SADRŽAJ

1. RAD U BIOLOŠKOJ LABORATORIJI.............................................................3

1.1. OPŠTA PRAVILA RADA U LABORATORIJI.......................................................3
1.2. LABORATORIJSKA OPREMA..............................................................................3
1.3. LABORATORIJSKO SUĐE....................................................................................4
1.4. PRANJE LABORATORIJSKOH SUĐA.................................................................5
1.5. PRANJE PREDMETNIH I POKROVNIH STAKALA..........................................5
2. MIKROSKOP I TEHNIKA MIKROSKOPIRANJA........................................6
2.1. DIJELOVI MIKROSKOPA.....................................................................................6
2.1.1. Mehanički dijelovi..............................................................................................6
2.1.2. Optički dijelovi..................................................................................................8
2.2. REZOLUCIJA MIKROSKOPA...............................................................................9
2.3. ČUVANJE MIKROSKOPA...................................................................................10
2.4. TEHNIKA MIKROSKOPIRANJA........................................................................11
2.5. MIKROSKOPSKA MJERENJA...........................................................................12
3. PRIPREMA PRIVREMENIH MIKROSKOPSKIH PREPARATA...........13
3.1. METODE I TEHNIKE...........................................................................................13
3.2. SKVOŠ PREPARAT.............................................................................................14
3.2.1. Opšti princip pripremanja skvoš preparata......................................................14
3.3. PRIPREMA PREPARATA SA MATERIJALOM IZ USTA..................................16
3.4. PREPARAT VISEĆA KAP....................................................................................17
4. PRIPREMA TRAJNIH MIKROSKOPSKIH PREPARATA........................19
4.1. UBIJANJE I FIKSIRANJE....................................................................................19
4.1.1. Fiksativi koji se najčešće upotrebljavaju........................................................20
4.1.2. Fizička fiksacija...............................................................................................22
4.2. ISPIRANJE MATERIJALA..................................................................................23
4.3. DEHIDRATACIJA I KONZERVANCIJA MATERIJALA....................................23
4.4. METODE PRAVLJENJA PRESJEKA.................................................................25
4.5. INKLUZIJA U KANADA BALZAM...................................................................25
4.6. OBILJEŽAVANJE PREPARATA..........................................................................25
5. BOJENJE PREPARATA........................................................................................26
5.1. BOJE I RASTVORI BOJA................................................................................26
5.2. HEMIJSKA OSNOVA BOJENJA.........................................................................27
5.3. METODE BOJENJA............................................................................................27
5.3.1. Hematoksilinska metoda.................................................................................28
Delafildov hematoksilin.....................................................................................................28
5.3.2. Dvojno bojenje preparata...............................................................................32
5.3.3. Ostale metode..................................................................................................33
5.4. REAGENSI ZA PROSVJETLJAVANJE I NAČIN UPOTREBE.........................36
6. PARAFINSKA METODA PRAVLJENJA MIKROSKOPSKIH PREPARATA
............................................................................................................................................38
6.1. INKLUZIJA MATERIJALA U PARAFIN............................................................38
6.2. KALUPLJENJE.....................................................................................................39
6.3. PRIPREMANJE PARAFINSKIH BLOKOVA......................................................41
6.4. PRIPREMANJE PREDMETNIH I POKROVNIH STAKALA............................41
6.5. PRAVLJENJE PRESJEKA MIKROTOMOM......................................................42

1
 6.6. UPOTREBA MIKROTOMA.................................................................................43
6.7. TEŠKOĆE PRI SJEČENJU MIKROTOMOM....................................................44
6.8. LIJEPLJENJE PRESJEKA NA PREDMETNO STAKLO....................................45
6.8.1. Pripremanje i upotreba Majerovog ljepila.......................................................46
6.9. RAZVLAČENJE PARAFINSKIH PRESJEKA...................................................46
6.10. DEPARAFINISANJE..........................................................................................47
7. TEHNIKA SMRZAVANJA TKIVA....................................................................48
8. SPECIFIČNE METODE PRIPREME CITOLOŠKIH PREPARATA.......49
8.1. FRAKCIONISANJE I CENTRIFUGIRANJE ĆELIJE.........................................49
8.2. MACERACIJA.......................................................................................................49
8.3. GLICERIN - ŽELATINSKI PREPARAT...............................................................50
9. PRAKTIČNA UPOTREBA ELEKTROFOREZE..........................................51
9.1. ANALIZA IZOLOVANE DNK.............................................................................51
9.2. ANALIZA IZOLOVANE RNK.............................................................................53
9.3. ANALIZA IZOLOVANIH PROTEINA................................................................54

2
 1. RAD U BIOLOŠKOJ LABORATORIJI

Prilikom rada u biološkoj laboratoriji često se koriste različite hemikalije od

kojih su neke dosta agresivne i nagrizaju materijale sa kojima dođu u kontakt,
izazivaju burne reakcije, ili su njihova isparenja štetna po zdravlje jer nagrizaju
sluzokožu usta, grla i nosa, mogu izazvati oštećenje očiju itd. Neke hemikalije, kao
što su npr. formalin, ksilol i druge imaju kancerogeno i teratogeno dejstvo, pa pri
rukovanju sa njima treba biti posebno oprezan. Zbog svega ovoga se pri radu u
biološkoj laboratoriji mora pridržavati određenih pravila.

1.1. OPŠTA PRAVILA RADA U LABORATORIJI

1. Nošenje radnog mantila smanjuje rizik kontaminacije odijela i raznošenje

materijala izvan laboratorije. Time ujedno sprečavamo prljanje i uništavanje
odijela.
2. Pranje ruku se vrši u toku rada prema potrebi, a na kraju rada je obavezno.
3. Ne preporučuje se rad sa ogrebotinama, a naročito ne sa otvorenim ranama
na rukama.
4. U toku rada ne treba dodirivati oči, nos i usta.
5. Pri radu u laboratoriji nije dozvoljeno uzimati hranu, piti ni pušiti.
6. Dugačka kosa treba biti svezana u rep da se ne bi spalila radom kraj
plamenika ili špiritusne lampe.
7. Radno mjesto se dezinfikuje odgovarajućim sredstvom kao što je 70% etanol
ili 5% asepsol prije početka i na kraju rada.
8. Nije poželjno pipetirati hemikalije ustima. Preporučuje se upotreba propipete.
9. Sa opasnim hemikalijama se radi u digestoru. Ako laboratorija ne posjeduje
digestor, onda se obavezno radi kraj otvorenog prozora.
10. Upotrebljene pipete, epruvete i drugo suđe treba odložiti u posebne
posude sa dezinfekcionim sredstvom.
11. Po završetku rada treba pospremiti i očistiti laboratoriju.
12. Oprema i hemikalije se ne smiju iznositi iz laboratorije.

1.2. LABORATORIJSKA OPREMA

Da bi se omogućio normalan eksperimentalni rad svaka biološka laboratorija

treba posjedovati sledeću opštu opremu:
1. Tehnička i analitička vaga
1. Vodeno kupatilo – uređaj u kom se održava destilovana voda na tačno
određenoj temperaturi. Omogućuje izvođenje raličitih biohemijskih, hemijskih i
bioloških reakcija.

3
 2. Sušnica (minimum do 200°C) – uređaj za sterilizaciju različitog, uglavnom
staklenog posuđa (petrijevke, pipete, čaše, menzure, erlenmajerice itd.).
3. Termostat (minimum do 44°C) – Za gajenje različitih kultura (za klijanje
sjemena biljaka, gajenje mikroorganizama itd.) neophodno je obezbijediti
određenu temperaturu što se postiže u termostatima. Oni su najčešće metalni
sa dvostrukim zidovima koji su obloženi nekim materijalom koji je slab
provodnik toplote, npr. vatom. Između zidova se nalazi voda ili vazduh, a
zagrijavanje se vrši grijačima.
4. Centrifuga (minimum do 5000 obrtaja u minuti)
5. Frižider – za čuvanje različitih hemikalija i materijala.
6. Mućkalica – uređaj za miješanje rastvora.
7. Mikrotom – za sječenje tkiva prilikom pravljenja preparata.
8. Termometri (0-100°C)
9. Eksikator – za isušivanje u uslovima vakuuma.
10.Vakuum pumpa – za filtraciju i obezbjeđivanje vakuuma u eksikatoru.
11. Vruća ploča – uređaj koji omogućuje zagrijavanje na tačno određenu
temperaturu.
12.Magnetna mješalica
13.Spektrofotometar
14.pH-metar – uređaj za određivanje koncentracije vodonikovih jona u rastvoru.
15.Oksimetar – uređaj za određivanje koncentracije kiseonika u rastvoru.
16. Bunzenov plamenik - nastavak koji se instalira na plinsku bocu i služi za
sterilizaciju plamenom.
17. Špiritusna lampa - takođe se koristi za sterilizaciju plamenom, u slučaju da
laboratorija nema Bunzenov plamenik.
18.Set za bojenje – niz povezanih posuda u kojima se vrši bojenje preparata.
19.Destilator – uređaj za proizvodnju destilovane vode.
20. Stalak za epruvete
21. Stalak za mikroskopske preparate
22.Propipeta – gumeni nastavak koji se postavi na pipetu. Služi za uvlačenje
tečnosti u pipetu u onim slučajevima kada se ne preporučuje uvlačenje
ustima, npr. ako su u pitanju opasne hemikalije sa štetnim isparenjima

Naravno, pored ove, zavisno od specifičnosti rada u laboratoriji, potreban je i

niz drugih aparata. Ovde su pobrojani samo neki koji imaju najširu upotrebu.

1.3. LABORATORIJSKO SUĐE

U biološkim laboratorijama se upotrebljava različito stakleno suđe izrađeno od

specijalnog stakla koje podnosi zagrijavanje na visoku temperaturu.
Epruvete su izrađene od staklenih cijevi sa zaobljenim dnom i ravnim
ivicama. Postoji nekoliko vrsta epruveta, ali se najčešće koriste epruvete dužine 160-
200 mm i prečnika 16-20 mm.
Petrijeve kutije se prave od stakla ili plastike. Imaju oblik spljoštenog valjka i
sastoje se iz dva dijela, poklopca koji ima nešto veći prečnik, i dna sa nešto manjim

4
prečnikom, tako da naliježu jedan u drugi. Najčešće se koriste petrijevke prečnika 60
do 100 mm.
Pipete su dugačke, kalibrisane staklene cijevi koje su na donjem kraju
izvučene u kapilarno suženje. Služe za odmjeravanje tečnosti. Najčešće se
upotrebljavaju pipete od 1, 5 i 10 ml. Često se upotrebljavaju i tzv. Pasterove pipete
koje nisu graduisane.
Erlenmajerove boce su stakleni sudovi u obliku kupe sa kraćim ili dužim
grlićem različitog prečnika. Njihova zapremina se kreće od 10 do 5000 ml. Koriste se
za pripremu i čuvanje različitih rastvora.
Menzure su cilindrični stakleni sudovi sa ravnim dnom, a koriste se za
odmjeravanje tečnosti. Graduisane su, a zapremina im se kreće od 10 do 2000 ml.
Čaše su cilindrični stakleni sudovi čije ravno dno služi kao postolje. Kraće su i
šire od menzura.

1.4. PRANJE LABORATORIJSKOH SUĐA

Pravilno pranje laboratorijskog posuđa predstavlja jedan od preduslova za

uspješno izvođenje eksperimenata. Sudovi se peru toplom vodom sa deterdžentom,
temeljno se ispiraju u mlazu tekuće vode i potapaju se u hromsumpornu kiselinu u
trajanju od 24 sata. Nakon toga se sudovi ispiraju u tekućoj vodi, ostavljaju u
destilovanoj vodi 2-3h, a zatim se još jednom ispiraju u destilovanoj vodi.

1.5. PRANJE PREDMETNIH I POKROVNIH STAKALA

Za pripremu mikroskopskih preparata neophodna su čista predmetna i

pokrovna stakalca. Stakalca koja su ranije korištena treba držati 2 sata u rastvoru
pripremljenom od 100 dijelova sumporne kiseline, 50 dijelova kalijum dihromata i
1000 dijelova vode. Nakon toga ispiraju se vodom, kuhaju 20 minuta u 1% rastvoru
NaOH i ispiraju destilovanom vodom. Zatim se potope u razblaženu hlorovodoničnu
kiselinu i ponovo se ispiraju destilovanom vodom. Ovako pripremljena stakalca se
čuvaju u 96% etilalkoholu.
Čak se i nova stakalca trebaju pripremiti prije prve upotrebe. Ona se kuhaju
10 minuta u 1% rastvoru NaOH, ispiraju se u destilovanoj vodi, potapaju u rablaženu
hlorovodoničnu kiselinu i ponovo ispiraju u destilovanoj vodi. Njihova čistoća se
može provjeriti tako što se na suho stakalce stavi kapljica vode. Ako je stakalce čisto
kapljica će se razliti, dok se na prljavom stakalcu formiraju kapljice.

5
 2. MIKROSKOP I TEHNIKA MIKROSKOPIRANJA

Mikroskop je optički instrument koji daje uvećan lik malih objekata i njihovih
detalja. Danas se koristi više vrsta mikroskopa: svjetlosni, mikroskop sa tamnim
poljem, faznokontrastni, fluorescentni, ultraljubičasti i elektronski. Budući da se u
nastavi najviše koristi svjetlosni mikroskop, ovde će biti detaljnije opisan.

2.1. DIJELOVI MIKROSKOPA

Postoje različiti tipovi svjetlosnog mikroskopa, ali svi imaju nekoliko osnovnih
dijelova koji se mogu podijeliti na mehaničke i optičke dijelove.

2.1.1. Mehanički dijelovi

U mehaničke dijelove mikroskopa spadaju: postolje, ručica, stočić sa

mehanizmom za pomijeranje, tubus, kolijevka mikroskopa, zavrtanj kondenzora,
makrometarski i mikrometarski zavrtanj.
Stativ mikroskopa je napravljen od metala i u svom donjem dijelu je proširen,
obično u obliku potkovice, u postolje (Slika 1a) na kome stoji mikroskop. Postolje je
od teškog metala, tako da mikroskopu obezbjeđuje stabilan položaj. Kod novijih
mikroskopa u njega je ugrađen sistem za osvjetljenje. Postolje je preko nagibnog
zgloba (Slika 1c) povezano sa gornjim dijelom stativa koji se zove ručica. Ručica
(Slika b1) služi za prihvatanje, nošenje i premiještanje mikroskopa i kao nosač drugih
dijelova. Preko nagibnog zgloba mikroskop se iz vertikalnog dovodi u kosi položaj,
koji je često povoljniji za rad
Iznad nagibnog zgloba za stativ je pričvršćen stočić mikroskopa (Slika 1e). Na
sredini stočića se nalazi otvor preko koga se postavlja preparat. Kroz otvor stočića
prolaze svjetlosni zraci kojima se objekat koji posmatramo prosvjetljava. Stočić može
biti pokretan ili nepokretan. Ukoliko je pokretan pokreće se pomoću dva zavrtnja koji
se nalaze na ivici stočića, sa njegove lijeve i desne strane. Stočić se može pokretati
u svim pravcima i na taj način je omogućeno posmatraču da u vidnom polju
mikroskopa, finim pomijeranjima, pronađe odgovarajući dio preparata. Pokretan
stočić je naročito koristan pri radu sa većim uvećanjima koja zahtijevaju neznatna
pomijeranja preparata. Tako mala pomijeranja gotovo je nemoguće izvesti
slobodnom rukom. Na nepokretnom stočiću preparat se pokreće rukom sve dotle
dok se lik objekta ne pojavi u vidnom polju mikroskopa. Na stočiću se nalaze dva
metalna držača za preparat, koji su od velike koristi, čak i neophodni, ako se u toku
rada mikroskop izvodi iz vertikalnog položaja.
Tubus (Slika 1d) je metalna cijev koja na gornjem kraju nosi okular, a na
donjem, kod savremenih mikroskopa, pokretan revolver u kome se nalaze ležišta za
objektive različitog uvećanja (Slika 1f). Okretanjem revolvera dovodimo objektiv
željenog uvećanja u optičku osu mikroskopa. Objektiv je doveden u optičku osu

6
mikroskopa onda kada metalno perce, pričvršćeno na stativu, upadne u zarez na
revolveru koji se
nalazi iza tog
objektiva.

Tubus može da
bude postavljen
vertikalno ili koso. Ukoliko je postavljen koso između objektiva i okulara nalazi se
prizma koja prelama svjetlosne zrake i usmjerava ih u koso postavljen tubus. Tubus
je sa stativom pokretno spojen preko kolijevke mikroskopa. Kolijevka mikroskopa je
sistem zupčanika koji se pokreće pomoću makrometarskog i mikrometarskog
zavrtnja. Makrometarski zavrtanj (Slika 1i) služi za gruba pomijeranja tubusa na
fokusno rastojanje pri kome je lik jasno vidljiv i upotrebljava se pri radu sa manjim
uvećanjima. Pomoću mikrometarskog zavrtnja tubus se dovodi tačno u fokus.
Mikrometarski zavrtanj (Slika 1j) se upotrebljava pri radu sa većim uvećanjima.
Zavrtanj kondenzora služi za podizanje i spuštanje kondenzora, čime se
reguliše osvjetljenost preparata.

7
 2.1.2. Optički dijelovi

U optičke dijelove mikroskopa spadaju okulari, objektivi i sistem za

osvjetljavanje. Pomoću optičkih dijelova vrši se osvjetljavanje i uvećavanje lika
objekta koji posmatramo.
Sistem za osvjetljavanje se nalazi ispod stočića mikroskopa i sastoji se iz
ogledala i kondenzora. Ogledalo zauzima niži položaj i smješteno je na pokretnoj
osovini tako pričvršćeno u polukružni ram da se može pokretati u svim pravcima
(Slika 1k). Pokretljivost ogledala je veoma važna osobina, jer se zahvaljujući tome
svjetlosni zraci, koji dopiru iz različitih svjetlosnih izvora, mogu korisnije upotrijebiti u
cilju osvjetljavanja preparata. Ogledalo je okruglo, na jednoj strani ravno, a na
suprotnoj udubljeno. Pri korišćenju svjetlosti sa udaljenih svjetlosnih izvora (dnevna
svjetlost) upotrebljava se ravna strana ogledala, a u slučaju da je svjetlosni izvor
blizu (vještačka svjetlost) upotrebljava se udubljena strana ogledala.
Kondenzor se nalazi između mikroskopskog stočića i ogledala (Slika 1l).
Sagrađen je iz više sočiva koja se nalaze u zajedničkom prstenu. Kondenzor
funkcioniše kao sabirno sočivo. Pomoću njega se objekat osvjetljava širim
svjetlosnim snopom nego što bi to bio inače slučaj kada bi svjetlost dolazila samo sa
ogledala, što je od posebnog značaja kada se radi sa velikim uvećanjima. Drugim
riječima, objekat će biti prosvijetljen intenzivnijom svjetlošću nego što bi bio u istim
uslovima ako bi svjetlost dolazila samo sa ogledala. Kondenzor se može spuštati i
podizati pomoću zavrtnja (Slika 1m). Podizanjem kondenzora
svjetlost se pojačava, a spuštanjem se smanjuje. Neki
mikroskopi imaju kondenzor tako montiran da se, osim u
vertikalnom, može pomijerati i u horizontalnom pravcu. Slika 2. Objektiv
U donjem dijelu kondenzora smještena je iris-dijafragma
(Slika 1n). Pomoću nje se podešava količina svjetlosti kojom se
osvjetljava objekat koji posmatramo. Iris-dijafragma je
sagrađena od većeg broja polukružnih, čeličnih Ijuspica koje
se, pomoću jedne poluge, skupljaju ili šire i na taj način
stvaraju uži ili širi otvor za prolaz svjetlosti.
Objektivi (Slika 1g) su manje ili više složeni sistemi
centriranih sočiva koja se nalaze u kratkom cilindru (SI. 2). Na
svom gornjem dijelu cilindar ima navoje pomoću kojih se uvrće
u ležište na revolveru. Na objektivu je urezana brojka koja
označava koliko puta dati objektiv uvećava lik posmatranog objekta. Sočiva u
objektivu su plankonveksna (ravnoispupčena). Ravnom stranom su okrenuta
objektu, a ispupčenom prema oku. Od kvaliteta objektiva uglavnom zavisi i kvalitet
lika objekta koji posmatramo.
Objektiv daje stvaran, uvećan i obrnut lik. Svaki objektiv karakteriše njegova
moć razdvajanja, fokusno rastojanje i uvećanje. Slabiji objektivi imaju veće fokusno
rastojanje: 50 do 60 mm, a jači 1 do 3 mm. Moć razdvajanja objektiva je njegova
sposobnost da daje slike dve međusobno bliske tačke razdvojeno.
U odnosu na način upotrebe objektivi mogu biti suvi i imerzioni. Suvi objektivi
su oni između čijih se frontalnih sočiva i preparata nalazi vazduh. (SIika 3 lijevo). To
su objektivi manjih uvećanja: 3,2x; 10x; 40x. Imerzioni objektivi su oni čije se
frontalno sočivo mora potopiti u kap tečnosti (voda ili kedrovo ulje) koja se nalazi na
preparatu iznad objekta koji posmatramo (SIika 3 desno). Imerzioni objektivi su većih

8
uvećanja (90x, 100x). .

Slika 3. Šema presjeka suvog objektiva i preparata (lijevo) i imerzionog (desno). A - -

frontalno sočivo objektiva B - pokrovno stakalce C - predmetno stakalce

Kvalitet mikroskopske slike zavisi, između ostalog, i od količine svjetlosnih

zraka koji ulaze u objektiv. Upotrebom imerzionih objektiva, u odnosu na suve, pri
ostalim jednakim uslovima, postiže se ulazak većeg broja svjetlosnih zraka u
objektiv. Naime, svjetlosni zraci pri upotrebi suvih objektiva prolaze kroz sistem:
stakla (predmetna ploča) - vazduh - stakla (frontalno sočivo objektiva). Usljed
različitog indeksa prelamanja pojedinih sredina (stakla: 1,53; vazduh: 1:0) dolazi do
znatnog rasipanja svjetlosnih zraka pa manja količina svjetlosti ulazi u objektiv (Slika
3 lijevo)
Pri upotrebi imerzionog objektiva svjetlosni zraci prolaze kroz sistem: staklo
(predmetna ploča) - tečnost (kedrovo ulje) - staklo (frontalno sočivo imerzionog
objektiva). Pošto je indeks prelamanja stakla 1,53 a kedrovog ulja 1,51, svjetlosni
zraci prolaze kroz sredine približno istih indeksa prelamanja, te je rasipanje znatno
umanjeno. Zbog toga u objektiv ulazi mnogo više korisnih svjetlosnih zraka (Slika 3
desno) nego što je to slučaj kod suvih objektiva, a time se u znatnoj mjeri poboljšava
i kvalitet mikroskopske slike. Treba napomenuti da su imerzioni objektivi specijalno
građeni pa se zato samo oni mogu utapati u kap tečnosti na preparatu. Osim uljanih
imerzionih objektiva postoje i takvi koji se utapaju u kapljicu vode.
Nešto jednostavnije od objektiva sagrađeni su okulari. Njih možemo uporediti
sa lupom. Okulari se nalaze na gornjem dijelu tubusa (Slika 1h) i na svakom je
upisan broj (7x, 10x, 15x) koji označava njegovu moć uvećanja. Mikroskopi koji imaju
jedan okular se nazivaju monokularni, a oni koji imaju dva okulara binokularni.
Postoje i mikroskopi sa dvostrukim okularima koji su namješteni u horizontalnoj cijevi
tako da dvije osobe mogu istovremeno posmatrati preparat.

2.2. REZOLUCIJA MIKROSKOPA

Rezolucija ili moć razdvajanja mikroskopa može da se formuliše na sledeći

način: to je veličina najmanjeg dijametra čestice koju jasno vidimo ili najmanje
rastojanje između dve linije koje možemo odvojeno vidjeti u mikroskopu. Moć
razdvajanja zavisi od numeričke aperture objektiva, talasne dužine svjetlosti i ugla
pod kojim svjetlost pada. Ukoliko je numerička apertura veća, talasna dužina
svjetlosti manja i osvjetljenje koso, moć razdvajanja je bolja.

9
 Numerička apertura je mjera za moć razdvajanja objektiva i označena je na
samom objektivu. Njene vrijednosti se kreću od 0,11 do 1,3. Razdvojna moć
objektiva se izračunava tako što se talasna dužina svjetlosti pri kojoj posmatramo
podijeli sa vrijednošću numeričke aperture. Npr. ako je talasna dužina svjetlosti 560
nm, a numerička apertura 1, razdvojna moć je 560 nm. To znači da taj objektiv
razdvaja i čini vidljivim dva objekta koja su na međusobnoj udaljenosti od 560 nm.
Jedna od osnovnih karakteristika mikroskopa je njegovo opšte uvećanje. Opšte
uvećanje mikroskopa (Um) određuje se kao proizvod uvećanja objektiva (Uob) i
uvećanja okulara (Uok), a izražava se formulom:

Um= Uob x Uok

Ako objektiv uvećava lik posmatranog objekta 90x, a okular 15x, tada će opšte
uvećanje mikroskopa iznositi 1350x. Upotrebom okulara većeg uvećanja (20x) neće
se dobiti bolji kvalitet slike posmatranog objekta, jer smo prešli granicu tzv. korisnog
uvećanja mikroskopa. Izračunato je da korisno uvećanje mikroskopa nije veće od
1300 do 1450 puta. Postavlja se pitanje kako izabrati okular maksimalnog uvećanja
u okviru korisnog uvećanja mikroskopa. Pretpostavimo da radimo sa objektivom 40x
čiji je aperturni ugao 0,65. Korisno uvećanje je 1000 x 0,65 = 650x. Kada korisno
uvećanje podijelimo uvećanjem objektiva koji koristimo (40x) dobićemo maksimalno
korisno uvećanje okulara, u datom primjeru 16x. Korišćenje jačih okulara negativno
bi uticalo na kvalitet lika, jer se javlja difrakcija svetlosti.

2.3. ČUVANJE MIKROSKOPA

Pri radu sa mikroskopom posebnu pažnju treba obratiti na prenošenje

mikroskopa. Mikroskop se isključivo prenosi ili pomijera na taj način što se jednom
rukom drži za ručicu, a drugom za postolje.
Kao što je već ranije napomenuto od kvaliteta optičkih dijelova mikroskopa
zavisi i kvalitet lika objekta koji dobijamo, pa prema tome okulare i objektive treba
posebno čuvati i njegovati. Njihova sočiva treba da su uvijek čista. Na početku i na
kraju rada, a po potrebi i u toku rada, sočiva treba očistiti mekom, i za tu svrhu
specijalno napravljenom četkicom ili mekom krpom koja ne ostavlja tragove. Ukoliko
se prašina nalazi sa unutrašnje strane sočiva ono se odvrne i na isti način očisti, no
ovu radnju bolje je prepustiti specijalizovanim radionicama. Sočiva se nikad ne
dodiruju prstima, niti se sa njih prašina otklanja duvanjem.
Pri mikroskopiranju se često na metalnim dijelovima mikroskopa kondenzuje
vodena para (usljed disanja) koju treba ukloniti brisanjem.
Po završenom mikroskopiranju makrometarskim zavrtnjem podići tubus
mikroskopa i ukloniti preparat, pokretanjem revolvera u optičku osu dovesti najmanji
objektiv, a sve mehaničke i optičke dijelove obrisati i mikroskop vratiti u kutiju.
Mikroskop treba čuvati i kada se ne upotrebljava i to naročito od prašine,
toplote, neposrednog djelovanja sunčeve svjetlosti, vlage i isparenja raznih
hemikalija.

10
 2.4. TEHNIKA MIKROSKOPIRANJA

Opšte napomene. Pri mikroskopiranju se mogu koristiti dnevna difuzna ili

vještačka svjetlost. Iako je dnevna svjetlost veoma prijatna za rad, pri dužoj upotrebi
mikroskopa prednost ima vještačka svjetlost.
Visina stola i stolice treba da bude takva da posmatrač može duže vremena
udobno i bez naprezanja da radi.
Pred početak rada mikroskop se izvadi iz kutije, postavi na radno mjesto i
mekom krpom pažljivo očisti od prašine.
Poslije završenog mikroskopiranja preparat se skida sa stočića, u osu se
postavlja najmanji objektiv, mikroskop se obriše i pažljivo, držeći ga jednom rukom
za ručicu a drugom za postolje, stavlja u kutiju.
Uzimanje i prenošenje mikroskopa vrši se isključivo držanjem za ručicu i
postolje istovremeno.
Mikroskop se postavlja tako da ogledalo bude uvijek okrenuto svjetlosnom
izvoru, a ručica mikroskopa posmatraču.
Dovođenje objektiva u optičku osu mikroskopa. - Kada mikroskop stavimo
na radno mjesto dovodimo objektiv najmanjeg uvećanja u optičku osu mikroskopa.
Objektiv se dovodi u optičku osu mikroskopa okretanjem pokretnog dijela revolvera.
Na revolveru se, prema svakom objektivu, nalazi ispupčenje sa zarezom. Kada,
okrećući revolver, u zarez na njemu upadne perce koje se nalazi na fiksiranom dijelu
revolvera ispod tubusa, čuje se karakterističan zvuk, što je znak da se dati objektiv
nalazi u optičkoj osi mikroskopa.
Traženje vidnog polja mikroskopa. Kada smo objektiv najmanjeg uvećanja
postavili u optičku osu mikroskopa pristupamo traženju vidnog polja. Mikroskopira se
uvijek lijevim okom, a desno je otvoreno. Ovo je naročito važno pri crtanju preparata.
Ma koliko teškoća takav način rada u početku bude izazivao, vremenom se uvježba.
Prema tome, jedno od pravila pri mikroskopiranju je da su oba oka otvorena. Takođe
treba istaći da se mikroskopira bez naočara, osim ako je posmatrač jako kratkovid.
Traženje vidnog polja vrši se na sledeći način: gledajući kroz okular okrećemo
ogledalo prema svjetlosnom izvoru sve dotle dok ne ugledamo ravnomjerno kružno
vidno polje mikroskopa. Pronalaskom vidnog polja mikroskop je pripremljen za rad
pa se vrši fokusiranje.
Fokusiranje. Na stočić mikroskopa staviti preparat i pristupiti traženju jasnog
lika objekta koji želimo da proučavamo. Preparat se stavlja na stočić tako da se
objekat našeg ispitivanja nalazi preko otvora stočića i, od prilike, ispod sočiva
objektiva. Gledajući kroz okular pažljivo pomijeramo preparat sve dok se u vidnom
polju ne pojavi sijenka. Tada preparat više ne pomijeramo već pomoću
makrometarskog zavrtnja pažljivo podižemo tubus sve dotle dok ne ugledamo jasan
lik objekta koji posmatramo. Pri ovome tzv. malom uvećanju (ono se kreće od 8x do
10x) pregledamo preparat, uočimo njegove osnovne karakteristike, nacrtamo šemu i
izaberemo najpogodnije mjesto za detaljnije proučavanje građe pri većem uvećanju.
Zatim, ne pomijerajući preparat, okretanjem revolvera dovodimo u optičku osu
mikroskopa objektiv većeg uvećanja (40x, 45x). Pomoću mikrometarskog zavrtnja
izoštrimo lik objekta koji posmatramo.
Jedno od osnovnih pravila fokusiranja je da se tubus pri radu sa malim
uvećanjem prvo spusti na 0,5 cm od preparata, što se posmatra sa strane, a zatim
gledajući kroz okular, tubus se podiže sve dok se ne pojavi lik objekta u vidnom polju
mikroskopa. Fokusira se uvijek odozdo na gore.

11
 Pokretanje tubusa pri upotrebi objektiva manjih uvećanja vrši se uvijek
makrametarskim zavrtnjem, a pri radu sa objektivima većih uvećanja isključivo se
koristi mikrometarski zavrtanj za fokusiranje.

Pri upotrebi imerzionih objektiva postupak je sledeći:

1. pomoću objektiva manjeg uvećanja pronaći lik objekta

2. podići tubus toliko da donja ivica objektiva bude udaljena oko 2 cm od
preparata
3. na preparat staviti kap imerzionog ulja (kedrovo ulje)
4. okretanjem revolvera dovesti u optičku osu mikroskopa imerzioni objektiv
5. gledajući sa strane, polako i veoma pažliivo spuštati tubus sve dok se sočivo
6. imerzionog objektiva ne utopi u kedrovo ulje
7. spuštati objektiv sve dok ne dođe u neposrednu blizinu preparata, a zatim
fokusirati gledajući kroz okular
8. poslije rada imerzioni objektiv odmah očistiti od ulja mekom lanenom krpom
koju prethodno treba Iako natopiti ksilolom, ili još bolje, medicinskim benzinom
budući da ksilol nagriza sočiva objektiva. Za čišćenje se nikada ne
upotrebljava alkohol! Poslije čišćenja još jednom obrisati objektiv mekom i
suvom krpom i ostaviti ga na mjesto.

2.5. MIKROSKOPSKA MJERENJA

Veličina ćelije, određene ćelijske komponente ili čitavog organizma (ako je

riječ o organizmima mikroskopskih razmjera) se može odrediti pomoću okular-
mikrometra koji se postavlja na svjetlosni mikroskop.
Okular-mikrometar (Slika 4) je obično okruglo staklo koje se može umetnuti u
okular mikroskopa. Na njemu se nalazi skala koja je najčešće dužine 5,0 mm i
izdijeljena je na 50 podioka. Vrijednost jednog podioka na okular-mikrometru se
određuje pomoću objektiv-mikrometra.
Objektiv-mikrometar (Slika 5) ima izgled predmetnog stakalca na kom je
ugrađena skala dužine 1,0 mm, a podijeljena je na 100 dijelova. Prema tome,
rastojanje između dva podioka iznosi 0,01 mm ili 10,0 mikrometara.

Vrijednost podioka na okularnom mikrometru se određuje tako što se okularni

mikrometar postavi u okular, a objektivni na stočić mikroskopa. Podešavanje

12
objektivnog mikrometra se vrši tako što se prva lijeva crta na njemu (označena sa 0)
poklopi sa prvom lijevom crtom na okular-mikrometru (takođe označena sa 0). Zatim
se skale prate udesno dok se ne pronađe mjesto gdje se poklapa podiok objektiv sa
podiokom okular-mikrometra. Izbroji se broj podioka i pošto se zna da vrijednost
jednog podioka na objektiv-mikrometru iznosi 0,01 mm, izračuna se vrijednost
jednog podioka na okular-mikrometru.
Na primjer, ako se poklopi četvrti podiok na objektiv-mikrometru i šesnaesti
podiok na okular-mikrometru, vrijednost jednog podioka okular mikrometra iznosi:
0,01x4/16 = 0,0025 mm ili 2,5 mikrometara. Kada se dobije vrijednost jednog
podioka na okular mikrometru na stočić mikroskopa se stavi preparat i izmjeri
veličina posmatranog objekta.
Vrijednost podioka se određuje za svaku kombinaciju objektiva i okulara.

3. PRIPREMA PRIVREMENIH MIKROSKOPSKIH PREPARATA

Često se u biološkim laboratorijama pripremaju privremeni mikroskopski

preparati koji se koriste kratak vremenski period, nakon čega dolazi do njihovog
isušivanja i deformacije posmatranog materijala.

3.1. METODE I TEHNIKE

Pod pojmom mikroskopske tehnike podrazumijeva se opis postupaka koji je

primijenjen, kako pri neposrednom posmatranju živog materijala, tako i metode
pripremanja privremenih i trajnih preparata.
Obradu materijala i pravljenje mikroskopskih preparata moguće je podijeliti u
nekoliko radnih faza: ubijanje i fiksiranje, ispiranje, siječenje (slobodnom rukom ili
mikrotomom), bojenje, inkluzija u materiju u kojoj može da se sačuva duže vremena.
Sve one zajedno čine jedinstven postupak čiji je krajnji cilj dobijanje privremenog ili
trajnog mikroskopskog preparata.
Prije nego što se pristupi pravljenju preparata neophodno je izvršiti prethodna
orijentaciona posmatranja na živom materijalu u cilju provjeravanja podobnosti
materijala u vezi sa postavljenim zadatkom, određivanja najpogodnijeg fiksativa i
ustanovljavanja karaktera tkiva od kojih je organ sagrađen, jer od svega toga zavisi
primjena odgovarajućih mikrotehničkih postupaka. Osim toga, proučavanja na živom
materijalu sama po sebi su veoma značajna, često i nezamjenjiva (na primjer:
kretanja citoplazme), i zato, kad god je to moguće, treba vršiti paralelno proučavanje
na živom i fiksiranom materijalu. Ove dve metode se uzajamno dopunjuju, a nikako
jedna drugu ne isključuju.

13
 3.2. SKVOŠ PREPARAT

U savremenoj mikroskopskoj tehnici, posebno pri proučavanju procesa

ćelijske diobe, određivanju broja hromozoma i analizi kariotipova, primjenjuje se
tehnika pravljenja skvoš preparata (engleski: squash - gnječiti, spljeskati). Skvoš
preparati su po svome karakteru najčešće privremeni, ali i oni se mogu posebnim
postupkom prevesti u trajne. Osnovna karakteristika skvos preparata je da se
materijal poslije fiksiranja, ispiranja i bojenja macerira i na mikroskopu posmatra i
analizira ustvari macerirano tkivo.
S obzirom na široku primjenu ove metode postoji niz specifičnih postupaka u
svim navedenim fazama rada.

3.2.1. Opšti princip pripremanja skvoš preparata

Skvoš preparati se prave od mladih biljnih organa čije se ćelije nalaze u fazi
intenzivne deobe (vrhovi korjena, mladi prašnici, mladi koleoptili i mladi listovi).
Materijal se često prije fiksiranja mora još i specijalno obraditi, posebno ako se
javljaju teškoće pri brojanju hromozoma. Najčešći reaktivi koji se u tu svrhu
upotrebljavaju su hloralhidrat, kolhicin, paradihlorbenzol, 8-hidroksihinolin i u

poslednje vrijeme enzimi (citaza). Pri radu sa ovim reaktivima nužno je zaštititi ruke
gumenim rukavicama. .
Hloralhidrat sa koristi u vidu 0,3 do 1 % vodenog rastvora. U ovom reaktivu
materijal se drži 1 sat, a zatim se isto toliko dugo ispira u vodovodnoj vodi i još 2 do
4 sata ostavlja u vlažnoj komori, pa tek onda fiksira. Hloralhidrat se koristi u cilju
postizanja skraćivanja hromozoma. .
Prije fiksiranja materijal, na kome želimo da ispitujemo broj, raspored i građu
hromozoma, obrađuje se 0,01 - 0,05% rastvorom kolhicina u trajanju od 2 sata.
Zasićen rastvor paradihlorbenzola se takođe koristi kao sredstvo u
prethodnoj obradi vrhova korjenčića. Zasićen rastvor dobija se rastvaranjem 5 do 10
grama kristala paradihlorbenzola u 500 ml destilovane vode. Ovaj rastvor se u
zatvorenoj posudi ostavlja u termostatu 10 do 12 sati na temperaturi od 60°C. U
ovako pripremljenom rastvoru materijal sa drži 2 do 3 sata prije fiksiranja i to na
temperaturi izmedu 12 i 16°C.
8-hidroksihinolin se upotrebljava kao 0,002 M rastvor pri temperaturi od 10
do 14°C. Materijal u njemu provodi 3 sata i poslije ispiranja u vodovodnoj vodi se
fiksira.
Za skvoš preparate materijal se najčešće fiksira u glacijalnoj sirćetnoj kiselini i
apsolutnom alkoholu u odnosu 3:1 ili u fiksativu Karnoa. Vrijeme koje materijal
provodi u fiksativu određeno je izborom fiksativa i karakteristikama samog materijala.
Tako na primjer u fiksativu Karnoa materijal ostaje 2 do 12 sati. U zavisnosti od
prirode materijala, u navedenim granicama, određuje se vrijeme fiksiranja. Materijal
na kome želimo da brojimo hromozome fiksira se na nižim temperaturama koje se
kreću izmedu +2 i +3°C.
Poslije fiksiranja objekti se ispiraju u 70% alkoholu. U ovom alkoholu materijal
može ili da se konzervira iIi se iz njega odmah dalje sprovodi.

14
 Objekti se poslije ispiranja maceriraju. Maceriranje se obavlja na više načina:
prokuhavanjem u boji, 45% glacijalnom kiselinom, 40-45% propionskom kiselinom, u
1 n sonoj kiselini.
Sledeća faza u pravljenju skvoš preparata je bojenje. Za bojenje se koristi više
boja: acetokarmin, acetorsein, acetolakmoid i metilensko plavo.
Pripremanje boja.
Acetokarmin. 1 do 2 gr karmina rastvoriti u 45 ml glacijalne sirćetne kiseline i
55 ml destilovane vode. Rastvor boje uparavati 30 do 60 minuta. Kada se ohladi
tamno crveni rastvor karmina se profiltrira i ostavlja u dobro zatvorenoj posudi sve do
upotrebe.
Acetorsein. 1 gr orseina rastvoriti u 45 ml vrele sirćetne kiseline i ostaviti da
se ohladi. Kada se rastvor ohladi dodati 55 ml destilovane vode, dobro izmiješati,
profiltrirati i boja je spremna za upotrebu.
Acetolakmoid. 2 gr lakmoida rastvoriti u 100 ml 45% sirćetne kiseline i
uparavati do suve.supstance (oko 2 sata). Kada se završi uparavanje, ponovo dodati
sirćetnu kiselinu do nivoa zapremine na početku uparavanja. Prije upotrebe boja se
filtrira.
Metilensko plavo. 100 do 500 mg metilenskog plavog rastvoriti u 100 ml
destilovane vode. Poslije filtriranja boja se može koristiti.

Iz boje se materijal prenosi na predmetno stakalce u kap 45% sirćetne kiseline

iIi u hloralhidrat (5 gr hloralhidrata rastvoriti u 2 ml destilovane vode), prekriva se
pokrovnim stakalcem i pritišće. Pritiskanje se vrši preko filter papira, najbolje
običnom gumicom za brisanje. Pritisak treba da bude takve jačine da se pod
njegovim dejstvom tkiva razdvoje na pojedinačne ćelije, a da se pri tome ne razbije
stakalce. Na ovaj način napravljen je privremeni skvoš preparat.

U cilju jasnijeg sagledavanja pravljenja skvoš preparata navešćemo jednu od

većeg broja šema koje se koriste u mikroskopskoj tehnici:

 fiksiranje: glacijalna sirćetna kiselina - apsolutni alkohol (3:1) u trajanu od 2

sata
 ispiranje: u 70% alkoholu (sve dok se osjeća miris sirćetne kiseline) u vodi
 maceracija: u 1n sonoj kiselini na 60°C nekoliko sekundi ili minuta, ili samo
prokuhavanje u boji
 bojenje: bojenje u acetokarminu, acetorseinu i acetolakmoidu traje 3 do 5
minuta. Pri bojenju se materijal zagrijava. Kada se maceriranje vrši u boji
onda ona treba više puta da proključa, a to se postiže primicanjem i
odmicanjem epruvete plamenu špiritusne lampe.
 Skvoš preparat: materijal se prenosi na predmetno staklo u kap 45% sirćetne
kiseline iIi hloralhidrata, pokriva se pokrovnim staklom, pritišće i spreman je
za mikroskopsku analizu.

Od privremenih, moguće je posebnim postupkom dobiti trajan skvoš preparat.

Jedan od načina za pravljenje takvih preparata predložili su K on že r i i Fer č a j I
d, a sastoji se u sledećem: privremeni skvoš preparat postavlja se na površinu
parčeta suvog leda 1 do 1,5 minuta. Zatim se nekim instrumentom udalji pokrovno

15
stakalce, a na predmetnom ostaje zalijepljen materijal. Ovako pripremljen preparat
dalje se sprovodi kroz 96% alkohol, apsolutni alkohol, apsolutni alkohol-ksilol u
odnosu 1: 1, ksilol i na kraju se preko materijala stavlja kanada balzam i pokriva se
čistim pokrovnim stakalcem. U svakom od navedenih agenasa preparati ostaju 2 do
5 minuta.

3.3. PRIPREMA PREPARATA SA MATERIJALOM IZ USTA

Budući da su u ustima stalno prisutne rastvorene hranjive materije i sitni

komadići hrane, kao i stabilni uslovi vlažnosti i temperature, usna šupljina predstavlja
veoma povoljno stanište za rast različitih vrsta mikrooorganizama. Tu se mogu naći
brojne bakterije iz rodova Streptococcus, Micrococcus, Staphylococcus, protozoe
kao što je Entamoeba gingivalis, gljivice Candida, Aspergilus, Penicillium,
Saccharomyces itd.
Za pripremu preparata sa mikroorganizmima iz usta materijal se može uzeti
struganjem plaka sa površine zuba, sa površine desni, sa sluzokože obraza itd.
Budući da se na svakom od ovih mikrostaništa razlikuju uslovi života, i
mikroorganizmi koji ih nastanjuju će biti različiti.
Takođe, blagim struganjem čačkalicom sluzokože obraza može se dobiti
materijal za posmatranje ćelija sluznice obraza.

MATERIJAL

predmetno stakalce, Bunzenov plamenik ili špiritusna lampa, vata, 70% alkohol,
sterilna čačkalica, bakteriološka eza, marker, štipaljka (nije obavezna)

POSTUPAK

1. Sterilisati radnu površinu 70% alkoholom, uzeti čisto stakalce i označiti ga

markerom.
2. Flambirati ezu na plamenu do usijanja, sačekati da se ohladi i prenijeti petljom
eze dvije kapljice vode na sredinu predmetnog stakalca.
3. Uzeti sterilnu čačkalicu i njom zahvatiti malu količinu materijala koji se nalazi
između zuba.
4. Zahvaćeni materijal prenijeti u kap vode na stakalcu, dispergovati ga i
napraviti razmaz.
5. Iskorištenu čačkalicu baciti u kantu za smeće.
6. Ostaviti preparat da se osuši, a zatim ga fiksirati na plameniku.
7. Da bi se mikroorganizmi iz usta mogli lakše uočiti poželjno ih je obojiti
šafraninom ili kristal violet bojom. Potrebno je preliti razmaz jednom od ovih
boja i sačekati 30 sekundi da djeluje.
8. Zatim se boja izlije i ispere destilovanom vodom.

16
 9. Preparat osušiti na vazduhu ili ga prisloniti na filter papir. Nikako se ne smije
brisati filter papirom!
10. Ovako pripremljen preparat se posmatra pod imerzionim objektivom.

Imerzioni objektiv ima veću moć uvećanja od klasičnog objektiva. Na preparat se

stavi kapljica kedrovog ulja u koju se zatim uranja objektiv. Izoštravanje slike se vrši
mikrovijkom da se ne bi slomilo stakalce. Radi lakšeg uočavanja mikroorganizama
potrebno je da osvjetljenje preparata bude maksimalno i kondenzor mikroskopa
spušten.
Ako je preparat dobro pripremljen na njemu se mogu uočiti mikroorganizmi
različitih oblika.

3.4. PREPARAT VISEĆA KAP

Za proučavanje živih ćelija fitoplanktona, zooplanktona i drugih mikro-

organizama, tj. njihovog razmnožavanja, pokretljivosti, sporulacije itd, kao i za
izolaciju mikrooorganizama, koristi se preparat ²viseća kap². Za pripremu ovakvih
preparata potrebna su specijalna predmetna stakalca koja imaju udubljenje u sredini.

POSTUPAK

1. Oko udubljenja predmetnog stakalca namazati tanak sloj vazelina (Slika 6a).
2. Na centar pokrovnog stakalca nanijeti suspenziju mikroorganizama. Ako se
mikroorganizmi nanose iz tečne kulture onda se samo sterilnom ezom uzme
kap kulture i postavi na stakalce (Slika 6b). Ako se mikroorganizmi uzimaju sa
čvrste podloge onda se na pokrovno stakalce prvo stavi kap fiziološkog
rastvora, a zatim se sterilnom ezom zahvati malo kulture i razmuti u
nanesenoj kapljici. Budući da se neobojeni mikroorganizmi obično veoma
slabo vide pod svjetlosnim mikroskopom, često je neopho-dno na pokrovno
stakalce dodati i kap metilenskog plavog. Boja mora biti razblažena 10 000
puta da ne bi ubila mikroorganizme. Metilensko plavo se priprema tako što se
rastvori 0,3 g boje u 30,0 ml 96% etanola i doda se 100 ml destilovane vode.
Ovako pripremljenu boju treba razblažiti 10 000 puta miješanjem 0,01 ml boje
i 100 ml destilovane vode. Kap razblaženog metilensko plavog se izmiješa sa
suspenzijom mikroorganizama na pokrovnom stakalcu.
3. Predmetno stakalce okrenuti i pritisnuti na pokrovno stakalce tako da kap sa
kulturom mikroorganizama ostane u centru udubljenja (Slika 6c).
4. Zatim predmetno stakalce pažljivo okrenuti tako da kap sa kulturom ostane
visiti na pokrovnom stakalcu iznad udubljenja predmetnog stakalca.
5. Pritisnuti ivice pokrovnog stakalca da se dobro zalijepe za vazelin (Slika 6d).
6. Ovako pripremljen preparat posmatrati pod velikim uvećanjem mikroskopa ili
u imerziji. Posmatra se ivica kapljice u zatamnjenom vidnom polju.

17
 4. PRIPREMA TRAJNIH MIKROSKOPSKIH PREPARATA

Jednom pripremljen privremeni preparat se može koristiti samo kratak

vremenski period, budući da veoma brzo dolazi do njegovog isušivanja i
deformisanja posmatranog materijala. Da bi preparat bio upotrebljiv duži vremenski
period, pa i nekoliko godina, potrebno je primijeniti nimalo jednostavan niz postupaka
za pripremu trajnih preparata.

4.1. UBIJANJE I FIKSIRANJE

Prva i veoma važna faza u obradi materijala jeste ubijanje i fiksiranje. Ubijanje
i fiksiranje materijaia obično se vrši istim agensima. Cilj fiksiranja je ne samo da se
ubije objekat, već da se brzim i ravnomjernim prodiranjem, i to u što kraćem
vremenu, prekinu životni procesi, a da se pri tome gotovo ništa, ili što je moguće
manje izmijeni objekat, tako da ovaj i kasnije pokazuje u najtananijim detaljima istu

18
građu koju je imao dok je bio živ.
Jedan od osnovnih preduslova uspješnog fiksiranja je stanje samog materijala
i zato ga uvijek treba fiksirati dok je još svjež. Najbolje je da se ova faza pripremanja
preparata vrši odmah nakon što je uzet materijal (npr. ako je riječ o biljnom materijalu
na samom mjestu gdje biljka raste). Uspjeh fiksiranja zavisi još i od brzine prodiranja
fiksativa, a ona opet zavisi od prirode i veličine materijala koji se fiksira. Sitniji objekti
fiksiraju se cijeli, a krupniji (u slučaju biljnog materijala korijen, stablo, list itd.) se
sijeku na manje dijelove veličine od 0,5 do 3,0 cm. Pri siječenju krupnijih biljnih
organa na manje dijelove vodi se računa o orijentaciji. Tako na primjer cilindrični
organi se sijeku poprečno, a list normalno na centralni nerv.
Fiksiranje se vrši u odgovarajućim staklenim sudovima kao što su: epruvete,
teglice, mjerni sudovi i slično. Pošto se sastav fiksativa tokom vremena mijenja
potrebno je pri fiksiranju koristiti znatno veću količinu fiksativa u odnosu na
zapreminu objekta koji preparujemo. Jednom upotrebljen fiksativ više se ne
upotrebljava. Ako materijal duže vremena stoji u nekom fiksativu, fiksativ treba
povremeno zamijeniti svježim.
Materijal u koji fiksativ prodire pravilno, a to znači brzo i ravnomjerno, ubrzo
pada na dno. Da bi sa donje strane objekta fiksativ i dalje ravnomjerno prodirao, na
dno suda u kome se vrši fiksiranje stavlja se vata ili filter papir. Može se desiti da
iako su sve pripremne radnje dobro sprovedene neki objekti ne potonu, već ostaju
na površini. Jedan od uzroka ove pojave može da bude sama priroda materijala,
odnosno da je bogat intercelularima koji su puni vazduha. Ukoliko ustanovimo da
materijal ne tone zato što je ispunjen vazduhom, treba na posudu u kojoj se vrši
fiksiranje pripojiti vakuum pumpu koja će svojim radom odstraniti nepoželjan vazduh
i omogućiti prodiranje fiksativa u sve dijelove materijala.
U sud sa fiksativom, pored materijala koji se obrađuje, stavlja se cedulja
(etiketa) veličine 1-1,5 x 3 cm na kojoj su ispisani neophodni podaci o objektu: ime
vrste, datum i mjesto uzimanja materijala, naziv organa koji se preparuje itd. Za
etiketiranje se upotrebljava čvršći bijeli papir, a na njemu se podaci ispisuju isključivo
običnom grafitnom olovkom.

4.1.1. Fiksativi koji se najčešće upotrebljavaju

95% etil alkohol

95% etil alkohol upotrebljava se kao fiksativ samo za materijal koji će se u

daljem postupku sijeći rukom pomoću žileta. Ovaj fiksativ se ne preporučuje za
materijal koji će biti podvrgnut finijim analizama, jer izaziva kontrakciju citaplazme.
Da bi se izbjegla kontrakcija citoplazme, a iskoristila dobra svojstva alkohola,
upotrebljavaju se fiksativi koji u sebi sadrže glacijalnu sirćetnu kiselinu.

Fiksativ Karnoa (Carnoy)

Priprema se po sledećoj recepturi:

Apsolutni alkohol 6 ml

19
 Hloroform 3 ml
Glacijalna sirćetna kiselina 1 ml

Ovaj fiksativ brzo prodire. Materijal se u njemu fiksira 6 do 12 sati, a može i

kraće. Vrijeme fiksiranja zavisi od veličine i prirode materijala. Tako na primjer za
vrhove korjena crnog luka dovoljno je fiksiranje od 10 do 15 minuta. Poslije fiksiranja
materijal se ispira u apsolutnom alkoholu sve dok se osjeća miris sirćetne kiseline.
Ukoliko se u daljem postupku ne primjenjuje parafinska metoda, materijal se može
čuvati (konzervira se) u 80% etil alkaholu. Fiksativ Karnoa nalazi široku primjenu u
citološkim i embriološkim istraživanjima.

Farmerov fiksativ

Priprema se po sledećoj recepturi:

Apsolutni alkahol 6 ml
Glacijalna sirćetna kiselina 1 ml

Farmerov fiksativ se upotrebljava na isti način i u iste svrhe kao i fiksativ

Karnoa.

Alkohol-formalin

Priprema se po sledećoj recepturi:

50% etil alkahol 100 ml

35 ili 40% prodajni formalin 5 ml

Alkohol-formalin je veoma pogodan za fiksiranje materijala na terenu, jer

istovremeno vrši i konzervaciju, tako da u njemu objekti mogu da ostanu do konačne
obrade. Kao fiksativ koristi se pri anatomskim istraživanjima, a može da se upotrebi i
za fiksiranje nježnijeg materijala.

Formalin

Priprema se po sledećoj recepturi:

35 ili 40% prodajni formalin 2-4-6 ml

voda 98-96-94 ml

20
 2-4% formalin je dobar fiksativ za alge i gljive. Materijal se u fiksativu drži do
obrade. Prije obrade materijal se ispira vodom, jer pare formalina, koje se iz
neispranog materijala odvajaju, nadražuju oči i sluzne pokožice.

Fiksativ Navašina

a) Jači rastvor:

1 % hromna kiselina 10 ml
40% (prodajni) formalin 4 ml
Glacijalna sirćetna kiselina 1 ml

b) Slabiji rastvor:

1 % hromna kiselina 15 ml
Destilovana voda 17 ml
40% (prodajni) formalin 2 ml
Glacijalna sirćetna kiselina 1 ml

1 % rastvor hromne kiseline može se napraviti u većoj količini, a kompletan

fiksativ neposredno prije upotrebe. Materijal se fiksira 24 sata, zatim se pažljivo i
dugo ispira tekućom vodom (čak i do 24 sata). Zatim se vrši dehidratacija kroz seriju
alkohola sve veće koncentracije. U 80% alkoholu materijal može da se konzervira ili
se postupak nastavlja dalje parafinskom metodom, koja će detaljno biti opisana u
daljem tekstu. Ovaj fiksativ pogodan je za finija anatomska i embriološka
istraživanja.

Fiksativ Buena (Buin)

40% prodajni formalin ....................................................................... 25 ml

Pikrinska kiselina (zasićen rastvor u 70% etil alkoholu) . . . . . . . . . . 75 ml
Glacijalna sirćetna kiselina .................................................................5 ml

Fiksiranje traje 24 sata. Ispiranje se vrši u 70% alkoholu sve dotle dok iz
materijala izlazi žuta boja. Dehidrataciju obaviti kroz seriju alkohola sve veće
koncentracije. U 80% alkoholu materijal se može konzervirati, ili se dalje sprovodi po
principima parafinske metode. Upotrebljava se u iste svrhe kao i fiksativ Navašina.

Fiksativ FAA (formalin-acetoacid-etil alkohol)

21
 Priprema se na sledeći način:

70% etil alkohol 90 ml

40% (prodajni) formalin 5 ml
Glacijalna sirćetna kiselina 5 ml

U ovom fiksativu materijal ostaje 24 sata, a zatim se ispira u 70% alkoholu 1

sat. Dehidratacija i konzerviranje vrše se na isti način kao i poslije upotrebe
Navašinovog i Buenovog fiksativa. Vrlo je pogodan fiksativ za citološka istraživanja.

4.1.2. Fizička fiksacija

Ako se pripremaju preparati sa mikroorganizmima mnogo je jednostavnije

izvršiti fiksaciju fizičkim, umjesto hemijskim putem. Fizički se preparati fiksiraju
toplotom tako što se suvi razmaz brzo prenese iznad plamena 5 do 6 puta, vodeći
računa da materijal na predmetnom stakalcu bude okrenut na gore. Treba
napomenuti da se na ovaj način usmrćuju samo vegetativni oblici mikroorganizama,
dok sporegeni opstaju, pa treba biti posebno pažljiv pri rukovanju sa patogenim
materijalom.

4.2. ISPIRANJE MATERIJALA

U fiksativu materijal ostaje kraće ili duže vrijeme. Vrijeme fiksiranja je uvijek
naznačeno u metodici i različito je za pojedine fiksative. Da bi dalji mikrotehnički
postupci mogli pravilno da se odvijaju neophodno je poslije fiksiranja materijal dobro
isprati. U čemu će se ispiranje obaviti zavisi od sastava fiksativa. Ako u njegov
sastav ulazi alkohol onda se ispiranje vrši alkoholom one koncentacije koja je
upotrebljena i pri pravljenju fiksativa. Na primjer: ako je fiksiranje vršeno u fiksativu
Karnoa, u čiji sastav ulazi apsolutni etil alkohol, onda se ispiranje vrši apsolutnim
alkoholom, dok će materijal fiksiran u Buenovom fiksativu biti ispiran 70% alkoholom.
Ako je za fiksiranje korišćen vodeni rastvor neke materije, ispiranje se obavlja
tekućom vodom i to najmanje u vremenu od jednog do tri sata, a često i duže.
Najjednostavniji, ali ne i najbolji, način ispiranja je česta promjena vode ili
alkohola u staklenim posudama u kojima se materijal fiksira. Mnogo je bolje pronaći
mogućnost stalnog proticanja vode preko fiksiranog materijala. Jedan od dobrih, ali
komplikovanijih načina ispiranja je upotreba aparata koji predstavlja bateriju cjevčica
koje se uvode u posude u kojima se nalazi materijal koji se ispira. Cjevčice se uvode
u posude kroz gazu, kojom su ove zatvorene, i dovode do dna. Puštanjem vode
preko priključka na slavini u više posuda istovremeno, ravnomjerno i stalno protiče
voda onoliko vremena koliko je predviđeno da ispiranje traje (od 1 do 24 sata).
Materijal se može ispirati i na drugi način. Fiksirani objekti se zajedno sa
etiketama prebace u vrećice od gaze. Naravno da se pri ovom postupku

22
podrazumijeva da se materijali iz različitih posuda ne miješaju već da svaki ima svoju
vrećicu. Svaku vrećicu pri vrhu dobro vezati koncem, tako da iz njih ništa ne može
ispasti. Ovako pripremljene vrećice stavljaju se u jedan širi sud u koji se, kroz lijevak,
pušta vodovodna voda. Materijal u vrećicama ispira se onoliko vremena koliko je za
ovu fazu rada metodikom predviđeno.

4.3. DEHIDRATACIJA I KONZERVANCIJA MATERIJALA

Apsolutni alkohol i 96% alkohol, kao i fiksativi u čiji sastav oni ulaze istovremeno
i dehidriraju i konzerviraju materijal. Međutim, ako je fiksiranje obavljeno u nekom od
fiksativa u čiji sastav ulaze alkoholi niže koncentracije, onda se poslije ispiranja
dehidratacija vrši postepeno alkoholima jače koncentracije, a konzervacija se obavlja
u 80% alkoholu. Ako konzerviran materijal po svojoj prirodi ne sadrži veće količine
vode u sebi (dijelovi drvenastih biljaka, vegetativni organi kserofita i slično)
konzervans se mijenja jedanput u dve do tri godine. Ali ako se konzerviraju objekti
čija su tkiva bogata vodom potrebna je češća promjena konzervansa, posebno na
početku ovog procesa.
Tvrd materijal, kao što je na primjer drvo, obično se čuva u nekom od sledećih
konzervansa:

 jedan dio 95% etil alkohol i jedan dio vode

 tri dijela 95% etil alkohola, dva dijela vode i jedan dio glicerina
 jedan dio 95% etil alkohola i jedan dio glicerina

Kada se materijal fiksira u nekom od vodenih fiksativa, ispiranje se vrši, kao

što je već ranije rečeno, vodom, a do alkohola u kome će se čuvati (80%) dovodi se
postepeno kroz seriju alkohola sve veće koncentracije (proces dehidratacije). U
principu, nježniji objekti se poslije ispiranja u vodi uvode u 10% alkohol i dalje se
provode kroz sledeću seriju alkohola: 20% - 30% - 40% - 50% - 65% - 75% - 85% -
95%. Tvrđi materijal se uvodi u 20% alkohol, a dalje proces dehidratacije teče kroz
sledeće alkohole: 40% - 65% - 85% - 95%. Ukoliko se ne poštuje princip postepenog
dehidriranja doći će, usljed brzog izvlačenja vode, do promjena na materijalu, koje se
obično manifestuju smežuravanjem ćelijskih zidova, ali i na druge načine.
Pojedini autori određuju različito vrijeme stajanja u rastvorima alkohola,
međutim, zadovoljavajući rezultati postižu se držanjem materijala 20 do 30 minuta u
svakom od ova 3-4 rastvora alkohola. U alkoholima veće koncentracije materijal
ostaje od jednog do dvanaest sati. Vrijeme dehidratacije zavisi od prirode i veličine
objekta koji se tretira, tako da, u okviru datih granica, za svaki objekat treba odrediti
najpogodnije vrijeme.
Promjena alkohola vrši se na više načina. Najčešće se alkohol, u kome je
materijal već stajao određeno vrijeme, pažljivo odlije i odmah se umjesto njega sipa
alkohol potrebne koncentracije. Za vrijeme sprovođenja kroz alkohole posude su
dobro zatvorene i otvaraju se samo radi zamjene alkohola.

Pravljenje alkohola određene koncentracije (procenta)

23
 U procesu dehidratacije neophodno je materijal postepeno sprovoditi kroz
seriju etil alkohola sve veće koncentracije (20-40-65-75-85-95%). Od 95% ili 96%
alkohola dobićemo svaki drugi alkohol niže koncentracije primjenjujući sledeću
tabelu:

Etil alkohol % 96 96 96 96 96 96 96 96 96
% Alkohol u ml 10 15 20 30 40 50 60 70 80
Voda u ml 86 81 76 66 56 46 36 26 16

Tabela 1. Pravljenje alkohola određene koncentracije

Na tablici su označene formule za alkohole različite koncentracije od 10 do

80%. Procenat alkohola za svaki pojedini slučaj označen je srednjim brojem u svakoj
koloni. Na primjer: ako želimo da od 96% napravimo 40% alkohol postupićemo na
sledeći način 96-40= 56, a to znači da treba uzeti 56 ml destilovane vode i 40 ml
96% alkohola. Tako dobijeni rastvor sadrzi 96 ml 40% alkohola. Drugim riječima,
svaku željenu koncentraciju alkohola dobićemo ako u menzuru sipamo onoliko
mililitara 96% alkohola koliki procenat želimo da napravimo i do 96 mililitara dolijemo
destilovanu vodu. Na primjer: želimo da napravimo 23% alkohol. U menzuru treba
sipati 23 ml 96% alkohola i izvršiti dopunu destilovanom vodom do 96-tog podioka
(dodati 73 ml vode).

4.4. METODE PRAVLJENJA PRESJEKA

U okviru anatomskog praktikuma rijedak je materijal koji se može posmatrati

pod mikroskopom bez prethodnog sječenja. Materijal se siječe slobodnom rukom
pomocu žileta ili brijača i specijalnim aparatom mikrotomom. Za sječenje na
mikrotomu objekti se prethodno moraju pripremiti relativno složenim postupkom.
Međutim, sječenje mikrotomom neophodno je primjeniti pri citološkim, embriološkim,
pa i mnogim histološkim istraživanjima ili pak kada je objekat toliko sitan i nježan da
ga drugačije nije moguće isjeći. Dvije najčešće metode pravljenja presjeka za
preparate jesu parafinska metoda i metoda sa smrznutim tkivom, koje će opširno biti
opisane u poglavljima 6 i 7.

4.5. INKLUZIJA U KANADA BALZAM

Da bi se preparat mogao očuvati duži period vrši se njegova inkluzija u kanada

balzam. Inkluziranje u kanada balzam vrši se na taj način što se na predmetno
staklo, izvađeno iz ksilola, preko preparata, nanese kap kanada balzama i presjek
pažljivo prekrije pokrovnim stakalcem. Presjeci koji nisu Iijepljeni prenose se iz
sahatnog stakla u kap kanada balzama koja je prethodno nanijeta na čisto

24
predmetno stakalce. Presjeci stavljeni u kanada balzam i prekriveni pokrovnim
stakalcem ostavljaju se, zaštićeni od prašine, najmanje 24 sata u horizontalnom
položaju. Za to vrijeme, zahvaljujući isparavanju ksilola u kome je kanada balzam
rastvoren, pločica prijanja uz pokrovno stakalce. Ovim je preparat gotov i može se
staviti u kutiju za preparate. Ipak treba napomenuti da preparati još nisu definitivno
osušeni, pa zato treba sa njima još izvijesno vrijeme postupati pažljivo da se pločica
ne pomjeri.

4.6. OBILJEŽAVANJE PREPARATA

Svako predmetno stakalce mora da bude obilježeno tj. numerisano.

Numeracija se vrši specijalnim olovkama ili markerima čiji se trag na staklu ne briše
u vodi, alkoholu i ksilolu. Ovakve olovke se mogu nabaviti u trgovinama koje prodaju
laboratorijski materijal.
U slučaju da do takvih olovaka ne može da se dođe pripremamo tuš koji ima
sve potrebne osobine (ne briše se). U tom cilju treba izmiješati jednake dijelove tuša,
bjelanceta i glicerina i tome dodati kristalić timola ili fenola. Pri upotrebi ovako
napravljenog tuša, poslije numerisanja (obilježavanja), predmetno stakalce treba
lako zagrijati, ali samo na mjestu gdje je ispisana oznaka. Ovako obilježena
predmetna stakalca neće izgubiti numeraciju pri daljoj obradi preparata. Istovremeno
sa obilježavanjem preparata vodi se i evidencija u posebnoj svesci. Evidencija treba
da bude što potpunija kako bi se analiza gotovih preparata mogla lakše i preciznije
izvršiti.
Kada čitav postupak pravljenja preparata bude završen (deparafinisanje,
bojenje, inkluzija u kanada balzam) na predmetna stakalca lijepi se etiketa na kojoj
su zabilježeni svi potrebni podaci koji se odnose na preparat.

5. BOJENJE PREPARATA

Pri proučavanju anatomske građe, bilo na privremenom ili trajnim preparatima,

u najvećem broju slučajeva, vrši se bojenje. Za svaki objekat, u zavisnosti od
njegove strukture i cilja rada, odabira se odgovarajući fiksativ i boja. Pri pravljenju
anatomskih preparata najčešće se primjenjuje diferencijalno bojenje, odnosno
bojenje sa više boja.
Prema načinu rada bojenje može biti progresivno ili regresivno. Pri
progresivnom bojenju presjeci se stavljaju u slab rastvor boje, tako da se vremenam
obojenost preparata povećava. Na ovaj način se na primjer boji hematoksilinom.
Češće se primjenjuje regresivan način bojenja, pri čemu se preparati prvo preboje, a
zatim se u tzv. procesu diferenciranja uklanja višak boje sve dotle dok se ne dobije
željena nijansa. Diferenciranje je, prema tome, uklanjanje viška boje putem ispiranja.
Diferenciranje se vrši u rastvaraču u kome je i boja, kojom se preparat boji,
rastvorena, a intenzitet obojenosti preparata se stalno kontroliše mikroskopom.

25
 Boje se najčešće upotrebljavaju kao zasićeni vodeni ili alkoholni rastvori
(najčešće odgovaraju 1-2% rastvoru boje), mada se neke vrlo lijepo rastvaraju u
karanfilićevom ulju (na primjer oranž, svijetlo zeleno i druge).

5.1. BOJE I RASTVORI BOJA

Prema porijeklu boje za bojenje preparata mogu biti prirodne i vještačke.

Prirodne boje su ekstrakti dobijeni iz biljaka, životinja ili minerala, npr. karmin,
šafranin, lakmus, orcein i druge. Vještačke boje se dobijaju sintetskim putem iz
katrana kamenog uglja. Budući da je u početku razvoja industrije katranskih boja
anilin služio kao ishodišni materijal, sintetske boje se još nazivaju i anilinskim
bojama.
Boje se kupuju u trgovinama i nalaze se u čvrstom stanju, najčešće u obliku
kristala ili u prahu. Rastvor se može pripremiti prema tzv. direktnom načinu, kada se
boja rastvara direktno u destilovanoj vodi, ili indirektnom načinu, kada se prvo
pripremi zasićeni alkoholni rastvor boje. To je matični rastvor od kog se poslije pravi
razblaženi rastvor boje u destilovanoj vodi. Vodeni rastvori su manje postojani pa je
preporučljivo pripremiti matični rastvor koji može duže stajati, a od njega se lako
priprema pravi rastvor za bojenje. Matični rastvor se pravi u 96% alkoholu tako što
se u određenu količinu alkohola postepeno dodaje boja dok se ne pojavi talog koji se
dalje ne rastvara. Rastvor se ostavi 2-3 dana u termostatu na 30°C, a zatim se
prema potrebi pravi rastvor za bojenje.

Na 100 ml destilovane vode dodaje se matičnog rastvora:

 Fuksin 10 ml
 Gencian violet 15-20 ml
 Metilensko plavo 20-30 ml

5.2. HEMIJSKA OSNOVA BOJENJA

Boje za bojenje preparata su ciklična jedinjenja koja u

osnovi sadrže benzolov prsten (Slika 19) za koji su vezane Slika
hromoforna i auskohromna grupa. Hromoforna grupa je 19.Benzolov
odgovorna za obojenost, a auksohromna grupa omogućuje prsten
vezanje jedinjenja sa molekulima ćelije (npr pikrinska
kiselina ima žutu boju jer sadrži hromofornu nitro grupu –
NO2, dok je za njeno vezivanje sa ćelijskim molekulima
odgovorna auksohromna hidroksilna grupa OH - ).
Boje se u zavisnosti od njihovog ponašanja pri
elektrolitičkoj disocijaciji dijele na kisele i bazne. Kisele boje imaju afinitet za bazne
ćelijske komponente jer sadrže karboksilnu ili hidroksilnu grupu koje pri
disocijacijaciji imaju negativan naboj. Ove boje imaju veći afinitet prema citoplazmi
pa se još nazivaju i citoplazmatske boje i uglavnom je boje u crveno ili ružičasto. Za

26
razliku od njih, bazne boje sadrže amino grupu, koja pri disocijaciji ima pozitivan
naboj, pa boje kisele ćelijske komponente, kao što je jedro, u plavo. Najčešće
korištene kisele boje su eozin, kiseli fuksin, pikrinska kiselina i eritrozin, a od baznih
boja se najčešće koriste metilensko plavo, kristal violet, bazni fuksin, gencian violet
itd.

5.3. METODE BOJENJA

S obzirom na postojanje velikog broja boja koje se primjenjuju prilikom

pravljenja preparata, opisaćemo pravljenje i upotrebu samo onih boja koje se
najčešće upotrebljavaju.

5.3.1. Hematoksilinska metoda

Hematoksilin je boja biljnog porijekla, a dobija se iz drveta tropske biljke

Haematoxylon campechianum. Za bojenje se koristi produkt oksidacije hematoksilina
hematein.
S obzirom da postoji više načina za pripremanje ove boje, opisaćemo
pripremu Delafildovog i Hajdenhajnovog hematoksilina.

Delafildov hematoksilin

- Napraviti zasićen rastvor amonijum alauna u vodi (amonijum alaun =

aluminijum amonijum sulfat = alumen ammonium; formula: AINH 4(SO4)2 + 12 H2O).
- 1 gr hematoksilina rastvoriti u 6 ml apsolutnog alkohola. U 100 ml zasićenog
rastvora amonijum alauna u vodi dodati kap po kap hematoksilina rastvorenog u
alkoholu. Ovako pripremljena boja stoji na svjetlosti 7 dana u boci koja je zatvorena
vatom. Poslije 7 dana rastvor se profiltrira i dodaje mu se 25 ml hemijski čistog
glicerina i 25 ml metil alkohola. Kroz 4 sata (rastvor treba da potamni) ponovo se vrši
filtriranje. Profiltrovana boja se sipa u bocu koju potom treba dobro zapušiti i izložiti
djelovanju svjetlosti ne manje od 2 mjeseca. Tek tada je boja spremna za upotrebu.
Mnogi praktičari preporučuju da se ovako napravljena boja prije upotrebe
razblaži (na 100 ml destilovane vode dodati 30 ml pripremljene boje). Ovako
razblaženim rastvorom boje preparati se nešto duže boje, ali je moguće izvesti
preciznije bojenje.
Delafildov hematoksilin je vrlo postojana boja. Prema podacima koje navodi
Černberlen (Chamberlain, C., 1921) bila je upotrebljena i dala karakterističnu
reakciju boja stara 20 godina.

Dužina bojenja (vrijeme bojenja) ovom bojom različito je za pojedine

preparate, a varira od 3 do 30 minuta. Ako je materijal poslije fiksiranja dobro ispran
sa bojenjem ne smije biti problema. Naročito dobro treba isprati materijal ako je
fiksativ sadržao neku kiselinu.
Iz boje preparati se prenose u tekuću vodu i dobro se isperu. Za parafinske
presjeke ispiranje traje 5 do 10 minuta, a za deblje preparate (sječene rukom) 20 do

27
30 minuta. Pri ispiranju voda se mijenja sve dok se u njoj pojavljuju i najmanji
znakovi tragova boje. Iz vode se preparati prebacuju u alkohole sve jače
koncentracije (vidi: dehidratacija) i na kraju se preko ksilola inkluziraju u kanada
balzam.
Pri prebacivanju iz vode u alkohol na preparatima se može obrazovati talog.
Talog se odstranjuje provođenjem preparata kroz zakiseljeni alkohol koji se priprema
tako što se na 100 ml 70% alkohola doda 1 do 2 kapi sone kiseline (HCl). Iz ovog
alkohola preparati se prenose u čist 70% alkohol u kome treba da promijene boju -
od crvenkaste da postanu purpurni. Pošto se prenošenjem iz zakiseljenog alkohola u
čist uvijek prenesu i male količine kiseline preporučuje se iIi višekratno ispiranje u
čistom 70% alkoholu ili se u 70% alkohol doda kap amonijaka koji neutrališe dejstvo
kiseline. Jedna od češće upotrebljavanih šema za bojenje Delafildovim
hematoksilinom je sledeća:

 Bojenje (iz vode, 35% ili 50% alkohola) .........................3 do 30 min.

 Ispiranje u tekućoj vodi: za parafinske presjeke ............5 do 10 min.
o zapresjeke žiletom ................20 do 30 min.
 Dehidratacija: 35% alkohol.......5 minuta
 50% alkohol...............................5 minuta
 70% zakiseljeni alkohol.............u ovom alkoholu vrši se diferenciranje koje se
prati pod mikroskopom.
 70% alkohol (nezakiseljen) preparate isprati više puta
 85% alkohol ............................................5 minuta
 95% alkohol ............................................5 minuta
 100% alkohol ..........................................5 minuta
 100% alkohol i ksilol u odnosu 1:1 ..........5 minuta
 ksilol ........................................................5 minuta
 inkluzija u kanada balzam

Ako je poslije ispiranja u vodi preparat blijedo obojen treba ga ponovo vratiti u
boju.
- Ako u zakiseljenom alkoholu boja brzo blijedi (za 4 do 5 sekundi) treba
smanjiti količinu kiseline.
- Čim se boja u 70% alkoholu počne mijenjati od crvenkaste u purpurnu, dalji
tok rada kontrolisati pod mikroskopom. Ako se konstatuje da je preparat slabo
obojen treba ga ponovo vratiti u boju, a ako je prebojen u zakiseljeni alkohol.
Inkluziranje u kanada balzam vrši se na taj način što se na predmetno staklo,
izvađeno iz ksilola, preko preparata, nanese kap kanada balzama i presjek pažljivo
prekrije pokrovnim stakalcem. Presjeci koji nisu Iijepljeni prenose se iz sahatnog
stakla u kap kanada balzama koja je prethodno nanijeta na čisto predmetno
stakalce. Presjeci stavljeni u kanada balzam i prekriveni pokrovnim stakalcem
ostavljaju se, zaštićeni od prašine, najmanje 24 sata u horizontalnom položaju. Za to
vrijeme, zahvaljujući isparavanju ksilola u kome je kanada balzam rastvoren, pločica
prijanja uz pokrovno stakalce. Ovim je trajni preparat gotov i može se staviti u kutiju
za preparate. Ipak treba napomenuti da preparati još nisu definitivno osušeni, pa
zato treba sa njima još izvijesno vrijeme postupati pažljivo da se pločica ne pomjeri.

Hajdenhajnov hematoksilin gvožđa.

28
 Ovu boju je 1892. godine u tehniku pravljenja preparata uveo Hajdenhajn
(Haidenhain) i do danas je ostala jedna od osnovnih boja pri pravljenju preparata.
Za bojenje po ovoj metodi pripremaju se dva rastvora koji se nikada ne miješaju.
A - 2% - 4% vodeni rastvor feriamonium sulfata.
B - 0,5% vodeni ili alkoholni rastvor hematoksilina.

Rastvor feriamonium sulfata ne boji preparate, već samo služi kao štavilo, tj.
priprema preparate da bolje prime boju. Ovaj rastvor se može upotrebiti čim se
kristali feriamonium sulfata rastvore, a održava se oko 2 mjeseca.
Pripremanje hematoksilina. 1 gr hematoksilina rastvoriti u 10 mililitara 96%
etil alkohola i dodati 90 ml destilovane vode. Sud zatvoriti vatom i ostaviti na
svjetlosti 2 do 3 nedjelje da boja sazri.
Prije upotrebe boja se razblaži destilovanom vodom (1:1), tako da se dobije
0,5% rastvor hematoksilina.
Proces sazrijevanja može da se ubrza zagrijavanjem. U tom slučaju 1 gram
hematoksilina stavlja se u 100 ml destilovane vode i zagrijava se sve do rastvaranja
kristala boje. Ovaj rastvor više puta mora da se filtrira i kada se ohladi može da se
upotrijebi za bojenje.
Da bi se spriječilo razviće mikroorganizama u boju se dodaje kristalić timola.
Hajdenhajnov hematoksilin gvožđa može da se upotrijebi više puta za bojenje, ali se
pri tome mora paziti da se u njega ne unese feriamonium sulfat. Zagađivanje boje
feriamonium sulfatom uočava se lako, jer hematoksilin počinje da tamni.

Boja može da se upotrebljava duže vremena (do 6 nedjelja, ali povremeno

mora da se profiltrira i da se izvrši proba da Ii je još uvek upotrebljiva. Proba
ispravnosti boje vrši se tako što se u stakleni sud stavi nekoliko kapi hematoksilina
čiju upotrebljivost ispitujemo, i prelijemo ih vodovodnom vodom. Ako se voda oboji
Ijubičasto hematoksilin je još uvijek upotrebljiv, a ako boja vode bude žuta ili prljavo
Ijubičasta treba praviti novu boju.

opšta šema bojenja Hajdenhajnovim hematokslilinom gvožđa:

1. Preparate staviti u 4% feriamonim sulfat ................6 do 12 sati

2. Dobro isprati tekućom vodom...........................10 minuta ili, ako se ispiranje
ne vrši tekućom vodom, vodu mijenjati više puta (4 do 5 puta).
3. Prenijeti preparate u hematoksilin ........................ 12 do 14 sati
4. Isprati preparate tekućom vodom
5. Diferenciranje u 2% feriamonium sulfatu. Diferencirati svaki preparat
pojedinačno u petri kutiji i kontrolisati pod mikroskopom oduzimanje viška
boje. Kada jedra budu jasno vidljiva preparate prenijeti u sud sa protočnom
vodom ....... ......................................1/2 sata do 1 sat
6. Dehidratacija se vrši kroz seriju postupno jačih alkohola počevši od 35%
zaključno sa apsolutnim. Zatim se preko alkohol-ksilola i čistog ksilola
preparati inkluziraju u kanada balzam.

Kao što se vidi opisani način bojenja zahtijeva nešto više vremena. Međutim,
ako preparator iz nekih razloga treba brže da radi može se preporučiti sledeći
postupak:

29
 Preparate koji se nalaze u 4% feriamonim sulfatu staviti 30 do 40 minuta u
termostat na temperaturu 45°C do 56°C. Zatim ih isprati kao u prethodno opisanom
postupku i uvesti ih u hematoksilin. Bojenje vršiti takođe u termostatu pri istoj
temperaturi i isto vrijeme kao i štavljenje. Diferenciranje se obavlja u 2% feriamonium
sulfatu, a dehidratacija kao što je opisana u opštoj šemi.
Hematoksilin brzo i lijepo boji celulozne ćelijske zidove, sluzi, citoplazmu i
jedra Ijubičasto i javlja se kao jedna od široko primjenjivanih boja u anatomskim,
embriološkim i citološkim istraživanjima.
Pri dvojnom bojenju daje lijepe kombinacije sa šafraninom (koji boji
odrvenjene zidove kod biljnih preparata crveno).
Hematein je osnovna supstanca hematoksilina od koje u stvari i potiče
karakteristična boja. Pošto je hemijski sastav hemateina poznat, ona se industrijski
proizvodi kao sintetička boja i u potpunosti zamjenjuje hematoksilin, boju koja se
dobija ekstrakcijom iz drveta biljke Haematoxylon campechianum.
Hematein se priprema tako što se 0,5 ml hemateina rastvori u 25 ml 90%
alkohola, a zatim je potrebno uzeti 25 grama stipse (KAl (SO 4)2, x 12 H2O) i rastvoriti
je u 500 ml vode. Spojiti rastvor stipse sa pripremljenom bojom i malo zagrijati da se
stipsa rastvori. Kada se ovaj rastvor ohladi boja je spremna za upotrebu.
Šafranin je boja koja daje dobre rezultate ako se kao fiksativ upotrebi alkohol
ili neki od fiksativa koji sadrži hromnu kiselinu.
Boja se upotrebljava kao 1% vodeni ili, češće, alkoholni rastvor, a priprema se
po sledećem receptu:

 Šafranin..............................................1 gr
 95% etil alkohol..................................50 ml
 voda.....................................................50 ml

Parafinski preparati poslije deparafinisanja u boju se prenose iz 50% alkohola,

a presjeci napravljeni od svježeg materijala prvo se stavljaju u 95% alkohol 1/2 sata,
pa se zatim prenose u boju. Presjeci pravljeni slobodnom rukom od materijala
fiksiranog u alkoholu direktno se prenose u boju. Ako je materijal bio fiksiran u
alkohol-formalinu presjeci se prvo sprovedu kroz 50% alkohol (10 minuta), pa se tek
poslije toga boje.
Vrijeme bojenja varira od 5 minuta do 24 sata, a zavisi od karakteristika tkiva
koje proučavamo. Ako se radi o biljnim preparatima može se reći da materijal u
kome je stepen odrvenjenosti (lignifikacije) manje izražen treba bojiti duže.
Diferenciranje se vrši pod mikroskopom u 50% alkoholu. Ako su presjeci
prebojeni, a to se zna na osnovu vremena potrebnog za diferenciranje (za 5 do 10
minuta ne dobije se željeni ton boje), treba u 100 ml alkohola, u kome se vrši
diferenciranje dodati 1 do 2 kapi sone kiseline (HCl). Poslije upotrebe zakiseljenog
alkohola preparate, iIi presjeke, dobro isprati čistim 50% alkoholom tako da se
kiselina potpuno odstrani.
Dehidratacija se vrši na već opisani način, kroz seriju alkohola sve jačih
koncentracija počev od 70% do 100%, a u svakom ostaju po 5 minuta. Prije inkluzije
u kanada balzam preparati iIi presjeci prolaze kroz ksilol-alkohol (1: 1) i čist ksilol (po
5 minuta u svakom).
Pri dvojnom bojenju šafranin daje lijepe kombinacije sa hematoksilinskim
bojama, oranž, svijetlo zelenim, vodenim plavim itd.

30
 Vodeno plavo (Wasserblau). Vodeno plavo upotrebljava se u vidu 1%
vodenog rastvora, ali ljepše nijanse plave boje ova boja daje ako se pripremi na
sledeći način: Napraviti zasićen rastvor pikrinske kiseline (C 6H3N307) u 50% alkoholu.
U ovaj rastvor postepeno se dodaju kristali boje vodeno plavog sve dotle dok se ne
dobije željena nijansa plave boje.
Boja može da se napravi i tako što se boja rastvori u 50% alkoholu i tek tada
treba postepeno dodavati rastvor pikrinske kiseline sve dotle dok se ne dobije že-
Ijena nijansa plave baje.
Ovom bojom se boje vrlo brzo, za 30 sekundi do 1 minuta, celulozni biljni
ćelijski zidovi. Diferenciranje i dehidratacija vrše se u 96% alkoholu. Pri dvojnom
bojenju daje lijepe kombinacije sa šafraninom i hrizoidinom.
Oranž G se upotrebljava kao 1% vodeni iIi alkoholni rastvor, a može da se
pripremi i kao zasićen rastvor u karanfilićskom ulju (1 gr boje na 100 ml
karanfilićskog ulja približno odgovara zasićenom rastvoru). Alkoholni rastvor ove boje
pravi se u apsolutnom alkoholu. Boji celulozne biljne zidove u žuto.
Preparati iz vode prenose se u vodeni rastvor boje, a iz apsolutnog alkohola u
alkoholni rastvor iIi u zasićeni rastvor boje u karanfilićskom ulju. Bojenje sa oranž G
je kratko, oko 1 minuta. Diferenciranje se vrši u onom agensu u kome je boja
rastvorena. Oranž G je pogodna boja za rad pri dvojnom iIi trojnom bojenju i daje
dobre kontraste sa šafraninom.
Hrizoidin boji odrvenjene zidove žuto, a upotrebljava se kao 1-2% vodeni
rastvor. Vrijeme bojenja kreće se od 5 do 20 minuta. Daje dobre kontraste sa svijetlo
zelenim.
Svijetlo zeleno. Ova boja se rastvara u vodi, alkoholu i karanfilićskom ulju.
Vrlo brzo boji celulozne zidove, za 1 minut, i daje lijepe kombinacije sa šafraninom.
Najčešće se upotrebljava kao 0,5% ili 1% rastvor u 50% iIi 70% alkoholu. Najljepše
nijanse zelene boje dobijaju se kada se rastvori u karanfilićskom ulju.
Preparati se u boju uvode ili iz vode, ili iz 50%, odnosno 70% alkohola. Ako je
boja rastvorena u karanfilićskom ulju, preparati ili presjeci se u boju prenose poslije
apsolutnog alkohola. Bojenje traje 1 do 30 minuta, a diferenci-ranje se vrši u
karanfilićskom ulju. Poslije provođenja kroz ksilol-apsolutni alkohol (1: 1) i čist ksilol
inkluziraju se u kanada balzam.

5.3.2. Dvojno bojenje preparata

Preparati se mogu bojiti jednom od odabranih boja kojom se ističe neki detalj u
građi proučavanih organa, tkiva ili ćeiija. Međutim, češće se pri izradi anatomskih
preparata primjenjuje metoda kombinovanja boja (diferencijalno bojenje), sa željom
da se jasnije istaknu razlike u građi. Na primjer, ako želimo da upoznamo građu
provodnih snopića izabraćemo dve boje od kojih će jedna bojiti ksilemski a druga
floemski dio. Ako se odlučimo za kombinovano bojenje preparata moramo voditi
računa da druga boja često utiče na prethodno upotrebljenu boju. Pri ovom načinu
rada neophodan je strpljiv i pažljiv postupak pri kome treba svaki detalj kritički
ocijeniti, kako bi se uočili svi uzroci koji bi, eventualno, doveli do nezadovoljavajućeg
rezultata.

31
 Šafranin i svijetlo zeleno.

 Pripremiti šafranin i obojiti preparate kao što je već opisano.

 Zatim izvršiti dehidrataciju do onog alkohola u kome je rastvarena boja svijetlo
zeleno (70% ili 100% alkohol). Do aspolutnog alkahola preparati se dovode i
kada je boja svijetlo zeleno rastvorena u karanfilićskom ulju.
 Poslije diferenciranja preparati se prosvetljavaju u ksilolu i inkluziraju u
kanada balzam.
Svijetlo zeleno boji celulozne zidove zeleno, a šafranin odrvenjene,
kutinizirane i oplutnjale crveno.

Primjer jedne opšte šeme rada za parafinske preparate od deparafinisanja do

uključivanja u kanada balzam izgledao bi ovako:

1. ksilol 20 min.
2. ksilol-apsolutni alkohol 20 min.
3. apsolutni alkohol 10 min.
4. 95% alkohol 5 min.
5. 85% alkohol 5 min.
6. 70%- alkohol 5 min.
7. 50% alkohol 5. min. safranin
8. 50% alkohol (diferenciranje)
9. 70% alkohol 5 min.
10. 95% alkohol 5 min
11. apsolutni alkohol 5 min.
12. svijetlo zeleno u karanfilićskom ulju
13. karanfilićsko ulje (diferenciranje)
14. ksilol-apsolutni alkohol 5 min.
15. ksilol 5 min.
16. kanada balzam

Na ovaj način mogu da se boje i preparati sječeni slobodnom rukom od

svježeg ili fiksiranog materijala, samo je u tom slučaju proces nešto skraćen jer se
isključuje prva faza rada (deparafinisanje) i počinje se ili od 95% alkohola ili od 50%
alkohola.

Delafildov hematoksilin i šafranin. Ako se odlučite za ovu kombinaciju boja

onda se preparati, poslije deparafinisanja, prvo boje hematoksilinom (vidi Delafildov
hematoksilin), a zatim se isperu vodom i prenose u šafranin. Dalji tok procesa teče
na već opisan način (dehidratacija, inkluzija u kanada balzam).
Svi neodrvenjeni elementi hematoksilinom se boje Ijubičasto, a odrvenjeni
šafraninom crveno.

5.3.3. Ostale metode

Azan

32
 Ova metoda se tradicionalno koristi za bojenje vezivnog tkiva. Kolagena
vlakna, bazalne membrane i mucin se boje plavo, jedra crveno, a mišići i eritrociti
narandžasto-crveno.

Trihromne metode bojenja (Masson)

Postoji veliki broj trihromnih metoda u kojima se koriste kombinacije tri

različite boje radi specifičnog bojenja i razlikovanja vezivnog tkiva od drugih tkiva
(mišića). Jedra i druge bazofilne strukture se boje plavo, kolagen zeleno ili plavo (u
zavisnosti od varijante bojenja), a citoplazma ćelija, mišići i eritrociti jasno crveno.

PAS metoda (perjodna kiselina-Schiff)

Za prikazivanje ugljenih hidrata (glikogen, glikoproteini) u tkivu koristi se PAS

histohemijska metoda. Bazira se na oksidativnom dejstvu perjodne kiseline, pri čemu
se stvaraju aldehidne grupe, za koje se vezuje bezbojni Šifov reagens koji nakon
toga postaje ružičaste boje. Ovom metodom se selektivno boje bazalne membrane,
glikogen i različiti ćelijski sekreti glikoproteinske prirode.

Bestov karmin

Ova metoda se koristi za selektivno bojenje glikogena u tkivu. Posebna

pažnja se obraća fiksaciji (hladni alkoholni fiksativi), pošto se glikogen rastvara u
vodi i samim tim se u toku rutinske fiksacije ispira iz tkiva.

Alcian plavo

Alcian plavo se upotrebljava za prikazivanje glikozaminglikana i proteoglikana,

a često se primjenjuje u kombinaciji sa drugim bojama. U kombinaciji sa tehnikom
van Gieson navedene supstance se boje zeleno.

Van Gieson

Ova tehnika spada u grupu metoda kojima se boji vezivno tkivo. Njome se
kolagen boji crveno, a mišićno tkivo i eritrociti žuto. I ova metoda se često koristi u
kombinaciji sa drugim metodama.

Orcein i rezorcin-fuksin

Ove metode se koriste za selektivno bojenje elastičnih vlakana, a najčešće se

koriste u kombinaciji sa drugim metodama.

May-Grΰnwald –Giemsa

Koristi se za bojenje razmaza krvi i koštane srži. Sastoji se iz kombinacije

baznih i kiselih boja (eozin, azur, metilen plavo), pa se jedra boje tamno plavo do
ljubičasto, citoplazma svijetlo plavo, a eritrociti ružičasto.

Srebro

33
 Postoji veliki broj metoda u kojima se upotrebljavaju različita jedinjenja srebra.
Najčešće se koriste za prikazivanje neurona i neuroglijskih ćelija, ali i za bojenje
nervnih vlakana i drugih struktura. U zavisnosti od primijenjene metode, vidljivi talog
je crne, braon ili zlatne boje. Rastvor srebra se koristi i u kombinaciji sa heksametilen
tetraminom (metenamin-srebro) za prikazivanje bazalnih lamina, ali i za bojenje
polutankih isječaka.

Osmijum tetroksid

Pored toga što se koristi kao fiksativ u elektronskoj mikroskopiji, osmijum

tetroksid se, zahvaljujući osobini da boji lipide, često upotrebljava za bojenje
mijelinskog omotača, ili lipidnih kapljica u svjetlosnoj mikroskopiji.

Toluidin i metilen plavo

Ove bazne boje se najčešće koriste za bojenje polutankih epoksi isječaka, ali i
za prikazivanje metahromazije (mastociti) na klasičnim parafinskim isječcima. Mogu
se koristiti i u kombinaciji sa azurom.

Bojenje preparata napravljenih žiletom ili na mikrotomu bez inkluzije u

parafin

Svaki presjek, bez obzira da Ii je napravljen žiletom, sječen na mikrotomu od

svježeg ili fiksiranag materijala, ili je napravljen iz parafinskog kalupa, moguće je
obojiti i napraviti privremeni ili trajni preparat.
Presjeci napravljeni slobodnom rukom uz pomoć žileta ili na mikrotomu od
svježeg ili fiksiranog materijala sprovode se kroz alkohole i boje iIi na predmetnom
stakalcu (ako je u pitanju 1-2 preparata) ili u sahatnim staklima (ako ih je više). Kako
proces rada zahtijeva da presjeci prolaze kroz serije alkohola i boju to se nameće
pitanje kako ih prenositi iz suda u sud, a da se pri tome ne oštete ili ne osuše. Ovaj
dio posla vrši se na više načina, a ovde će biti opisana dva najjednostavnija.
1. Presjeci se finom četkicom prebacuju iz jednog u drugo sahatno staklo. Za
ovaj način rada treba pripremiti onoliko sahatnih stakala ili drugih odgovarajućih
sudova kroz koliko različitih agenasa materijal prolazi do konačnog uvođenja u
kanada balzam ili neku drugu materiju.
2. U toku rada presjeci mogu ostati u jednom sudu (ne prebacuju se), a
odlivanjem ili pipetiranjem izvlači se reagens u kome su stajali. Poslije ispiranja
(čistom porcijom reagensa u kome su bili) dodaje se nova, svježa porcija
odgovarajućeg reagensa.
Jedna od čestih kombinacija boja koja se pri ovom načinu rada upotrebljava je
šafranin - vodeno plavo i zato će na jednom primjeru upravo sa ovim bojama biti
opisan način rada.
Presjeci napravljeni od fiksiranog materijala odmah se stavljaju u šafranin u
kome najčešće ostaju 10-30 minuta, a ponekad i 24 sata. Kada se izvade iz
šafranina presjeci se diferenciraju u 50% alkoholu i prenose u boju vodeno plavo. U
toj boji ostaju do 10 minuta, a zatim se prenose u 95% alkohol. Ako su presjeci
prebojeni diferenciranje vršiti u zakiseljenom alkoholu (u 100 ml 95% alkohola dodati

34
kap-dve sone kiseline) i kada se postigne odgovarajući ton boje presjek, prije daljeg
sprovođenja, više puta isprati čistim (nezakiseljenim) 95% alkoholom. Diferenciranje
se vrši sve dok se alkohol boji, odnosno dok se ne ukloni višak boje i ne ispolje jasne
razlike u obojenosti tkiva. Sva odrvenjena tkiva šafranin će obojiti crveno, a celulozni
i drugi neodrvenjeni zidovi biće plavi od boje vodeno plavo.
Dehidratacija presjeka vrši se u apsolutnom alkoholu koji se pri tome više
puta mijenja. Dehidratacija mora da bude potpuna, inače će se presjeci pri
prenošenju u ksilol, što je dalji korak u ovom poslu, zamutiti. U ksilolu presjeci ostaju
5 do 10 minuta. Iz ksilola se prenose na predmetnu ploču u kanada balzam,
prekrivaju se pokrovnim stakalcem i poslije sušenja od nekoliko dana trajni preparat
je gotov.

5.4. REAGENSI ZA PROSVJETLJAVANJE I NAČIN UPOTREBE

Pri proučavanju pojedinih struktura nekih biljnih organa često je potrebno

primijeniti neku od metoda za prosvjetljavanje. Na ovaj način moguće je posmatrati,
ne praveći presjeke, epidermis, stome u epidermisu, dlake, a istovremeno i odrediti
dužinu nervature (izračunava se na jedinici površine lista), zatim broj stoma i slično.
Najčešće upotrebljavani reagensi za prosvjetljavanje su sledeći:

Hloralhidrat

Hloralhidrat ..........................5 ml (može i 8 ml)

Voda ..........................2 ml

Ovaj reagens se koristi za prosvjetljavanje debelih presjeka. Reagens

hloralhidrat se može upotrijebiti hladan, ali i zagrijan do ključanja. Kada se
upotrebljava zagrijjan brže prosvjetljava, ali i izaziva bubrenje ćelijskih zidova.

Kalijum hidroksid

Kalijum-hidroksid (K0H).......................5 gr
Voda ili 96% etil alkohol.....................100 ml

Djeluje isto kao i hloralhidrat. Preporučuje se za prosvjetljavanje

herbarizovanog materijala.

Žavelova voda

Rastvor A:
Hlorni kreč ....... 20 gr
Voda .............. 100 ml

Rastvor B:

35
K2CO3 . . . . .. 15 gr
Voda............ 100 ml

Hlorni kreč se razmuti u vodi i ostavi da odstoji dok pripremamo drugi rastvor
(rastvor B). Zatim se oba rastvora izmiješaju i ostave da stoje nekoliko sati. Poslije
tog vremena dobijeni rastvor se profiltrira i upotrebljava kao reagens za
prosvjetljavanje. Žavelova voda može da se napravi u većoj količini. Čuva se u dobro
zatvorenoj tamnoj boci i na zamračenam mjestu.
Materijal koji se prosvjetljava prvo stoji u 96% alkoholu sve dotle dok ne
pobijeli, odnosno izgubi zelenu boju. Zatim se prenosi u Žavelovu vodu u kojoj se
proces izbjeljivanja dovršava. Žavelova voda je dobar reagens za prosvjetljavanje i
naročito je efikasna kada djeluje na svjetlosti. Pod njenim dejstvom se razaraju
citoplazma i hloloplasti i zato je pogodna za prosvjetljavanje biljnih objekata u kojima
želimo dobro da vidimo ćelijske zidove.
Iz Žalelove vode materijal se brzo prenosi u tekuću vodu i u njoj se nekoliko
minuta ispira. Ovako pripremljen materijal posmatra se u vodi ili glicerinu. Ako želimo
da materijal sačuvamo duže vremena postepeno se dovodi do 70% alkohola i u
njemu se konzervira.

Glicerin

Glicerin . . . . . . . . . 1 dio
Voda .. ................. 1 dio

Upotrebljava se kao medijum u kome se posmatraju presjeci. Može da se

upotrijebi i čist glicerin.
Prosvjetljavanje krupnijih objekata se vrši u vatrostalnom sudu. Stavljaju se u
stakleni sud (epruveta) j pažljivo se kuvaju u 50% alkoholu sve dok se iz njih
izdvajaju mjehurići vazduha. Zatim se u epruvetu stavlja 0,25 gr KCl0 3. Kada se ova
so rastvori dodati još nekoliko kapi sone kiseline (HCl). Sve se zajedno promućka i
ostavi na dnevnoj svjetlosti. Čak se preporučuje da se izloži djelovanju direktne
sunčeve svjetlosti. Vrijeme ekspozicije se kreće, u zavisnosti od prirode materijala,
od 1 minuta do 2 dana.

36
 6. PARAFINSKA METODA PRAVLJENJA MIKROSKOPSKIH
PREPARATA

Već je ranije napomenuto da se na preparatima sječenim slobodnom rukom ne

mogu vršiti mnoge analize, posebno analize finijih struktura ćelijske građe. Pri
citološkim, embriološkim pa i anatomskim proučavanjima često je istraživač prinuđen
da presjeke pravi posebnim aparatom mikrotomom. Isto tako, pri analizama građe
sitnih objekata, ili kada je potrebno, u cilju rješavanja postavljenog problema, dobiti
seriju preparata u nizu jedan za drugim, takođe se primjenjuje sječenje mirkotonom.
Objekti koji se sijeku mikrotonom moraju se prethodno, posebnim načinom,
pripremiti. Postupak pripremanja objekata za sječenje mikrotonom je dosta složen i,
generalno rečeno, sastoji se u tome da se u fiksirane i dehidrirane objekte uvede
određena materija, u kojoj će poslije biti i zaliveni. U ovu svrhu najčešće se
upotrebljava parafin, a rjeđe celoidin. Po parafinu u koji se inkluziraju objekti ova
metoda je dobila ime parafinska metoda.
Čvrsti objekti mogu se i direktno, bez inkluziranja u parafin, sjeći mikrotomom.
O tom postupku biće riječi kasnije.

6.1. INKLUZIJA MATERIJALA U PARAFIN

Da bi materijal koji se preparuje mogao biti uveden u parafin potrebno ga je

prethodno fiksirati, isprati i vrlo pažljivo, provodeći ga kroz seriju alkohola, dehidrirati.
Za uvođenje u parafin dehidratacija materijala mora da ide i dalje od one koja
je opisana u poglavlju "Dehidratacija i konzervacija materijala". Naime, materijal
treba da ostane u 96% alkoholu ne manje od 1 do 2 sata, a zatim se prebacuje u
apsolutni alkohol. U apsolutnom alkoholu I materijal stoji ne manje od jednog sata, a
zatim se prebacuje u novi apsolutni alkohol (AAI II - apsolutni alkohol II). Sitni objekti
i u AAI II ostaju 1 sat, a krupniji mogu i da prenoće.
Da bi se omogućilo natapanje materijala parafinom potrebno je agens kojim se
vršila dehidratacija (AAI) zamijeniti agensom koji ne sadrži vodu, a u kome se parafin
rastvara. Takvih tečnosti ima više: kedrovo ulje, terpentin, benzol, toluol, hloroform,
ali se najčešće upotrebljava ksilol (Xy). Iz apsolutnog alkohola materijal se
postepeno prevodi u neki od navedenih agenasa, a pri tom procesu istovremeno
dolazi i do prosvjetljavanja materijala. Prosvjetljavanje je značajan proces, jer
pokazuje da je alkohol zamjenjen agensom u kome se parafin rastvara i da se može
početi sa inkluzijom (uvođenjem) parafina.
Za prosvjetljavanje i zamjenu alkohola koriste se manje količine agensa, toliko
koliko je potrebno da se prekrije materijal koji se sprovodi. Postupak koji se pri tome
primjenjuje najčešće je sledeći:

1 dio ksilola i 3 dijela apsolutnog alkohola......................................... 1 sat

1 dio ksilola i 1 dio apsolutnog alkohola ............................................1 sat
3 dijela ksilola i 1 dio apsolutnog alkohola ........................................1 sat
čist ksilol I ..........................................................................................1 sat
odnosno do prosvjetljavanja meterijala, a može i da prenoći
 čist ksilol ll ........................................................................................1 sat

Vrijeme držanja materijala u svakom od ovih rastvora zavisi od prirode i

veličine objekta, ali nije manje od navedenog vremena.

U sudove sa materijalom, koji je doveden do čistog ksilola, ubaciti malo

nastruganog parafina. Preporučljivo je da se usitnjen (isjeckan ili nastrugan) parafin
stavi u vrećice od gaze, a one potope u ksilol tako da ne dodiruju materijal. Na taj
način sprečavaju se mehaničke povrede materijala do kojih bi moglo da dođe od
direktno ubačenih komadića parafina. Posude sa materijalom prvo se stavljaju u
vodeno kupatilo, da se parafin brže rastvori, a zatim se otvore i prenose u termostat.
Temperatura u termostatu treba da bude za 2 do 3°C viša od tačke topljenja
parafina. Ako je parafin potpuno rastvoren u ksilolu, ili kada do toga dođe, u sudove
sa materijalom treba doliti jos čistog, otopljenog parafina. U ksilol-parafinu materijal
stoji u termostatu 24 sata. Poslije ovog vremena ksilol-parafin se zamjenjuje čistim
rastopljenim parafinom. U zato posebno izdvojenu i obilježenu posudu treba odliti
ksilol-parafin, a umjesto njega u sudove sa materijalom naliti čist otopljen parafin čija
se tačka topljenja kreće od 52 do 57°C. U ovom parafinu materijal ostaje u otvorenim
sudovima 72 sata, a nakon tog vremena izlijevaju se kalupi. U zavisnosti od tvrdoće
materijala upotrebljava se parafin različite tačke topljivosti. U najvećem broju
slučajeva za anatomske analize zadovoljavajuće rezultate daće rad sa parafinom
čija se tačka topljenja kreće od 48 do 52°C. Tvrđi objekti se inkluziraju u čvršći
parafin tj. u parafin čija je tačka topljenja 52 do 57°C.
S obzirom da je poznavanje tačke topljenja važan podatak, opisaćemo
jednostavan način njenog određivanja. U stakleni kapilar naliti rastopljen parafin.
Kada se parafin stegne kapilar pričvrstiti za termometar i zajedno ih staviti u sud sa
hladnom vodom. Voda se postepeno zagrijava, a istovremeno se posmatra pri kojoj
će se temperaturi parafin u kapilarnoj cjevčici rastopiti. Očitana temperatura je tačka
topljenja parafina.
Ako se parafin pri sječenju na mikrotomu kruni i lomi treba mu dodati 5 do 10
procenata voska.

6.2. KALUPLJENJE

Materijal koji je uveden u parafin i koji je predviđeno vrijeme stajao u

termostatu kalupi se u porcelanskim posudama (posude za žarenje), petri kutijama,
sahatnim staklima ili drugim odgovarajućim posudama. Pri kalupljenju je važno da se
upotrebi posuda u kojoj će se parafin brzo stezati. Ako se uzima neka vrsta staklenih
sudova, prije izlivanja parafina sa materijalom u njih treba ih dobro oprati sapunicom
i toplom vodom, a zatim ih namazati glicerinom.
Kalupljenje se vrši pored termostata, a prije nego što se pristupi ovom poslu
treba pripremiti, osim posuda za izlijevanje parafinskih kalupa, još špiritusnu lampu,
dve anatomske igle, pincetu i posudu sa hladnom vodom. Pošto se posude sa
materijalom u rastopljenom parafinu nalaze u termostatu, sve što je potrebno za
izlijevanje kalupa treba rasporediti na radnoj površini ispred termostata, tako da se u
najkraćem vremenlu može izliti dobar kalup. Određena brzina pri radu potrebna je
zato što se parafin brzo steže na sobnoj temperaturi.
Pri kalupljenju radi se sledećim redoslijedom:

1. Pripremiti posude za izlijevanje parafinskih kalupa.

2. Upaliti špiritusnu lampu.
3. Izvaditi posudu sa materijalom iz termostata. Iz nje brzo izvući pincetom
etiketu i staviti je uz kraj posude u koju se izlijeva kalup.
4. Ugrijanom iglom pažljivo promiješati rastopljeni parafin, tako da se objekti
5. podignu sa dna, ali da se pri tome ne stvore mjehurići vazduha u parafinu.
6. Naglo izliti parafin sa materijalom u posudu za kalupljenje. Svi preparovani
objekti treba da se nalaze u posudi za kalupljenje. Ako je neki dio materijala
ostao u sudu koji je bio u termostatu ugrijanom iglom ga prijeneti u posudu za
kalupljenje u kojoj se parafin još nije stegao.
7. Ugrijanim iglama razmjestiti objekte u parafinu tako da budu ravnomjerno
raspoređeni po cijeloj površini posude, da se nalaze na dovoljnom rastojanju
jedan od drugog, i orijentisati ih u najpovoljniji položaj za sječenje. Orijentacija
objekata je važan dio procesa kalupljenja, jer kada se kalup stegne i kada u
njemu možemo samo nazirati objekte koje želimo da siječemo, moramo tačno
znati u kom se položaju oni nalaze.
8. Pažljivo prenosimo posudu sa izlivenim parafinom na površinu hladne vode.
Posuda sa vodom je ranije pripremljena. Kada je parafin dovoljno očvrsnuo
potapamo posudu sa kalupom u vodu. Brzo rashlađivanje parafina potrebno
je da bi se kasnije parafin mogao dobro da siječe. Ako se dopusti da se
parafin rashlađuje polako, dolazi do njegove kristalizacije, a takav parafin
izaziva određene teškoće pri sječenju.

Ako je sve dobro urađeno, kada se parafin potpuno ohladi i očvrsne, kalup bi
trebalo da sam ispliva iz posude za kalupljenje, ili bar da se odvoji na lak dodir
skalpelom. Ako ga moramo vaditi skalpelom, iglom ili nekim drugim predmetom,
onda kalup zahvatimo na nekoliko mjesta sa strane i polako ga odvojimo od suda.
Naravno, pri tom poslu ne smije da dođe do pucanja kalupa. Ako se iz bilo kog
razloga kalup pokvari, jednostavno ga treba opet vratiti u termostat i ponoviti cijeli
postupak kada se parafin rastopi.

Kada se kalupi izvade, posude za kalupljenje se operu toplom vodom i

sapunicom, a ako na njima ima djelića parafina, prije pranja ih treba odstraniti vatom
natopljenom u ksilolu ill nekom drugom rastvaraču parafina. Posude se zatim dobro
obrišu vatom natopljenom u apsolutnom alkoholu i isuše suvom krpom.
U parafinskim kalupima, koji imaju oblik suda u kome su izliveni, vide se
ukalupljeni objekti. U parafinu objekti mogu da ostanu neograničeno dugo vrijeme, ili
se pak odmah sijeku.

6.3. PRIPREMANJE PARAFINSKIH BLOKOVA

Već je rečeno da parafinski kalup ima oblik suda u kojem je tečan parafin
izliven. Za dalju obradu potrebno je iz parafinskog kalupa isjeći parafinske blokove u
kojima će se nalaziti materijal koji je kalupljen. Napravljeni blokovi se lijepe za
drvene nosače koji se pričvršćuju u određeni dio mikrotoma i pristupa se sječenju
preparata.
Ukoliko se materijal odmah ne siječe parafinski blokovi se čuvaju u kesicama
na kojima se ispišu svi podaci neophodni za identifikovanje materijala i dalju obradu
(vrsta, organ, fiksativ, datum i drugo). Neki autori preporučuju da se parafinski
blokovi nekoliko dana (5 do 6) prije sječenja potope iIi u vodu ili u agens koji sadrži
20 ml zasićenog rastvora pikrinske kiseline i 1 ml glacijalne sirćetne kiseline.
Pošto se objekti u parafinskom kalupu vide (makar kao siluete prema
svjetlosnom izvoru) treba oko njih isjeći parafin tako da oko objekta ostane 1-2 mm
parafina i na taj način će se dobiti parafinski blokovi sa objektima u njima. Parafinski
blokovi se sijeku tako da je u njima materijal najpovoljnije orijentisan za sječenje.
Naspramne strane blokova moraju biti međusobno paralelne.
Blokovi sa parafinom se lijepe za drvene nosače koji se obično prave od
hrastovine, bukovine, brezovine ili nekog drugog čvrstog drveta. Veličina drvenih
nosača je različita, ali bi se kao prikladna mogla preporučiti sledeća 2 x 2 x 2,5 cm.
Na manju površinu pripremljenog nosača špatulom se nanosi rastopljen parafin i u
njega se, dok je još rastopljen (ili dok se još nije stegao) potapa parafinski blok. Blok
se lijepi u onom položaju pri kome je materijal orijentisan za sječenje. Pošto se
parafin brzo steže blok će biti zalijepljen čim se parafin ohladi. Da bi bili sigurni da je
blok dobro pričvršćen na nosaču, treba ga još sa svih strana zaliti rastopljenim
parafinom. Poslije ove radnje drveni držač zajedno sa parafinskim blokom potapa se
u vodu da parafin brže očvrsne. Ovako pripremljen kalup spreman je za sječenje na
mikrotomu.

6.4. PRIPREMANJE PREDMETNIH I POKROVNIH STAKALA

Prije nego što pristupimo pravljenju presjeka potrebno je, bilo da se radi o
privremenim iIi trajnim preparatima, da se pripreme predmetna i pokrovna stakalca.
Predmetna i pokrovna stakalca moraju biti besprekorno čista. Ako su stakalca nova
dovoljno ih je oprati toplom vodom i obrisati lanenom ili nekom drugom krpom koja
ne ostavlja tragove (dlačice). Pri pranju, brisanju, i uopšte pri uzimanju predmetnih i
pokrovnih stakalca mora se voditi računa da se uvijek drže sa strane između palca i
kažiprsta. Ako su predmetna i pokrovna stakalca bila ranije upotrebljavana, ili ih
pripremamo za trajne preparate, moramo ih oprati toplom vodom i sapunicom.
Nakon toga ih ispiramo tekućom vodom i potapamo u sonu kiselinu (HCI). U sonoj
kiselini ostaju 24 sata. Umjesto sone kiseline mogu se upotrijebiti i drugi rastvarači.
Jedan od njih je sledeći:

destilovana voda . . . . . . . . . . . 80 cc
Kalijum bihromat. . . . . . . . . . . . . .10 gr 2-3 dana
tehnička sumporna kiselina . . . . .10 cc
U ovom rastvaraču predmetna i pokrovna stakla ostaju 2 do 3 dana.
Poslije stajanja u rastvaraču treba ih isprati prvo tekućom, a zatim i
destilovanom vodom i potopiti u 96% alkohol. U alkoholu ostaju sve do upotrebe.
Prije upotrebe predmetna i pokrovna stakalca pincetom se vade iz alkohola i suše, iIi
dobro ispranom krpom koja ne ostavlja tragove, iIi na plamenu špiritusne lampe.
Umjesto u alkoholu predmetna i pokrovna stakalca se mogu čuvati i u destilovanoj
vodi, ali prednost dajemo alkoholu.

6.5. PRAVLJENJE PRESJEKA MIKROTOMOM

Precizan laboratorijski aparat koji služi za dobijanje finih presjeka zove se

mikrotom. I ako postoje različiti tipovi mikrotoma najčešće se upotrebljavaju klizeći i
rotacioni. Osnovna razlika izmedu ova dva tipa mikrotoma je u sledećem. Kod
rotacionog mikrotoma nož je nepokretan, a po vertikali se kreće mikrotomski stočić.
Kod klizećeg mikrotoma je obrnuto: pri sječenju preparata stočić je nepokretan, a
nož se pokreće.
Bilo o kom mikrotomu da je riječ stočić mikrotoma je uvijek povezan sa
mikrometarskim zavrtnjem i pri svakom pokretu noža automatski se podiže za
određenu željenu visinu. Na taj način dobijaju se presjeci uvijek određene debljine.
Debljina presjeka se inače može podešavati, a zavisi od materijala koji se siječe i
cilja rada.
Pripremljen drveni nosač sa parafinskim blokom u kome je materijal,
pričvršćuje se između dve metalne ploče u stočić klizećeg mikrotoma. Mikrotomski
stočić je inače konstruisan tako da pomoću različitih zavrtanja može da mijenja
položaj čime se omogućava neophodno dotjerivanje orijentacije objekta koji sa
siječe. Kada se objekt orijentiše, a prije nego što se počne sa sječenjem, svi zavrtnji
moraju biti stegnuti, a samim tim i stočit postaje potpuno nepokretan.
Mikrotomski nož ima svoje ležište na mikrotomu u koje se stavlja i pričvršćuje
pomoću dva zavrtnja. Sam nož je, prema tome nepokretno pričvršćen, a kod klizećih
mikrotoma, koji su inače češće u upotrebi, nosač noža slobodno klizi po žlijebu na
tijelu mikrotoma. Žlijeb mora, kao u ostalom i svi drugi dijelovi mikrotoma, da bude
čist i dobro podmazan kako bi se nosač noža po njemu lako i ravnomjerno kretao.
Pri pravljenju presjeka od materijala koji je kalupljen u parafinu nož se
postavlja tako da njegova oštrica bude paralelna ivici parafinskog bloka. Na
mikrotomu nož može da se postavi i koso prema bloku koji se siječe, ali takav
polažaj noža se preporučuje ako su objekti kalupljeni u celoidin, ili ako se siječe
materijal koji uopšte nije kalupljen (čvršća tkiva koja možemo direktno pričvrstiti u
stočić mikrotoma). Na ovaj način se, i bez prethodnog uvođenja u parafin, od
svježeg ili fiksiranog materijala mogu dobiti presjeci na mikrotomu. Pri ovakvom
pravljenju presjeka ne smije se izgubiti iz vida da presjeci ne smiju da se osuše i
zato, ako se radi sa svježim materijalom, i nož i površinu presjeka treba stalno kvasiti
vodom, a ako se upotrebljava materijal iz fiksativa vlaži se 70% alkoholom. Dobijeni
presjeci se prenose u vodu ili alkohol koji se nalaze u sahatnom staklu. Debljina
presjeka koji se na ovaj način dobije obično se kreće između 20 i 25 mikrona, a
mogu da budu i deblji.
Mikrotomski noževi su veoma važan dio mikrotoma. Od njihovog kvaliteta i
oštrine zavisiće i kvalitet presjeka. Mikrotomski noževi se po obliku razlikuju. Ima
noževa koji su sa jedne strane ravni a sa druge ugnuti, iIi mogu biti sa obe strane
ugnuti. Ravno-ugnuti upotrebljavaju se za sječenje objekata inkluziranih u parafin, a
dvostrano ugnut za sječenje objekata koji se teško sijeku, ili za one koji se sijeku na
mikrotomu sa uređajem za smrzavanje (poseban tip mikrotoma).
S obzirom na značaj mikrotomskih noževa pri radu neophodno je da se oni
pažljivo čuvaju i održavajiu. Ovo se posebno odnosi na njihovo sječivo koje je vrlo
osjetljivo na najmanji udar o neki čvršći predmet. Poslije upotrebe nož se očisti
vatom namočenom u ksilol. Na taj način se otklanjaju i poslednji ostaci parafina koji
su se, eventualno na njemu zadržali. Zatim se nož obriše suvom krpom i stavlja u
kutiju za noževe. Ako se nož duže vremena neće upotrebijavati treba ga konzervirati
tankim slojem ulja ili specijalne masti, čime je zaštićen od korozije.
Sječivo noža se mora povremeno naoštriti. Oštrenje noža se vrši ili ručnim
oštračem mikrotomskih noževa ili automatskim oštračem, a kontrola kvaliteta sječiva
se vrši lupom ili na mikroskopu pri uvećanju od 100 puta. Nož je dobro naoštren i
spreman za rad kada na njegovom sječivu nema zubaca.
Za dobijanje dobrog presjeka potrebno je, osim već navedenih postupaka, još i nož
pravilno namjestiti na mikrotomu, odnosno podesiti odgovarajući ugao noža prema
površini parafinskog bloka. Mnogi autori smatraju da je nož dobro postavljen kada je
njegova donja faseta paralelna površini rezanja.

6.6. UPOTREBA MIKROTOMA

Prije nego što se pristupi pravljenju presjeka mikrotom treba pažljivo očistiti od
prašine i ostataka parafina. lsto tako, svi pokretni dijelovi na mikrotomu uvijek moraju
biti podmazani. Kao mazivo se koristi specijalno ulje za mikrotome, ili ako njega
nema dobro je i ulje za šivaće mašine.
Na očišćen i podmazan mikrotom stavlja se nož, podešava se njegov ugao
prema objektu (faseta paralelna površini objekta, a upravna na pravac kretanja
noža). Za vrijeme rada i poslije završenog posla nož se čisti od ostataka parafina
krpom namočenom u neki od rastvarača parafina (ksilol, benzin i dr.) i dobro isuši
čistom suvom krpom.
Kada je nož postavljen, u stočić mikrotoma se stavlja drveni nosač
parafinskog bloka i čvrsto zavrtnjem pritegne. Pri tome se vodi računa o pravilnoj
orijentaciji materijala. Kada je sve na opisan način pripremljeno polako se nož
privlači parafinskom bloku, a istovremeno kada se nož nalazi uz sam blok, pomoću
zavrtnja se podešava visina bloka prema nožu. Pošto je blok uvijek tako sječen da
se iznad objekta nalazi jos 1-2 mm parafina, laganim podizanjem stočića i
istovremeno odsijecanjem (mikrotomskim nožem) viška parafina, dolazimo do
objekta. Ponovo fiksiramo stočić i na mikrometarskoj skali odredimo debljinu
presjeka. Debljina presjeka se određuje jednostavnim postupkom pomijeranja
klizećeg dijela na mikrometarskoj skali do željenog mjesta. Mikrometarska skala je
podijeljena na podioke označene brojevima od 0 do 30. Postavljanjem klizećeg dijela
na jedan od podioka, odnosno brojeva, i pritezanjem na tom mjestu, odredili smo i
debljinu presjeka koje ćemo sjeći. Drugim riječima, ako oznaku postavimo i
učvrstimo na br. 20 svakim pokretom noža, koji mora da dođe do mikrometarske
skale i da je gurne do kraja, stočić se podigne zajedno sa objektom za 20 mikrona, a
pri povlačenju noža prema sebi dobija se presjek upravo te debljine. Radnja se
ponavlja i tako se dobija željeni broj presjeka određene debljine. Određivanje
debljine presjeka zavisiće od samog objekta kao i od cilja istraživanja. Za anatomska
ispitivanja biljnog materijala zadovoljavajuće rezultate daju presjeci debljine 15 do 20
mikrona, a za animalni i humani materijal presjeci su znatno tanji, i do 5 mikrona.
Ako su suprotne strane parafinskog bloka u kome je objekat koji siječemo
paralelne, pri odgovarajućoj sobnoj temperaturi i nagibu noža, na nožu ostaju
presjeci u obliku trake. Presjeci se sa noža skidaju mekom i nakvašenom četkicom i
stavljaju na posebno pripremljeno predmetno staklo. Pri stavljanju presjeka na
predmetno staklo mora se voditi računa o orijentaciji parafinskih traka ili pojedinačnih
presjeka, ako se oni kao takvi prave. To nije teško jer se gornja i donja strana
parafinskih presjeka razlikuju. Donja strana je glatka i svijetla, a gornja je mat.
Presjeci se uvijek donjom, glatkom stranom stavljaju na predmetno staklo. Ako se
postave suprotno, u daljem postupku će se odljepljivati.

6.7. TEŠKOĆE PRI SJEČENJU MIKROTOMOM

Pri pravljenju presjeka često se javljaju mnoge teškoće od kojih ćemo

nabrojati najčešće, ukazati na uzroke koji do njih dovode, kao i na način kako da ih
otklanimo.
Presjeci se lijepe za nož. Do ovoga obično dolazi ako je u radnoj prostoriji
visoka temperatura koja prouzrokuje omekšavanje parafina ili je kalupljenje izvršeno
u neodgovarajućem parafinu, odnosno u parafinu niske tačke topljenja. Ova teškoća
u radu se otklanja snižavanjem sobne temperature, rashlađivanjem (pomoću kockica
leda) parafinskog bloka i noža, a ako je u pitanju parafin, kalupe treba pretopiti, a
objekte ponovo ukalupiti u parafin više tačke topljenja (tvrđi parafin).
Presjeci se krune. Do pojave krunjenja presjeka dolazi ili usljed niske sobne
temperature ili usljed kalupljenja u neodgovarajuećem (tvrdom) parafinu. Uzrok
može da bude i lagano hlađenje pri izlijevanju kalupa.
Rascijepljena traka, uzdužne brazde na presjecima. Pojava ovakvih presjeka
znači da nož više nije dobar, da se na njemu nalaze zubci, ili da je prljav. Ako je nož
tup treba ga opet naoštriti, ili ga bar pomjeriti za širinu oštećenog (zupčastog) dijela,
a ako je prljav treba ga očistiti. Do pojava brazda i raskidanja dovode i drugi uzroci,
kao npr. nečist parafin ili priroda samog objekta. Ako je parafin nečist treba ga
profiltrirati, a ako se kao uzrok ovoj pojavi ustanovi prisustvo kristala
silicijumdioksida, treba izvrštiti desilifikaciju prije uvođenja u parafin.
Iskrivljena traka. Strane bloka nisu paralelne, ivica bloka nije paralelna sa ivicom
noža. Žiletom pravilno oblikovati blok.
Pri sječenju mikrotom "preskače" i dobijaju se presjeci nejednake debljine.
Nož je postavljen pod suviše kosim uglom. Podesiti ugao pod kojim nož stoji u
odnosu naparafinski blok. Neki šarafi u zglobovima mikrotomskog stočića ili držača
noža nisu dovoljno zategnuti. Treba prekontrolisati sve zavrtnje i pritegnuti one koji
su labavi. Mikrotom nije podmazan. Treba ga očistiti i podmazati.
Presjeci zbijeni, naborani i slijepljeni. Uzroci mogu biti različiti: nož suviše tup, soba
pretopla, parafin mekan, mali nagib noža, prljav nož. Pored oštrenja noža,
podešavanja sobne temperature, hlađenja parafina, podešavanja nagiba noža i
njegove čistoće, pri pojavi ovakvih presjeka preporučljivo je prije sječenja potopiti
blok sat, dva ili preko noći u vodu ili 10% glicerin u 60% alkoholu.
Ukalupljeni materijal se lomi i ispada iz bloka. Materijal nije dovoljno
dehidrovan iIi nije potpuno prosvijetljen, alkohol nije potpuno zamijenjen reagensom
za prosvetljavanje, materijal je postao krt u reagensu za prosvjetljavanje, tkivo suviše
tvrdo za kalupljenje u parafinu. Ako je uzrok navedenoj pojavi nedovoljno anhidrovan
i nepotpuno prosvijetljen materijal, pomoći nema, mora se ponovo početi od
fiksiranja. Ako se kao reagens za prosvjetljavanje koristi ksilol i materijal u njemu
postane previše krt, tako da se ne može sjeći, umjesto ksilola treba upotrijebiti toluol
ili mješavinu toluola i kedrovog ulja. Ako je tkivo suviše tvrdo za kalupljenje u
parafinu, umjesto u parafin uvodi se u neku drugu odgovarajuću materiju.
Presjeci se podižu. Veliki nagib noža; tup nož, soba pretopla ili parafin mekan.
Presjeci talasasti. Materijal nije dobro zaliven u parafin. Pretopiti kalupe.
Presjeci lete i lijepe se za dijelove mikrotoma zato što se pri sječenju stvara
statički elektricitet. Ovo obično nastaje kada je vazduh izuzetno suh. Vlažnost
vazduha se u radnoj prostoriji može povećati postavljanjem suda sa vodom.

6.8. LIJEPLJENJE PRESJEKA NA PREDMETNO STAKLO

Za lijepljenje parafinskih prejseka koriste se apsolutno čista predmetna

stakalca. Da Ii su predmetna stakalca dobro oprana provjerava se tako što se na
čisto predmetno stakalce stavi nekoliko kapi vode. Ako se voda po njemu lako
razlijeva staklo je dobro oprano, a ako se skuplja znači da na ploči ima masnoće. Sa
nečiste ploče preparati se odljepljuju i zato ovoj fazi rada treba pristupiti ozbiljno. Ma
koliko nam se stakalca činila čistim treba provesti kompletan praces pranja da ne
bismo doživjeli neprijatno iznenađenje, tj. da se poslije fiksiranja, dehidriranja,
kalupljenja i sječenja, preparati, zbog nemarnosti, odlijepe i da se mora čitav proces
započinjati od početka.
Prema nekim autorima presjeci se mogu lijepiti direktno na čista predmetna
stakalca, ali ako nismo sigurni da će se bez upotrebe Majerovog ili nekog drugog
ljepila preparati održati, poslije pranja i sušenja na predmetna stakalca treba nanijeti
ljepilo.

6.8.1. Pripremanje i upotreba Majerovog ljepila.

Iz svježeg jajeta razdvojiti bjelance od žumanceta. Bjelance sipati u menzuru i

na njega dodati istu količinu glicerina. Bjelance i glicerin dobro izmješati, toj smjesi
dodati kristalić fenola ili timola (konzervans) i filtrirati. Pošto filtracija teče sporo
(nekoliko dana) lijevak treba pokriti. U sud sa filtratom treba ubaciti kristalić fenola ili
timola.
Predmetna stakalca na koja se nanosi Majerovo ili neko drugo ljepilo moraju
biti apsolutno čista, jer će se u protivnom preparati u daljem postupku odljepljivati.
Na čisto i suho predmetno stakalce kapaljkom se nanosi kap Majerovog ljepila.
Nanijetu kap ravnomjerno i u tankom sloju rastrljati po površini stakla. Utrljavati sve
dotle dok kažiprst ne počne da zapinje o površinu stakla. Predmetno stakalce se pri
ovom postupku drži lijevom rukom sa strane između kažiprsta i palca. Na
pripremljenu površinu predmetnog stakalca stavi se nekoliko kapi destilovane vode i
na njenu površinu postavljaju se parafinski presjeci. Oni se sa mikrotomskog noža
prenose vlažnom četkicom ili nekim instrumentom, a pri tome se vodi računa da
donja strana presjeka (glatka strana) leži na površini vode. Pri pravljenju serijskih
preparata takođe se mora voditi računa o redoslijedu postavljanja.
Broj presjeka koji se stavljaju na jedno predmetno staklo zavisiće od namjene
pravljenja preparata, ali isto tako i od veličine pokrovnog stakalca kojim se presjeci
kasnije prekrivaju. Ako se upotrebljavaju pokrovna stakalca različitih dimenzija
(20x20 mm, 22x22 mm, 32x32 mm) preporučujemo da se konture svake od
navedenih dimenzija pločica nacrtaju na neku tvrdu, tamniju podlogu i tako dobije
marker za raspoređivanje presjeka. Presjeci se raspoređuju samo unutar kontura
markera. Kada se presjeci pravilno rasporede i orijentišu pristupa se razvlačenju ili
ispravljanju parafinskih presjeka.
Za lijepljenje presjeka koriste se i druge materije i drugačiji postupci, međutim
ovaj opisani način je najrasprostranjeniji i najdostupniji, a daje dobre rezultate.

6.9. RAZVLAČENJE PARAFINSKIH PRESJEKA

Poslije sječenja parafinski presjeci se razvlače ili ispravljaju. Postupak

ispravljanja parafinskih presjeka obavlja se na više načina.
1. Kada se presjeci poslije sječenja prenesu na predmetno stakalce i
rasporede mogu se razvlačiti ili na plamenu špiritusne lampe ili na specijalno
konstruisanom stočiću (Slika 7). Pri razvlačenju na plamenu predmetno stakalce se
brzim pokretima prenosi preko plamena sve dok se presjeci ne isprave. Pri ovom
postupku osoba koja pravi preparat mora biti izuzetno pažljiva da ne pregrije
presjeke i da ne dozvoli da se parafin otopi. Znači, presjeci se ispravljaju ispod tačke
topljenja parafina.
Ako se razvlačenje parafinskih presjeka vrši na specijalnom termo stočiću
onda se temperatura grejne ploče reguliše pomoću preklopnog dugmeta tako da
uvijek bude nešto niža od temperature na kojoj se upotrebljen parafin topi.
Opisani postupci primjenjuju se za ispravljanje kako serijskih tako i
pojedinačnih presjeka. Pri razvlačenju mora se stalno voditi računa da voda na
predmetnom stakalcu u kojoj se nalaze presjeci ne ispari. Po potrebi pipetom se
može voda i naknadno dodavati. Tek kada su presjeci ispravljeni višak vode se
odstranjuje filter papirom.

Slika 7. Stočić za razvlačenje parafinskih presjeka

 2. Mnogi praktičari primjenjuju postupak razvlačenja parafinskih presjeka na
toploj vodi. Temperatura vode mora da se održava za nekoliko stepeni niže od tačke
topljenja parafina (temperatura se stalno kontroliše termometrom). Presjeci se sa
noža prenose na površinu vode. I u ovom slučaju mora da se vodi računa o
orijentaciji presjeka. Donja, glatka strana presjeka leži na vodi. Kada se isprave
presjeci se prenose na predmetno stakalce tako što se ispod presjeka u vodu koso
zamače predmetno stakalce i laganim pokretom izvlači. Pri tome presjek ostaje
zalijepljen na staklu. Ovaj način ispravljanja pogodniji je za pojedinačne presjeke, ali
je za serijske povoljnije razvlačenje na plamenu ili na termostočiću.
Poslije razvlačenja predmetna stakalca prenose se na marker (tamna površina
na kojoj su označene konture pokrovnih stakalaca) i vrši se raspoređivanje presjeka
na već opisan način.
Razvučeni i raspoređeni presjeci treba da se osuše. Sušenje presjeka se
obično vrši na sobnoj temperaturi i to na taj način što se predmetna stakalca sa
presjecima ostavljaju (zaštićene od prašine) nekoliko dana izložena djelovanju sobne
temperature. Zatim se obilježavaju i stavljaju u kutije.
Neki preparati zahtijevaju sušenje u termostatu, 1-2 dana, na temperaturi od
približno 35-40°C. Prema literaturnim podacima na ovaj način se isključuje
mogućnost odljepljivanja presjeka pri daljem radu.

6.10. DEPARAFINISANJE

Bojenju preparata prethodi proces deparafinisanja - oslobađanja presjeka od

parafina. Deparafinisanje se vrši u posebnim staklenim posudama – kivetama. Po
obliku i veličini kivete mogu biti različite. Predmetna stakalca se stavljaju, jedna po
jedna ili u parovima, u odgovarajuće žljebove u kivetama. Ako se deparafinišu, a
kasnije i boje u parovima, stakalca se stavljaju "Ieđa u leđa", tj. parafinski presjeci su
okrenuti spolja.
Deparafinisanje se vrši ksilolom, a traje, u zavisnosti od debljine presjeka, 5 do
15 minuta. Količina ksilola koja ispunjava jednu kivetu dovoljna je za deparafinisanje
do sto predmetnih stakalaca na kojima se nalaze parafinski presjeci. Pri
deparafinisanju svi presjeci moraju biti potpuno potopljeni u ksilol, kao uostalom i u
sve rastvore kroz koje preparat prolazi.
Iz ksilola predmetna stakla se pincetom prenose u sledeću kivetu u kojoj se
uvijek nalazi apsolutni etil alkohol i ksilol u jednakim dijelovima. U ksilol-alkoholu
preparati ostaju 5 do 10 minuta. Prenošenje preparata iz jedne kivete u drugu
obavlja se brzo kako bi se izbjeglo sušenje presjeka. Postoji još jedan način
promjene reagenasa: odlivanje upotrebljenog, pri čemu se preparati pridržavaju
pincetom, i brzo nalivanje sledećeg reagensa. Bilo da se primjenjuje jedan ili drugi
način,cilj rada je da se vrši sprovođenje preparata kroz seriju alkohola sve niže
koncentracije, ako je potrebno sve do vode. U svakom alkoholu preparati ostaju po 5
minuta. Šematski taj proces se može predstaviti na sledeći način:

Xy - Xy+AAI - AAI - 96%At - 90%AI - 80%A I - 70%AI - 50%AI - 30%AI -20%AI

- voda.
 Pošto se iz ove faze rada prelazi na bojenje, a boje se rastvaraju u alkoholu
različite koncentracije (na primjer 50% ili 70% alkoholu) ili u vodi, to će upravo taj
rastvarač i uticati u kom trenutku će preparat iz navedene serije alkohola biti
prebačen u boju. Drugim riječima, ako se koristi vodeni rastvor boje onda preparate
sprovodimo do vode (kroz cijelu seriju) pa ih tek tada bojimo. Ako se pak
upotrebljava alkoholni rastvor boje, na primjer boja je rastvarena u 50% alkoholu,
onda se preparati, pri sprovođenju kroz seriju alkohola, u boju uvode iz 50%
alkohola. Ako je boja rastvorena u apsolutnom alkoholu, onda se preparati odmah iz
njega prenose u boju itd.

7. TEHNIKA SMRZAVANJA TKIVA

Da bi se spriječilo oštećenje određenih ćelijskih komponenti koje može

nastati primjenom parafinske tehnike i da bismo sačuvali osjetljive molekule u
uzorku, tkivo možemo podvrgnuti brzom zamrzavanju, najčešće u tečnom azotu.
Smrznuto tkivo tako postaje dovoljno tvrdo da se pomoću mikrotoma u hladnoj
komori mogu dobiti tanki isječci (5 do 10 mikrometara), koji se zatim mogu direktno
bojiti bez izlaganja organskim rastvaračima ili alkoholu. Ova metoda se primjenjuje
kod brojnih histohemijskih i imunohistohemijskih metoda za demonstraciju enzima ili
osjetljivih molekula. Međutim, sa morfološke tačke gledišta tkivo je znatno slabije
sačuvano. S obzirom da se isječak može posmatrati pod mikroskopom već poslije 5
do 10 minuta od dobijenog uzorka, ova tehnika se široko primjenjuje u toku
operativnih zahvata (biopsija “ex tempore”) radi dobijanja brze dijagnoze i nastavka
hirurške procedure.
Danas se prave i specijalna rashladna kupatila, koja se povežu sa
mikrotomom i omogućavaju sječenje tkiva na niskim temperaturama, ali ne toliko
niskim kao pri sječenju tkiva zamrznutog u tečnom azotu. Rashladna kupatila obično
omogućavaju snižavanje temperature tkiva na –20 do – 40 0C, čime tkivo postaje
dovoljno tvrdo da bi se moglo sjeći mikrotomom. Ovaj proces je znatno brži od
pravljenja parafinskih kalupa, ali su takođe ćelije morfološki slabije očuvane.

8. SPECIFIČNE METODE PRIPREME CITOLOŠKIH PREPARATA

Pored standardnih metoda pravljenja privremenih i trajnih preparata, često se

u laboratoriji primjenjuje i jedan od sledećih postupaka:

8.1. FRAKCIONISANJE I CENTRIFUGIRANJE ĆELIJE

U nekim slučajevima prilikom pravljenja preparata potrebno je izdvojiti

pojedine ćelijske komponente. Jedan od načina na koji se to može postići jeste
centrifugiranje pri velikom broju obrtaja. Postoji veliki broj različitih modela centrifuga
koji se međusobno razlikuju po broju obrtaja u minuti, a time i po veličini razvijene
centrifugalne sile i vrsti pogona. Za najveći broj potreba dobro može poslužiti svaki
model električne centrifuge koji može postići brzinu od 3000 do 5000 obrtaja u
minuti. Kod rada sa centrifugom mora se voditi računa o sledećem:

 Epruvete sa tečnošću koja se centrifugira moraju biti uravnotežene.

 Poklopac centrifuge mora biti zatvoren prije početka rada centrifuge, a otvara
se tek kada “glava” centrifuge prestane da se okreće.
 Brzina obrtaja se mora postepeno povećavati, a isto tako, po isteku
određenog vremena, postepeno smanjivati ukoliko se centrifuga ne isključuje
automatski. Nagla promjena brzine pored ostalog dovodi do potresanja
taloga, a time i do ponovnog zamućenja. Tečnost iznad taloga se može odliti
(dekatnirati) ili odvojiti pipetom, a ostatak tečnosti se uklanja izvrtanjem
epruvete na filter papir ukoliko to dozvoljava vrsta taloga.

8.2. MACERACIJA

Maceracija predstavlja prirodno ili vještačko razlaganje međućelijske

supstance. Kao rezultat maceracije dolazi do razdvajanja ćelija. Vještačka
maceracija se vrši u cilju dobijanja pojedinačnih ćelija određenag tkiva. Na ovaj način
moguća su detaljnija ispitivanja oblika i veličine ćelija kao i finija ispitivanja ćelijskog
zida.
Postoji više načina za maceriranje tkiva, a koji od njih ćemo primijeniti zavisi od
samog tkiva koje se macerira.

1. Nježna tkiva se maceriraju kuvanjem u ključaloj vodi.

2. Maceracija nježinih tkiva vrši se i u različitim koncentracijama KOH (5-50%).
Koncentracija KOH se određuje prema čvrstini materijala koji se macerira.
Ukoliko je materijal tvrđi, upotrebljava se jaca koncentracija. Poslije
maceracije, a prije posmatranja, materijal se ispira vodom.
3. Najpogadniji metod za maceriranje tkiva zeljastih biljaka je metod Manžea, a
sastoji se u sledecem: Dijelovi biljke se stavljaju u zakiseljenu vodu ili
zakiseljeni alkohol (na 3-5 dijelova 96% alkohola 1 dio sone kiseline HCI). U
ovom rastvoru ostaju 24 sata. U daljoj fazi obrade materijal se prenosi u
10% rastvor amonijaka u kome ostaje 24 sata. Ukoliko želimo da proces
ubrzamo, materijal treba kuhati u 10% amonijaku 1 sat. Kada se izvade iz
amonijaka dijelovi biljke treba da se, na lak dodir pincetom, raspadnu na
ćelije. Ukoliko je maceracija slaba treba povećati koncentraciju
amonijaka do 30%, a ponekad se može upotrijebiti i nerazblaženi amonijak.
Maceracija po metodu Manžea ima tu prednost što se u toku procesa ne
razara sadržaj u ćelijama.
4. Drvo i veoma čvrsti dijelovi biljke, kao što je endokarp kad oraha (ljuska),
vrlo dobro se maceriraju Šulceovom smješom. Prilikom ovog načina
maceriranja obavezno je da se rad odvija u digestoru ili na otvorenom
prostoru jer se izdvajaju pare azotne kiseline koje su otrovne. Dijelovi drveta
se stave na dno epruvete i preko njih se naspe bertoletova so (KCIO 3), tako
 da prekrije materijal koji se macerira. Preko soli se pažljivo sipa nekoliko
kapi azotne kiseline (HNO3). Pri lakom zagrijavanju, a nekad i bez
zagrijavanja, dalazi do burne reakcije pri kojoj se u početku izdvajaju mrke
pare azatnog oksida, a zatim bijela para hlora. Kada ključanje prestane i
kada dijelovi drveta postanu bijeli, sadržaj epruvete se izlijeva u sud sa
vodom i nekaliko puta se ispira. Naravno, pri tome se pazi da sa vodom ne
ode i macerirani materijal. Ovako pripremljeni materijal se čuva u alkoholu
do upotrebe.

Maceririani materijal se može bojiti eozinom, šafraninom i Delafildovim

hematoksilinom, a posmatra se u 2% sirćetnoj kiselini ili u glicerinu.
Osim privremenih preparata moguće je napraviti i trajne, samo prethodno
materijal treba da prođe kroz seriju alkohola da bi mu se oduzela voda (uobičajen
mikrotehnički postupak).

8.3. GLICERIN - ŽELATINSKI PREPARAT

Kad god postoji potreba da se brzo naprave trajni preparati od svježeg

materijala, bez sprovođenja kroz alkohole, prave se glicerin-želatinski preparati. U
glicerin-želatin obično se stavljaju neobojeni preparati, jer u njemu boje brzo
izblijede, osim nekih koje su nešto postojanije (na primjer metilensko plavo).
Pripremanje glicerin-želatina. U 6 ml destilovane vode, koja se sipa u
vatrostalnu posudu, dodati 1 gram želatina. Želatin u destilovanoj vodi ostaje
nekoliko sati i za to vrijeme on bubri. Poslije ovog vremena u posudu se još dolijeva
7 ml hemijski čistog glicerina i ubacuje kristalić antiseptika (timol, fenol). Zatim se
posuda prenosi u vodeno kupatilo i zagrijava. Kroz izvijesno vrijeme sadržaj u
vatrostalnoj posudi će se otopiti. Za vrijeme otapanja potrebno je više puta staklenim
štapićem promiješati sadržaj u posudi. Poslije otapanja i homogenizovanja glicerin -
želatin obavezno treba profiltrirati kroz lijevak u kome se nalazi staklena vata. Na
ovaj način se odstranjuju nepoželjne primjese kojih uvijek ima u želatinu. Filtriranje
se vrši u termostatu, jer se na običnoj temperaturi glicerin-želatin steže. Ovako
pripremljeno ljepilo se čuva u frižideru i veoma je postojano.
Pri korišćenju glicerin-želatina potrebno je staklenu posudu, u kojoj se nalazi,
postepeno zagrijavati u vodi sve dotle dok se on ne otopi. Staklenim štapićem se kap
glicerin-želatina prenosi na predmetno stakalce i u nju se utapaju napravljeni
presjeci. Zatim se presjeci prekrivaju pokrovnim stakalcem i kroz izvijesno vrijeme,
kada se glicerin- želatin stegne, dobija se trajan preparat.

9. PRAKTIČNA UPOTREBA ELEKTROFOREZE

Pod elektroforezom se podrazumijeva kretanje čestica sa električnim nabojem

u električnom polju. Brzina kretanja ovih čestica je proporcionalna jačini električnog
polja, a zavisi od električnog naboja, veličine i oblika čestica. Postoje tri tipa
elektroforeze:

1) Slobodna elektroforeza koja se vrši u naročitom staklenom sudu –

ćeliji u obliku slova “U”, u koju se stavlja serum ili plazma, razblaženi
određenim puferskim rastvorom, određenog pH i određene jonske
jačine. Elektroforetska ćelija je u kontaktu sa sudom koji je
ispunjenistim puferskim rastvorom kao i ćelija, a u njega su
zagnjurene elektrode koje su u vezi sa izvorom konstantne struje
određenog napona i jačine.
2) Zonska elektroforeza se vrši na čvrstoj podlozi kao što su filter-papir,
acetatna celuloza, agar-gel i skrobni gel.
3) Imunoelektroforeza koja služi za dokazivanje molekula bjelančevina
na osnovu njihovih antigenih osobina.

Danas se najčešće primjenjuje zonska elektroforeza.

9.1. ANALIZA IZOLOVANE DNK

Analiza kvantiteta i kvaliteta izolovane genomske i plazmidne DNK se vrši

agaroznom gel elektroforezom bojenom etidijum bromidom. Agaroza je polisaharid
čiju osnovnu jedinicu čini disaharid agrobioza. Nakon rastvaranja, kuvanja i laganog
hlađenja, agaroza formira gustu mrežu sa porama koje variraju od 100 do 300 nm, u
zavisnosti od koncentracije rastvora agaroze.
U električnom polju, u blago alkalnom puferu, molekuli DNK će se kretati kroz
ovaj matriks, od katode ka anodi (DNK molekul je inače negativno nabijen), pri čemu
brzina kretanja DNK molekula zavisi od njihove veličine, od veličine pora u
agaroznom matriksu, tj. od njegove gustine, zatim od primijenjene električne struje
(voltaža) i drugih parametara kao što su temperatura, puferski sistem (jonska jačina)
i dr.
Poređenjem brzine kretanja molekula DNK koji ispitujemo sa brzinom kretanja
molekula DNK poznate veličine (tzv. DNK markeri), elektroforezom možemo
procijeniti veličinu dobijenog DNK fragmenta. DNK molekuli se separišu na osnovu
veličine tako što manji mogu da se kreću kroz pore gela brže od onih većih.
Generalno, na gušćim gelovima bolje se razdvajaju fragmenti DNK male
molekulske težine, dok rjeđi gelovi služe za razdvajanje velikih fragmenta.
Za pripremu agaroznog gela i elektroforetsku analizu koristi se neki od
standardnih pufera za elektroforezu, npr. TAE (glacijalna sirćetna kiselina), TBE
(borna kiselina), TPE (fosforna kiselina); sadrže Tris kao deterdžent te Na-EDTA za
denaturaciju, a razlikuju se u koncentraciji, tj. u jačini.

Agarozni gel se priprema na sledeći način:

1. U staklenu bocu ili erlenmajer (zapremine 2-4 puta veće od zapremine gela
koji želimo da napravimo) usuti željenu zapreminu pufera već razblaženog do
finalne koncentracije (0,5X ili 1X).
 2. Dodati odgovarajuću količinu prethodno izmjerenog agaroznog praha i
mućkanjem omogućiti disperziju agaroze u puferu.
3. Izmjeriti ukupnu masu suda, pufera i agaroze i prekriti plastičnom folijom da bi
se smanjio gubitak tečnosti isparavanjem. Na foliji probušiti iglom nekoliko
rupica.
4. Zagrijati u mikrotalasnoj rerni (na najvećoj snazi za nisko-procentne gelove,
odnosno na srednjoj snazi za gelove koncentracije >2%) ili u ključaloj vodi,
dok se u rastvoru agaroze ne pojave mjehurići. Izvaditi erlenmajer i lagano ga
promućkati.
1. Pažnja: rastvor agaroze nakon vađenja iz mikrotalasne rerne može prilikom
mućkanja dodatno proključati ili se zapjeniti pa treba biti oprezan.
5. Ponovo zagrijati rastvor agaroze, ovog puta do ključanja, i pustiti ga da ključa
oko 1 mi- nut, odnosno dok se sva agaroza ne rastvori.
6. Izmjeriti sud sa agarozom ponovo na vagi i doliti vruće destilovane vode dok
se ne dobije prvobitno izmjerena masa (iz koraka 3 ovog protokola).
7. Ohladiti rastvor do temperature od 50-60°C.
8. Sastaviti kalup za nalivanje gela i postaviti češalj na odgovarajuće mesto,
pazeći da zubići češlja ne dodiruju dno kalupa. Rastvor agaroze sipati u kalup
tako da se dobije gel debljine oko 3 mm i ostaviti na sobnoj temperaturi tokom
30 minuta da se postepeno ohladi i očvrsne. Formiran gel se može čuvati do
1 dan, najbolje u frižideru, umotan u plastičnu rastegljivu foliju.
9. Gel, zajedno sa plastičnim nosačem, staviti u kadicu za elektroforezu i doliti
pufer tako da prekrije gel 3-5 mm. (Koristiti isti pufer i u istoj koncentraciji kao
za pripremu gela.) Izvaditi češalj i pre nalivanja uzoraka eventualno, ukoliko je
potrebno, ukloniti pasterovom pipetom iz bunarića komadiće otkinutog gela.

Uzorci koje želimo da analiziramo prethodno se pomiješaju sa puferom za

nalivanje uzoraka koji služe da povećaju gustinu uzorka čime se omogućuje da DNK
iz uzorka padne na dno bunarića. Zatim se uzorak boji čime se olakšava njegovo
nalivanje u gel i olakšava se praćenje elektroforeze jer se boje u električnom polju
kreću određenom brzinom u smjeru prema anodi.
Najčešće se koriste glicerolski ili saharozni puferi. Na gel se obično nanosi
100-500 nanograma DNK što zavisi od veličine fragmenata DNK u smjesi (da bi se
mogli vidjeti veći fragmenti potrebno je staviti više DNK).
Uobičajeno se koristi struja konstantnog intenziteta od 5 V/cm (rastojanje
između elektroda). Prejaka struja će dovesti do bržeg propadanja puferskog sistema
što se ogleda u prekomjernom grijanju pufera, topljenju gela i difuziji traka u gelu. Do
difuzije molekula DNK u gelu će doći i ako se primjenjuje struja previše niskog
intenziteta.
Za vizuelizaciju molekula DNK u gelu, najčešće se koristi etidijum bromid, supstanca
koja se «umeće» između lanaca DNK molekula i koja flourescira kada se osvijetli UV
svjetlom. Etidijum bromid se može staviti u gel prilikom pripreme, može se staviti u
pufer za elektroforezu ili se može dodati nakon elektroforeze rastvoren u destilovanoj
vodi (etidijum bromid je kancerogen pa je neophodno nositi gumene rukavice
prilikom manipulacije njime).
Trajni zapis rezultata elektroforetske analize u agaroznom gelu može se dobiti
fotografisanjem gela izloženog UV svjetlu (fotografisanje se obavlja u mraku).
Nakon bojenja moguće je vizuelno uočiti do 10 ng DNK veličine do 1 kb.
Najjasnija traka DNK na gelu se vidi kod oko 100 ng DNK fragmenta.
 9.2. ANALIZA IZOLOVANE RNK

Analiza rRNK se vrši denaturišućom agaroznom elektroforezom bojenom

etidijum bromidom. Za analizu izolovanih RNK poželjna je denaturišuća agarozna
elektroforeza zato što većina RNK formira sekundarnu strukturu na osnovu
intramolekulskog sparivanja baza što može spriječiti da se kroz gel kreće pravilno
proporcionalno dužini fragmenta.

Priprema gela:

1. zagrijati 1 g agaroze u 72 ml vode dok se ne rastvori i onda ohladiti na

60oC
2. dodati 10 ml MOPS pufera (0,4 M MOPS, pH 7.0; 0,1 M Na acetata; 0,01
M EDTA u 18 ml 37% formaldehida (12,3 M)
3. izliti gel koristeći «češalj» koji će formirati «bunariće»u koje će se staviti
RNK uzorci
4. gel koji se nalazi u kadici prelije se puferom u visini od nekoliko mm i onda
ukloniti «češalj»

U sam RNK uzorak dodaje se određena količina formaldehida u svrhu

denaturacije, tj. narušavanja sekundarne strukture RNK.
Slijedi nastavak denaturacije na temperaturi od 65-70 oC u trajanju od 5-15
min.
Uključiti elektroforezu na 5-6 V/cm. RNK je takođe negativno naelektrisana i u
neutralnom pH okruženju (u električnom polju) kretaće se ka katodi.
Za bojenje se koristi etidijum bromid koji se doda u formaldehid. Rezultati
eletroforeze vidljivi su pod UV svjetlom.

Kretanje RNK molekula u gelu zavisiće od molekulske veličine RNK (veće

molekule kreću se sporije), konformacije RNK (sekundarna struktura), jačine struje,
baznog sastava RNK, vrste pufera, boje, tipa aparata za elektroforezu itd.
Migracija fragmenata i DNK i RNK u agaroznom gelu obrnuto je
proporcionalna log10 njihove molekulske težine.

9.3. ANALIZA IZOLOVANIH PROTEINA

Elektroforetsko ispitivanje proteinskih frakcija krvnog seruma danas ima široku

primjenu. S obzirom da proteini krvnog seruma nisu homogeni već se razlikuju po
veličini, obliku i električnom naboju, mogu se ovom metodom odvojiti jedni od drugih.
Najčešće se primjenjuje zonska elektroforeza na filter-papiru.
Aparat za elektroforezu na papiru se sastoji od izvora konstantne struje
(ispravljača) i vlažne komore. Vlažna komora je kada 50x50 cm od pocinkovanog
lima ili neke plastične materije, na čijim bočnim stranama se nalazi po jedan otvor za
prolaz elektroda. Pokrivena je pokretnom staklenom pločom. U unutrašnjosti vlažne
komore nalaze se četiri suda za pufer, dimenzija 47x5 cm. U spoljašnje sudove su
uronjene elektrode koje su povezane sa izvorom konstantne struje. Kao izvor struje
se koristi ispravljač sa stabilizatorom koji omogućuje izbor željenog napona. Oba
puferska suda su međusobno povezana, obično filter-papirom.
Za elektroforezu na papiru se upotrebljava specijalni filter papir (Whatman No
I, Munktell No 20, Schleicher i Schull No 2043).

Za papirnu elektroforezu su potrebni sledeći reagensi:

1) Pufer Veronal-natrijum pH 8,6 jonske jačine 0,1 ( priprema se od
29,428 grama veronal-natrijuma, 19,428 g natrijumacetata, 270 ml
0,1 mol/l HCl, do 3000 ml redestilovane vode.
2) Boja brom-fenol plavo ili amido crno ( 1g boje, 40 ml glacijalne
sirćetne kiseline, 20 g sublimata do 2 litre vode)
3) Rastvor 83,3 mmol/l sirćetne kiseline za ispiranje traka
4) Rastvor 0,01 mol/l NaOH za eluiranje traka.

POSTUPAK:

U svaki sud za pufer usuti po 500 ml svježe napravljenog pufera. Na isječenu

traku filter papira dimenzija 27x4 cm staviti mikropipetom 0,05 ml seruma, a potom
traku pokvasiti puferom izuzev mjesta gdje je stavljen serum. Serum se nanosi 5-6
cm od kraja trake i taj kraj se postavlja prema katodi. Pokvašena traka se pažljivo
zategne između dva unutrašnja suda, tako da njeni krajevi leže u puferu. Poslije
postavljanja traka elektrode se dovedu u kontakt sa izvorom struje određene voltaže.
Pošto su trake postavljene, kada se pokriva staklenom pločom da bi se izbjeglo
nepoželjno isparavanje. U cilju održavanja stalne vlažnosti komore, ispod traka se
postavi petrijevka sa destilovanom vodom. Ovako postavljene trake stoje 19-20 sati,
nakon čega se skidaju i suše na sobnoj temperaturi.
Osušene trake se boje tako što se u sud za bojenje sipa brom fenolplavo i
ostave se desetak minuta da boja djeluje. Nakon toga trake se vade i suvišak boje
se uklanja odbojavanjem tri puta po 10 min u 83,3 mmol/l sirćetnoj kiselini. Tamo
gdje na traci nema bjelančevina, pri odbojavanju traka se potpuno obezboji. Trake se
zatim ponovo suše na sobnoj temperaturi.
Kada se traka osuši, boja se pojača parom amonijaka pa se traka isiječe na
pojedine frakcije. Svaka frakcija se posebno isjecka i stavi u bočicu u koju se nalije
po 5 ml 0,01 mol/l NaOH i ostavi 30 minuta. Poslije toga se intenzitet boja čita na
fotometru sa zelenim filtrom talasne dužine 540 nm.
Iz dobijene ekstinkcije se izračunava relativna vrijednost pojedinih frakcija kao
što je dato na primjeru:

Ekstinkcija za albumine 159

Ekstinkicija za α globuline 66
Ekstinkicija za β1 globuline 48
Ekstinkicija za β2 globuline 40
Ekstinkicija za γ globuline 92
Ukupno 405
Relativan odnos pojedinih frakcija se izračunava iz proporcije:

Ukupna ekstinkcija : 100 = ekstinkcija frakcije : X

405 : 100 = 159 : X
X = 39,2
Tako se u ovom primjeru za albumine dobije relatina vrijednost 39,2%. Ovako se
izračuna i za sve ostale frakcije, a zbir relativnih vrijednosti mora iznositi 100%.