Métodos inmunoanalítico s

MÉTODOS INMUNOANALITICOS
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Características de un inmunoanálisis   Marcadores de antígenos y anticuerpos   Ensayos homogéneos y heterogéneos   Clasificación  Métodos inmunoanalíticos sin marcadores  Analizadores  automáticos  para  inmunoanálisis nefelométrico y turbidimétrico.

MÉTODOS INMUNOANALITICOS

Visión global
• Visualizar (con instrumentos) • Marcador • Homogéneos • Heterogéneos • Competitivos • No competitivos

Visualización

Separación

Reacción

Clasificación
• Sin marcador – Inmunoprecipitación Inmunoturbidimetría e inmunonefelometría – Aglutinación Particuloinmunoanálisis • Con marcador – Enzimoinmunoanálisis – Fluoroinmunoanálisis – Radioinmunoanálisis – Quimioinmunoanálisis

Inmunoprecipitación
• Precipitación (formación de un complejo visible) resultante de la combinación de un antígeno y un anticuerpo
– – – – Simple Doble Electroinmunodifusión Inmunoelectroforesis - Radial - Cohete

soluble

insoluble

Antígeno

Anticuerpo

soluble

Inmunodifusión radial

y = bx+a y = (diametro)2 b = pendiente

Título

Inmunodifusión doble

Identidad antigénica: Se fusionan las líneas Identidad antigénica parcial: aparece “espolón” Falta de identidad: Se cruzan

Electroinmunodifusión

Electroforesis

Inmunoelectroforesis

Inmunoelectroforesis

Inmunoelectroforesis en cohete

Inmunoturbidimetría e inmunonefelometría
1 .-Inmunoprecipitación 2.- Detectarlo por métodos ópticos basados en la dispersión de la REM

ID λ Región UV visible IR ID I0

Dispersión de luz según el tamaño de partícula
Partículas grandes Rayleigh .

Tamaño partícula < λ

Inmunoturbidimetría e inmunonefelometría

Particuloinmunoanálisis Detección mediante técnicas basadas en dispersión

Nefelometría

Turbidimetría

REM dispersada

Turbidimetría y nefelometría

Inmunoturbidimetría e inmunonefelometría
Nefelometría

Turbidimetría REM dispersada Turbidimetría y nefelometría

Turbidancia = log I0/I Señal a 90º

Lectura a punto único

Punto final

Segunda lectura

Señal

Señal

Atg Tampón

Ac Atg+Ac 1ª lectura

Tiempo

Tiempo

Lectura múltiple

Zona de medida Señal

Zona de seguridad

Concentración de antígeno Intervalos de tiempo de 0,1 y 0,2 s

Análisis nefelométrico en flujo continuo

Proteinas que se pueden determinar por inmunonefelometria

Aglutinación
Reacción inmunoquímica que produce la formación de agregados insolubles de “partículas” (células, bacterias, perlas..) recubiertas con antígenos o anticuerpos.

- Directa - Indirecta
Prueba de Combs (directa e indirecta)

- Inhibición de la aglutinación
1 Atc (completo)+Ag 2 Aglutinación 1 Atc (incompleto)+Ag 2 NO Aglutinación

Aglutinación indirecta

Aglutinación directa

Tratamiento de eritrocitos con enzimas

Demostrar presencia de anticuerpos incompletos (no aglutinantes)contra antígenos ABO y Rh de los eritrocitos utilizando antiinmunoglobulina como segundo anticuerpo

Detecta el AC en los eritrocitos

Analiza el suero para buscar anticuerpos

lavado

Particuloinmunoanálisis
• Sin marcador homogéneos
– Miden la aglutinación como señal de la reacción atg- ac – Partículas: – Inorgánica: metal – Biológica (Celular): microorganismo, eritrocito – Orgánica inerte: Polisacárido, bentonita, liposomas Latex

Aglutinación
Determinación de antígenos

Determinación de anticuerpos

Inhibición de la aglutinación
Compiten

Factor reumatoide
No se une al anticuerpo aislado,sí se une cuando cuando forma complejos

ELISA

WESTERN BLOT

CITOMETRIA D E FLUJO

Sensibilidad

MÉTODO

SENSIBILIDAD (µg/ml)

Precipitación en gel Precipitación en anillo Aglutinación bacteriana Fijación de complemento Hemaglutinación pasiva Inhibición de la hemaglutinación Inmunofluorescencia ELISA Neutralización bacteriana

30 18 0,05 0,05 0,01 0,005 0,005 0,0005 0,00005