“Efecto del complejo enzimático producido por Aspergillus oryzae sobre la producción

de alcohol etílico por Saccharomyces cerevisiae en condiciones de laboratorio”

"Effect of enzyme complex produced by Aspergillus oryzae on the production of ethyl

alcohol by Saccharomyces cerevisiae under laboratory conditions"

Liz Sánchez-Torres1 ,---------------------------------------------

Escuela de Microbiología y Parasitología, Universidad Nacional de Trujillo1.

ABSTRACT

In order to determine the effect of the concentration of the enzyme complex produced by

Aspergillus oryzae CECT 2094 and CECT 2095 on the production of ethyl alcohol by

Saccharomyces cerevisiae in laboratory conditions, four fermentation’s systems were

conditioned using bottle with 400 mL molasses broth, which was added enzymatic extract at

concentrations of 2, 4, and 6% (v / v) and a control without enzyme extract. The systems were

inoculated with Saccharomyces cerevisiae and incubated at 28 ° C for 2 days under anaerobic

conditions, then it was proceeded to measure the concentration of alcohol expressed in

percent in each of the fermentation systems. The highest percentage of alcohol was obtained

in the treatment with 4% extract enzyme, with an average of 4.47% alcohol as opposed to the

control which was obtained 3.73%, differ also in alcohol tolerance because biomass at the end

of fermentation was 1.36 x 108 cells / mL in the treatment with 4% while the control was 9.92

X107 Cel / mL. In both treatments a decrease of the Brix was observed to 6,6ºB. The

conclusion was that the enzyme complex produced by Aspergillus oryzae has an effect on

ethanol production by Saccharomyces cerevisiae under laboratory conditions.

Keywords: Aspergillus oryzae, Saccharomyces cerevisiae, percentage of alcohol, amylase,

protease, fermentation.
 INTRODUCCIÓN

El mundo encara el agotamiento progresivo de sus recursos energéticos basados

mayoritariamente en combustibles no renovables. Al mismo tiempo, el consumo de energía

aumenta a ritmo cada vez más creciente. De otro lado, el consumo global de combustible

genera enormes cantidades de gases contaminantes que son liberados a la atmósfera. La única

forma de encarar esta problemática es mediante recursos energéticos renovables; una solución

renovable es el uso de energía solar en forma de biomasa, la cual está representada en los

materiales lignocelulósicos y los cultivos de plantas ricas en energía, a partir de los cuales se

producen biocombustibles líquidos (bioetanol, biodiesel)1,2.

El biocombustible más importante es el alcohol carburante (etanol, EtOH) el cual

permite un aumento del índice de octano y por lo tanto, la reducción del consumo y reducción

de la contaminación (10 a 15% menos de monóxido de carbono e hidrocarburos). Así mismo

el etanol podría sustituir al metil ter-butil éter (MTBE) para reducir las emisiones de CO 2.

Está acción es muy importante pues el MTBE, por ser un compuesto muy estable de baja

degradación y muy soluble en agua, ha resultado ser un contaminante de aguas

subterráneas2,3.

Una de las opciones para producir etanol es por fermentación a partir de materias primas

ricas en carbohidratos (azúcar, almidón, celulosa, etc.). Por tal razón, es común designar al

etanol obtenido por esta vía “bioetanol”. Entre estas materias primas se encuentran vegetales

como la caña de azúcar y la remolacha, los cereales (trigo, maíz, sorgo), los tubérculos

(papas, yuca) y en general, materias provenientes de ligno-celulosa o de residuos orgánicos.

El proceso de obtención es más eficiente en aquellos productos que tienen más azúcar; de esta

manera el proceso más eficiente se logra a partir de caña de azúcar y de maíz, siendo la mejor
materia prima para los principales productores a nivel mundial como Brasil y EE UU

respectivamente3.

El uso de los biocombustibles se implementa e incrementa en países como Alemania,

Francia, Italia, Australia, Estados Unidos, Brasil y Colombia entre otros, impulsados por la

disminución de las reservas de petróleo, el incremento en su precio y la preocupación por el

impacto de los combustibles sobre el medio ambiente. A nivel mundial se está dando mucha

importancia a la producción de bioetanol, presentando muchas opciones de producción, es así

como la opción española de producción industrial de bioetanol se ha concretado en la

utilización de cereales; en un proceso que sigue los siguientes pasos: transformación del

almidón del cereal en glucosa, obteniéndose un mosto azucarado que se fermenta por medio

de levaduras. El mosto alcohólico obtenido se somete a destilación, para enriquecer el

contenido alcohólico y posteriormente se deshidrata por medio de tamices moleculares2.

Saccharomyces cerevisiae, la especie de levadura usada con más frecuencia en los

procesos de fermentación, convierte las hexosas en EtOH en condiciones anaeróbicas,

generando 2 moles del compuesto generador de energía en los seres vivos, el adenosín

trifosfato (ATP), por cada mol de hexosa consumida, además de dos moles de EtOH. Este

microorganismo tiene también la capacidad de convertir las hexosas en CO2 aeróbicamente.

Algunas levaduras tienen la ventaja adicional de tolerar concentraciones relativamente altas

de EtOH (hasta 150g.L-1)1,3.

El proceso de fermentación y su eficiencia para producir etanol depende en alto grado

de la acción de levaduras, esto implica la mayor tolerancia a la inhibición por concentración

de alcohol, dependiendo del sustrato utilizado, en algunos casos es necesario emplear

complejos enzimáticos sobre el almidón no convertido, para que pueda ser usado como

fuente de carbono durante la fermentación, así mismo para mejorar la asimilación de

nitrógeno, lo que otorga una mejor estructura conformacional de la membrana celular de las

levaduras, por lo tanto es importante el empleo de enzimas hidrolíticas como las amilasas y

proteasas 4.

La técnica de fermentación en medio sólido (FMS) ha sido y sigue siendo utilizada por

numerosos investigadores para producir enzimas y otros metabolitos primarios y secundarios.

Por lo general los cultivos de microorganismos en medio sólido se realizan utilizando

sustratos agrícolas como salvado de trigo, bagazo de caña, harina de yuca, cáscara de cereales

y de remolacha etc; a estos sustratos se les agrega una solución de sales y una suspensión de

esporas de hongo como inoculante5,6.

El salvado de trigo es más rico en celulosa, hierro, fósforo, magnesio, calcio, y

vitaminas del complejo B, y ha sido utilizado en Bogotá como sustrato en la Obtención de

amilasas por Aspergillus sp. aislado de lentejas, demostrando que estas amilasas son activas

en el desdoblamiento de la molécula de almidón a pH 5.0 y temperatura de 37ºC 7.

Los hongos filamentosos producen una variedad de metabolitos secundarios originados

a partir de intermediarios del metabolismo primario, además son los microorganismos más

adaptados a cultivo en medio sólido y son la base de muchas fermentaciones y fuentes de

muchas enzimas comerciales (amilasas, proteasas, pectinasas, peroxidasas, etc.), ácidos

orgánicos, antibióticos y otros muchos principios activos usados en medicina y en industrias

alimentarias y textil 8,9.

El hongo a utilizar en este proyecto pertenece al Género-forma Aspergillus especie

Aspergillus oryzae. Al comenzar su desarrollo, las colonias son blanco-amarillentas, y luego

se convierten en amarillo verdosas o de color castaño; puede tener una o dos filas de

esterigmas con conidiosporos piriformes. Produce amilasas, proteasas, y ácido kójico.

 Dentro de las investigaciones realizadas en este campo, se ha estudiado el efecto de la

concentración de CO2 y del O2 en la fase gaseosa sobre el crecimiento y el metabolismo de

Aspergillus oryzae para la producción de amilasas y proteasas en FMS, y se demostró que la

producción óptima de amilasa se obtiene durante la fase exponencial de crecimiento con bajas

concentraciones de CO2 (de 2 a 5%) al contrario de las proteasas que necesitan una

concentración elevada de CO2 (5%) durante la fase estacionaria 8.

Muchas Industrias biotecnológicas de bioprocesos han evaluado la adición de una serie

de enzimas que mejoran la producción de alcohol etílico empleando melaza como sustrato. La

melaza presenta aproximadamente entre 4 y 7% de componentes como maltosa, almidón y

celulosa que no pueden ser metabolizados por la levadura en condiciones normales de

proceso; por esta razón ha evaluado una mezcla de enzimas comerciales (0.05% p/v),

obteniendo muy buenos resultados, pero el elevado costo no es apropiado desde el punto de

vista económico10,11.

Hoyos y Carrera (2004) reportaron un incremento del grado alcohólico del 10% v/v con

la adición de de enzimas de 0.5% p/v obtenidas por fermentación en sustrato sólido con

Rhizopus niveus, valor muy satisfactorio; que sin embargo, no supera el rendimiento que se

obtiene con la adición de la enzimas comerciales 10.

Actualmente, en América Latina está aumentando el interés por la producción de etanol;

por ejemplo en noviembre del 2005 Colombia inicia la adición de un 10% de EtOH a la

gasolina; Argentina por su parte, planea para los próximos cinco años la transición hacia

mezclas de gasolina con un 5% de EtOH. En nuestro país, aún no se ha desarrollado mucho

la producción de etanol; la falta de una tecnología desarrollada que pueda suplir las

necesidades de la industria productora de alcohol hace necesario el estudio de nuevas

alternativas y metodología de producción que permitan aprovechar al máximo los recursos

industriales como la melaza (para producir etanol) y el salvado de trigo (para producir

enzimas) 1,12.

El presente trabajo tuvo como objetivo optimizar el rendimiento en la producción de

etanol por S. cerevisiae a partir de melaza utilizando una mezcla de enzimas denominado

complejo enzimático, producido por A. oryzae mediante fermentación en sustrato sólido, cuyo

efecto se verá reflejado en el aumento del porcentaje alcohólico.

MATERIAL Y MÉTODO

1. Material Biológico

 Cepas de Aspergillus oryzae CECT 2094 y CECT 2095 Procedente de la

Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). Univ.de Valencia.

 Cepas de Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT-L51. Proporcionado por

el Laboratorio de Microbiología Industrial y Biotecnología del Departamento de

Microbiología y Parasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Univ.

Nac. de Trujillo.

 Salvado de Triticum aestivum “Trigo”.Procedente del Mercado Central de

Trujillo.

 Melaza de Saccharum officinarum “Caña de azúcar”. Procedente del Molino San

Francisco. Trujillo. La libertad.

2. Método

1.1. Fermentación en sustrato sólido con Aspergillus oryzae.

1.1. Propagación de Aspergillus oryzae.

Las cepas CECT 2094 y 2095 de A. oryzae, fue rehidratado con Caldo

Sabouraud estéril y sembrado en Agar Extracto de Malta y Papa Dextrosa (PDA)

 respectivamente. Se dejó incubar durante cinco días a 28ºC tiempo suficiente para

el crecimiento del hongo y producción de esporas.

1.2. Preparación del inóculo.

La preparación del stock de esporas de Aspergillus oryzae, se realizó partiendo

de un cultivo en placa de Agar Papa Dextrosa (PDA) y Agar Extracto de Malta

para las cepas CECT 2095 y CECT 2094 respectivamente, se lavó la superficie

del cultivo con 10 mL de solución al 0,1 % de Tween 80 para facilitar el

desprendimiento de esporas. La solución del lavado se centrifugó a 2800g, durante

3 minutos, se decantó y se resuspendió las esporas en 10 mL de agua destilada

estéril, se repitió el proceso de centrifugación y decantación. Finalmente las

esporas se resuspendieron en 10ml de agua destilada estéril. Seguidamente se tomó

una alícuota de esta suspensión y se llevó a la cámara de Neubauer para el

recuento de esporas por mL haciendo las diluciones necesarias para obtener la

concentración de 2X107 esporas/mL en el medio de fermentación.

1.3. Preparación del sustrato sólido e inoculación de esporas13

En botellas de vidrio planas de 1000 mL se colocó 80 gr de salvado de trigo y

se llevó a autoclave a 121ºC durante 20 minutos, seguidamente se humedeció el

salvado con solución tampón a pH 5,0 (previamente autoclavada) en cantidad

suficiente para alcanzar una humedad relativa de 50%. Posteriormente se le

adicionó una suspensión de esporas por gramo de materia seca y con una bagueta

estéril se extendió el medio tratando de formar una superficie plana. Este sistema

se ubicó horizontalmente en la incubadora a 24ºC, para semejar las condiciones del

cultivo en bandeja. La fermentación se llevó a cabo durante cinco días.

1.4. Extracción de enzimas14.

Una vez cumplido el tiempo de incubación, el sustrato de fermentación se pasó

a un matraz estéril y se le agregó 200 mL de la solución tampón, se agitó

aproximadamente por una hora en un agitador magnético para extraer la enzima,

luego se separó la fracción soluble de la insoluble filtrando a través de un lienzo

(prensado). Se recolectó el sobrenadante (preparado enzimático) y se centrifugó a

2500 rpm por 10 minutos a 4 °C y finalmente se filtró a través de un filtro

bacteriológico estéril; y el filtrado se guardó en refrigeración a 4ºC hasta la

determinación de las unidades de enzima.

2.2. Prueba de Actividad de Alfa Amilasa15

Se prepararon 3 tubos de la siguiente manera: Tubo I (Blanco Reactivo), Tubo

II (Blanco Muestra) y Tubo III (Muestra). En los tubos II y III se agregó 10µL del

extracto enzimático, luego al tubo I y III se agregó 0.5mL de la solución de

almidón bufferado pH 5. Luego se incubó los tres tubos por un tiempo de 7.5

minutos. Finalizando dicho tiempo se le añadió 4.5mL de la solución reveladora a

los tres tubos y se completaron los volúmenes con 0.01mL y 0.5mL de agua

destilada en los tubos I y II respectivamente. Luego se midió la absorbancia a

574nm.

Para cálculo de resultado se usó la siguiente fórmula:

Absorbancia (Blanco) – Absorbancia (Muestra)

Amilasa UA/dL ₌ ―––––––––––––––––––––––––––––––––––––––* 1000

Absorbancia (Blanco)

Donde:
 Absorbancia del Blanco= Abs. De Blanco reactivo + Abs. De Blanco muestra

Absorbancia de Muestra= Absorbancia de cada eluído enzimático.

2.3. Determinación de la actividad de las enzimas proteolíticas13.

Con el objeto de verificar si el complejo enzimático contiene proteasas se

empleó la siguiente metodología basado en la hidrólisis proteolítica de un sustrato

de caseína. Se trabajó con tres tubos (I, II, III), de los cuales dos de ellos (I, II)

contuvo 2mL de caseína al 1%, se agregó 2mL de buffer fosfato 0,1 M pH 8 a los

tres tubos ( I, II, III) , sólo a dos de ellos (I, III) se les colocó 2mL del preparado

enzimático; para igualar los volúmenes se añadió agua destilada a los tubos II y III,

se mezcló y se colocó en baño de agua a 37ºC durante 30 minutos. Finalizando el

tiempo de reacción, se tomó alícuotas de 0.5 mL de cada uno de los tubos y se

trasladó a otro sistema de tubos igualmente numerados (I, II, III) a los cuales se les

agregó 1 mL de solución de ninhidrina a cada uno de los tubos, se mezcló y llevó a

un baño de agua hirviendo (franca ebullición) durante 3 a 5 minutos, luego se retiró

y agregó 3,5 mL de agua destilada. Finalmente se mezcló por inversión y se leyó en

espectrofotómetro (640 nm).

La actividad enzimática se comparó con la curva estándar de caseína.

2.4. Preparación del inóculo de Saccharomyces cerevisiae 13.

A partir del cultivo conservado en agar sabouraud se activó la levadura

sembrando en placas conteniendo Agar Sabouraud Glucosa Enriquecido (ASGE), y

se incubó a 30ºC durante 36 horas. Luego se “cosecharon” las células de levaduras

utilizando de 2 a 3 ml de Solución Salina Fisiológica (SSF) por placa de cultivo.

Seguidamente se reunieron todas las suspensiones en un tubo estéril y se

 homogenizó la suspensión, se realizó una observación en fresco utilizando azul de

metileno para determinar la viabilidad de las levaduras.

2.5. Determinación de la fase logarítmica de crecimiento de Saccharomyces

cerevisiae13.

Para determinar la curva de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae se tomó

un volumen de 300mL de melaza diluida, con una densidad de 1,05 Kg/dm3 y a pH

4.5. Se esterilizó a 121ºC por 15 minutos. Luego se inoculó la levadura (10% de

inóculo) y se incubó a temperatura ambiental (19±1ºC) durante 48 horas. Los

recuentos de células se llevaron a cabo cada hora.

2.6. Producción de etanol.

En 4 biorreactores debidamente acondicionados y esterilizados se colocaron

400 mL de caldo melaza (Anexo 8), se inocularon con 40 mL de suspensión de

levaduras en fase logarítmica y se les adicionó el complejo enzimático en

concentraciones de 2, 4 y 6% (v/v) a los tres biorreactores problemas, el biorreactor

control se trabajó sin adicionar complejo enzimático, el proceso de fermentación

duró 48 horas.

2.7. Determinación del porcentaje de etanol.

A las 48 horas se midió el porcentaje (%) de etanol utilizando el Ebulloscopio

de Malligan en cada uno de los cuatro biorreactores cuyos resultados se organizaron

y analizaron estadísticamente en base a la prueba de análisis de varianza (ANAVA).

 RESULTADOS

Se observó que el porcentaje de Alcohol producido por Saccharomyces cerevisiae fue

mayor en los sistemas que se trabajaron con el extracto enzimático producido por Aspergillus

oryzae en comparación con el control donde no se añadió dicho extracto (fIg.1). Además se

observó que el extracto favoreció el crecimiento celular en un medio dónde puede ser inhibido

por el porcentaje de alcohol (fig.2 y 3). Dicho crecimiento celular puede observarse también

en la caída del Brix inicial del medio caldo melaza (fig.4).

También se observó que el mayor porcentaje de Alcohol se obtuvo en el tratamiento

con 4% de extracto enzimático obteniéndose una media de 4.47% de alcohol a diferencia del

control en el cual se obtuvo 3.73% como se puede observar en la figura 1. Así mismo se

puede observar que se obtuvo mayor población celular en el tratamiento con 6% de extracto

enzimático (Fig. 2.).

Según el ANAVA, existe diferencia estadísticamente significativa entre los

porcentajes de alcohol promedio de un nivel de Concentración Enzimático a otro para un

nivel de confianza del 95.0%. Según el Post. ANAVA (Tests de Rangos Múltiples), se

identificó que en el rango de 2 y 4 %; 2 y 6% al igual que 4 y 6% no hubo diferencia

significativa (p> 0.05) por lo tanto a dichas concentraciones se obtiene igual efecto; sin

embargo en los tres pares de medias restantes (comparación con la media control) se observó

que éstos muestran diferencia estadísticamente significativas a un nivel de confianza 95.0%

haciendo un total de dos poblaciones estadísticas (grupos homogéneos), considerando al

control como una de ellas ( Fig. 2).

 4,6
4.47%

producido porsaccharomyces
Porcentaje (% ) de alcohol
4,4
4.27% 4.27%
4,2 b
cerevisiae 4 b b

3,8 3.73%
3,6 a
3,4

3,2
0% 2% 4% 6%
Concentración de extracto enzimático producido por
Aspergillus oryzae

a, b : p ≤ 0.05  Hay diferencia significativa

Fig. 1. Porcentaje de alcohol producido por Saccharomyces cerevisiae empleando diferentes

concentraciones del extracto enzimático de Aspergillus oryzae a los 48 hrs. de

fermentación.
S alac cr h r o m y c e s

1,80E+08
1.61E+08
1,60E+08
1.36E+08
c e r e v is ia(ce e l/m L )

1,40E+08 1.27E+08
1,20E+08
9.92E+07
P o b la c ió n c e lu

1,00E+08
8,00E+07
6,00E+07
4,00E+07
2,00E+07
0,00E+00
0% 2% 4% 6%
Concentración de extracto enzimático producido por
Aspergillus oryzae

Fig. 2. Población celular de Saccharomyces cerevisiae (Cel/mL) en presencia de diferentes

concentraciones de complejo enzimático de Aspergillus oryzae a los 48 hrs. de

fermentación.
 400

Población Celular deSaccharomyces

350
Y=0.0513X+18.096
cerevisiae (millón/mL) 300

250

200

150

100

50

0
3 4 7 8 9 10 12 25
Tiempo (h)

Fig. 3. Fase exponencial de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae (millón/mL) cultivado en

medio Caldo Melaza y evaluado durante las 25 hrs.

14
14

12

10
Grados Brix (ºB)

8
6.67 6.67 6.65 6.57
6

4 0% 2% 4% 6%

0
2,76E+07 9,92E+07 1,27E+08 1,36E+08 1,61E+08
Población celular de Saccharomyces cerevisiae (Cel/mL)

Fig. 4. Grados Brix inicial (14ºB) y finales de los medios de fermentación (caldo melaza) con

la correspondiente Población celular de Saccharomyces cerevisiae evaluado a las

48hrs.
 DISCUSIÓN

En lo que se refiere a la estandarización de la metodología de la fermentación

alcohólica, hay una etapa muy importante que es el momento de pasar la levadura de fase

aerobia a fase anaerobia. La levadura se debe pasar a la fase anaerobia cuando la curva de

crecimiento del cultivo está en la fase logarítmica de desarrollo (véase figura 3).Para

determinar este grado de desarrollo fue necesario realizar una curva de crecimiento, en la cual

se observó que el momento óptimo para hacerlo era a las 5 horas 23 minutos después de

iniciada la fase aerobia. Al realizar la fermentación de esta forma, se asegura que la levadura

está pasando en las mejores condiciones a la fase anaerobia10,25.

Saccharomyces cerevisiae es una levadura que posee alta actividad metabólica, por lo

que en la fase aerobia se caracteriza por la producción de biomasa y la fase anaerobia

generalmente por la producción de etanol. Es importante la fase aeróbica, ya que la levadura

presenta una fase de adaptación para que produzca enzimas necesaria tipo invertasa que le

permitan metabolizar el sustrato y así alcanzar la biomasa adecuada para la fermentación en

donde la mayor parte del carbono se emplea como energía y sólo el 2% se asimila como

material celular26 .

El complejo enzimático obtenido de A. oryzae contiene enzimas de diferentes tipos.

Para la presente investigación se decidió evaluar el contenido de amilasas y proteasas. El

resultado de la prueba de actividad para amilasas arrojó un concentración de 676.42 UA/dL

(Anexo 3), que indica que el complejo enzimático puede hidrolizar residuos de maltosa y de

almidón (amilosa amilopectina). Realizando la prueba de actividad de la amilasa se

demuestra que el complejo actúa sobre enlaces alfa 1,4 y alfa 1.6 logrando disponer para la

levadura nuevos componentes. Esto justifica también la disminución final de los azúcares
totales reductores y el aumento del porcentaje de alcohólico con respecto al blanco 10. (Fig. 1 y

4).

David Johnston, tecnólogo alimentario en la Unidad de la Ciencia de Conversión de

Cultivos e Investigación de Ingeniería, está investigando nuevos procesos usando enzimas

proteasas de microbios y hongos para producir etanol más eficazmente. Él ha descubierto que

las enzimas hacen más nutrientes disponibles para la levadura, acelerando la fermentación de

los azucares. Además que las enzimas proteasas también pueden facilitar el proceso de quitar

el agua de los restos sólidos después de la extracción del etanol. Él en conjunto con otros

investigadores han reportado que las α-amilasas afectan la concentración final del etanol

dándoles como resultado un aumento de 10,5 hasta 11,6%(v/v) a una concentración de α-

amilasa de 42.8 U/g de maíz seleccionado para la molienda en seco a nivel de laboratorio11,27.

La prueba de la proteasa, fue incluida por la baja especificidad que presentan las

enzimas proteolíticas de la levadura. Las proteasas mejoran la asimilación del nitrógeno

presentes en la melaza como proteínas y aminoácidos, lo que representa una mejor estructura

conformacional de la membrana celular de la levadura y por tanto una mayor tolerancia a la

inhibición por concentración de alcohol. Como se observa en la figura 2, muestra un notable

aumento de la población celular por la adición del extracto enzimático. Al desarrollar la

metodología propuesta para evaluar la presencia de esta enzima, el resultado de la prueba

arrojó la presencia de proteasas en el medio que hidrolizan 2.7305mg de caseína a 37ºC por

30 minutos (Anexo 2) 10,20,26.

Como se sabe, solamente 20 aminoácidos componen el alfabeto a partir del cual se

forma la gran variedad de proteínas existentes, existen muchos métodos bioquímicos que nos

permiten identificar su presencia en una muestra, dentro éstos destacan la formación de

complejos cromóforos por interacción del aminoácido y un reactivo especifico, en esta

ocasión se trabajó con la Ninhidrina, agente que al entrar en contacto con aminoácidos libres

da lugar a un complejo visible de color azul-violáceo. Por ello podemos afirmar que el

extracto enzimático tiene proteasas por dar positiva la reacción de la ninhidrina con los

grupos aminos de los aminoácidos libres16.

La obtención de alcohol de melazas se diferencia de otras materias primas, como maíz,

papa, milo y otros, en que éstos son productos de plantas con alto contenido de carbohidratos

almacenados en la forma de almidón. Por lo tanto, estos materiales deben pasar por un

proceso de pretratamiento de cocción o tratamiento enzimático para hidrolizarlos y obtener

azúcares fermentables. En contraste, los carbohidratos presentes en las melazas ya se

encuentran disponibles y no requieren tratamiento, con fundamento en las propiedades que

tienen algunos microorganismos de metabolizar azúcares y producir como residuo, alcohol

etílico. Para el caso particular de hidrólisis de materiales lignocelulósicos de la caña de azúcar

o ruptura de las moléculas en medio acuoso, tiene como finalidad la transformación de

azúcares complejos (polisacáridos) en carbohidratos sencillos. Esto se logra con ácido

sulfúrico o clorhídrico a altas temperaturas y tiempos de operación cortos o largos; el ácido

actúa como catalizador y se obtiene una mezcla de glucosa y xilosa con algunos productos de

degradación como ácido acético, furfural y derivados de la ruptura de la lignina1,19.

Los principales cambios notados durante el almacenamiento de la melaza son: pérdida

de sacarosa, ganancia de azúcares reductores, incremento del porcentaje de compuestos

orgánicos no azúcares, pérdida de sólidos totales, y gran incremento de color. En la

descomposición de la melaza se producen varias reacciones siendo la más importante la de los

aminoácidos con estos azúcares reductores, en la cual se forman productos coloreados como

las melanoidinas (impurezas coloidales coloreadas con alto contenido de carbono) y los

residuos fermentables a los cuales se les ha encontrado un contenido de 68% de nitrógeno

combinado, en forma no asimilables por los microorganismos. Para reducir la probabilidad de

cambios químicos originados por las temperaturas, la melaza debe almacenarse a la menor

temperatura posible26.

La cantidad de melaza almacenada y la duración del período de almacenamiento, son

factores que se debió considerar ya que esa puede ser la causa de que la levadura no produjo

porcentajes de alcohol más altos al no tener la fuente de carbono y nitrógeno libres ya que se

formaron impurezas coloidales debido a un mal almacenamiento (temperatura ambiente).

Pues se sabe que el carbono sirve como fuente de energía y como material constitutivo de la

masa celular y el nitrógeno se encuentra en la célula formando parte esencial de las proteínas,

aminoácidos y ácidos nucleicos. Además según investigaciones realizadas, se ha reportado

que en un cultivo para levaduras en melaza la relación carbono/nitrógeno debe ser 1:1 para

que la productividad celular sea máxima26.

Una de las etapas en el proceso de fermentación es la preparación del “mosto”, el cual

consiste (en este caso particular) en una dilución de la melaza hasta 12-14º Brix por adición

de la cantidad adecuada de agua. Suele ser satisfactoria una concentración de azúcar del 10 al

18%, el valor más corriente es del 12%. Cuando se trabaja con concentraciones de azúcar muy

altas, del orden de 22%, se observa una deficiencia respiratoria en la levadura y un descenso

de la velocidad de fermentación; por el contrario, al trabajar con concentraciones muy bajas,

el proceso resulta antieconómico ya que requiere un mayor volumen para la fermentación. Por

esto se utiliza como sustrato la melaza, que tiene de 10 − 15% de azúcar. La melaza con la

que se trabajó tuvo 26.82% de sacarosa con un Brix de 80.5 la cual se diluyó hasta obtener

14ºB y 13.31% de azúcares. La evaluación de los grados brix (sólidos solubles), muestra una

disminución al final de la fermentación con respecto al blanco (fermentación alcohólica sin la

adición de enzima) como se observa en la figura 4, lo cual es indicativo de que hubo

conversión a etanol. La disminución del grado Brix puede estar dada por la asimilación de

maltosa, almidón amilasa hidrolizados por el complejo enzimático1,17,18,28.

 Las condiciones de fermentación también pueden ser un factor importante en la

producción de etanol; así el pH óptimo para el metabolismo de la levadura es de pH 4.5; el

tipo de azúcares también es un factor importante, la levadura solo metaboliza directamente

azúcares simples (glucosa y fructosa). Para fermentar disacáridos como la sacarosa, presentes

en jugos y mieles de caña, por ejemplo, la levadura emplea la enzima invertasa para desdoblar

la sacarosa en sus azúcares simples glucosa y fructosa. Para procesar materiales que contienen

azúcares simples y disacáridos, como las mieles de la industria de la caña de azúcar, basta con

diluir hasta conseguir concentraciones apropiadas (se diluyo hasta los 14ºB) y luego agregar

cantidades de levadura suficientes (2.76X107 cel/mL). Sin embargo, el porcentaje de alcohol

que se puede obtener en la fermentación está limitado por la tolerancia de la levadura a las

concentraciones de alcohol, lo cual varía de una especie a otra. El alcohol tiene un efecto

negativo sobre las enzimas que la levadura emplea para desdoblar el azúcar, por lo que a

medida que se genera durante la fermentación, la capacidad de la levadura para producirlo se

ve reducida.

Se ha demostrado que las membranas citoplasmáticas y de varios organelos son el

blanco principal para la inhibición por etanol. El alcohol ocasiona alteraciones en la

organización y permeabilidad de las mismas al afectar su composición lipídica y el

funcionamiento de proteínas de membrana involucradas en el transporte de azúcares y

aminoácidos. Estos cambios en la permeabilidad, causan la fuga de cofactores, coenzimas y

nucleótidos. La pérdida de estas biomoléculas, esenciales para la actividad de enzimas

involucradas en la glicólisis y producción de alcohol, son suficientes para explicar el efecto

inhibitorio del mismo20,21,22,23.

No obstante, se ha reportado que es posible alcanzar hasta 21% de alcohol con

especies genéticamente adaptadas y bajo ciertas condiciones. Lo común en la industria del

alcohol es alcanzar porcentajes de entre 9 a 15%. Sin embargo a nivel de laboratorio,

Concepción y Col24 reportaron rangos de 4.88 - 9.84 % y 4.95 - 9.56% y en ninguno de los

casos se excedió el 10% respectivamente, haciendo corridas experimentales con nitrógeno

(sulfato de amonio) y sin nitrógeno concluyeron que la adición de la fuente de nitrógeno

exógena no tuvo influencia sobre el rendimiento de alcohol además que en 4 y 8% de alcohol

existe una meseta que demuestra la estabilidad en la actividad celular.

En el presente estudio el porcentaje de alcohol producido por Sacharomyces cerevisiae

empleando diferentes concentraciones del extracto enzimático de Aspergillus oryzae también

dio valores bajos entre 4,27 y 4,47% (Fig 1.) hecho que se puede explicar como lo hacen

Hoyos y Carrera que reportaron un incremento del grado alcohólico del 8% a 10% v/v con la

adición de de enzimas obtenidas por fermentación en sustrato sólido con Rhizopus niveus,

concluyendo que es un valor satisfactorio pero muy bajos probablemente por la cepa de

Saccharomyces usada, la cual no es una cepa mejorada y específica para obtención de

alcohol pero al añadir el complejo enzimático la cepa presentó tolerancia (cepas clasificadas

así cuando soportan de 9 a11% de alcohol)10,24.

La adición de sulfato de amonio como fuente de nitrógeno a las distintas

concentraciones de miel durante la fermentación, surte a las levaduras de una fuente externa

de nitrógeno en exceso. Por una parte el sulfato de amonio favorece la reacción fermentativa y

por otra incrementa el ªBrix inicial, aumentando las presiones osmóticas del medio que se

oponen a los procesos celulares. El aumento progresivo de los niveles de sólidos en el medio

incrementan las presiones osmóticas, lo que conlleva a un incremento en la concentración de

etanol intracelular, lo cual da como resultado un decremento de las enzimas intracelulares que

intervienen en la producción de etanol24.

Por las razones mencionadas anteriormente no se le añadió sulfato de amonio al medio

Caldo Melaza debido a que la fuente de nitrógeno exógeno no ejerce efecto en cuanto al
aumento de la producción de alcohol. Esto evidencia que la melaza utilizada contiene la

suficiente cantidad de nitrógeno alfa amino (6.3% proteínas) para el metabolismo celular a

estas concentraciones18,24.

CONCLUSIONES

1. El complejo enzimático producido por Aspergillus oryzae, a una concentración de

676.42 UA/dL (unidades aminolíticas) y proteasas con una actividad de hidrolizar

2.7305mg de caseína a 37ºC por 30 minutos; tiene efecto sobre la producción de

alcohol etílico por Saccharomyces cerevisiae aumentando la producción de etanol. en

condiciones de laboratorio.

2. Se obtuvo un incremento del porcentaje alcohólico de 3.73 % a 4.47% v/v con un

porcentaje de adición complejo enzimático de 4% valor estadísticamente significativo

pero bajo debido a que la cepa de Saccharomyces usada no es una cepa mejorada.

3. Al comparar estadísticamente el porcentaje de alcohol con los tratamientos de 2,4 y

6% de concentración del complejo enzimático, se observó que no hay diferencia

significativa entre estas concentraciones. Sin embargo si hay diferencia significativa

entre estas concentraciones y el control.

AGRADECIMIENTOS

A la Ms.C. Nélida Milly E. Otiniano García; por su asesoramiento, constante apoyo y

sus acertados consejos sin los cuales no hubiera sido posible la realización de la presente tesis.

Al Ms C. Julio Arrellano Barragán; por ayudarme a resolver algunas inquietudes que

se han estado presentando durante el desarrollo de la tesis.