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Purificación de Proteínas

Dado que una célula contiene miles de proteínas distintas, la tarea de separarlas y determinar su estructura es en extremo difícil. Hay muchas técnicas para purificar y caracterizar proteínas que van desde estrategias para determinar características físicas hasta descubrir el número y el tipo de aminoácidos constituyentes y determinar su secuencia completa.

Una proteína se puede identificar por cromatografía según su carga y polaridad. La cadena entera se puede degradar por escisión específica con enzimas para obtener fragmentos de péptidos relacionados. Luego cada péptido se puede degradar aminoácido por aminoácido para descubrir su secuencia.

En el paso final de la determinación de la estructura, la proteína intacta se somete a un análisis por difracción por rayos X para determinar su conformación tridimensional. Sin embargo, antes es necesario purificar la proteína empleando técnicas como cromatografía de columna y electroforesis, y luego cristalización.

Aislamiento de Proteínas de células.

se somete a centrifugación diferencial. es preciso extraer las proteínas de las células y organelos subcelulares. Al primer paso se le denomina homogeneización e implica la ruptura de las células. Una vez homogeneizadas las células. Después de solubilizada la proteína se somete a un primer paso de purificación basado en la solubilidad.    Antes de purificar. .

PURIFICACION DE PROTEINAS .

 Se aplican muchas técnicas para eliminar contaminantes y lograr una muestra pura de la proteína de interés.  . Al seguirse los pasos de purificación. se elabora una tabla de recuperación y pureza de la proteína para juzgar el éxito de cada etapa.

de forma que se obtendrán proteínas relativamente puras (ver la siguiente figura).   Uno de los primeros pasos para iniciar el fraccionamiento proteico consiste en agregar una sal iónica a la mezcla en cuestión (salting out). . Se puede comenzar adicionando cantidades cada vez mayores de la sal y separando cuidadosamente las proteínas que vayan precipitando.Purificación por salting-out.

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Lo que se hace es preparar varias soluciones de pH ´s diferentes y colocar en ellos la mezcla de proteínas para que aquella cuyo pI sea el mismo que el pH del amortiguador. y es muy útil cuando se pretende purificar proteínas provenientes de una mezcla.Purificación por pH   El valor de pH en el cual una proteína tiene su mínima solubilidad se llama punto isoeléctrico. precipite allí. .

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Tabla de purificación de proteínas  Los primeros pasos de purificación de una proteína que se encuentre formando parte de una mezcla comienzan casi siempre con salting-out. Para calcular la actividad específica hay que hacer la siguiente operación: Actividad = Actividad total Específica total de proteína   . que es el de preparar el homogeneizado crudo para los procedimientos más eficaces y finos que siguen.   En la tabla siguiente hay que observar que tanto el volumen como la cantidad total de proteína disminuyen (¿por qué?) mientras que la actividad específica (en el caso de las enzimas) se incrementa (¿por qué?). pues esta técnica cumple muy bien su objetivo.

Extracto crudo Precipitado salino Cromatografía por intercambio iónico Cromatografía por criba molecular Cromatografía por inmunoafinidad 3800 165 65 40 6 22 800 2 800 100 14.TABLA . específica recuperación.1 Ejemplo de esquema para purificación de proteínas: Purificación de la enzima xantina deshidrogenasa de un hongo. Fracción Volumen (ml) Total de proteína (mg) Actividad Actividad Porcentaje de total.8 2 460 1 190 720 555 275 0.108 100 48 29 23 11 .425 7.2 38.108 0.3 152.5 1.

 . Esta cifra suele ir bajando durante la purificación. El grado de purificación compara la pureza de la proteína en cada paso y este valor debe ir en ascenso si la purificación tiene éxito. El porcentaje de recuperación indica cuánto de la proteína de interés se ha conservado en cada paso.

CROMATOGRAFIA EN PAPEL .

CROMATOGRAFÍA BIDIMENSIONAL .

    Croma = color Grafein = escribir Esta técnica se comienza a utilizar en el siglo XX para separar pigmentos vegetales cuyos colores se distinguían con facilidad Se basa en la distribución de compuestos en distinto grado entre diferentes fases (fase móvil y fase estacionaria) .

gel de sílice o alúmina dentro de la columna. Como fase estacionaria se usa. La elección del disolvente es crucial para una buena separación. generalmente. CROMATOGRAFIA DE COLUMNA .   Se emplea para la separación de mezclas o purificación de sustancias a escala preparativa.

.  Se introduce la muestra por la parte superior de la columna y se eluye con el disolvente elegido. para evitar que la sílica o la alúmina se salgan de la columna. recogiéndose por lo general en tubos de ensayo La columna se prepara mezclando el soporte con disolvente y se rellena la columna poniendo en el fondo de ésta un poco de algodón.

CROMATOGRAFIA DE COLUMNA .

Tipos de cromatografía de columna    Cromatografía de afinidad Cromatografía de exclusión molecular Cromatografía de intercambio iónico .

Cromatografía de afinidad    La cromatografía de afinidad permite la separación de mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unión a un determinado ligando. . Las proteínas que se retienen en la columna son aquellas que se unen covalentemente a la matriz de la columna. La proteína de interés que ha quedado retenida en la columna se eluye (se libera) mediante el empleo de una solución que rompa la interacción entre el ligando y la proteína.

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La matriz de la columna esta formada por un polímero entrecruzado con poros de tamaños determinados. . Las proteínas de menor tamaño. entran en los poros y su marcha a lo largo de la columna se hace más lenta.Cromatografía de exclusión molecular o cromatografía en gel     Separa a las proteínas en función de su tamaño. Las proteínas de mayor tamaño migran a lo largo de la columna más deprisa que las de pequeño tamaño.

Filtración en Gel .

en la cual se observa que. pues se refiere a Ve/Vo) .  En este tipo de cromatografía se coloca la muestra dentro de la columna empacada con perlas de agarosa.  Los resultados obtenidos se ilustran en la siguiente figura. Las proteínas grandes pasan de largo. más rápido saldrá de la columna (cuidado al interpretar el eje vertical o de las ordenadas. mientras que las pequeñas entran en los pequeños poros de las perlas y se quedan allí un rato. mientras más grande sea la proteína. eluyendo después de las grandes.

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se hace necesaria otra técnica que sea capaz de separar a las proteínas en base a su tamaño.Diálisis  Las proteínas se pueden separar en base a su tamaño y solubilidad a ciertos pH´s. son muy cercanos. pero cuando estos últimos. como pI´s. y esta es la diálisis. .

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forma y tamaño. hacia un electrodo con carga opuesta.Electroforesis.  Se basa en el movimiento de partículas cargadas en un campo eléctrico. La movilidad de estas macromoléculas depende de su carga.  .

Medios de soporte para Electroforesis. No obstante. pueden emplearse medios de soporte como papel y líquidos.  El soporte más común es un polímero de agarosa o acrilamida.  . similar a los empleados en la cromatografía de columna.

a un voltaje controlado. Cada banda que se observa en el gel es una proteína distinta. 1. . Una vez que las proteínas se han separado en el gel (agarosa). que puede ser papel o gel. 4. para lograr la separación deseada.Forma en la que se lleva a cabo la Electroforesis. medio de soporte. Se hace pasar una corriente eléctrica por el medio. Se aplica una muestra con carga eléctrica en el 2. 3. éste se tiñe para revelar la ubicación de las proteínas.

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. la muestra de proteínas se trata con el detergente dodecil sulfato de sodio (SDS). rompiendo todas las interacciones no covalentes que determinan su estructura terciaria y cuaternaria. antes de aplicarse en el gel.   En una variación de la electroforesis en gel de poliacrilamida. cuya estructura es CH3 (CH2)10 CH2OSO3Na. El SDS. desnaturaliza por completo a las proteínas .

Las proteínas pequeñas avanzan con más rapidez que las grandes.Ventajas de la electroforesis en gel de SDS.poliacrilamida (SDSPAGE)   La acrilamida ofrece más resistencia a las moléculas grandes que a las pequeñas. .

Para casi todas las proteínas .  Este tipo de electroforesis puede servir para estimar el peso molecular de las proteínas comparando las muestra con muestras estándar. el logaritmo del peso molecular tiene una relación lineal con su movilidad en SDSPAGE. .

se prepara el gel con un gradiente de pH. En un experimento de enfoque isoeléctrico.El enfoque isoeléctrico o isoelectroenfoque    Este es otra variación de la electroforesis en gel. también tienen distinto punto isoeléctrico. . Dado que las distintas proteínas tienen diferentes grupos titulables.

.  Conforme las proteínas migran a través del gel bajo la influencia del campo eléctrico. encuentran regiones de distinto pH que hacen que cambie la carga de la proteína. Después cada proteína llega a un punto en el que no tiene carga neta (su punto isoeléctrico) y deja de avanzar.

Centrifugación en gradiente de concentración .

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Puede revelar la posición tridimensional exacta de la mayor parte de los átomos de una molécula proteica.  .  Conocimiento de la estructura y función de las proteínas.CRISTALOGRAFÍA POR RAYOS X.

Aspectos básicos  Se requieren cristales puros de la proteína que interesa estudiar. obtenidos generalmente por añadir sulfato de amonio u otra sal concentrada a la disolución proteica para disminuir su solubilidad. Una adición lenta de sal favorece la formación de cristales ordenados en vez de precipitados amorfos. .

. Figura: un cristal de proteína.

.     Hay tres componentes requeridos en un experimento cristalográfico por rayos X : La fuente de rayos X . Un cristal de proteína.Análisis con rayos X. Un detector .

de manera que el ennegrecimiento de la emulsión es proporcional a la intensidad del haz de rayos X dispersado. Parte de este haz atraviesa el cristal sin ningún cambio de dirección. Un haz estrecho de rayos X se hace incidir en el cristal proteico. Los haces dispersos (o difractados) pueden ser detectados mediante película fotográfica.54 A.   Al acelerar los electrones contra una pieza de cobre. El resto se dispersa en una serie de direcciones diferentes. . se produce un haz de rayos X de longitud de onda de 1.

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  El cristal de la proteína se monta en un capilar y se sitúa en una orientación precisa con respecto al haz de rayos X y a la película sensible. . Un movimiento de precesión del cristal suministra una fotografía de rayos X en la que existe una disposición regular de manchas.

El paso siguiente consiste en reconstruir la imagen de la proteína a partir de las intensidades de las manchas. Los puntos más próximos a la periferia de la fotografía contienen información de los lados de las moléculas más próximos en el espacio dentro del cristal.    Se miden las intensidades de cada una de las manchas y estos son los datos experimentales básicos de un análisis cristalográfico de rayos X. . La resolución obtenida mediante difracción de rayos X depende del número de puntos analizados.

Patrón de difracción de rayos X .

48 ..97O3/0/17..O3/07.!.