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Tcnicas Inmunolgicas

1. Interacciones antgeno-anticuerpo
REACCIONES DE PRECIPITACIN: Inmunodifusin radial REACCIONES DE AGLUTINACIN: Hemaglutinacin REACCIONES DE INMUNOFLUORESCENCIA: Citometra de flujo ELISA

2. Tcnicas radio inmunomtricas PRIST RAST 3. Tcnicas de tipificacin de antgenos histocompatibilidad Tcnicas serolgicas: MICROLINFOCITOTOXICIDAD/CROSS MATCH Tcnicas moleculares 4. Pruebas de funcionalidad de los fagocitos - ENSAYO DEL NITROBLUE TETRAZOLIUM 5. CROSS MATCH

de

Reacciones de precipitacin

INMUNODIFUSION RADIAL

Reacciones de aglutinacin

HEMAGLUTINACION

CONCEPTO DE TTULO: Es la inversa de la mxima dilucin de suero que produce aglutinacin visible.

HEMAGLUTINACION

INMUNOFLUORESCENCIA

CITOMETRIA DE FLUJO

Citmetro de flujo
Es el aparato que es capaz de medir componentes y propiedades de clulas y organelas celulares (partculas biolgicas) que fluyen en una suspensin celular.

Son muchos los parmetros que pueden medirse:

Muestras y procesamiento
Se puede utilizar sangre perifrica, mdula sea, u otros fluidos biolgicos. La muestra a analizar debe encontrarse en forma de suspensin monodispersa. Algunas muestras requerirn cierto procesamiento (disgregacin mecnica, enzimtica, etc.)

Fundamento
Clulas marcadas con anticuerpos fluorescentes rojos y verdes.

Corriente de flujo con clulas pasando de a una.

FM para fluorescencia verde

FM para fluorescencia roja

FM para granularidad

COMPUTADORA QUE ANALIZA LOS DATOS

FM para tamao

Anlisis y presentacin de los datos

Los datos de tamao celular, granularidad y fluorescencia son analizados mediante un SOFTWARE ESPECFICO y se presentan cmo grficos

Ejemplo 1: Grfico Dot Plot tamao vs granularidad


LEUCOCITOS DE SANGRE PERIFERICA

GRANULARIDAD (SSC)

Neutrfilos

Monocitos

Linfocitos TAMAO CELULAR (FSC)

Ejemplo 2: Histograma de fluorescencia


Clulas no marcadas (control de isotipo) Clulas CD 18 positivas

Nmero de clulas

CD 18 FITC FLUORESCENCIA VERDE (FL1)

Ejemplo 3: Grfico Dot Plot de fluorescencia verde (FL1) versus fluorescencia roja
LINFOCITOS T CD 4 + Y CD 8 + DE SANGRE PERIFERICA EN UN PACIENTE CON LEUCEMIA DE CELULAS B

CD8- PE

CD4- FITC

PRIST- RAST

PRIST (Paper disk Radio Inmuno Sorbent Test)


Mide los niveles de IgE en suero

RAST (disk Radio Allergo Sorbent Test)


IgE especfica para un alrgeno en particular
Agregado del suero del paciente Agregado del anticuerpo anti IgE marcado

Agregado del suero del paciente

Agregado del anticuerpo anti IgE marcado

YY

YY

YY

Lectura de radioactividad

ELISA

ELISA DIRECTO (deteccin de antgeno)

ELISA INDIRECTO (deteccin de anticuerpos)

Tcnicas de TIPIFICACIN de antgenos de histocompatibilidad

Tcnicas serolgicas
Microlinfocitotoxicidad:

Tcnicas moleculares:
(basadas en el empleo de ADN de sangre o tejidos)
PCR con cebadores especficos de secuencia (SSP). PCR que tiene resolucin igual o mayor que las tcnicas serolgicas pero un costo significativamente bA ms bajo. Es adecuada para la tipificacin de donantes cadavricos para el JA caso de trasplantes de rganos slidos pero no para la tipificacin de donantes de mdula sea no relacionados. Tambin presenta ambigedades. PCR con cebadores especficos de locus e hibridacin con sondas especficas de alelos marcadas (SSOP). Tcnica basada en una primera PCR para amplificar cada loci del HLA y luego una hibridacin con sondas marcadas especficas para cada alelo. Posee alta resolucin, es posible AL detectar homocigosis y es adecuada para la tipificacin de donantes TA cadavricos. La interpretacin es compleja debido a la reactividad cruzada entre sondas y a que la deteccin de determinadas combinaciones de alelos producen patrones similares. Secuenciacin directa (SBT). Tcnica de mxima resolucin, ideal para la deteccin de homocigosis y para la tipificacin de donantes cadavricos La AL interpretacin es automatizada pero es una tcnica muy costosa que requiere TA de un secuenciador automtico de ADN). Otras: RFLP, SSCP, Luminex.

Ensayo de funcionalidad de los fagocitos

ENSAYO DEL NBT

CROSS MATCH
Determinacin de anticuerpos especficos contra alelos del HLA en suero de pacientes en lista de espera.

6 8 2 6

CROSS MATCH
CONTRA DADOR: (pre transplante) Analiza la presencia de anticuerpos especficos contra HLA de un posible donante.
Clulas del donante

CONTRA PANEL: Analiza la presencia de anticuerpos contra diferentes alelos HLA de un posible donante. Enfrenta el suero del paciente con clulas de donantes no relacionados. El nmero de personas contra quienes reacciona el suero indica el grado de sensibilizacin del receptor. Permite cuantificar el riesgo de rechazo hiperagudo.

Suero del receptor