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MICROBIOLOGÍA DE

LOS ALIMENTOS.
MÉTODOS DE ANÁLISIS
E INTERPRETACIÓN DE
RESULTADOS

Blga. Patricia A. Núñez Ramos


LA CONTAMI NACIÓN D E
LO S A LIME NTO S

¿Qué es un alimento contaminado?

Es todos aquel producto que contiene


sustancias o elementos ajenos a su
composición natural, en concentración
o cantidad tal que pueden causar daño
a la salud del consumidor.
¿C uántos t ipos de
contaminación exis te?
Se reconocen tres tipos de contaminación:

a) Contaminación biológica, cuando es


causada por bacteria y/o sus toxinas,
parásitos en su forma adulta o forma larvaria;
virus, hongos y sus toxinas naturales (hongos
venenosos) y biotoxinas marinas.
b) Contaminación química, cuando es
causada por sustancias químicas que llegan
a los alimentos de forma accidental o por
malas prácticas de los productores,
comercializadores o manipuladores en
general.
Ejemplos, de contaminación química:

• Contaminación por metales pesados: plomo,


cadmio, mercurio, cobre, etc; al usar recipientes que
contienen estos metales.
• Contaminación por plaguicidas aplicados en los
productos agrícolas, cuando se aplican en exceso o a
destiempo (no se respeta el número de días previos a
la cosecha) venenos, insecticidas, sustancias
químicas que se transportan o almacenan junto con
alimentos.
• También se considera como contaminación
química la aplicación de aditivos alimentarios no
autorizados o el uso en exceso de los autorizados.
c) Contaminación física, cuando es
ocasionada por cuerpos extraños al
producto, por lo general visibles;
ejemplos: astillas de madera,
excremento de roedores, larvas de
insectos, trozos de metal o vidrio,
tierra, arena, piedras pequeñas, etc.
INFORMACIÓN QUE SE OBTIENE AL
ESTUDIAR LA MICROFLORA
ALIMENTARIA:
- Permite conocer las fuentes de contaminación del
alimento que se analiza.
- Valorar las normas de higiene utilizadas en la

elaboración y manipulación de los alimentos.


- Detectar la posible presencia de flora patógena

que suponga un riesgo para la salud del


consumidor, siendo este uno de los objetivos más
importantes en Microbiología Alimentaria.
- Establecer en qué momento se
producen
fenómenos de alteración en los
distintos
alimentos, con el fín de delimitar su
período
de conservación.
EN LA CALIDAD MICROBIOLÓGICA
DE LOS PRODUCTOS ALIMENTARIOS
SE CONSIDERAN, PRINCIPALMENTE:

- Calidad higiénico-sanitaria.
- Calidad comercial.
EL EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE
ALIMENTOS ESTA BASADO,
ESENCIALMENTE:

- Muestreo
- Criterio microbiológico
- Elección de técnica analítica
- Interpretación de los resultados
analíticos
PUNTOS DE MUESTREO DE
ALIMENTOS

* MERCADOS
* KIOSCOS ESCOLARES
• COMEDORES POPULARES
• RESTAURANTES
• SERVICIOS DE ALIMENTACIÓN EN
TRANSPORTE TERRESTRE
* ETC.
MATERIAL PARA LA TOMA DE
MUESTRA:
 Cooler
 Ficha de muestreo
 Plumón indeleble
 Guantes
 Gel refrigerante
descartable.
 Bolsas de  Protector de cabello
polietileno de primer  Guardapolvo
uso  Alcohol
 Frascos de vidrio
 Algodón
con tapa rosca  Cucharas estériles
estéril.
 Termómetro
 Pinzas estéril
ambiental
¿QUE ALIMENTOS SE MUESTREA?

• ALIMENTOS DE ALTO RIESGO


(PREPARADOS)
(200 gramos aprox.)

* ALIMENTOS ENVASADOS
¿CUÁLES SON LOS ALIMENTOS DE
ALTO RIESGO?

* JUGOS * ENSALADA DE VERDURAS


* REFRESCOS * ENSALADA DE FRUTAS
* CEVICHE * AJI AMARILLO MOLIDO
* MAYONESA * SANDWICHS
* AJOS MOLIDOS * EMPANADAS
* CAUSA RELLENA * ETC.
* CREMA DE PAPA A LA HUANCAINA
* ROCOTO MOLIDO C/S CEBOLLA CHINA
CRITERIO MICROBIOLÓGICO
 Es la aceptabilidad de un alimento basado en
la presencia o ausencia de un determinado
número de microorganismos, parásitos por
unidad de masa, volumen, área o lote.

 Utilizado para la inocuidad alimentária.


NORMA MICROBIOLÓGICA
-“Criterios Microbiológicos de Calidad Higiénico
Sanitaria e Inocuidad para los Alimentos y
Bebidas de Consumo Humano”
Resolución Ministerial Nº 615- 2003-SA/DM
-“Norma Sanitaria para el Funcionamiento de
Restaurantes y Servicios Afines”
Resolución Ministerial
Nº 363-2005/MINSA
 “Norma Sanitaria para la Fabricación de
Alimentos a Base de Granos y Otros, destinados
a Programas Sociales de Alimentación”.
Resolución Ministerial Nº 451-2006-MINSA.
GRUPOS DE ALIMENTOS Y BEBIDAS
SUJETOS A CONTROL Y VIGILANCIA

1. Leche y Productos Lácteos.


2. Helados y Mezclas para Helados.
3. Productos Grasos.
4. Productos deshidratados.
5. Cereales, leguminosas y derivados
6. Azúcares y mieles
7. Productos de confitería.
8. Productos de panadería, pastelería y galletería
9. Alimentos formulados (regímenes especiales)
GRUPOS DE ALIMENTOS Y BEBIDAS
SUJETOS A CONTROL Y VIGILANCIA

1. Carnes y productos cárnicos


2. Productos Hidrobiológicos
3. Huevo y oviproductos.
4. Especias,condimentos y salsas.
5. Frutas y Verduras.
6. Comidas y Platos Preparados.
7. Bebidas.
8. Estimulantes y Fruitivos.
9. Conservas
10.Semiconservas
CRITERIOS MICROBIOLÓGICOS
PARA ALIMENTOS DE ALTO
RIESGO
Comidas preparadas sin tratamiento térmico (ensaladas
crudas, mayonesas, salsa de papa huancaína, ocopa,
postres, jugos, otros).
Comidas preparadas que llevan ingredientes con y sin
tratamiento térmico (Ej. Ensaladas mixtas, palta rellena,
sandwichs, ceviche, postres, refrescos, otros).

Límite por
Agente microbiano g/mL
m
Aerobios mesófilos 105

Coliformes 102

Staphylococcus aureus 10

Escherichia coli 10

Salmonella sp. en 25 g/ mL 0
Comidas preparadas con tratamiento térmico
(ensaladas cocidas, guisos, arroces, asados, postres
cocidos, arroz con leche, mazamorra, otros)

Límite por
Agente microbiano g/mL
m
Aerobios mesófilos 104

Coliformes 10

Staphylococcus aureus 10

Escherichia coli <3

Salmonella sp. en 25 g/ mL 0
PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
PARA SU ANÁLISIS:

 Toma de muestras, aprox. 200 g o


mL
 Cuando se trata de alimentos
sólidos, es necesario someterlos
previamente a una suspensión,
utilizando un diluyente estéril.
 Diluyente:

Agua peptonada salina


 Trituraciónde la muestra y obtener
una mezcla homogénea para lograr
la distribución equilibrada de los
gérmenes y sus toxinas.
Ejm: Homogenizador -- Stomacher
(a base de paletas)
TÉCNICA PARA LA PREPARACIÓN DE
LAS DILUCIONES:

10 g de muestra
1 mL 1 mL

90 mL
APS
9 mL ....
APS
10-1
10-2 10-3
1 mL
MÉTODO: CUALITATIVO

PRESENCIA / AUSENCIA en 25 g ó
mL de muestra.

MÉTODO: CUANTITATIVO
• Tubos múltiples: NMP/g ó mL de
muestra
• Recuento en placa: ufc/g ó mL
a. Por incorporación
b. Por superficie
MÉTODO CUALITATIVO

ENSAYOS:

4. Salmonella sp.
5. Vibrio cholerae
6. Listeria monocytogenes
MÉTODO CUANTITATIVO

1. Tubos múltiples
 Coliformes totales 2. Recuento en placa
 Coliformes fecales a. Mesófilos aerobios
 Escherichia coli a. Mohos
a. Levaduras
a. Enterobacterias
a. Clostrid. perfringens
b. Staphylococccus
aureus
b. Bacillus cereus
AISLAMIENTO E
IDENTIFICACIÓN DE
Salmonella sp.
- Preenriquecimiento en medio líquido no
selectivo.
- Enriquecimiento en medios líquidos selectivos.
- Aislamiento diferencial sobre medios sólidos

selectivos.
- Confirmación bioquímica de las colonias

sospechosas.
- Confirmación serológica de las colonias
sospechosas.
DETECCIÓN DE Salmonella sp.
25g o mL de 225 mL
muestra medio de pre-
enriquecimiento
(A.P.T.)

Incubar a 35°C por 20 horas


0.1 mL 10 mL ó 1 mL
Caldo
Rappaport- Caldo
Vassiliadis Selenito/
(10 mL) Cistina
(100 mL) (10 mL)

Incubar a 42°C por 24 h junto Incubar a 35°C por 20 h junto


con los controles (+) y (-) con los controles (+) y (-)

Estriado en medios selectivos

Agar Verde
Brillante/ Agar XLD ó
Rojo Fenol Agar SS

Incubar a 35°C por 24 h


Si no aparecen colonias típicas, reincubar 18-24 h más a
35°C
Seleccionar colonias típicas o
sospechosas

Estriar en Agar
Nutritivo e Incubar a
35°C por 18-24 h

CONFIRMACIÓN
BIOQUÍMICA
Agar Agar Agar Rx. Voges Rx. Detección de
TSI Úrea Proskauer Indol β-Descarboxilasa
LIA
Incubar a 35°C por 24 h

(+): Forma (-): Mantiene (+): Color (-): No vira (-): No


(-): No vira
ácido, c/s color del púrpura a rosado o forma
a amarillo
gas y H2S (+) medio K/K rojo anillo rojo
K/A brillante

CONFIRMACIÓN SEROLÓGICA

Salmonella O antiserum poly A-I & Vi

Rx (+): Aglutinación

Salmonella sp.
Salmonella enteritidis
• ISO 6579, 1993
Salmonella sp.
en el medio de cultivo Agar
XLD
Salmonella sp. en Agar XLD y
Agar Bismuto Sulfito
Salmonella sp. en Agar Verde
Brillante
Salmonella sp.
en Agar Salmonella y Shigella
NUMERACIÓN DE Staphylococcus aureus

10 g de muestra 1 mL 1 mL

90 mL
APS 9 mL
APS
....
10-1
10-2 10-3
1 mL 1 mL 1 mL

Inocular 1 mL de cada dilución


por duplicado en placas Petri (14
mm) con Agar Baird Parker y
esparcir con la espátula
drigalsky.

Incubar a 35ºC por 18-24 h


Si no hay crecimiento, reincubar a 35ºC por 24 h.

Seleccionar para la numeración, placas con un máximo de 200 colonias (típicas y/o atípicas))
Aislar 5 colonias típicas y atípicas y colocar cada una de ellas en caldo
BHI
Incubar a 35°C por 24 h

0,3 mL plasma
PRUEBA DE + 0,3 mL de inóculo
de conejo con
COAGULASA del Caldo BHI
EDTA
Incubar a 35°C

Examinar luego de 4-6 h y hasta un máx. de 24 h y verificar la formación de coágulo

No hay formación Formación de coágulo


de coágulo

Prueba de coagulasa (+)


Prueba de coagulasa (-)

Staphylococcus aureus

ISO 6888-1, 1999


Staphylococcus aureus
en Agar Baird Parker
Staphylococcus aureus
Prueba de coagulasa
NUMERACIÓN DE MESÓFILOS AEROBIOS
VIABLES
10 g de muestra 1 mL 1 mL

90 mL
APS 9 mL
APS
....
10-1
10-2 10-3
1 mL 1 mL 1 mL

Inocular 1 mL de cada
dilución en placas Petri
por duplicado
Incorporar el medio Agar Plate Count*, homogenizar y
que se solidifique.

Incubar a 35ºC por 48 h

Seleccionar para la numeración placas con un máximo de 250 colonias

•Agregar a 100 mL de medio PCA, 2 mL de TTC al 0.5% .


(TTC= 2.3.5 triphenil tetrazolium chloride)

ICMSF Vol. 1, 2da. Ed. 2000


MESÓFILOS AEROBIOS
EN AGAR PLATE COUNT
MESÓFILOS AEROBIOS
EN AGAR PLATE COUNT
COLIFORMES TOTALES

10 g de muestra 1 mL 1 mL

90 mL
APS 9 mL
....
APS
10-1
10-2 10-3
1 mL 1 mL 1 mL
Caldo lauryl sulfato
Prueba Presuntiva 10 mL por tubo

2X X

Incubar a 35ºC por 24 - 48 horas

Los tubos positivos con gas y turbidez, se


pasan a:
Caldo verde brillante
Prueba confirmativa bilis lactosa
10 mL por tubo
Incubar a 35ºC por 24 - 48 horas

Leer los
tubos
Negativos a Positivos: gas y
gas y turbidez turbidez

COLIFORMES
TOTALES

ISO 4831:2006
Escherichia coli
10 g de muestra 1 mL 1 mL

90 mL
APS 9 mL
....
APS
10-1
10-2 10-3
1 mL 1 mL 1 mL
Caldo lauryl sulfato
Prueba Presuntiva 10 mL por tubo

Incubar a 35ºC por 24 - 48 horas

Los tubos positivos con gas y turbidez, se


pasan a:
PROCEDIMIENTO

Caldo EC
Prueba Confirmativa
10 mL por tubo
Incubar a 44.5ºC por 24 - 48 horas

Leer los
tubos
Negativos a Positivos: gas y
gas y turbidez turbidez

Sembrar en Agar EMB


(Eosina azul de metileno)

Colonias individuales, Bioquímica

ICSMF - 2000 Escherichia coli


INTERPRETACIÓN DE
RESULTADOS
Salmonella sp.

REPORTE:

AUSENCIA o PRESENCIA DE
Salmonella sp. en 25 g de
muestra.
Staphylococcus aureus

CÁLCULO:

Tipo de Nº de
colonia colonias/ Bioquímica PRE
Plac dilución Selección CÁLCULO
ufc
a -1 -2 de colonias Prueba de
Coagulasa

1 T 42 3 3 (+) 42 5
A 28 3 1(+) 9,3 1,3
2 T 52 3 2 (+) 34,7 5
A 32 3 2 (+) 21,3 6,0

Promedi 5
Nº de colonias x inversa del
volumen usado x factor de la
dilución=
53,7 x 10 x 10 = 5370

REPORTE:

54 x 102 u.f.c. de Stap. aureus /


g de
muestra
MESÓFILOS AEROBIOS

Nº de RESULTADO
colonias / (obtener la
Placa dilución media aritmética
x factor de la REPORTE
-1 -2 -3 dilución)

1 188 19x 102 ufc


190 x 10 de mesófilos
2 192 aerobios / g
de muestra
COLIFORMES TOTALES

Nº de
Tipo de tubos
Prueba positivos/ SERIE TABLA REPORTE
dilución (NMP)

-1 -2 -3
P.P. 3 3 2 15 x 10
NMP de
P.C. 3 2 1 3-2-1 150 coliformes
totales/ g de
muestra
Escherichia coli

Nº de tubos
Tipo de positivos/
prueba dilución SERIE TABLA REPORTE
-1 -2 -3 (NMP)

P.P. 3 3 2 20 NMP de
Escherichia
P.C. 2 2 1 coli / g de
muestra
Bioquí- 2 1 1 2-1-1 20
mica
CUADRO RESUMEN DE RESULTADOS

Agente Límite
microbiano por g/mL Resultado
m
Aerobios 105 19 x 102
mesófilos
Coliformes 102 15 x 10

Staphylococcus 10 54 x 102
aureus
Escherichia coli 10 20

Salmonella sp. 0 Ausencia


en 25 g
CONCLUSIÓN

La muestra Nº 224, sobrepasa los


limites permisibles de Staphylococcus
aureus, Coliformes y de Escherichia
coli, según la Norma Sanitaria para el
funcionamiento de restaurantes y
servicios afines. Comidas preparadas
sin tratamiento térmico.
R. M. Nº 363-005/MINSA.
MUESTRAS DE ALIMENTOS
LAVADO DE MATERIALES
PREPARACIÓN DE MATERIALES
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
ANÁLISIS DE BEBIDAS GASIFICADAS
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO
(DILUCIÓN DE LA MUESTRA)
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO
(DILUCIÓN DE LA MUESTRA)
COLOCANDO LA MUESTRA DILUIDA
EN LA PLACA PETRI
MÉTODO RAPIDO-PLACA PETRIFILM
ANÁLISIS DE COLIFORMES- E. COLI
INCUBACIÓN
COLIFORMES TOTALES y Escherichia coli
ANÁLISIS DE SALMONELLA
Bacillus cereus en Agar MYP
Mohos y Levaduras en Agar
OGY
MUCHAS GRACIAS …

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