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INSTRUMENTACIÓN - II

Colorimetría Espectrofotómetro

OBJETIVOS •Conocer los fundamentos e importancia de la instrumentación (equipos ) en Bioquímica •Conocer el funcionamiento y uso de la Centrífuga y el espectrofotómetro como equipos útiles en Bioquímica. •Elaborar curvas o gráficos de calibración .

seleccionada de acuerdo al soluto en estudio • Reporta resultados como A o T Io = luz incidente I1 = luz transmitida c = concentración l = distancia . • La luz utilizada es monocromática.Espectrofotometría • Se basa en la medida de la luz absorbida por una solución mediante un espectrofotómetro.

01M .O.Beer A= ecl Log Io/It = e.c A= Absorbancia (D.l.) e =coeficiente de extinción C= concentración molar l= longitud de celda (cm) log Io/It = A A = 2 – log%T Principal limitación de ley: Concentración de soluto mayor de 0.Absorbancia En función de la naturaleza y de la concentración de la muestra Ley de Lambert.

considerando que A y C tienen relación lineal: Fc = C/A Fc = factor de calibración C = concentración solución conocida (patrón) A = Absorbancia de la solución conocida (pat.) . • A o Densidad Optica se expresa en valores semilogarítmicos de 0 a 2. • Aplicando la ley de Lambert – Beer.• T se expresa en valores de 0 a 100%.

La absorbancia es reciproca de la transmitancia Absorbancia contra concentración (comportamiento lineal) Absorbancia Concentración % Transmitancia contra concentración (pendiente con signo negativo y comportamiento exponencial) % Transmitancia Concentración .

Curva de calibración A b s o r b a n ci a A Concentración .

Azul de metileno A b s o r b a n ci a A l Max l Longitud de onda (nm) 660 nm .

Muestra Problema ¿ABSORBANCIA? .

Prob = (A Prob)(Conc.765 .8 mg% Conc. Problema = (0.Problema Patrón Conc. Patrón)/A Patrón Conc.458 A Patrón = 0. Problema= ? Conc.765 Patrón= 145mg% Conc.458)(145mg%) Conc. /0. Prob = (A Prob)Fc Ejemplo : A Problema = 0. Problema= 86.

4 Absorbancia del problema N C I A 0 0 2 4 6 0.6 0.2 0.CURVA PATRÓN 0.1 Interpolación 8 10 12 Concentración mg/lt .5 A B S 0 R B A 0.3 0.

PARTE EXPERIMENTAL .

Preparar la siguiente batería de tubos Contenido ml Azul metileno al (5 mg/ml) ml Agua destilada 1 2 8 Tubo Nº 2 3 4 4 6 8 6 4 2 5 10 0 Llevar a lectura en el espectrofotómetro La longitud de onda de lectura será 540 nm .

Con Fc Desconocido 1 Desconocido 2 Estimar el factor de calibración promedio Construir las graficas Concentración Vs Absorbancia y Concentración Vs transmitancia Conc.RESULTADOS Concentración (mg/mL) % T= Antilog(2-A) A FC= C/A Factor calibración promedio Conc. De grafica Entregar el valor de las concentraciones desconocidas determinadas usando el factor de calibración y el método grafico .

¿Para que es útil el factor de calibración y las curvas de calibración? 3.CUESTIONARIO 1. ¿De que características de las soluciones hace uso el espectrofotómetro para ayudar en la cuantificación de concentraciones de muestras desconocidas? . ¿Cual es la importancia de los instrumentos de laboratorio en análisis clínico? 2.