METABOLISMO DEL NITROGENO

Funciones del nitrgeno en la levadura

Funcin estructural Membranas Orgnulos subcelulares Sntesis de protenas estructurales

Funcin regulatoria
Formacin de cidos nucleicos Sntesis de enzimas Sntesis de transportadores Sntesis de protenas de resistencia al stress

El contenido de nitrgeno en la levadura es de un 6% de su peso: de este del 10 al 30% est formando parte de la estructura proteica.

FUENTES DE NITROGENO
Las principales fuentes de nitrgeno para la levaduras son:

Ion amonio (NH4) Aminocidos Aminas

La levadura puede sintetizar todos los aminocidos a partir del amonio y de las cadenas carbonadas producidos en el metabolismo de los azcares. Sin embargo bajo algunas condiciones fermentativas algunas vias pueden estar reprimidas

Nitrgeno en los mostos

Amplio rango de concentraciones: TOTAL = 60 - 2400 mg/L Principalmente nitrgeno orgnico ( polipeptidos aminocidos, protenas, in amonio) Los nitritos y los nitratos estn presentes en niveles muy bajos < 0,3%.

Aporte de la determinacin de nitrogeno en la baya o mosto

La determinacin del N total no tiene una gran relevancia para predecir deficiencias para la levadura. La determinacin del N total mediante el mtodo de Kjeldal no es un buen predictor. Slo tienen relevancia la fraccin de nitrgeno asimilable por la levadura (YAN).

Caracterizacin del YAN

Como sabemos las principales fuentes de nitrgeno utilizable por la levadura corresponden a:
Hay 1 excepcin

Amonio

+ Aminocidos = YAN

La nutricin depender de la disponibilidad en el mosto y de la posibilidad que las formas nitrogenadas ingresen a la clula.

Concentraciones de YAN en el mosto

Su concentracin es muy variable pues depende de varios factores. Un estudio en 90 mostos de 25 c.v. provenientes de cuatro distintas regiones, entreg valores muy variables 28 - 336 mg/L Media 120 mg/L

Utilizacin de compuestos nitrogenados

Se pueden considerar tres grupos:

Compuestos utilizados directamente en la biosntesis Compuestos que deben ser modificados antes de ser utilizados en la biosntesis Compuestos utilizados como donadores de N o de catin amonio mediante reacciones de desaminacin y transaminacin.

Mecanismos de transporte de metabolitos

Transportador

Transportador

Transporte de Nitrogeno: Difusin Facilitada

Es asistida por un transportador proteico, pero no requiere de suplementacin directa de energa para funcionar
Este modo de transporte se utiliza para igualar concentraciones entre el medio y la clula (No funciona contra gradiente Para aumentar la velocidad de transporte a bajos gradientes Para modular la velocidad de transporte segn requerimientos

Difusin facilitada de aminocidos

El transporte est acoplado al movimiento de iones. Muchos transportadores de aminocidos son simportes con iones de hidrgeno
La estrategia permite acoplar el transporte de iones, con alto gradiente, a un compuesto con bajo gradiente.

Los protones que entran a la clula deben ser excretados nuevamente para impedir la acidificacin del citoplasma Este sistema de transporte solo funciona activamente en las primeras etapas de la fermentacin

Difusin facilitada de aminoacidos en Sacch. cerevisiae

A: Acoplado a la escresion
de protones

B: acoplado a un intercambio
de iones potasio

Caractersticas de los transportadores de aminocidos

Algunos transportadores son altamente especficos Otros transportadores actan con un grupo de aminocidos relacionados. Algunos transportadores son reprimidos por la presencia de in amonio.

Tipos de transportadores de aminocidos

Transportador General de Aminoacidos: GAP
Es reprimido por el in amonio Numero de protones co-transportados = 2

Dicarboxilic Aminoacid permeasa: DAP

No es reprimido por el in amonio Numero de protones co-transportados = 2 o 3

Branched chain aminoacid permeasa: BAP

No es reprimido por el in amonio Numero de protones co-transportados = ?

Transporte de Amonio
Se han descrito dos permeasas para el in amonio El transporte es inhibido de manera no competitiva por ciertos aminocidos (arginina y ac. Aspartico) El ingreso del in esta acoplado, por razones de carga, a la excrecin de protones por la ATPasa de la membrana. Por tanto, esta actividad de transporte necesita una fuente energa para poder funcionar.

Mecanismos de absorcin de nitrgeno amoniacal

ATPasa

Transportador

Factores que afectan la utilizacin del nitrgeno por la levadura

Concentracin de etanol Temperatura Composicin de la membrana Plasmtica Cepa de levadura Grado aireacin Presin de CO2 pH Competencias microbiolgicas

Efecto de concentracin de etanol

Disminuye la fuerza motriz a travs de la membrana Inhibe el bombeo activo de protones provocado por la ATPasa de la membrana. Los mecanismos de transporte activo disminuyen o se cancelan El etanol desactiva la GAP por modificacin de su parte proteca.

Efecto del etanol sobre el transporte de N

La

difusin facilitada de aminocidos es fuertemente inhibida por el etanol (aumenta la difusin pasiva de protones).
La

levadura acumula aminocidos en la vacuola cuando la concentracin de etanol todava es baja.

Efecto de la Temperatura
El transporte de amonio ha demostrado ser independiente de la temperatura La velocidad de acumulacin de aminocidos disminuye con las bajas temperaturas porque afecta al transporte activo.
La demanda cuantitativa de aminocidos afecta la intensidad de la funcin de transporte

Efecto de la composicin de la membrana plasmtica

Su efecto se ve regulado por varios factores:
Concentracin de esteroles (aireacin) Grado de insaturacin de los residuos acidos de los fosfolpidos de la membrana. (mejor una doble insaturacin linoleico que monoinsaturado oleico. El grado de insaturacin de los cido grasos de la membrana afecta la actividad de la GAP. El efecto es atribuido a una mayor fluidez en la vecindad de los sitios de las permeasas.

Efecto de la cepa de levadura

Se ha determinado una amplia variacin entre cepas de Sacch. cerevisiae en relacin a su patrn de utilizacin de aminocidos y concentracin total de nitrgeno. Las diferencias cuantitativas son mas amplias que las cualitativas La cepa Montrachet es muy exigente en sus requerimiento de nitrgeno. Las cepas AWRI72 Y AWRI77 muestran una gran sensibilidad para la acumulacin de tirosina y baja para glicina y alanina. La cepa Epernay2 excreta elevadas cantidades de arginina luego de haberla absorbido del medio.

Utilizacin de YAN por distintos strain

Epernay 2 Prise de Mousse Montrachet AWRI 350 AWRI 2 Flor

mg/L 392 449 473 330 430 402

Efecto de la aireacin
La aireacin influye indirectamente a travs de su accin sobre la composicin de la membrana plasmtica Como ya sea ha mencionado la utilizacin de prolina esta condicionada a la disponibilidad de oxgeno en el mosto En condiciones de anaerobiosis se ha determinado la excrecin de prolina y urea posiblemente como resultado del metabolismo de la arginina. La aireacin mejora la utilizacin del nitrgeno del mosto en fermentacin (mayor produccin de energa metablica)

Efecto de la presin de CO2

La presin de CO2 disminuye la velocidad y la concentracin de absorcin de aminocidos del mosto (alrededor de un 50%) El CO2 altera la formacin y la excrecin de productos secundarios del metabolismo de los aminocidos afectando su ingreso a la clula

Efecto del pH
Los mecanismos de transporte activo son afectados por los pH bajos del mosto El pH optimo para el transporte del amonio esta entre 6,0 y 6,5. Se ha observado que las levaduras disminuyen en un 50% la utilizacin del amonio cuando crecen a pH 3,25 respecto de pH 4.0.

Competencias microbiolgicas
El crecimiento de hongos disminuye de manera dramtica el YAN Botrytis cinerea puede disminuir el YAN entre un 7 y 61% Un importante desarrollo de flora apiculada puede hacer que el YAN sea deficiente para Saccharomyces

Aspectos Cualitativos y Cuantitativos del YAN

Aspectos relacionados con el YAN

Desgraciadamente no existe una concentracin fija que permita definir una disponibilidad suficiente de YAN El YAN debera ser analizado en cualquier mosto, pero de preferencia:
En vias de suelos pobres que provocan limitaciones al crecimiento (bajo vigor) Vias con enfermedades degenerativas (virus, nematodos) Vias con estrs hdrico prolongado Vias con historial de fermentaciones flojas o que se paralicen.

Concentraciones necesarias de YAN

En ocasiones 140 ppm se citan como nivel mnimo necesario. Cuando existen factores de estrs, las necesidades aumentan En general se establece que las levadura en fase de crecimiento prefieren unas 500 ppm pero con estos niveles pueden fermentar demasiado rpido (mayores necesidades de refrigeracin). Valores entre las 200 y las 400 ppm parecen suficientes; las concentraciones necesarias depende del grado Brix y otras condiciones.

Concentraciones necesarias de YAN (2)

En el mosto de uva el contenido de N alfa-amino es mayor que el de amonio (promedio de unas 2 a 3 veces). Cuando se adiciona una elevada concentracin de amonio se altera el equilibrio drsticamente lo que puede perturbar la sntesis y transporte de algunos aminocidos. Algunas fuentes de aminocidos ( extracto de levadura, hidrolizados de protenas de soya) puden impartir defectos sensoriales.

Aspectos cuantitativos
Cuando la disponibilidad aumenta fuertemente: 300 a 800 mg/L. la asimilacin de nitrgeno se eleva en pequea extensin 200 a 260 mg/L Los datos de Bely (1991) muestran una pequea reduccin en la duracin de la fermentacin cuando el contenido de YAN excede los 300 mg/L. La respuesta eficiente ms tarda coincide con la mitad de la fermentacin. En las etapas avanzadas de la fermentacin tienen un mayor efecto las fuentes ms complejas de nitrgeno, efecto que se debera al cambio de transportadores. Las condiciones redox afectan las asimilacin del nitrgeno. El oxgeno estimula la eficiencia en la utilizacin del nitrgeno

Concentracin de azcar y asimilacin de nitrgeno, biomasa y velocidad media de fermentacin

Nitrgeno Rendimiento Nitrgeno Azcar Asimilado Biomasa asimilado/biomasa conc. (g/l) (mg YAN/l) (g M.S./l) (%p/p) 183 71.8 2.06 3.3 208 127.5 2.63 4.9 233 128.6 2.85 4.5 258 143.2 2.38 6.0 Velocidad de fermentacin (gCO2/l dia) 8.4 12.3 11.5 9.1

Antecedentes sobre suplementacin de YAN

La forma de suplementacin ms utilizada es la adicin de (Fosfato de amonio) FDA. La adicin de FDA no es un panacea, en ocasiones los suplementos complejos presentan mejores respuestas Lo anterior puede deberse a que la levadura trabaja mejor si dispone de un equilibrio entre aminocidos y amonio.

Prctica de la suplementacin Nitrogenada

Cuando se efectan suplementaciones abundantes, es muy importante hacerlas en forma parcializada. Las aplicaciones masivas al inicio de la fermentacin provocan un desequilibrio en la distribucin de las formas de nitrgeno asimilable, esto origina: problemas sensoriales, baja eficiencia de la aplicacin, acelera demasiado la fermentacin, generando calor y provocando perdida de aromas. Las adiciones deberan parcializarse en los 2 a 4 primeros das. Todas las adiciones deberan haberse realizado cuando la concentracin de slidos soluble llega alrededor de 10 Brix.