Universidade dos Açores Departamento de Ciências Agrárias Mestrado em Engenharia Agronómica Biotecnologia Vegetal 2011/2012

Biotecnologia Vegetal da Clonagem de Plantas à Transformação Genética
Autor: Jorge M. Canhoto

vulgarmente designadas por calos (callus). plantas ou massas de células. órgãos vegetais. tecidos.Capitulo 2 – Cultura in vitro Por cultura in vitro entende-se o estabelecimento e manutenção. em condições laboratoriais de células. Objectivos clonagem de plantas produção de metabólitos secundários transformação genética fusão dos protoplastos obtenção de plantas haplóides .

darem origem a novas plantas sem a intervenção de um processo de reprodução sexuada.2 – Totipotência da célula vegetal As células de um organismo têm uma origem comum. em cultura. base da reprodução assexuada diferenciação desdiferenciação células do parênquima A totipotência constitui a base da reprodução assexuada devido à capacidade que as células vegetais.2. O corpo da planta à excepção dos gametófitos é um clone do zigoto. o ovo ou zigoto. .

2.4 Métodos convencionais de multiplicação vegetativa reprodução por estaca enxertia limitações número reduzido de plantas obtidas morosidade do processo disponibilidade de meios necessários para a concretização dessas técnicas . a multiplicação vegetativa nas condições naturais terá essencialmente um papel benéfico a curto prazo. como Margara (1984).3 .2. permitindo a colonização acelerada de novos habitats.Multiplicação Vegetativa Segundo alguns autores.

Permite a produção de clones ou de novas variedades Essencial na regeneração de plantas a partir de células geneticamente modificadas. . Possibilita a propagação de espécies difíceis de clonar por técnicas convencionais. Pode ser utilizada para o estabelecimento de bancos de germoplasma.5 – A cultura in vitro de plantas Obtenção de um número elevado de plantas para ensaios na agricultura num curto espaço de tempo partindo de um explante diminuto. Permite uma rápida troca de material vegetal.2.

1 – Condições de Cultura Recipientes ou frascos Erlenmeyers Caixas de Petri Tubos de ensaio Utilizam-se tampas de plástico ou metálicas para reduzir as trocas gasosas entre o explante e o exterior sendo o uso de tubos de ensaio tapados com rolhas de algodão cardado e gaze o mais frequente.5.2. .

sempre que possível. Factores Físicos Temperatura (22 -25 °C) Luz tubos fluorescentes Humidade relativa obliteração dos recipientes .Assepsia A realização das culturas deve ser feita. em camaras de fluxo onde o ar é filtrado assegurando assim a supressão de microrganismos vindos do exterior.

a cisteína.cálcio B.oxigénio . potássio. Fe. a riboflavina e a piridoxina (vitamina B6).ácido nicotínico.azoto.8 Elementos Minerais Macroelementos Microelementos Carbono . Mo e Zn Vitaminas e aminoácidos Tiamina (vitamina B1).O Meio de Cultura meio solido (gelificado) agar Ao solidificar o meio forma um complexo coloidal que facilmente liberta os iões meio liquido propagação de plantas em ecossistemas aquáticos pH dos meios 5. Glicina Outros Compostos ácido ascórbico.6 – 5. enxofre. fosforo. Mn.hidrogénio . Cu. magnésio . o ditiotreitol e a polivinilpolipirrolidona leite de coco sacarose auxinas citocininas .

Esses tipos são a proliferação de meristemas existentes no explante original. Meristema apical do caule fitómeros Cada fitómero é. consoante o material inicial e o tipo de resposta obtida.3 – CLONAGEM DE PLANTAS – Proliferação de meristemas e organogénese Os métodos de micropropagação de plantas podem dividir-se em três tipos diferentes. O meristema apical do caule constitui para a edificação da planta através de: funções de iniciação de órgãos Tecidos Sinais de comunicação Da sua própria manutenção Um segundo tipo de organização para o meristema apical do caule baseia-se numa divisão de em zonas: Zona central Zona periférica Zona de nervura . potencialmente uma planta. Tipos de Meristemas Do ponto de pista da micropropagação os meristemas mais interessantes são os meristemas apicais do caule e os meristemas axilares. a indução de organogénese e a formação de embriões somáticos. uma vez que apenas lhe falta uma raiz para que assim se possa considerar.

Propagação em larga escala aplicação mais importante da cultura de meristemas As 3 fases de Murashige (1974): Estabelecimento dos explantes in vitro Multiplicação Enraizamento Fase inicial de preparação da planta mãe Fase final de aclimatização. são problemáticos. Limitações difícil isolar apenas o meristema e. a dormência.Funcionamento do meristema possibilidade de estudar os mecanismos que controlam o crescimento. os ciclos reprodutivos o outros processos fisiológicos que ocorrem naquela zona. a expressão de genes homeóticos ou de outros genes. a sua manutenção e crescimento in vitro . noutros casos. In vitro Solo .

Capitulo 4 – Embriogénese Somática Embriões com origem em células do corpo (soma) podem também ser produzidos. quimeros. Os embriões zigóticos têm origem unicelular enquanto os somáticos podem ter origem unicelular ou multicelular. No uso de embriões somáticos para a regeneração de plantas geneticamente transformadas é fundamental possuírem uma origem unicelular porque se forem de origem pluricelular pode-se correr o risco de as plantas regeneras apresentarem sectores transformados e outros não. . Estes embriões designados “somáticos” são como os zigóticos e possuem o mesmo genótipo da planta mãe.

Foi também possível verificar que manipulações do DNA através da indução de mutações com obtenção de haplóides. na última metade do seculo XX. O uso de engenharia genética associadas à totipotência da célula vegetal é cada vez mais frequente. poliplóides e aneuplóides permitiam obter novas plantas com novas características com potencial interesse sob vista agronómico. ganhos de produtividade absurdos. .Capitulo 8 – Transformação genética de plantas A transferência de genes de plantas selvagens. Assim constata-se que todas as variedades de plantas que actualmente consumimos resultaram de profundas alterações genéticas introduzidas no seu genoma por cruzamentos ou por manipulações grosseiras do seu DNA. apresentando características de interesse. Tudo começou na planta do tabaco e desde então começou a ser realizada em centenas de espécies. para as plantas cultivadas ou a combinação das características dos progenitores nos híbridos tornou-se uma prática comum e permitiu.

O processo repetese de 3 a 5 vezes até temos uma nova variedade que possui o genoma da variedade inicial mais o gene ou genes com características que se pretende preservar. A escolha da espécie mais produtiva e/ou resistente a doenças/fungos ira passar essas características à variedade que queremos manter. O processo descrito foi a inserção de novos genes na planta original sem recorrer a qualquer manipulação laboratorial do ADN. O resultado é uma 3ª geração (F3) onde se voltam a seleccionar aquelas que apresentam características fenotípicas da variedade inicial resistentes a fungos.Transferência de genes por cruzamento e selecção A 1ª fase de um melhoramento clássico inicia-se com a escolha criteriosa das plantas a cruzar. . A 2ª fase do processo consiste em cruzar a variedade que se pretende melhorar (planta recorrente) com a variedade resistente (planta doadora).

Indução dos genes vir O sistema que permite as células bacterianas detectar os sinais químicos emitidos pelas células vegetais componentes é um sistema de dois componentes constituído pelos produtos dos genes vir A e vir G. flagelada.Plantas geneticamente modificadas por engenharia genética As plantas podem ser geneticamente modificadas pela inserção de genes ou pela inactivação dos mesmos. pertencente à família Rhizobiaceae. inserção do gene (ou genes) nas células vegetais utilizando um vector Agrobacterium tumefaciens É o método de transformação mais utlizado recorrendo ao Agrobacterium. Processamento do T-ADN A activação dos genes vir tem como consequência a clivagem de uma molécula de TDNA de cadeia única do plasmídeo Ti e que irá ser incorporada nas células vegetais. que vive no solo e que é responsável por uma doença das plantas chamada “crown gall” (galha-do-colo). fitopatogénica. genes que se exprimem constitutivamente na bactéria. . uma bactéria Gram-.

tumefaciens A transformação das células vegetais com A. tumefaciens pode ser utilizada como um veículo para a introdução de genes nas plantas permitindo assim a obtenção de plantas geneticamente transformadas. Genes quiméricos O gene quimérico deve possuir uma sequência responsável pela produção de um factor que permita a selecção ou a identificação das células transformadas. . Para que o plasmídeo Ti seja utilizado é necessário estar desarmado e perca a capacidade de infectar os tecidos da planta. tumefaciens na transformação experimental de plantas A A.A utilização de A. A transformação genética de plantas com A. tumefaciens apresenta algumas vantagens como sejam o facto de se tratar de um sistema natural capacitado para a introdução de ADN em células vegetais de forma precisa e estável. Esses genes são designados por marcadores e podem ser genes repórter ou genes de selecção.

Capitulo 9 – Plantas com novas características obtidas por transformação genética resistência a factores bióticos ou abióticos produção de proteínas recombinantes interesse farmacêutico modificação dos alimentos suprir deficiências nutritivas resultantes de dietas alimentares deficientes Plantas tolerantes a herbicidas princípio activo é a fosfinotricina (PTT) herbicida não toxico para os animais. efectivo a baixas concentrações e facilmente decomposto no solo sem permanecer muito tempo no ecossistema. Plantas resistentes a insectos toxina Bt produção de proteínas antivirais Plantas resistentes a agentes patogénicos Plantas resistentes a factores abióticos Produção de compostos de interesse biorreactores produção de anticorpos em plantas .

Alteração das propriedades dos alimentos β-caroteno arroz geneticamente transformado objectivo de colmatar as deficiências em vitamina A Alterações no amadurecimento dos frutos Tomate Flavr Savr obtido através da inserção na planta de uma sequencia codificadora para uma RNA antisense da enzima poligalacturonase (PG). Alterações na coloração das flores modificação das vias de síntese dos pigmentos antociânicos. Alteração nos teores de lenhina Esta manipulação tem dois objectivos como a redução dos teores em lenhina sem que isso afecte a arquitectura e a estrutura do lenho e desse modo interfira no desenvolvimento das árvores e as tentativas de modificar a composição da lenhina de forma a tornar a sua separação de celulose mais eficaz. ..

.Rendimento das culturas Redução de perdas devido a factores bióticos e abióticos Aumento de rendimento tornando as plantas mais eficazes em termos fotossintéticos Tecnologia Terminator TPS ( Terminator Protection System) afecta a viabilidade de sementes impedindo que elas sejam utilizadas em novos ciclos de propagação.

Mas no final a verdade e a ciência triunfam. que o negam.Capitulo 10 – Impacto das plantas geneticamente modificadas Saúde Pública Toxicidade Doenças Cancerígenas Ambiente Pólen milho Bt diminuía a taxa d sobrevivência das borboletas monarca Sem fundamento cientifico. “Cada vez que se cria um novo conhecimento há pessoas que resistem.” .

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