Escola Superior Agrária de Viseu Reprodução Animal

Transferência de embriões Estado da Arte

2º SEMESTRE

13 - 06 - 08

1. Introdução
TE é uma biotécnica que permite a recolha de embriões, seleccionando os de elevada qualidade genética e maior resistência ás doenças Os embriões de uma fêmea doadora são transferidos para fêmeas receptoras as quais levarão a gestação a termo. O objectivo desta técnica em bovinos é a amplificação das taxas reprodutivas de fêmeas valiosas.

2. História
Não é uma tecnologia recente, sendo a primeira transferência de embriões de bovinos relatado em 1949 (Umbaugh, 1949). E o primeiro bezerro de transferência de embriões em 1951 (Willett et al., 1951). Nas ultimas décadas a TE tem vindo a ser difundida por todo o mundo. Em Portugal tem vindo a ser utilizada: no Programa Nacional de Melhoramento Genético da bovinicultura leiteira; no sector produtivo em algumas explorações leiteiras; raças autocnes.

Ai!! Senhor Doutor, cuidado!

2.1 Selecção da Doadora
o É feita pelo proprietário;
o Elevado valor genético; o Em casos de infertilidade; o Deve apresentar estrutura e função reprodutora normais; o E após dois meses do ultimo parto.
È uma escolha importante!

2.2. Selecção da Receptora
o Novilhas ou vacas jovens;
o Estrutura e função reprodutora normais; o Tamanho e grau de maturidade do animal deve coincidir com a raça e tipo de embrião a ser implantado;

o Dois meses após o parto.

2.3.Vantagens da T.E.
o Melhoramento genética;
o Aumento de crias por vaca/ano; o Optimizar a selecção das doadora; o Diminuir o intervalo entre gerações;

o Controlo sanitárias dos efectivos;
o Protecção de espécies ou raças em vias de extinção; o Indução de gémeos; o Importação e exportação comercial de embriões;

o Pode ser implementada em pequenas explorações;
o Diagnostico e terapêutica de infertilidade:
Endometrites Subclinicas

Obstrução dos oviductos Existência ou não de fertilização Avaliação do estado embriológico Exame citológico, microbiológico e virulógico

2.4. Desvantagens
o Requer um número elevado de gestão; o Aumento potencial da propagação de certas doenças; o Nem todos os potenciais doadores conseguem responder positivamente ao tratamento; o Aumentos (variáveis) das despesas e custos, sendo mais elevados para a produção dos vitelos.

3. Procedimentos na Transferência Embriões

3.1. (clicar) Superovulação da doadora com Gonadotrofinas

3.2. Inseminação Artificial (5 dias 3.3. Recolha não cirúrgica de depois de iniciar a Superovulação) embriões (6 a 8 dias após inseminação)

Cateter de Foley para Recolha de Embriões

3.4. Isolamento e Classificação de Embriões

3.5 Conservação de Embriões

3.6. Transferência de Embriões

Dignostico de gestação por Palpação Rectal (1 a 3 meses depois)

Parto (9 meses após a transferência)

3.1. Superovulação
o Consiste na administração de hormonas Gonadotrofinas superovulatorias

o Existem vários métodos, sendo os seguintes mencionados os mais utilizados:

1º Utilização da Gonatrofina Coriónica Equina (eCG);
2º Utilização do Hormona Foliculo-estimulina (FSH-p)

1º Utilização de eCG
o eCG é uma glicoproteína produzida pelos cálices endometriais da égua.
o Administração intramuscular de 1800 a 3000UI de eCG, entre os 8 e os 12 dias do ciclo estrico.
o 2 a 3 dias depois administra-se prostaglandina F2 alpha ou analogo (I.M.). o 12 a 24h depois repete-se a dose.

Cont.
o Um dos inconvenientes deste método deve-se ao facto do ovário ficar com um maior volume devido á meia vida da eCG ser muito longa (5 dias), havendo um continuo recrutamento de folículos após a ovulação.

Níveis elevados de estrogenio

Afecta a taxa de fertilização e a qualidade embrionária.

Cont.
oDeve-se tambem ter em atenção que a eCG induz uma resposta imunológica com a produção de anticorpos anti-eCG. oPara eliminar este efeito, num próximo tratamento, vai-se proceder á administração de um soro anti-eCG que deve ser dado logo após o pico préovulatório de LH. Na pratica é administrado no momento da I.A. oNos tratamentos superovulatórios seguintes (num mesmo animal), deve-se fazer um aumento na dose de eCG para que se obtenha sucesso.

2º Utilização de FSH-p
oObtida através de extractos hipófisarios suínos
o Provoca a estimulação dos folículos pequenos, devendo ser administrado antes de haver um folículo dominante. o Administra-se 8 a 10 injecções da hormona, com 12 horas de intervalo entre elas o Doses de 6; 6; 4; 4; 2; 2; e 2mg (SC ou IM) CAMPO o48 a 72 horas também se administra prostaglandina F2,alpha. (regressão corpo lúteo)

O cio ocorre 48h depois da administração.

Cont. o Principal desvantagem deste método é a maioria da FSH-p ser muito impura.
oTem havido uma melhoria do produto, sendo a contaminação pela LH diminuida.
oAltos niveis de LH provoca uma ovulação prematura ou luteínização dos folículos.

Baixa Produção Ovulatória
Atenção: baixos níveis de LH vai melhorar a resposta á ovulação

Este método tem mais sucesso que o anterior.

Outras hormonas utilizadas:
o EPE (extracto hipofisiario equino) oFSH-O (extracto hipofisiario ovino) oHMG (Gonadatrofina isolada da urina das mulheres em menopausa)

No entanto não são muito utilizadas, devido á indisponibilidade no mercado e quando se encontram têm custos elevados.

Considera-se que houve resposta ao tratamento de superovulação sempre que se obtiveram mais de duas ovulações.

3.1. 1. Modificações nos esquemas de Tratamento
As modificações do tratamento limitam-se ao FSH-p pois representa um problema do ponto de vista pratico, pelo numero de aplicações utilizadas em programas de T.E. Novas alternativas estudadas: o Redução na duração do tratamento de 4 para 3 dias. Já se fez uma única dose (SC); Administração de uma dose diária (4 dias). Não teve aceitação na pratica, pois a meia vida da FSH-p é de 12 a 14 horas. Mudanças na via de administração. Foi proposto administração contínua por via intra-arterial ou mesmo via endovenosa, com o objectivo de manter um nível de hormona no sangue.

o

o

3.2. Inseminação Artificial
o Esperma de alta qualidade; o A colocação atempada de esperma é essencial para garantir a fertilização do maior número de ovos possíveis;

o Devido ao número de ovos e á sua libertação, as fêmeas deveram ser inseminadas uma a três vezes durante e após o estro;
o O custo do sémen utilizado provavelmente vai determinar o número de inseminações; o Se só for feita uma inseminação, esta deve ser feita 24 horas após ter sido detectado o estro .

3.3. Recolha de Embriões
Metodo cirúrgico
o Lapararotomia na linha média;
o Anestesia Geral; o Tem vindo a ser substituído pelo método não cirúrgico;

Metodo não cirúrgico
o A doadora deve ser contida convenientemente;
o Administração de anestesia epidural caudal
evitar as contracções uterinas
relaxamento do recto

o Recolha das fezes contidas no recto, e assepsia da vulva e do perinio.

o Deve-se deixar secar toda esta zona de forma a evitar o arraste de produtos de assepsia.
o Evitar a entrada de ar no recto.

oPode-se utilizar um cateter PVC Foley com três vias ou um com duas vias.

Cont.
o São constituídos por silicone, suportando a esterilização em auto clave, assim como a capacidade de manter a forma concêntrica do balão e as várias saídas de drenagem.
o Antes de se introduzir o cateter nos cornos uterinos, este deve ter passado por uma solução de lavagem uterina: PBS (solução salina tamponada e enriquecida com fosfato); o O cateter e constituído por:  mandril (no seu interior)  papel de aluminio (extremidade posterior)  balão (inflado quando ultrapassado o cervix) o Depois é feito o encaixe do tubo Y de PVC, juntamente ao filtro e á bolsa de lavagem.

o Esta deve permanecer a uma temperatura de 37oC até o momento da colheita.

Cont.
oA lavagem é realizada com pequenos volumes de DPBS (Dulbecco phosphate buffer solution) em quantidade que preencha todo o interior uterino (300ml ou 1 2L)
oUma prática interessante consiste em encher os cornos uterinos com PBS, bloquear a saída do cateter e soltar o animal no estábulo enquanto é realizada a procura dos embriões. oAntes utilizava-se o mesmo meio (PBS suplementado com soro) para realizar a colheita e a conservação dos embriões.

o Actualmente, várias empresas oferecem meios mais complexos, elaborados especificamente para atender as diversas etapas da TE.
o Não existem provas científicas que o uso desses produtos resulte numa melhoria significativa da qualidade após a colheita ou das taxas de gestação. oNo final,o filtro segue para laboratório, onde se vai proceder á lavagem deste. O líquido obtido com esta lavagem vai ser armazenado numa placa de Petri com meio de manutenção para posterior avaliação

3.5. Classificação de embriões
Este é um dos passos importantes para o sucesso do programa de TE.
As características morfológicas avaliadas, para que um embrião seja considerado viável são:
•Forma esferóide; •Aparência clara e nítida dos blastómeros; •Uniformidade da membrana celular; •Ausência de vacúolo e fragmentos celulares no espaço perivitelíneo; •Proporcionalidade entre o embrião e o espaço perivitelíneo; •Tonalidade escura e uniforme;

•Compactação dos blastómeros entre si;
•Uniformidade da membrana celular; •Simetria dos blastómeros;

•Integridade da zona pelucida;
•Ausencia de fragmentos celulares aderidos á zona pelucida;

3.6. Conservação de Embriões
Depois da recolha de embriões segue-se o seu armazenamento, com o objectivo de os preservar para posteriores utilizações. o Os embriões podem ser armazenados com êxito em nitrogénio líquido usando
glicerina como crioprotector, em palhas de plástico de 0,25 e 0,5 ml. oUltimamente, os embriões bovinos têm sido congelados, usando o etilenoglicol como crioprotector: o Dada a sua grande permeabilidade permite a transferência do embrião imediatamente após a descongelação. o O embrião não precisa de ser removido da palhinha de congelação original e de ser exposto a passagens sucessivas por soluções com concentrações decrescentes de crioprotector. o Revelou igual eficiência que o método convencional com: redução de custos laboratoriais, simplificação da técnica e racionalização dos cios espontâneos de potenciais receptoras.

3.7. Transferência de Embriões
São conhecidos dois métodos, o cirúrgico e o não cirúrgico. O primeiro tem vindo a ser substituído pelo segundo, de forma a garantir o bem-estar das receptoras.
o Esta técnica realiza-se usando uma pipeta Cassou, também usada em Inseminação artificial, mas ligeiramente modificada. o Cada embrião, com um pequeno volume de PBS é aspirado para uma palha com uma pequena bolha de ar de cada lado para facilitar a identificação. A palha é colocada na pipeta de Cassou. o Os ovários são palpados com suavidade para se determinar que ovário contém o C.L. oA vaca mantém-se imobilizada num tronco, com anestesia epidural caudal.

Cont. oDe seguida limpa-se completamente a vulva e o períneo;

o Coloca-se na abertura externa do cólo do Útero a pipeta e introduz-se suavemente usando procedimento normal de inseminação artificial;
o Avançar cuidadosamente ao longo do corno adjacente ao CL, comprimindo fortemente o êmbolo para expulsar o embrião; oPor último a pipeta é retirada com muito cuidado.

A palpação do aparelho genital deverá ser tão mínima quanto possível e a técnica deve ser realizada prestando a máxima atenção às regras de higiene.

4. Fertilização in Vitro
A fertilização in vitro é uma biotécnica utilizada para acelerar a produção de animais de nível genético superior.
Começou por ser usada como alternativa á recolha de gâmetas de vacas superovuladas, fazendo-se a recolha de um ovário, em matadouro, recuperando – se milhares de oócitos. Recentemente, faz-se a recolha de oócitos em vacas de super produção, utilizando aspiração orientada com imagens de ecografia transvaginal.

Cont.
A FIV envolve a produção de embriões produzidos in vitro, até ao estado de mórula, incluindo as seguintes etapas: - Maturação - Fecundação - Cultura in Vitro A FIV possibilita que uma reprodutora produza centenas de bezerros num mesmo ano. Esta técnica permite evitar a rejeição precoce de fêmeas geneticamente privilegiadas, portadoras de alterações adquiridas que impeçam que a reprodução ocorra de forma natural.

5. Conclusão
Em vista das diversas biotecnologias desenvolvidas na área de reprodução animal, a transferência de embriões trouxe um incremento positivo para a produção animal. Os protocolos para superovulação ainda não são perfeitos e devem ser adequados na sua individualidade de cada animal para obtenção de respostas cada vez melhores. É uma técnica dispendiosa que somente permite a produção de crias geneticamente privilegiadas e com alto valor de mercado

6. Bibliografia
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Obrigado pela Atenção!
Trabalho realizado por:
Alisha Oliveira Ana Rosa Patricia Santos nº 1556
nº 1543 nº 1545

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