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Investigador Responsable: Dra.

Ana María Adamo

Colaboradores: De Moliner, Karina L. (a cargo de los estudiantes)
Millanovich, Verónica L.
Aparicio, Evangelina
Milanesio, Berenice

Instituto: Departamento de Química Biológica Patológica, Facultad de Farmacia y
Bioquímica. UBA. IQUIFIB-CONICET.

Alumnos: Rodrigo C. Pampin y Robby Mattes

Antecedentes
• El grupo de investigación con el cual trabajamos,
hace unos años, se interesó por estudiar la
importancia de la Ubicuitina en la degradación de
proteínas en el sistema nervioso central.

y la sustancia blanca. • Se subdivide en el sistema nervioso periférico y el sistema nervioso central. compuesta por las prolongaciones nerviosas. Dendrita Axón Terminal Nodo de Ranvier Soma Axón Célula de Schwann Núcleo Mielina . • El sistema nervioso central tiene dos tipos de formaciones: La sustancia gris. Este último está constituido por el cerebro. • Los axones están recubiertos por mielina.• Sistema Nervioso Las principales células de este sistema son las neuronas. dendritas y axones. • Las funciones del axón son el transporte tanto de organelas como de otros componentes celulares y la conducción del impulso nervioso. el cerebelo. el tronco cerebral y la médula espinal.

Este sistema está involucrado en: •La regulación del ciclo celular •La diferenciación y el desarrollo •La respuesta celular a efectos extracelulares y al estrés •La modulación de los receptores de superficie celular y canales iónicos •La reparación del ADN •La regulación de la respuesta inmune e inflamatoria •La biogénesis de organelas . Sistema Ubicuitina- Proteosoma El sistema Ubicuitina-proteasoma es un camino proteolítico caracterizado por su alto grado de especificidad y selectividad.

Ub Ub Ub ATP Ub Ub E1 Ub Ub E1 R-Ub U b Ub E2 Ub Ub E2 E3 Ub U K Sustrato Proteico Ub E3 E3 U K Sustrato Proteico .

. GAP-43 • La GAP-43 es una fosfoproteína específica de las neuronas. • La función precisa de esta proteína no se conoce completamente pero probablemente participe en los mecanismos de traducción de señales a nivel de la membrana del terminal nervioso. 2005). • Está localizada en la superficie interna de la membrana plasmática. no se conoce aún el sitio subcelular donde se produce la conjugación de esta proteína con ubicuitina para su posterior degradación. sin embargo. • El nivel de esta proteína está controlado por la estabilidad de su ARN mensajero pero no se sabía nada acerca de su degradación. • El grupo de investigación con el que estamos trabajando ha demostrado que la GAP-43 es degradada vía el sistema Ubicuitina-proteosoma (Journal of Neuroscience Research.

Microscopía Confocal GAP-43 Ubicuitina Superposición .

Objetivo • Poner a punto la técnica de fluorescencia por complementación con el objeto de utilizarla para estudiar la localización subcelular donde se lleva a cabo la conjugación de la GAP-43 con ubicuitina. .

Nuestro Sistema .

Plásmidos .

. Amplificación de los • Plásmidos Las colonias seleccionados se cultivaron durante toda la noche a 37ºC.

Purificación de los Plásmidos .

tras una digestión enzimática. Electroforesis • se hizo una electroforesis. • Esto comprobó la presencia de los plásmidos en las bacterias . para comprobar la presencia de los plásmidos en las muestras.

El cociente de absorbancias 260/280 se utiliza para evaluar la pureza de la preparación. Un cociente inferior a 1. La concentración de ADN en la muestra (μg/ml) es igual a 50 x A260 nm. La absorbancia a 260 nm se empleó para calcular la concentración de ADN. .8 indica que hay impurezas. Cuantificación • La cantidad total de ADN se realizó midiendo la absorbancia de una alícuota de las soluciones conteniendo los plásmidos a 260 nm y a 280 nm. Una absorbancia igual a 1 corresponde a una solución de 50 μg/ml.

Condiciones de la Transfección Vectores: YN-Ub Jun-CC Linea celular: NIH 3T3 Agente utilizado para la transfección: Lipofectamina. .

fibroblastos NIH-3T3. . • Se cultivaron a 37ºC. antibióticos penicilina 50 U/ml y estreptomicina 50 mg/ml. Cultivo Celular • Para ver la degradación de la GAP-43 utilizamos células que no expresan esta proteína. bajo atmósfera de 5% de CO2 en DMEM alta glucosa conteniendo suero fetal bovino 10% v/v.

D-MEM alta glucosa. . 10% SFB.. Agregar los complejos a las células en un 60-70% confluentes Fibroblastos Incubar de NIH-3T3 5 a 7 Hs. Cambio de medio. Transfección Transiente de la Línea Celular Fibroblastos NIH-3T3 Diluir el ADN en D-MEM Diluir la Lipofectamina Lipido Complejo en D-MEM cationico ADN-Lípido Incubar la ADN mezcla 45 min.

Transfección de Células • Se sembraron las células sobre cubreobjetos polilisinados. • Después de 24hs en cultivo las células se observaron en un microscopio de fluorescencia. . • Se transfectaron con cada plásmido individualmente y se realizaron cotransfecciones con ambos plásmidos.

.

Por otro lado. . En la imagen de las células transfectadas con ambos plásmidos se observa fluorescencia verde principalmente en el citoplasma que rodea al núcleo. las células transfectadas con los plásmidos individualmente no muestran una fluorescencia marcada y la distribución de la misma es diferente a la de las células cotransfectadas.• Se pudo obtener una visualización directa de los conjugados de Jun con ubicuitina en las células transfectadas con ambas construcciones.

cabe destacar que se utilizaron técnicas de biología molecular siendo esta una herramienta muy útil para el estudio y compresión de diversos procesos celulares. . Una vez puesto a punto este sistema. • Además. Kerppola es una herramienta útil para la visualización de proteínas ubicuitinizadas en células in vivo. Esta técnica tiene limitaciones ya que no permite el análisis de la ubicuitinización en células in vivo. • La técnica de fluorescencia por complementación desarrollada por Deyu Fang y Tom K. La visualización de los conjugados de ubicuitina es una tarea dificultosa y hasta el momento las técnicas generalmente utilizadas para la detección de los mismos incluyen inmunoprecipitación seguida de Western Blot utilizando anticuerpos específicos. el mismo podrá ser utilizado para la localización de conjugados de ubicuitina de cualquier proteína de interés. Teniendo en cuenta los antecedentes del grupo de trabajo. Conclusión • Los resultados presentados demuestran que se cumplieron los objetivos propuestos. este sistema podrá ser utilizado para caracterizar la conjugación de GAP-43 con ubicuitina.