Cultivo de células animales

María Isabel Correa Estrada Alejandra Muñoz Rendón

PARA EL DESARROLLO DE UNA SUSTANCIA NUEVA CON ACTIVIDAD BIOLOGICA
1. 2. 3. 4. 5. 6.

Ingeniería genética Selección de la línea celular y del clon Definición y optimización del medio de cultivo Caracterización de las células Determinación de las estrategias óptimas de cultivo Evaluación de la calidad y actividad del producto obtenido.
Cultivo de células animales

• Siglo XIX → Estudio del comportamiento de células animales. • Actualmente → Cultivos en laboratorios, de células procedentes de una amplia gama de tejidos y organismos diferentes. • Condiciones de crecimiento → Temperatura, mezcla de gases y pH. • Medio de cultivo → Factores de crecimiento, indicadores de pH, antibióticos y antimicóticos.

Cultivo de células animales

Aplicaciones Ingeniería de tejidos y órganos Terapia génica Biofarmacología Medicina Toxicología y fisiología in vitro Nanobiotecnología Dispositivos bioelectromecánicos Cultivo de células animales .

Equipos. Uso de suplementos y medios de cultivo costosos.Ventajas Producción de proteínas altamente similares a las humanas. Incalculable impacto en el incremento de la calidad de vida y salud humana. Mercado de más de diez mil millones de dólares anuales. Procesamientos complejos. Bajas productividades. Cultivo de células animales . instalaciones y bioprocesos son sofisticados y costosos. como la glicosilación. Bajas velocidades de crecimiento → Largos tiempos de cultivo. Desventajas Potencial presencia de virus endógenos. Fragilidad de las células.

Procedencia del cultivo Tejidos Epitelial Conectivo Muscular Nervioso Fluidos y otros Sistema hematopoyético Médula ósea Tejido linfoide Crecen adheridas a una superficie y formando monocapa Crecen suspendidas en forma esférica Cultivo de células animales .

Clasificación del cultivo celular Cultivo de células animales .

Tipos de cultivos celulares Cultivo de células animales .

http://www.com/es_productos _escaparate.asp Líneas celulares en la biofarmacología .innoprot.

Aplicaciones industriales Principales líneas celulares:  Ovario de Hámster Chino (CHO)  Mieloma de ratón SP2/0  Mieloma de ratón NS0 Usadas para producir 11 de los 21 productos aprobados por la FDA (Food and Drug Administration) entre los años 1996 y 2000 Cultivo de células animales .

smbb.com.Vacunas y tejidos para transplantes Proteínas o anticuerpos recombinantes http://www.mx/anuncios /applikon/applikon.html Aplicaciones industriales Cultivo de células animales .

 Acumulación de productos residuales: • Sistemas en perfusión • Expresión de la glutamina sintetasa (Celltech).Aplicaciones industriales  Daño debido a la agitación y aireación: • Diseño y control de los biorreactores • Pluronic F68. .

Calidad de productos  Activador tisular t-PA: • Rata de crecimiento • Estado de las células  mAB humano. Synagis®: • Tiempo de cultivo • Fed-Batch • Medio libre de suero Cultivo de células animales .

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Cultivo de células animales .

Cultivo de células animales .

Biorreactores y tipos de operación utilizados Cultivo de células animales .

Cultivo de células adherentes     Botella cilíndrica Sistemas de platos apilados Microportadores suspendidos en tanques agitados No tradicionales: Biorreactor de columna de burbujeo. reactor de lecho empacado en perfusión Usadas en campo especializados: • Producción de eritropoyetina • Terapia génica • Producción de vacunas Cultivo de células animales . Reactor de membrana de diálisis.

Cultivo de células adherentes  Microportadores suspendidos en tanques agitados: • • • • • • • Escalas por encima de 10000 L Optimización más eficiente Flexibilidad en el diseño de la alimentación Perfusión Filtros Spin Concentración para aumentar el área superficial Diseño del agitador para altas cantidades de microportadores. Cultivo de células animales .

Células adherentes • Microaireación con O2 puro previene el daño por gaseado excesivo → Acumulación de CO2 • Es muy necesario el uso de sueros y proteínas en el medio de cultivo → Mayor probabilidad de contaminación Cultivo de células animales .

Cultivo de células animales . etc.Aplicaciones industriales Producción de proteínas y anticuerpos:  Suspensiones en tanques agitados con alimentación controlada (Fed-Batch. Perfusión. Cultivos a gran escala: o o o o o Maximizar la productividad Mantener la calidad del producto Remover componentes no deseados en el cultivo Minimizar la contaminación Controlar la remoción de CO2.).

ESCALADO Cultivo de células animales .

Rata de transferencia de masa Agitación Sensibilidad a los esfuerzos cortantes Balance Cultivo de células animales .

Criterios de selección de un sistema de cultivo celular   Operación estéril Agitación sin causar daño las células sensibles   Facilidad del escalado Posibilidad de automatización y control del proceso  Suficiente transferencia  Compatibilidad con los de gas (O2 y CO2) procesos aguas arriba y aguas abajo Cultivo de células animales .

Modos de operación reportados • Batch o Fed-Batch STRs 8-10 m3 15 m3 • Continuos en perfusión Más común para producción de proteína. Cultivo de células animales .

Escala Utilizada Reactor Utilizado Productividad de la línea celular Cantidad de producto requerida Cultivo de células animales .

• Ofrece ventajas competitivas. VARIACIONES EN LAS PRODUCCIONES REQUERIDAS Cultivo de células animales .PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS (kg/año) ANTICUERPOS MONOCLONALES EL ESCALADO EXITOSO: • Cortos períodos de tiempo. • Ahorra en costos de producción.

AGITACIÓN Cultivo de células animales .

Número de Bodenstein (Bo): • Número de Peclet (Pe)  Indicador de o Mezcla en distintas regiones del reactor o Índice de mezcla longitudinal También usado para caracterizar la agitación o mezcla   Pe = vD/ D1 D: Diámetro del tanque • Bo= Lv/ D1 • L: Longitud característica • v: velocidad media • D1 : Difusividad axial USADOS EN STR’s Y EN AIRLIFTS Cultivo de células animales .

Gradientes de pH Dispersión de los nutrientes FACTORES CRÍTICOS EN EL CULTIVO Productos de desecho Aireación Cultivo de células animales .

TRANSFERENCIA DE MASA Cultivo de células animales .

Nutrientes Productos tóxicos Gases • Micro • Macro • Lactato • Amonio • O2 • CO2 Cultivo de células animales .

Requerimientos de O2  Dependientes de la línea celular Líneas celulares comerciales comunes: 2.5 (mmol/L* h) Para 106 cel/mL 0.5 mg/108 cel*h Células humanas: 0.05 (mmol/L* h) 0.1 mg/108 cel*h Cultivo de células animales .

Transferencia de gas La mayoría de las correlaciones realizadas para obtener kLa no son apropiadas para los cultivos de células animales Cultivo de células animales .

• • • Membranas permeables al gas Esparcimiento directo de aire u oxígeno Esparcimiento de oxígeno puro usando dispositivos especiales • Generación in situ de oxígeno usando: Peróxido de hidrógeno Peroxidasas Métodos de aireación Cultivo de células animales .

Enfoque: Diseño de inyectores de gas Disolución completa de las burbujas antes de que alcancen la superficie Transferir gas sin producir burbujas Membranas permeables Tubos vibratorios de silicona Cultivo de células animales .

(1992) midieron las ratas de transferencia de oxígeno en bioreactores aireados de células animales. como función del diámetro de burbuja.Burbujas • Zhang et al. • Los diámetros de burbuja estudiados fueron: ◦ 5 mm ◦ 1 mm ◦ 100 μm • La transferencia aumenta a medida que el diámetro de la burbuja disminuye Cultivo de células animales .

 Regímenes de formación de las burbujas 1. Formación de burbujas separadas. 2. 3.Burbujas  En las células animales los diámetros de burbuja estarán casi siembre entre 4–6 mm. Burbujeo en cadena Régimen jet ((Re) >2000) 4. Régimen turbulento 1.Burbujas separadas 2.Burbujeo en cadena Cultivo de células animales .

Transferencia del CO2   Producto del metabolismo Su transferencia de la solución a las burbujas de gas células animales Aumentos en CO2 Aumentos en HCO3Disminución en el pH Crítica para las .

ESFUERZOS CORTANTES Cultivo de células animales .

Posibles causas del daño celular 1 2 • Colisiones directas de las células con los aspersores y/o baffles • Diferencias de presión entre la parte frontal y tracera de los impulsores • Turbulencia mediada por las diferencias en las longitudes del vector del campo del flujo no laminar • Microeddies con diámetro menos al diámetro celular 3 4 .

Interacciones célula-burbuja  Regiones principales donde puede ocurrir el daño: 1. Región de generación de la burbuja (Incluyendo la región donde el aspersor induce incorporación y rompimiento) 2. Región de rompimiento de la burbuja  Depende también de la línea celular y su resistencia a la deformación. Cultivo de células animales . Región de ascensión de la burbuja 3.

(1992) Cultivo de células animales .Tramper et al (1987) En columnas de burbujeo Jobses et al (1991) Muerte celular por contacto con las burbujas Kioukia et al.

Cultivo de células animales  . Si las células están expuestas a un ambiente altamente inhibitorio más sensibles.Efectos del esfuerzo cortante según la etapa de crecimiento  Estado de crecimiento del inóculo ◦ Mayor fragilidad ◦ Mayor resistencia Fases: lag y estacionaria Fase exponencial  Si la línea celular se desarrolló desde la fase de laboratorio en cultivos bien agitados Menos sensible.

Temperatura del fluido Concentración celular Otros factores Características de las superficies contenedoras Historia de estrés y deformación de la muestra .

Concluyendo… 1. La aireación que combinada posibles dejan un con la agitación 3. Homogenización Transferencia de masa Formación de producto Suspensión de las células 2. tiene efectos rango La muerte celular en suspensiones nocivos aumenta remolinos a de medida que los se limitado de velocidades de agitación disponibles. En STR’s la muerte celular ocurre ◦ principalmente las burbujas por el estallido de 5. Kolmogorov aproximan al tamaño de las células Cultivo de células animales . Muchas suspensiones celulares 4. Los esfuerzos mecánicos afectan también: ◦ ◦ ◦ (hibridomas) no son tan sensibles a los esfuerzos cortantes como se pensaba.

PRESIÓN Cultivo de células animales .

La presión afecta:
   

Solubilidades del O2 y CO2 El tamaño de las burbujas La viabilidad y fisiología celulares Pocos estudios… Takagi et al. (1995):
◦ Efectos de variaciones de 0.1 a 0.9 MPa.
◦ Cambios en las ratas de conversión
 Glucosa a lactato

 Consumo de glutamina

◦ Aumento del 20% en la rata específica de producción de anticuerpos monoclonales, con el incremento de presión.

CRITERIOS PARA ESCALADO ASCENDENTE
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Criterios
    

Dimensiones del reactor. kLa. Tasa de deformación (valor máximo). P/V (muy usado en cultivos microbianos). Flujo volumétrico de gas por unidad de volumen de líquido. Velocidad superficial de gas. Tiempo de mezcla (no muy usado). Velocidad en la punta del impulsor (para STR’s).
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  

ESCALADO DESCENDENTE Cultivo de células animales .

 Lo más importante es encontrar en la pequeña escala las mismas constantes cinéticas del proceso realizado en la escala original.¿ Para qué se usa ?    Entender fenómenos vistos Mejoramiento de procesos La similitud geométrica no es un parámetro necesariamente importante. Cultivo de células animales .  Optimización de los procesos.

TIPOS DE REACTORES Cultivo de células animales .

A PEQUEÑA ESCALA   Biorreactores desechables Hexascreen mini biorreactores Cultivo de células animales .

Biorreactores desechables 1. Puertos para adición de medio de cultivo y otros componentes 4. Puerto para drenado 10. Sello de cojinete para el agitador 5. Puerto de sobrepresión de gases de salida 3.Sistema de aireación Cultivo de células animales . Puerto de muestreo 9. Puertos para la integración de electrodos de pH y oxígeno disuelto estándar de 1/2 pulgada 7. Puerto para el sensor de temperatura 8. Impulsor de polietileno moldeado ensamblado por una tubería que da la forma al agitador 6. Filtro de venteo 2.

Los parámetros de cultivo son controlados por sistemas adicionales convencionales. Cultivo de células animales . Unidad de control de temperatura y Mezclado únicamente. Contenedor de acero inoxidable 304 2. Plataforma 5.Biorreactores desechables 1. Motor 3. Chaqueta de calentamiento 4.

xcellerx.com www.Biorreactores desechables www. Cultivo de células animales .startorious-ste Diagrama de los perfiles de flujo de un Wave Bioreactor.com www.hyclone.

Biorreactores desechables Fabricantes:           Thermofisher Xcellerx Startorius-stedim GE healthcare Applikon Amprotein Cellexus Biosystems Atmi-lifescience Pall Co Upfront Chromtography Cultivo de células animales .

oxígeno disuelto y pH.Hexascreen mini Biorreactores • Volúmenes entre 10 y 15 mL • Seis experimentos en paralelo y monitoreo en línea • Sistema adecuado tanto para cultivos en suspensión como adherentes • Información cinética en tiempo real del crecimiento celular y la actividad metabólica: concentración de células (OD). Cultivo de células animales .

A GRAN ESCALA  Tanques agitados (STR’s)   Fermentadores air-lift Columnas de burbujeo    Reactores de lecho empacado Reactores de lecho fluidizado Reactores de membrana Cultivo de células animales .

o Se operaban en modo Fed-Batch y luego se impuso el cultivo en perfusión.En general… • Se prefieren los sistemas de suspensión a los de inmovilización. • Sistemas de Inmovilización: o Fibra hueca o Lechos de vidrio o Microportadores • Los últimos pueden presentar problemas • Heterogeneidad en el pH y la TOD Cultivo de células animales .

 Geometría del impulsor (Di. Hi)  Relación (Di/Dt)  Detalles del aspersor  Tasas de flujo gaseoso  Ubicación de alimentaciones  Alcális  Puntos de muestreo  Diseño de la base del tanque  Sondas de pH y OD  Diseño del eje del impulsor (Motores y sellos)  Bafles  Control de la Temperatura  Relación de aspecto Cultivo de células animales .Tanques Agitados Consideraciones del Diseño:  Velocidad del Impulsor.

◦ Grandes impulsores agitando lentamente.  Elección de impulsor: Altos números de flujo (Fl) y bajos números de potencia (Np).  Impulsores de turbina: Dañinos para muchas líneas celulares  Propela marina: Se ha utilizado ampliamente   Relación de aspecto: Se prefieren altas. ◦ Presión hidrostática en el tanque. Cultivo de células animales . Alturas muy grandes pueden afectar: ◦ Control y monitoreo de pH.Tanques Agitados  Hidrodinámica: La dispersión del gas debe encontrarse generalmente en el régimen de inundación.

Reactores Airlift: Consideraciones del Diseño  Relación de aspecto  Detalles del aspersor  Flujo gaseoso  Posición de alimentaciones  Alkali  Puntos de muestreo  Sondas para pH y OD  Diseño de la base del tanque  Control de la temperatura Cultivo de células animales .

TANQUE AGITADO  AIRLIFT  Similitud geométrica Similitud geométrica  Esfuerzos cortantes constantes (Velocidad en la punta del   Kla Velocidad superficial del gas impulsor)    Rata de flujo de gas por unidad de volumen Tiempo de mezcla Kla QG / V  ESCALADO Cultivo de células animales .

Cultivo de células animales . • Ratas de flujo de gas similares. • Mayor flexibilidad en la perfusión.Comparación entre los sistemas • Relación de aspecto más favorable para el adecuado mezclado en el caso de tanques agitados. particularmente respecto al uso de filtros.

se ha probado: • Adición de agentes osmoprotectores • Adición de glutamina • Adición de butirato de sodio Cultivo de células animales . condiciones del proceso y remoción de compuestos.Mecanismos para incrementar la productividad Además de cambios en el diseño del reactor.

Retos Estrés hidrodinámico Apoptosis Productividad • Agitación • Aireación • Sulfactantes Plurónicos • Disponibilidad de oxígeno y nutrientes • Elevación de T • Disminución de pH • Cantidad • Calidad • Remoción de compuestos no deseados • Contaminación Cultivo de células animales .

y Meneses A (2009) Alcances y perspectivas del cultivo de células animales en la biotecnología farmacéutica. A.A. Valdez N. pp. (2007) Superando los retos de células animales a través de la bioingeniería. A. 385399. Vol..K.. Biotecnología. 12. Vol. Dávila I.. Estrada S. Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas. Ortega A. 180-187 Cultivo de células animales . 35-46. (2001) Industrial choices for protein production by large-scale cell culture. pp. y Ramírez O.T. 40. Núm. and Robinson D. pp. Biochemical engineering.Bibliografía • Palomares L. • Chu L. Vol.. 4. • Tavira C. 14.

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