Fluxo?

 um aparelho que permite analisar parmetros (celulares?)

vrios

Capta e digitaliza a disperso de fotes, provocada pela passagem de partculas em suspenso alinhadas uma a uma, num fluxo laminar, frente a um feixe de luz.

Princpio
Fazer passar as partculas em suspenso, de uma forma alinhada, por um feixe de luz A interao das partculas com o feixe gera sinais que so captados por detectores apropriados A informao produzida pode ser gerada: - Pela disperso do feixe de luz - Pela luz emitida por fluorocromos aps excitao pelo feixe de luz

CITMETRO DE FLUXO
CITMETRO DE FLUXO

SISTEMA FLUIDO

SISTEMA TICO

SISTEMA ELETRNICO

Componentes Bsicos de um Citmetro de Fluxo

Fludico Fludico
Suspenso de partculas Fluxo laminar Fonte de iluminao Captao da disperso da luz e da fluorescncia Filtrao da disperso e da fluorescncia

tica tica

Eletrnico Eletrnico

Converso do sinal em valores analgico-digitais Aquisio, Processamento, Anlise Armazenamento por computador

Fludos
Injeco da amostra no lquido de envolvimento (sheath fluid), passando por um pequeno orifcio central do fluxo (50-300 m) As partculas fluem no centro, no se misturando com o restante lquido de envolvimento A injeo da amostra em fluxo laminar e a regulao da presso so conseguidas atravs: - Presso Diferencial - Velocidade de Fluxo - Fluxo Contnuo

Cmara de Fluxo
Agulha de injeco Lquido de
envolvimento

Laser

Disperso laser

Ponto de Hidrofocagem

FILTRO DE AR GERA PRESSO AO FLUIDO ENVOLVENTE SHEATH

LOW DIFFERENTIAL PRESSURE

HIGH DIFFERENTIAL PRESSURE

Low Sample Pressure 12l/min

Laminar Flow

High Sample Pressure 60l/min

Laminar Flow

Sheath Sample

Sheath

Sheath

Sample

Sheath

tica
Fontes de iluminao:
Lmpadas de Mercrio

Lasers
Emite num comprimento de onda (ex: 488 nm- azul), monocromtico. Produz um feixe de luz coerente

SISTEMA PTICO
SISTEMA COMPOSTO POR UM LASER E LENTES PARA MOLDAR E ALINHAR O FEIXE DO LASER. A COLEO DE LENTES SERVE PARA CAPTAR A DISPERSO E A LUZ FLUORESCENTE EMITIDA PELAS PARTCULAS QUE INTERAGEM COM O FEIXE DO LASER. UM SISTEMA DE ESPELHOS PTICOS E FILTROS DIRECIONAM OS COMPRIMENTOS DE ONDAS DA LUZ PARA OS DETECTORES PTICOS ESPECFICOS.

Laser

Fotosensor de Disperso Frontal (FS)

Capta a intensidade da disperso frontal A
.

intensidade

da

disperso

frontal

proporcional ao tamanho e forma das partculas

Laser
Sensor de FS

Fotosensor de Disperso Lateral (SS)

Capta a intensidade e luz dispersa a 90o A intensidade dessa disperso proporcional ao tamanho, granularidade e forma das partculas
Laser
Sensor de FS

Sensor SS 900

O que a Fluorescncia?

Laser

Intensidade de Fluorescncia
Emitted Fluorescence Intensity
FITC

Binding Sites
FITC FITC FITC FITC FITC

FITC FITC FITC FITC

Numero de eventos

Intensidade de Fluorescncia

Disperso da Fluorescncia
A fluorescncia emitida detectada por fotosensores que recebem o comprimento de onda seleccionado A especificidade da deteco de cada sensor controlada pela seleco do comprimento de onda, atravs de uma conjugao de filtros e de espelhos.
Laser
Sensor de FS

Detectores de Fluorescncia (PMT1, PMT4 etc.)

Filtros pticos coletar sinais de luz

Espelhos LP (longpass) = todo comprimento de onda maior que seu nmero deixado passar e menor que seu nmero refletido. Espelhos SP (shortpass) = todo comprimento de onda abaixo de seu nmero deixado passar e acima de seu nmero refletido. Espelhos BP (bandpass) = s deixa passar o comprimento de onda especfico. Longpass
460 500 540

Shortpass
460 500 540 460

Bandpass
500 540

Filtro
LP 500 SP 500 BP500/30

Detector clula fotoeltrica

Filtro ou Espelho Dicrnico Colocado a 45o

Fonte de Luz

Luz Transmitida

Luz Refletida

Captao dos Parmetros

PMT
4

Cmara de Fluxo

Filtros Dicricos
PMT
2 PMT 1

PMT
3

Filtros Bandpass

Fotosensores

Laser

Eletrnica
Processamento electrnico do sinal gerado nos sensores que traduzido num histograma ou scatter plot

SISTEMA ELETRNICO
A medida proveniente de cada detector denominada Parmetro Parmetro 1 Parmetro 2 Parmetro 3 Parmetro 4 Parmetro 5 FSC SSC FL1 FL2 FL3

FLUORESCNCIAS
O detector de FL-1 (Fluorescncia 1) capta luz de comprimento de onda 530 nm, que corresponde luz verde. O detector de FL-2 (Fluorescncia 2) capta luz de comprimento de onda 570 nm, o que corresponde luz laranja. O detector de FL-3 (Fluorescncia 3) capta luz de comprimento de onda 650 nm, o que corresponde luz vermelha.

DISPERSO
BLASTOS

VOLUME (FS)

POLIMORFONUCLEARES MONCITOS

LINFCITOS DEBRIS/HEMCIAS/PLAQUETAS
GRANULARIDADE (SS)

O que pode ento dizer um citmetro de fluxo de uma clula? Tamanho (FSC) Complexidade (SSC) Fluorescncia relativa. (FL1, FL2, FL3, Complexidade Antgenos celulares Tamanho Metabolismos Enzimas Receptores ADN Citoquinas

nfection of microvascular endothelial cells with ExoU-producing Control PA103 PA103DexoU udomonas aeruginosa triggers the release of von Willebrand fac and platelet adhesion

Controle

PA103

PA103exo U

Superfcie

Intracelular

Citometria de Fluxo Citometria de Fluxo

Contr ol

PA1 03

PA103ex oU

Agregao plaquetria