Biologie Cellulaire

Septembre 2002

Récepteurs et transduction du signal

Frédéric Vély
Centre d¶Immunologie de Marseille-Luminy CNRS-INSERM-Université de la Méditerranée

La communication intercellulaire

Interaction de molécules extracellulaires avec des récepteurs membranaires ou nucléaires

Ancrage des protéines dans la membrane plasmique

Les différentes formes de communications via des molécules sécrétées .

Le devenir d¶une cellule dépend de l¶intégration de différents signaux .

Différentes réponses peuvent être induites par une même molécule .

Récepteur Signaux de transduction Apoptose Adhésion Prolifération Différenciation .

Différents types de couplage [ récepteur / activité enzymatique ] 1 2 3 R E R E R A E R = récepteur E = enzyme effectrice A = molécule adaptatrice .

. .. activité protéine sérine / thréonine kinase ex: récepteur au TGF .. activité guanylate cyclase ex: ANF ..1 R Activité catalytique intrinsèque E dans la partie intracytoplasmique activité protéine tyrosine kinase (PTK) ex: récepteur au PDGF... EGF .. activité protéine tyrosine phosphatase (PTPase) ex: CD45 ..

Prolactine« . EPO.2 R Activité catalytique directement E associée à la partie intracytoplasmique association non covalente La famille des récepteurs aux facteurs de croissance hématopoïétique: GH.

3 R A E Activité catalytique associée à la partie intracytoplasmique via une molécule adaptatrice Récepteurs pour l¶antigène des lymphocytes T et B TCR CD3 ZAP 70 .

1 R E Activité catalytique intrinsèque dans la partie intracytoplasmique LES RECEPTEURS A ACTIVITE TYROSINE KINASE INTRINSEQUE (RTK) .

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Sites de reconnaissance des protéines kinases et de leur substrats .

Les familles de RTK .

Différentes stratégies de dimérisation des RTK .

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A heparin dodecasaccharide was manually docked into the putative heparin-binding site and is shown in stick representation. Ig-like domains 2 (D2) and 3 (D3) in the ligandbinding domain are labeled. .Structure-based model of FGF receptor dimerization Shown in full-sphere representation are two FGF2 molecules (orange) and two ligand-binding domains of FGF receptor 1 (green and cyan).

Mécanisme de dimérisation de VEGF et Flt1 the two protomers of disulfide-linked VEGF shown in orange and purple. and Ig-like domain 2 of Flt1 shown in green. .

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L¶activation de récepteur au FGF .

La liaison du récepteur avec le ligand stabilise la formation des dimères actifs. .

Activation des membres de la famille du récepteur à l¶EGF par formation d¶hétéro-tétramères .

Les grandes voies de signalisation utilisées lors de l¶activation des RTK .

La notion de domaines protéiques .

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Activation de la voie PI3kinase par les RTK .

Activation de la voie PLCg par les RTK .

Les petites protéines G : Ras Modèle : activation de Ras après stimulation du récepteur à l¶EGF SH3 ( YINQ ) Y.P SH2 SH3 Sos p21ras GDP Grb2 GTP p21ras Raf p21ras sous forme active permet l¶activation d¶une cascade de Ser / Thr kinases. MEK MAP kinases ERKs .

différentes petites protéines G famille Ras famille Rho famille Rab Expression de gènes Morphologie cellulaire Transport intracellulaire .

 Analyse d¶une protéine : immunoprécipitations suivi d¶un test d¶activité enzymatique in vitro ou western blot.  Utilisation de molécules chimèriques contenant des domaines adaptateurs isolés (ex. . GST Src SH2).Méthodes d¶étude des phases précoces de l¶activation cellulaire  Mesure de la concentration en Ca2+ intracytoplasmique.  Substrats des PTKs : analyse des protéines phosphorylées par western blot en utilisant un anticorps anti-phosphotyrosine.

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Régulation négative de l¶activité des RTK .

1 R E Activité catalytique intrinsèque dans la partie intracytoplasmique LES RECEPTEURS A ACTIVITE SERINE/THREONINE KINASE INTRINSEQUE .

‡Subfamily ‡Examples of ligands ‡TGF-b ‡TGF-b1 ‡TGF-b2 ‡TGF-b3 ‡TbR-II ‡Activin ‡Activin A ‡BMP ‡BMP-2 ‡BMP-4 ‡BMP-7/OP-1 ‡BMPR-II ‡ActR-II ‡ActR-IIB ‡BMPR-IA ‡BMPR-IB ‡ActR-I ‡Smad2 ‡Smad3 ‡Smad4 ‡Smad6 ‡Smad7 ‡Induction of ventral mesoderm ‡Induction of cartilage and bone ‡Induction of apoptosis ‡Type II receptors ‡ActR-II ‡ActR-IIB ‡ActR-I? ‡ActR-IB ‡Smad2 ‡Smad3 ‡Smad4 ‡Smad6 ‡Smad7 ‡Induction of dorsal mesoderm ‡Induction of erythroid differentiation ‡Induction of folliclestimulating hormone release ‡Type I receptors ‡TbR-I ‡Pathway-restricted SMADs ‡Common-partner SMAD ‡Inhibitory SMADs ‡Smad2 ‡Smad3 ‡Smad4 ‡Smad6 ‡Smad7 ‡Inhibition of mitogenicity ‡Induction of extracellular matrix ‡Responses .

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TFR-55kD Courte région extracellulaire (150 AA) riche en cystéine Au moins 10 cystéines Domaine intracellulaire à activité kinase Autophosphorylation Phosphorylarion du récepteur de l'autre type Phosphorylation des SMAD Domaine juxtamembranaire intracellulaire (30AA) riche en GS Contient les S/T phosphorylées suite à la reconnaissance du ligand Site d'activation de l'activité kinase + TFR--70kD + + + + + + + - .

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2 R Activité catalytique directement E associée à la partie intracytoplasmique association non covalente à une protéine à activité tyrosine kinase LA FAMILLE DES RÉCEPTEURS AUX FACTEURS DE CROISSANCE HÉMATOPOÏÉTIQUES .

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3

R A E

Activité catalytique associée à la partie intracytoplasmique via une molécule adaptatrice

2 - Récepteurs pour l·antigène des lymphocytes T et B

TCR

CD3

ZAP 70

APC

Y
Lymphocyte T

Cellule NK

Y
Lymphocyte B

Lymphocyte signaling: the importance of receptor clustering (1)
TCR BCR
sIg CD16 TCR CD3

FcIRI

ADCC R

EF

E
CD3

E

IK

HI

IgF IgE ITAM (CD3^)2

K

F

K

Charged amino acid

(CD3^)2

Initialisation du signal passant par le TCR

Y L Y L

PTKs

Y PO4L Y PO4L

Y PO4L Y PO4L Kinase

PTKs

Y PO4L Y PO4L

Kinase

PO4-

ZAP-70 associée
Kinase

ZAP-70 phosphorylée

ZAP-70

SIGNAL 1

tandem de domaines SH2 de la PTK ZAP-70

Blocage sous une forme immature dans le thymus .Pas de lymphocytes dans le sang périphérique .KNOCK OUT DU GENE DE ZAP-70 .

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E. a T cell tyrosine kinase. T CD4+ - après stimulation par des mitogènes ou des antigènes Diminution du niveau de tyrosine phosphorylation Ne produisent pas d¶IL-2 Ne prolifèrent pas .Human severe combined immunodeficiency to a defect in ZAP-70. 2. Elder M. 1. Thymus: CD4+CD8+ cells Périphérie: CD4+ présentes pas de CD8+ 3. 264 (5165): 1596-9. SCIENCE 1994. et al.

LES RECEPTEURS A 7 SEGMENTS TRANSMEMBRANAIRES = LES RECEPTEURS SERPENTINS .

Récepteurs liés à des protéines G hétérotrimériques R ( récepteur F adrénergique) E F GDP K E GTP ATP E ( adénylate cyclase ) AMP cyclique .3 R A E 1 .

plus de 1% des gènes codent pour plus de 1000 protéines à 7 domaines TM potentiels ‡ Plus de 50% des agents thérapeutiques actuels ont pour cible les GPCR ‡ Plusieurs milliards de dollars de bénéfices .Les récepteurs couplés aux protéines G G-Protein-coupled receptors (GPCR) ‡ Grande famille ‡ Grande variété de ligands ‡ La plus grande famille de gènes  1% de tous les gènes chez Drosophila  Plus de 5% de tous les gènes chez Caenorhabditis elegans  Chez l¶homme.

N-term Exemple Recepteur F adrenergique C-term Extracellulaire L 1 2 Effecteur membranaire Effecteur cytoplasmique Membrane Intracellulaire Rc E F K .

Extracellulaire L 1 2 Effecteur membranaire Effecteur cytoplasmique Membrane Intracellulaire Rc E F K Seconds messagers AMPc Ca2+ GMPc K+ 1 Myristylation 2 Isoprénylation Exemple Adenylate cyclase IP3 Na+ DAG Catalyt Ser481 PKC N-term Catalyt PKA Ser1035 C-term .

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RECEPTEURS ET PATHOLOGIES .

RTK et pathologies .

RTK et pathologies ‡ Anomalies pour les souris EGFR-déficientes au niveau:  Du développement épithélial  De la prolifération cellulaire  De l¶organogenèse ‡ EGFR (Erb-B1) est le proto-oncogène correspondant à v-erbB  v-erbB provient du Virus de l¶Erythroblastose Aviaire (AEV)  AEV code pour une forme tronquée d¶Erb-B1 dépourvue de domaine extracellulaire et présentant de nombreuses mutations intracellulaires  Dimérisation et phosphorylation indépendante du ligand .

RTK et pathologies ‡ L¶absence de dégradation de l¶EGFR induit la transformation cellulaire  Rétrovirus murin: Cas NS-1 hémopathie maligne  Mutant inactif de c-Cbl  Augmentation du recyclage et de l¶expression d¶EGFR ‡ La surexpression d¶EGFR ou de son ligand TGFE induit la transformation in vitro ‡ Surexpressions des mRNA et/ou de la protéine EGFR retrouvées dans plusieurs cancers humains  Souvent associées à une surexpression de ligands  Amplification du gène EGFR retrouvé dans 40% des gliomes humains .

RTK et pathologies Le pouvoir de prolifération des EGRF est fonction de la nature des dimères .

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Le développement d·inhibiteurs d·activité tyrosine kinase à des fins thérapeutiques .

La kinase Bcr-Abl et la leucémie myéloïde chronique (LMC) ‡ Chromosome Philadelphie: translocation réciproque entre les chromosomes 9 et 22 ‡ Le gène de fusion produit une oncoprotéine Bcr-Abl ayant une activité exacerbée ‡ Retrouvé dans 90% des LMC Il faut trouver des inhibiteurs des activités tyrosine kinase qui soient spécifiques .

Traitement de la LMC par le STI571 ‡ STI571 Signal Transduction Inhibitor n°571 ‡ Inhibiteur sélectif de bcr-abl. c-kit et PDGFR ‡ Une dose par jour par voie orale pendant 14 jours ‡ Réponse hématologique dans plus de 95% des cas .