9.10.2009r.

ĆWICZENIA 1
Techniki histologiczne
(technika parafinowa, celloidynowa, mrożeniowa)

Technika parafinowa
1. Pobieranie materiału
Przy pobieraniu materiału należy zwrócić uwagę na dwie zasadnicze sprawy:
• fragment pobranej tkanki powienien być stosunkowo niewielki (do celów mikroskopii świetlnej przynajmniej
jeden wymiar nie powinien przekraczać 5 mm, a do celów mikroskopii elektronowej 1 mm), aby zapewnić
dobrą i możliwie szybką penetrację płynów stosowanych w dalszych etapach procedury (utrwalacz, płyny
odwadniające i pośrednie); przy pobraniu większego fragmentu należy go przed utrwaleniem pokroić na
mniejsze kawałki;
• jeżeli materiał pochodzi od uprzednio zabitego zwierzęcia laboratoryjnego, pobranie materiału powinno się
odbyć za życia lub natychmiast po śmierci zwierzęcia, aby zapobiec zmianom rozkładowym w tkankach. Z
tego samego powodu, jeżeli po pobraniu materiału trzeba go gdzieś przetransportować, należy użyć do tego
celu pojemnika z lodem.

2. Utrwalanie materiału
Utrwalanie materiału ma na celu:
• natychmiastowe zatrzymanie procesów metabolicznych w komórkach i tkankach, przede wszystkim poprzez
denaturację enzymów. Można w ten sposób zapobiec zmianom autolitycznym, czyli samostrawieniu komórek
przez ich własne enzymy lizosomowe, oraz wtórnym zmianom rozkładowym i gnilnym wywołanym przez
obecne w materiale lub zawleczone z zewnątrz bakterie;
• związanie i wytrącenie (precypitację) niektórych zawartych w tkankach substancji rozpuszczalnych, co
zapobiega ich późniejszej dyfuzji i umożliwia uwidocznienie;
• wstępne utwardzenie materiału i zwiększenie jego odporności na działanie odczynników używanych w
dalszych etapach procedury;
• niekiedy również poprawę optycznego zróżnicowania tkanki poprzez wywołanie w niej reakcji chemicznych
ułatwiających późniejsze barwienie.
Niewątpliwie najistotniejsze znaczenie mają trzy pierwsze cele utrwalania i prawie wszystkie
utrwalacze spełniają zawarte w pierwszych trzech punktach warunki. Umożliwiają one zachowanie w
utrwalonym materiale struktury możliwie najbardziej zbliżonej do naturalnej struktury żywych komórek i
tkanek.

Rodzaje utrwalaczy
Utrwalanie możemy podzielić na chemiczne i fizyczne. Do utrwalaczy chemicznych należą (w
nawiasach podano najczęściej stosowane stężenia):
• aldehydy: formaldehyd (aldehyd mrówkowy, formalina - 2-10%), aldehyd glutarowy (1,5-6,0%), akroleina
(10%);
• alkohole: etylowy i metylowy (50-100%);
• ketony: aceton (50-100%);
• kwasy organiczne i nieorganiczne: kwas octowy (50-100%), kwas pikrynowy (1%), kwas chromowy (2%),
kwas taninowy (1%);
• związki metali ciężkich: chlorek rtęci (sublimat - 5-7%), dwuchromian potasu (2,5-5,0%), czterotlenek
osmu (0,5-2,0%)

Utrwalacze chemiczne podzielić można na proste i złożone.

Utrwalacze proste (czyli jednoskładnikowe):
- kwasy mineralne i organiczne (kwas chromowy, kwas octowy, kwas pikrynowy, kwas trójchlorowy)
- formalina 10% rozkłada glikogen, nie rozkłada tłuszczy)
- alkohol etylowy 70% (rozpuszcza tłuszcze, nie rozpuszcza glikogenu)
- alkohol metylowy
- aceton
- sole metali ciężkich
Utrwalacze złożone, będące mieszaniną dwóch lub kilku utrwalaczy prostych oraz niekiedy innych substancji.
Do najczęściej stosowanych utrwalaczy złożonych należą np.:
• utrwalacz Bouina (kwas pikrynowy i octowy, formalina),
• utrwalacz Susa (chlorek rtęci, chlorek sodu, kwas trójchlorooctowy, kwas octowy lodowaty, formalina, woda
destylowana)
• utrwalacz Carnoya (alkohol etylowy, chloroform i kwas octowy),
• utrwalacz Zenkera (sublimat, chlorek rtęci, dwuchromian potasu, siarczan sodu, woda destylowana, kwas
octowy, siarczan sodu).
Rozpuszczalnikiem w roztworach utrwalaczy może być woda, bufory o określonym pH i sile jonowej, a
w niektórych przypadkach również alkohole.

Utrwalanie fizyczne polega na oddziaływaniu na materiał mikrofalami lub promieniowaniem

jonizującym.

3. Płukanie materiału w wodzie

W przypadku większości utrwalaczy określony jest maksymalny czas utrwalania. Przedłużenie tego
czasu może spowodować niekorzystne zmiany strukturalne w komórkach i tkance. Dlatego też proces
utrwalania przerywa się poprzez wypłukanie utrwalacza z materiału. W zależności od rodzaju planowanych
badań mikroskopowych (rutynowa mikroskopia świetlna, histochemia, mikroskopia elektronowa) płukanie
przeprowadza się bądź w wodzie (najlepiej bieżącej), bądź w buforach, które służyły uprzednio jako
rozpuszczalnik dla utrwalacza. Jeżeli użyto alkoholowego (bezwodnego) roztworu utrwalacza, płukanie
przeprowadza się w kilku zmianach alkoholu o nieco wyższym stężeniu.

4. Odwadnianie
Po utrwaleniu materiału, dalsze etapy procedury uzależnione są od rodzaju docelowego preparatu
mikroskopowego. W przypadku rozmazów, rozgniotów czy hodowli, można od razu przystępować do
barwienia. Jeżeli natomiast chcemy uzyskać skrawki o przydatnej w mikroskopii bardzo niewielkiej grubości,
pokrojenie materiału jest możliwe jedynie pod warunkiem jego należytego utwardzenia. Im cieńsze mają być
skrawki, tym twardszy musi być krojony materiał.
W procesie odwadniania zastępujemy wodę obecną w tkance alkoholem lub acetonem. Proces ten
polega na przeprowadzeniu materiału przez szereg wodnych roztworów tych substancji o stopniowo
wzrastających stężeniach (np. 50, 70, 80, 90%) aż do dwóch zmian bezwodnego (absolutnego) alkoholu lub
acetonu. Odwadniania dokonuje się w szczelnie zamkniętych naczyniach - jest to szczególnie istotne podczas
ostatniego etapu tej procedury, gdyż zwłaszcza absolutny alkohol jest niezwykle higroskopijny i z łatwością
chłonie wodę z powietrza.

5. Przeprowadzenie materiału przez płyny pośrednie: benzen, toluen, ksylen I i II, chloroform
Odwodnionego materiału zazwyczaj nadal nie można zatopić, gdyż substancja, którą chcemy go
przepoić, nie rozpuszcza się również w alkoholu czy acetonie. Istnieje zatem konieczność wstępnego
przepojenia tkanki płynem, który rozpuszczałby się zarówno w odwadniaczu, jak i w środowisku użytym do
zatapiania. Płyny takie noszą nazwę płynów pośrednich, bowiem pośredniczą pomiędzy odwadnianiem a
zatapianiem. Dopiero po dokładnym przepojeniu materiału płynem pośrednim można rozpocząć jego
zatapianie.
W przypadkach, gdy materiał zatapia się w środowiskach polarnych, nie jest konieczne ani
odwadnianie, ani przepajanie płynem pośrednim.

6. Umieszczenie w parafinie ciekłej (początkowo w parafinie o topliwości poniżej 50oC, później w

parafinie o topliwości powyżej 50oC)
Używając parafiny do utwardzania materiału przed jego skrojeniem wykorzystuje się fakt, iż w
temperaturze pokojowej parafina jest substancją stałą, natomiast po stosunkowo nieznacznym ogrzaniu
przechodzi w stan płynny.
W pierwszym etapie umieszcza się materiał w roztworze płynu pośredniego i parafiny (1:1) w
temperaturze 37°C. Pozwala to na wstępne wprowadzenie parafiny do tkanki. Następnie materiał przeprowadza
się przez 2 lub 3 zmiany czystej parafiny, aby usunąć zeń nawet śladowe resztki płynu pośredniego, którego
obecność wpłynęłaby niekorzystnie na własności materiału podczas krojenia.
 W rutynowej technice histologicznej używa się kilku odmian parafiny różniących się twardością i
temperaturą topnienia (im wyższa twardość, tym wyższa temperatura topnienia: od 45°C dla parafiny bardzo
miękkiej do 60°C dla bardzo twardej). Proces przepajania parafiną odbywa się w cieplarce, w temperaturze o
kilka stopni wyższej od temperatury topnienia użytej parafiny. Czas przepajania jest zależny od rodzaju tkanki
(jej twardości, spoistości, itp.) oraz od rozmiarów zatapianego materiału i wynosi od kilku godzin do kilku dni.
Skonstruowano urządzenia (tzw. procesory tkankowe), w których cały proces od odwodnienia
materiału do jego przepojenia parafiną odbywa się automatycznie. Są one wykorzystywane w pracowniach
wykonujących szczególnie duże ilości preparatów mikroskopowych (np. duże pracownie histopatologiczne).

7. Formowanie bloczków
Po zakończeniu procesu zatapiania materiał wkłada się do specjalnych foremek, zalewa płynną parafiną
i szybko oziębia, np. przez zanurzenie w zimnej wodzie. Parafina zestala się i tak uzyskany bloczek można
następnie przyciąć do pożądanego kształtu i rozmiarów za pomocą ostrego noża.
Przy równoczesnym opracowywaniu większej ilości materiałów niezbędne jest odpowiednie
oznakowanie bloczków. Najprościej można to zrobić przez włożenie do foremki niewielkiego paska papieru
zawierającego symbol danego materiału w ten sposób, aby po zestaleniu parafiny oznakowany fragment paska
wystawał poza bloczek.

8. Krojenie przy pomocy mikrotomów

Do krojenia skrawków histologicznych służą przyrządy zwane mikrotomami. Każdy mikrotom składa
się z czterech podstawowych części: noża mikrotomowego, stolika przedmiotowego, na którym montuje się
skrawany bloczek, mechanizmu skrawania oraz mechanizmu regulującego grubość skrawków. W zależności od
typu konstrukcyjniego, częścią ruchomą może być albo stolik, albo (rzadziej) nóż.
Istnieje kilka typów mikrotomów:
• mikrotom rotacyjny, najpowszechniejszy, w którym obrotowy ruch korby przekształcany jest w posuwisto-
zwrotny ruch stolika względem noża;
• mikrotom wahadłowy, w którym obrotowy lub wahadłowy ruch uchwytu jest przekazywany systemem
dźwigni na stolik przedmiotowy, wykonujący ruch wahadłowy (po wycinku koła);
• mikrotom saneczkowy, w którym stolik wraz z uchwytem przesuwa się ruchem posuwisto-zwrotnym
wzdłuż prowadnic, a nóż jest nieruchomy (lub odwrotnie).
Nowoczesne mikrotomy często wyposażone są w napęd elektryczny oraz układy elektroniczne
umożliwiające regulację szybkości skrawania, automatyczne dosuwanie nowo założonego bloczka do noża, itp.

9. Ułożenie skrawka materiału na szkiełku podstawowym

Przy krojeniu materiału zatopionego w parafinie tworzy się tzw. wstęga, złożona z kolejnych
(seryjnych) skrawków zlepionych ze sobą krawędziami. Używane obecnie mikrotomy pozwalają na uzyskanie
skrawków parafinowych o grubości 2-10 µ m. Skrawki takie można przechowywać dowolnie długo bądź w
formie wstęgi, bądź po ich uprzednim naklejeniu na szkiełka podstawowe.
Naklejenie skrawka parafinowego na szkiełko podstawowe wymaga jego rozprostowania, gdyż podczas
krojenia skrawki mocno się fałdują. W celu rozprostowania skrawka umieszcza się go na powierzchni wody
ogrzanej do ok. 40°C - działają nań wówczas siły napięcia powierzchniowego wody, a parafina staje się
miękka. Po podłożeniu szkiełka pod rozprostowany skrawek wyjmuje się go z wody, a skrawek "przykleja" się
do powierzchni szkła. Naklejone skrawki suszy się przez ok. godzinę w temperaturze 37°C, co powoduje
mocne przywarcie wciąż miękkiej parafiny skrawka do szkiełka podstawowego.
W przypadku niektórych materiałów oraz pewnych procedur wiążących się z intensywnym działaniem
chemicznym na skrawek (np. utlenianie) lub z gwałtownymi zmianami środowiska (szybkie odwadnianie)
skrawki mogą jednak odklejać się od szkiełka podstawowego. Zapobiega się temu przez pokrycie szkiełka
przed naklejeniem skrawka cienką warstwą roztworu albumin lub poli-L-lizyny.

10. Odparafinowanie – przeprowadzenie przez płyny pośrednie

11. Nawadnianie – przeprowadzenie przez szereg alkoholi o malejących stężeniach: 96%, 80%, 70%, 50%

12. Barwienie
W histologii używane są przede wszystkim wodne (rzadziej alkoholowe) roztwory barwników.
Przepojone niepolarną parafiną skrawki nie zabarwią się, gdyż cząsteczki barwnika w wodnym środowisku są
"odpychane" przez parafinę. Dlatego z takich skrawków trzeba najpierw usunąć parafinę (przez zanurzenie w
ksylenie lub innym rozpuszczalniku organicznym), a następnie przeprowadzić przez szereg roztworów
alkoholu o coraz niższych stężeniach (nawadnianie, odwrotność odwadniania), aby w końcu przenieść je do
czystej wody.

Barwienie:
a) naturalne
- hematotoksylina (niebieski),
- karmin (czerwony)
b) sztuczne syntetyczne

Najpopularniejszą metodą barwienia jest wykorzystanie barwników kwaśnych (eozyna, floksyna, oranż
G) i zasadowych (hematoksylina, błękit metylenowy, safranina). Barwienie ma tu charakter reakcji
zobojętniania: barwniki kwaśne wiążą się z tymi strukturami komórkowymi i tkankowymi, które wykazują
odczyn zasadowy (struktury kwasochłonne), jak np. białka cytoplazmatyczne, włókna kolagenowe, itp.,
natomiast barwniki zasadowe wiążą się ze strukturami wykazującymi odczyn kwaśny (struktury
zasadochłonne), jak np. chromatyna jądrowa (obecność DNA), czy rejony cytoplazmy bogate w rybosomy
(obecność RNA). W najpowszechniej stosowanym barwieniu przeglądowym z użyciem hematoksyliny i
eozyny, jądra komórkowe wybarwiają się hematoksyliną na granatowo, a cytoplazma eozyną na czerwono. W
komórkach zawierających liczne rybosomy, cytoplazma barwi się na kolor fioletowy (efekt nałożenia barwy
czerwonej i niebieskiej).

Technikę barwienia można podzielić na barwienie progresywne, w którym przerywamy proces

barwienia w momencie uzyskania pożądanej intensywności koloru, oraz barwienie regresywne, w którym
tkankę rozmyślnie przebarwiamy, a następnie stosując odpowiednie roztwory odbarwiające doprowadzamy do
wymaganego nasilenia barwy. Może się również zdarzyć, że podczas barwienia progresywnego - zwłaszcza
kilkoma różnymi barwnikami - dojdzie wbrew naszej woli do przebarwienia preparatu i trzeba zmniejszyć
intensywność koloru. Traktowanie zabarwionego preparatu roztworami odbarwiającymi nosi nazwę
różnicowania i przeprowadza się go oczywiście pod kontrolą mikroskopu. Do różnicowania służą - w
zależności od rodzaju użytego barwnika - roztwory alkoholi, kwasów, a także substancji o właściwościach
utleniających.

13. Nawadnianie

14. Zamykanie szkiełkiem nakrywkowym za pomocą balsamu kanadyjskiego.

Po zabarwieniu i wypłukaniu preparat jest praktycznie gotowy do analizy mikroskopowej - należy go
jednak zabezpieczyć przed niekorzystnym wpływem otoczenia (uszkodzenia mechaniczne, wysychanie,
utlenianie niektórych barwników). Do tego celu służy tzw. zamykanie preparatów, czyli umieszczenie ich
pomiędzy szkiełkiem podstawowym a nakrywkowym i wypełnienie przestrzeni pomiędzy oboma szkiełkami
substancją, która powinna spełniać dwa podstawowe warunki:
• powinna posiadać taki sam współczynnik załamania światła jak szkło (w celu uniknięcia uginania i
rozpraszania promieni świetlnych na pograniczu środowisk o różnej charakterystyce optycznej);
• powinna w temperaturze pokojowej hermetycznie i trwale spajać oba szkiełka.
Oba warunki najlepiej spełniają niepolarne żywice - albo naturalne (balsam kanadyjski), albo
syntetyczne (DPX, Malinol, XAM, Entellan). Ponieważ żywice te są rozpuszczalne jedynie w
rozpuszczalnikach organicznych, zabarwione preparaty muszą być poddane ponownemu odwodnieniu (tym
razem szybkiemu, gdyż dłuższe przetrzymywanie w roztworach alkoholi odbarwia preparaty) i zanurzone w
toluenie lub ksylenie (tzw. prześwietlanie). Dopiero wówczas preparaty można pokryć kroplą żywicy i nałożyć
szkiełko nakrywkowe. Po wysuszeniu (przez kilka godzin, w temperaturze ok. 60-80°C) oba szkiełka są ze
sobą ściśle i hermetycznie spojone, i tak przygotowany preparat zachowuje swe własności optyczne nawet
przez kilkadziesiąt lat.
W sytuacji, gdy potrzebne jest natychmiastowe zamknięcie preparatu po barwieniu (np. blaknący
barwnik), lub gdy preparatu nie można poddać odwodnieniu i prześwietleniu (w niektórych reakcjach
histochemicznych barwny produkt rozpuszcza się w alkoholu lub rozpuszczalnikach organicznych), stosuje się
mniej trwałe, wodne środowiska zamykające, które całkowicie spełniają tylko pierwszy z dwóch
wymienionych powyżej warunków. Są to np.: żel glicerolowy (roztwór glicerolu i żelatyny), glicerol w soli
fizjologicznej, roztwór gumy arabskiej i sacharozy, alkohol poliwinylowy. Środowiska te nie zapewniają
dłuższej trwałości preparatu (ok. miesiąca); aby ją poprawić, można dodatkowo uszczelnić obrzeża szkiełka
nakrywkowego szybko schnącym lakierem.

Zalety metody parafinowej:

• niskie koszty
• preparaty są bardzo trwałe, mogą być przechowywane przez wiele lat
• powstają cienkie skrawki 5-7 mikrometrowe
• stosunkowo krótki czas trwania procedury (1-3 dni od momentu pobrania materiału do otrzymania
preparatów).
Wady metody parafinowej:
• stosowanie wysokiej temperatury (50-60°C), powodującej inaktywację enzymów i obkurczanie się
niektórych tkanek;
• konieczność używania rozpuszczalników organicznych powodujących wypłukiwanie z materiału tłuszczów
(lipidów);
• konieczność dodatkowego przygotowania skrawków do barwienia (p. dalej).
• kruszenie się i rozwarstwianie skrawków przy materiałach twardych lub o niejednorodnej strukturze;
• znaczne trudności przy krojeniu skrawków o dużej powierzchni.

Technika mrożeniowa
Technika mrożeniowa polega na utwardzeniu materiału biologicznego poprzez jego zamrożenie -
można zatem materiał pokroić na odpowiednio cienkie skrawki bez uprzedniego zatopienia go w substancjach
utwardzających i bez złożonej procedury przygotowawczej (odwadnianie, płyny pośrednie).
Technika mrożeniowa ma szereg istotnych zalet:
• jest krótkotrwała: przy maksymalnie uproszczonej procedurze czas od pobrania materiału do wykonania
preparatu nadającego się do oglądania pod mikroskopem nie przekracza kilkunastu minut. Wykorzystuje się to
np. podczas operacyjnych badaniach histopatologicznych;
• zachowuje w materiale biologicznym wszystkie składniki chemiczne - również lipidy, które ulegają
wypłukaniu podczas zatapiania w parafinie, celoidynie czy niepolarnych żywicach;
• przebiega w niskiej temperaturze, która zapobiega denaturacji białek, zachowuje aktywność enzymów
wewnątrzkomórkowych i blokuje procesy autolityczne.
Dwie ostatnie zalety sprawiają, że technika mrożeniowa jest szeroko stosowana w histochemii i
immunocytochemii.
Wady:
• powstają grube skrawki, które się łamią
• skrawki nie nadają się do przechowywania

Preparaty histologiczne:
- totalne (położone na szkiełko całe fragmenty tkanek lub narządów - zazwyczaj są to wypreparowane warstwy
ścian wewnętrznych przewodów (np. warstwa mięśniowa cewy pokarmowej), w których bada się przestrzenny
układ włókien nerwowych lub sieci naczyniowych. Taki preparat musi być wystarczająco cienki, aby mogło
przezeń przechodzić światło)
- izolowane
- mechanicznie
- chemicznie
- enzymatycznie
- rozmazy (wykonywane z płynów ustrojowych, w których obecne są wolno zawieszone komórki (krew,
punktat szpiku krwiotwórczego, płyn mózgowo-rdzeniowy, płyny wysiękowe), a także z zawiesin
komórkowych uzyskanych w badaniach biochemicznych. Kroplę takiego płynu rozprowadza się na szkiełku
podstawowym w taki sposób, aby zawarte w nim komórki utworzyły pojedynczą warstwę. W diagnostyce
histopatologicznej wykonuje się rozmazy z materiału pobranego ze śluzówek (jama ustna, nosowo-gardłowa,
pochwa) oraz z wydzielin (wydzielina oskrzelowa))
- skrawki (uzyskane przez pokrojenie materiału na cienkie "plasterki"z narządów miąższowych,
odwapnionych kości)
- szlify kostne.(uzyskane przez zeszlifowanie tkanek twardych (zmineralizowanych) na bardzo cienkie płytki)