limits are signiIicantly improved over Flame AA.

Graphite Furnace analysis times are longer

than those Ior Flame sampling, and Iewer elements can be determined using GFAA. However,
the enhanced sensitivity oI GFAA, and its ability to analyze very small samples, signiIicantly
expands the capabilities oI atomic absorption. Applying the Beer-Lambert law directly in AA
spectroscopy is diIIicult due to variations in the atomization eIIiciency Irom the sample matrix,
and nonuniIormity oI concentration and path length oI analyte atoms (in graphite Iurnace AA).
Concentration measurements are usually determined Irom a working curve aIter calibrating the
instrument with standards oI known concentration. GFAA allows the determination oI over 40
elements in microliter sample volumes with detection limits typically 100 to 1000 times better
than those oI Flame AA systems (perkin elmer GFAAS). Atomic absorption spectroscopy (both
FAAS or GFAAS) is the main technique used Ior the analysis oI heavy metals in air samples,
because oI its selectivity, sensitivity, reproducibility, wide dynamic concentration range, and its
low cost (teski metali u zraku).

2.7. Validacija metode
2.7.1. Umjesto uvoda
Svakog dana, sirom svijeta naprave se milioni analitickih mjerenja u hiljadama razlicitih
laboratorija. Postoji bezbroj razloga za izvodenje tih mjerenja, npr: procjena kvaliteta robe za
trgovinske svrhe; zatim kontrola kvaliteta vode za pice; analiza elementarnog sastava legure da
bi se potvrdila njena pogodnost za koriscenje u avionskoj konstrukciji; Iorenzicka analiza
tjelesnih tekucina u krivicnim istragama itd. Prakticno skoro svaki segment danasnjeg drustva
zasniva se na neki nacin na analitickom mjerenju. Troskovi izvodenja ovih mjerenja su visoki, a
pored toga, dodatni troskovi mogu proisteci iz odluka donijetih na osnovu rezultata takvih
mjerenja. Na primjer, rezultati analize koji pokazuju da je analizirana hrana bila nepodesna za
upotrebu, mogu rezultirati kompenzacijskim tuzbama, ili je analizom utvrdeno prisustvo
zabranjene droge, rezultati takve analize mogli bi rezultirati zatvorskom kaznom ili cak u nekim
zemljama, smrtnom presudom. Iz gore navedenog, namece se zakljucak da je izuzetno vazno
utvrditi stvarnu vrijednost mjerene velicine odnosno dobiti 'tacan rezultat, ali je isto tako vrlo
bitno biti u stanju pokazati da se radi o tacnom rezultatu. Ako se rezultatu analize ili testa ne
moze vjerovati onda on ima malu ili prakticno nikakvu vrijednost, isto kao da analiza nije ni
uradena. Kada "klijent" zahtjeva analiticki rezultat iz laboratorije, pretpostavlja se da ta
laboratorija ima odredeni stepen strucnog znanja, koje klijent nema. Klijenti ili korisnici tog
rezultata imaju povjerenje u dobijeni rezultat i obicno, sumnja se javlja samo onda kada nastane
neki spor. Zbog toga laboratorija i njeno osoblje imaju jasnu odgovornost da opravdaju
povjerenje klijenta pruzajuci pravi odgovor na analiticki dio problema, odnosno proizvodeci
rezultate koji su dokazivo "svrsishodni" |eurachem, 4]. Prema IUPAC-u "svrsishodnost" se
deIinise kao stepen do kojeg je omoguceno korisniku da na osnovu podataka dobijenih tokom
mjernog procesa donese, za navedenu svrhu, ispravne tehnicke i administrativne odluke. Drugim
rijecima, podrazumijeva se da su sprovedena odgovarajuca ispitivanja za analiticki dio problema
koji korisnik usluge zeli rijesiti, te da krajnji izvjestaj analize predstavlja analiticke podatke na
takav nacin da su kupcu ili klijentu lako razumljivi kako bi mogao izvuci odgovarajuce zakljucke
|doktorska teza o validaciji.., 26]. Validacija metode je proces koji upravo omogucava
hemicaru da demonstrira da je metoda adekvatna za odredenu namjenu odnosno da je
"svrsishodna". Shvativsi vaznost tog procesa mnoge drzave su njegovu sustinu inkorporirale u
nacionalni zakonski okvir, postavljajuci kriterije koje svaka laboratorija mora ispuniti kako bi
dobila npr. odgovarajucu dozvolu za rad. Na taj je nacin omogucena, laboratorijama i njihovom
osoblju, kompetentnost za podrucje analize kojim se bave, a samim tim su zasticeni i korisnici
tog rezultata. U skladu sa prethodno navedenim, Evropska Unija je u svoju zakonsku legislativu
uvrstila i Odluku Vijeca
1
o perIormansama analitickih metoda i interpretaciji rezultata, koja je
donijeta 12 avgusta 2002 a stupila na snagu 1 septembra 2002, a odnosi se na implementaciju
Direktive 96/23/EC. U toj odluci, u Clanu 3, zemlje clanice EU se obavezuju, izmedu ostalog:
'da se za analizu odgovarajucih uzoraka prema direktivi 96/23/EC, koriste validirane metode
analize" |Odluka vijeca EU]. Medutim, i mnogo prije ove Odluke prepoznata je potreba da se ta
oblast zakonski regulise pa je tako daleke 1989 godine ministarstvo trgovine i industrije
pokrenulo program pod nazivom 'Validno analiticko mjerenje (VAM) kao dio svoje podrske
nacionalnom mjernom sistemu (NMS) Velike Britanije. VAM program je bio dizajniran da
zadovolji ciljeve NMS, odnosno da omoguci organizacijama da vrse mjerenja koja su adekvatna
njihovoj namjeni na neki od sljedecih nacina: upotrebom validiranih metoda, koje su kalibrirane
koristenjem reIerentnih materijala, primjenom procedura sa odgovarajucim stepenom osiguranja
kvaliteta (QA) i kontrole kvaliteta (QC), ukljucujuci i ucesca u testovima provjere sposobnosti
laboratorija i primjenom laboratorijskih metoda i procedura koje su bile podvrgnute van
laboratorijskoj akreditaciji. Osnovni cilj VAM programa bio je da odobri upotrebu gore
navedenih procedura kako bi se poboljsao kvalitet analitickog mjerenja u Velikoj Britaniji
Knjiga (google) naci stranicu|. Postoji mnogo razloga zasto je kvalitetno mjerenje potrebno.
Neki od tih razloga su vec navedeni, a najvazniji razlozi su zbog: usaglasenosti sa regulativom,
odrzavanja kvaliteta i kontrole procesa, donosenja regulatornih odluka, podrske nacionalnoj i
internacionalnoj trgovini i podrzavanja istrazivanja Knjiga (google) naci stranicu|. Prema tom
programu najbolja analiticka praksa je deIinisana pomocu sest VAM principa, koji ispunjeni
zajedno, cine osnovu dobrog prakticnog rada. To su sljedeci VAM principi:
1. "Analiticki mjerenja treba da zadovolje dogovoreno zahtjeve odnosno deIinirani cilj."
2. "Analiticki mjerenja treba izvoditi koristenjem metoda i opreme koji su testirani kako bi se
osiguralo da su adekvatni za namijenjenu svrhu "
3. "Osoblje koje izvodi analiticka mjerenja treba biti i kvaliIikovano i kompetentno da preuzme
zadatak i da demonstrira da moze obavljati analizu ispravno.
4. "Trebalo bi sprovoditi redovitu neovisnu procjenu tehnickih perIormansi laboratorije "
5. "Analiticki mjerenja koja su napravljena na jednom mjestu trebaju biti konzistentna s
mjerenjima napravljenim na bilo kom drugom mjestu."
6. "Organizacije koje vrse analiticka mjerenja trebaju imati dobro deIinisane procedure kontrole i
osiguranja kvaliteta. " Knjiga (google) naci stranicu|.

1
Zavedenu pod dokumentom br. C(2002) 3044) u sluzbenom listu EU
Navedeni principi su jednako vazni za laboratorije bilo da one rade u izolaciji ili generiraju
rezultate koji se trebaju usporediti s onima iz drugih laboratorija odnosno koje ucestvuju u
interlaboratorijskim komparacijama |eurachem, 1|. Validno mjerenje i medusobno priznavanje
rezultata izmedu razlicitih laboratorija, moze biti postignuto usvajanjem i primjenom gore
navedenih principa. VAM principi opisuju jedan pristup koji je konzistentan sa najboljim
modernim sistemima kvaliteta, prezentiran na nacin koji je odgovarajuce jasnoce za one koji vrse
analiticka mjerenja. Ovi principi predstavljaju osnovu VAM-a i dizajnirani su kako bi se
kontrolisali svi Iaktori koji mogu uticati na pouzdanost analitickog rezultata. Osnovna svrha ovih
principa jeste da se poveca svijest o vaznosti izvodenja pouzdanog 'svrsishodnog mjerenja
|Knjiga google naci stranicu|. Medutim da bi bilo koji analiticki rezultat bio odgovarajuci za
odredenu namjenu, odnosno da bi bio svrsishodan, on prije svega mora biti dovoljno pouzdan da
bi se bilo kakva odluka na osnovu njega mogla uzeti sa povjerenjem. Zbog toga perIormanse
metode moraju biti validirane a nesigurnost rezultata, sa odredenim nivoom povjerenja, utvrdena.
Nesigurnost, koja danas predstavlja kljucni indikator 'svrsishodnosti i pouzdanosti rezultata,
treba odrediti i predstaviti na nacin koji je siroko priznat, interno konzistentan i koji se lako
interpretira. Vecina inIormacija potrebnih za procjenu nesigurnosti mogu se dobiti tokom
validacije metode, a u nekim slucajevima sam proces validacije predstavlja dio procesa procjene
nesigurnosti |eurachem, 4|. Iz svega navedenog proizilazi da karakteristike analiticke metode i
njena primjenjivost za odredenu svrhu koje se utvrduju tokom validacije, predstavljaju kljucne
elemente u razumijevanju kvaliteta analitickih podataka i osiguranja povjerenja u kvalitet
Knjiga (google) naci stranicu|. Bez obzira koliko je dobra metoda i kako vjesto se koristi,
analiticki problem moze biti rijesen analizom uzoraka samo onda ako su ti uzorci prikladni za
analizu. Uzimanje odgovarajucih uzoraka je vjest posao, koji zahtijeva razumijevanje problema i
hemije koja se odnosi na njega. Zbog toga laboratorija, kao dio svoje brige o korisnicima, treba,
gdje god je to moguce, da ponudi savjet klijentu o pravilnom uzimanju reprezentativnih uzoraka.
Jasno je da postoje situacije kada laboratorije ne mogu same uzorkovati ili uticati na uzimanje
uzoraka. U tim slucajevima rezultate analize treba objaviti na osnovu primljenih uzoraka, a u
izvjestaju to treba jasno naglasiti eurachem, 5]. Iako je uzorkovanje vrlo bitan dio hemijskih
analiza, ono nije dio procesa validacije metode QA, 78].

2.7.2. Sta je validacija metode?
Validacija metode u internacionalnom standardu, ISO/IEC 17025 deIinise se kao proces
prikuplfanfa ispitivanfem, obfektivnih doka:a da su pofedini :ahtfevi :a specificnu namfenu
metode ispunfeni QA, 73]. Prema VIM
2
-u to je zapravo proces kojim se potvrduje da metoda
odgovara namjeni tj. upotrebi za rjesavanje odredenog analitickog problema. Tokom procesa
validacije metode koristi se niz testova kojima se provjeravaju cak i pretpostavke (hipoteze) na
kojima se analiticka metoda temelji pri cemu se uspostavljaju i dokumentiraju karakteristike
perIormansi metode, kako bi dokazali da je metoda prikladna za odredenu analiticku svrhu
odnosno kako bi pokazali da su navedeni kriteriji o parametrima perIormansi metode koje treba

2
lnLernaLlonal vocabulary of meLrology (vlM)
ostvariti za odredenu analiticku svrhu, ispunjeni iupac, 839|. Ti kriteriji o parametrima
perIormansi deIinisu se kao njihove vrijednosti na osnovu kojih bi bilo moguce potvrditi da
metoda odgovara svojoj namjeni i da generira pouzdane podatke EC]. Tipicni parametri
perIormansi metode, deIinisani kao Iunkcionalni kvalitet koji moze biti pripisan analitickoj
metodi EC], koji se obicno odreduju tokom procesa validacije su: primjenljivost, selektivnost,
preciznost, bias, istinitost, linearnost, radno podrucje, limit detekcije, limit kvantiIikacije,
kalibracija i robusnost iupac, 839|. Iz svega navedenog izvodi se kratak zakljucak da ce
validirane metode, ukoliko su koristene ispravno, generirati pouzdane rezultate koji su adekvatni
njihovoj namjeni. Da bi se to zaista i desilo vrlo je bitno detaljno razumjeti koja je svrha i koji je
kvalitet rezultata potreban tj. njegova nesigurnost. To je ono sto odreduje pomenute vrijednosti
parametara perIormansi metode koje treba ostvariti QA, 73]. Dakle, validacija metode je
planirani set ispitivanja kako bi se odredile te vrijednosti parametara perIormansi i ogranicenja
metode kao i identiIicirali Iaktori koji mogu uticati na te perIormanse i do koje mjere. Taj proces
treba da da odgovor na pitanja kao sto su: vrsta analita koja moze biti odredena tom metodom, u
kojem matriksu i u prisustvu kakvih ili kojih interIerencija, zatim koji nivo preciznosti i tacnosti
moze biti ostvaren u tim uslovima |eurachem, 52|. Proces validacije je graIicki prikazan na Slici
12.









Slika 12: Sematski prikaz procesa validacije metode (QA, 74)
U praksi validacija treba da demonstrira da analiticka metoda zadovoljava kriterije koji su
prihvatljivi samo za relevantne karakteristike ili parametre perIormansi. Validacija moze biti
sprovedena pomocu interlaboratorijskih studija kao sto su, ISO, IUPAC, ili pomocu
alternativnih metoda kao sto su jednolaboratorijske studije ili unutar-laboratorijske validacije. Za
validaciju metode pomocu jednolaboratorijske (unutar-laboratorijske odnosno in-house) studije
moze se koristiti modularni pristup. Ovaj pristup se sastoji od:
1. skupa zajednickih karakteristika perIormansi koje treba odrediti nezavisno od upotrijebljenog
validacionionog modela i
lsplanlra[
valldaclone
eksperlmenLe
lzvedl eksperlmenLe
lskorlsLl dobl[ene
podaLke za proc[enu
svrslshodnosLl
AnallLlckl zahL[evl
lspun[enl?

lz[ava o valldacl[l

ueflnlsl
anallLlcke
zahL[eve
8azvl[/ldenLlflclra[
odgovara[ucu
meLodu
nL
uA
Kljucni Iaktori prije
pocetka validacije

2. vise speciIicnih procedura koje zavise od primjenjenog validacionog modela kao sto je
prikazano u Tabeli 9.
Tabela 9. Model-nezavisni i model-zavisni parametri perIormansi

valldacl[a

Modelnezavlsnl

Modelzavlsnl parameLrl performansl
parameLrl performansl
uoblca[ene
karakLerlsLlke konvenclonalnl valldaclonl prlsLup lnhouse valldaclonl prlsLup
performansl
SpeclflcnosL 8lkaverl

8lkaverl
lsLlnlLosL
onovl[lvosL


onovl[lvosL

8obusnosL man[e
prom[ene
unuLar laboraLorl[ska
reproduclbllnosL
unuLar laboraLorl[ska
reproduclbllnosL
SLabllnosL 8eproduclbllnosL


8eproduclbllnosL
LlmlL deLekcl[e (LCu)

LlmlL deLekcl[e (LCu)
LlmlL kvanLlflkacl[e (LCC)

LlmL kvanLlflkacl[e (LCC)
kallbraclona krlva


kallbraclona krlva

8obusnosL vece prom[ene 8obusnosL

Pored navedenih mogu se koristiti i drugi pristupi kojima se demonstrira da je analiticka metoda
zadovoljila potrebne kriterijume karakteristika perIormansi, pod uvjetom da daju isti nivo i
kvalitet inIormacija EC]. U sklopu validacije metode, su i dva svojstva rezultata, koja nisu dio
samog procesa validacije a to su mjerna nesigurnost i mjeriteljska sljedivost. Ukoliko je uzeta u
obzir tokom planiranja validacije metode, inIormacije dobijene tokom tog procesa predstavljaju
korisne podatke za procjenu mjerne nesigurnosti. Sljedivost zavisi od procedure i materijala koje
se koriste tokom rada metode QA, 78]. Ukoliko ne postoji metoda za odredenu analizu, tada je
potrebno prilagoditi postojecu ili razviti novu metodu. Prilagodenu ili novu metodu je zatim
potrebno optimizirati i ispitati, kako bi osigurali da metoda moze biti rutinski koristena u
laboratoriji. Prikupljeni dokazi tokom tih procesa treba da demonstriraju da metoda odgovara
svojoj namjeni odnosno da su zadovoljeni osnovni principi na kojima se zasniva validacije
metode QA, 73].

2.7.2.1. Osnovni principi validacije metode
2.7.2.1.1. Specifikacija i svrha validacije
Validacija se odnosi na tacno deIinisani protokol ili proceduru, koja se koristi za odredenu
namjenu, kako bi se odredio speciIicni analit i njegovo koncentraciono podrucje u odredenom
tipu ispitnog materijala tj. uzorka. Opcenito, validacijom treba biti potvrdeno da je izabrana
metoda adekvatna za koncentraciono podrucje i vrstu uzoraka na koje se primjenjuje. Iz toga
proizilazi da te karakteristike zajedno sa izjavom o kriterijima 'svrsishodnosti odnosno
adekvatnosti, trebaju u potpunosti biti deIinisane prije nego sto se i pristupi validaciji, kao sto je i
prikazano na Slici 12.
2.7.2.1.2. Provjera hipoteze
Pored odredivanja karakteristika perIormansi metode koje indiciraju adekvatnost za odredenu
namjenu i koje danas dominiraju prakticnom upotrebom validacionih podataka, validacione
studije predstavljaju i objektivni test ili provjeru hipoteze (pretpostavke) na kojoj se analiticka
metoda bazira. Na primjer, ukoliko se koncentracija nepoznatog analita odreduje pomocu
jednacine kalibracionog pravca odnosno pomocu kalibracione krive, pretpostavka je da analiza
nije opterecena znacajnim biasom, da je odziv instrumenta proporcionalan koncentraciji analita, i
da je disperzija slucajnih gresaka konstantna kroz koncentraciono podrucje od interesa. U vecini
slucajeva, ovakve pretpostavke baziraju se obicno na iskustvu akumuliranom tokom razvoja
metode ili tokom dugorocne upotrebe metode, i koje su prema tome opravdano ili prilicno
pouzdane. Bez obzira na vec receno, kvalitetna mjerna nauka oslanja se na testirane ili
provjerene hipoteze. To je razlog zbog kojeg se mnoge validacione studije temelje na statistickoj
provjeri hipoteza; a cilj je pruziti neku osnovnu sigurnost da su odgovarajuce pretpostavke
(hipoteze) o principima metode dovoljno tacne ili ispravne. Postoji vazna prakticna implikacija
ove naizgled tesko razumljive konstatacije. Naime, puno je lakse dokazati odstupanje ili
neslaganje od navedenih pretpostavki (hipoteza) nego "dokazati" da je odredena pretpostavka
tacna. Dakle, tamo gdje se dugo vremena uspjesno primjenjuje odredena analiticka tehnika (kao
npr. gasna hromatograIija, ili razne metode kiselinske digestije) za odredenu vrstu analita i
matriksa, validacija opravdano predstavlja Iormu relativno jednostavnih preventivnih testova.
Obrnuto prethodno navedenom, tamo gdje je iskustvo malo, validacione studije treba da
osiguraju jake dokaze da su napravljene hipoteze odgovarajuce i ispravne za namijenjenu svrhu, i
obicno ce biti neophodna detaljna provjera velikog niza okolnosti. Iz toga slijedi da ce obim
validacionih studija potreban u pojedinim slucajevima ovisiti, izmedu ostalog, i od postojeceg
iskustva skupljenog tokom upotrebe analiticke metode i tehnike.

2.7.2.1.3. Izvori gresaka tokom analize
Greske u analitickim mjerenjima proizilaze iz razlicitih izvora i na razlicitim nivoima
laboratorijskih operacija. Jedan od pogodnijih nacina prikazivanja tih izvora (za odredene
koncentracije analita) je kako slijedi:

W slucajna greska mjerenja (ponovljivost)
W eIekti tokom izvodenja eksperimenta (predstavljeni kao bias jedne analize i kao slucajna
varijacija za nekoliko analiza)
W laboratorijski eIekti (predstavljeni kao bias jedne laboratorije)
W bias metode i
W eIekti zbog varijacija u matriksu
Iako ovi navedeni izvori ne moraju nuzno biti neovisni, gore navedeni popis je koristan nacin
provjere do koje mjere odgovarajuca validaciona studija adresira izvore nesigurnosti. Izraz
ponovljivost (u toku izvodenja eksperimenta) uzima u obzir doprinose u greskama iz bilo kojeg
dijela procedure koji variraju tokom eksperimenta, ukljucujuci i doprinose iz poznatih
gravimetrijskih i volumetrijskih gresaka, heterogenosti ispitnog materijala, varijacije u analizi
tokom razlicitih Iaza hemijskog tretmana, i koje su lako uocljive u disperziji ponovljenih
mjerenja. EIekti tokom izvodenja eksperimenta, kao izvori gresaka, uzimaju u obzir i dodatne
varijacije koje su reIleksija promjene uslova tokom dana u analitickom sistemu, kao sto su
promjene analiticara, serije reagenasa, ponovljeno kalibrisanje instrumenta i laboratorijskih
uslova (npr. temperaturne promjene). Pri validaciji metode od strane jedne laboratorije (ili
unutar-laboratorijske validacije) ovi eIekti ili uticaji na tacnost rezultata, obicno se utvrduju
izvodenjem planiranog eksperimenta, sa ponavljanjem analiziranja odgovarajuceg materijala
odredeni broj puta nezavisnim mjerenjem. Medu laboratorijske varijacije proizlaze iz Iaktora kao
sto su neidenticnost kalibracionih standarda, razlike izmedu lokalnih interpretacija protokola;
razlike u opremi ili okolinskim Iaktorima, npr. razlike prosjecnih klimatskih uslova. Opcenito,
ponovljivost, eIekti tokom izvodenja eksperimenta, i laboratorijski eIekti su mjerljive velicine,
tako da nijedna sa sigurnoscu ne smije biti ignorisana tokom validacije. U proslosti, postojala je
tendencija da se pojedini aspekti tokom analize smiju zanemariti, a narocito inIormacije o
procjeni i prikazivanju nesigurnosti. Posljedica toga su nerealno mali intervali nesigurnosti. Npr.,
uobicajeni nacin sprovodenja interlaboratorijskih evaluacija ne daje kompletnu sliku zbog toga
sto doprinosi nesigurnosti proistekli iz biasa metode i varijacija u matriksu se ne utvrduju tokom
tih evaluacija i mora im se zasebno pristupiti (najcesce prethodnom unutar-laboratorijskom
studijom). Tokom unutar-laboratorijske validacije postoji posebna opasnost od moguceg
zanemarivanja laboratorijskog biasa, a to je obicno izvor najveceg pojedinacnog doprinosa
nesigurnosti iz gore navedene liste. Stoga, posebnu paznju treba posvetiti laboratorijskom biasu
tokom unutar-laboratorijske validacije metode. Osim gore navedenih 'problema, validacija
metode ogranicena je na podrucje njene primjene, odnosno, na primjenjivost metode za
speciIcnu (ili odredenu) vrstu ispitnog materijala tj. uzorka. Ako postoji znatna varijacija u vrsti
matriksa za odredenu vrstu analita na koji se metoda odnosi, postojat ce dodatni izvori
varijacija zbog razlicitih interIerencija tog analita unutar tih razlicitih vrsta matriksa. Naravno,
ukoliko se metoda nakon validacionog procesa koristi za uzorke koji su izvan deIinisanog
podrucja na koje se validacioni proces odnosio, analiticki sistem se ne moze smatrati
validiranim; jer su na taj nacin u mjerni proces uvedeni dodatni izvori gresaka cije su vrijednosti
nepoznate. Takoder je vazno za analiticara da uzme u obzir nacin na koji se mijenjaju
perIormanse metode u odnosu na promjene u koncentraciji analita. U vecini slucajeva, disperzija
rezultata apsolutno se povecava sa koncentracijom i rikaveri se moze znatno razlikovati na
visokim i niskim koncentracijama. Mjerna nesigurnost rezultata je, dakle, cesto ovisna od oba
ova eIekta, i od ostalih Iaktora koji zavise od koncentracije. Na srecu, obicno je moguce
opravdano pretpostaviti jednostavan odnos izmedu perIormansi metode i koncentracije; najcesce
su te greske proporcionalne koncentraciji analita. Medutim, tamo gdje su perIormanse metode
od interesa utvrdene za znatno razlicite koncentraciije u odnosu na trenutnu upotrebu, vrlo je
vazno provjeriti taj pretpostavljeni odnos izmedu perIormansi i novih koncentracija analita. To
se obicno radi provjerom perIormansi metode na krajevima pretpostavljenog koncentracionog
raspona, ili na nekoliko odabranih nivoa takvog raspona koncentracija. Provjera linearnosti moze
takoder pruziti inIormacije iste vrste.
2.7.2.1.4. Efekti metode i laboratorije
Od presudne je vaznosti da se tokom jedno-laboratorijske validacije metode uzme u obzir bias
metode i laboratorijski eIekti. Uobicajeno je da ti eIekti metode zajedno sa eIektima laboratorije
trebaju biti ukljuceni u proracun nesigurnosti, ali cesto ih je teze identiIicirati nego greske
ponovljivosti i greske tokom izvodenja eksperimenta. U principu, da bi se utvrdili ovi izvori
nesigurnosti neophodno je koristiti inIormacije prikupljene za datu metodu koje su dobijene
neovisno od laboratorijskih podataka prikupljenih tokom validacionog procesa. Opcenito
najkorisniji izvori takvih inIormacija su; statistika iz interlaboratorijskih evaluacija (koja nije
dostupna u mnogim situacijama jedno-laboratorijskih validacija metode), statistika iz testova o
procjeni strucnosti laboratorija, i rezultati analize certiIiciranih reIerentnih materijala. Ako je
odgovarajuci certiIicirani reIerentni materijal (CRM) dostupan, jedno-laboratorijski testovi
omogucavaju laboratoriji procjenu kombinovanog biasa metode i laboratorijskog biasa, analizom
certiIiciranog reIerentnog materijala (CRM) odredeni broj puta. Dobijeni kombinovani bias
predstavlja razliku izmedu srednje vrijednosti dobijenog rezultata tokom analize CRM i njegove
certiIicirane vrijednosti. Odgovarajuci CRM nije uvijek dostupan, zbog toga se drugi materijali
umjesto njih mogu ili nekad moraju koristiti. Materijali ostali tokom procesa procjene strucnosti
laboratorije ponekad mogu posluziti u ovu svrhu i, iako pripisane vrijednosti ovakvim
materijalima mogu imati neutvrdene nesigurnosti, njihovo koristenje omogucava provjeru
ukupnog biasa. Druga alternativa nedostatku odgovarajuceg CRM je spajkovanje i upotreba
rikaveri podataka da bi se procijenili ovi biasi, iako je moguce postojanje nemjerljivih izvora
nesigurnosti povezanih s ovim tehnikama. Trenutno, najmanje prepoznati ili deIinisani eIekti na
validacioni proces su oni koji se odnose na varijacije u matriksu za deIinisanu vrstu ispitnog
materijala. Teoretski uvjet za procjenu ove komponente nesigurnosti je analiza odredenog broja
reprezentativnih ispitnih materijala odjednom, utvrdivanje njihovih individualnih biasa, i
izracunavanje varijanse tih biasa. ( Istovremena analiza znaci da visoke vrijednosti biasa ne uticu
na varijansu. Ako postoji siroko podrucje koncentracija na koje se taj bias odnosi, tada je
potrebno deIinisati promjene biasa u odnosu na koncentraciju.) Ukoliko su ti reprezentativni
materijali, zapravo CRM-i, ti biasi mogu biti direktno utvrdeni kao razlika izmedu dobijenih
rezultata i reIerentnih vrijednosti, i cijeli taj postupak u tom slucaju je jednostavan. U vrlo
vjerovatnijem slucaju kada ne postoji dovoljan broj CRM-a za sve vrste analize odnosno
uzoraka, mogu se koristiti, uz odgovarajuci nivo opreza rikaveri testovi za odgovarajucu vrstu
ispitnih materijala. Trenutno, postoji veoma mala kolicina kvantitativnih inIormacija o velicini
nesigurnosti iz ovakvih izvora, iako se u nekim slucajevima sumnja da je ona velika iupac,
839|.

2.7.3. Kada je potrebno validirati metode?
Metodu treba validirati onda kada je neophodno potvrditi da su njeni parametri perIormansi
adekvatni za koristenje za odredeni analiticki problem. Taj problem moze biti neka od sljedecih
situacija npr:
O razvijena je nova metoda za odredeni analiticki problem;
O postojeca metoda je modiIicirana kako bi se uzela u obzir neka poboljsanja ili kako bi se
upotrijebila izvan svog speciIiciranog podrucja primjene;
O kada se prilikom kontrole kvaliteta utvrdi da se postojeca metoda mijenja sa vremenom;
O kada se vadirana metoda u jednoj laboratoriji primjenjuje od strane druge laboratorije ili
od drugog analiticara ili se koriste drugi instrumenti;
O kada je potrebno demonstrirati slicnost izmedu dvije metode, npr. nove i standardne
metode
Obim potrebne validacije ili revalidacije zavisit ce od prirode napravljenih promjena u razlicitim
laboratorijima, instrumentaciji, operatorima i okolnostima u kojima ce se metoda koristiti.
Odredeni nivo validacije je uvijek neophodan cak i kada se koriste obicno dobro okarakterisane
standardne ili objavljene metode kao sto je prikazano u Tabeli 9 |eurachem, 6|.

2.7.4. Zasto laboratorija treba da koristi validirane metode?
U akreditacijskom standardu, ISO/IEC 17025, u tacki 5.4.2. je navedeno da: ' Metode razvijene
u laboratoriji ili metode uvedene u laboratoriju mogu takode biti koristene za analizu ukoliko su
adekvatne za odredenu namjenu i ako su validirane PS15, 17]. Dakle, pouzdane analiticke
metode su neophodne da bi se zadovoljili razni nacionalni i internacionalni propisi u svim
sIerama analize. To je u skladu sa internacionalnim zahtjevima da laboratorije moraju poduzeti
odgovarajuce mjere kako bi se osiguralo da su u stanju generirati i da generiraju podatke
potrebnog kvaliteta. Takve mjere ukljucuju:
O upotrebu validiranih metoda analize
O upotrebu procedura interne kontrole kvaliteta
O ucesce u testovima za ispitivanje sposobnosti
O akreditaciju do internacionalnih standarda, obicno, ISO/IEC 17025
Validacija metode je, dakle, esencijalna komponenta mjera koje laboratorija mora poduzeti kako
bi sama sebi omogucila da proizvodi pouzdane analiticke rezultate. U nekim sektorima
analitickog djelovanja, a narocito u analizi hrane, zakonski se zahtjevaju metode koje su "u
potpunosti validirane". "Potpuna" validacija analiticke metode, kojom se obuhvata ispitivanje
svih karakteristika metode je obicno neophodna u slucajevima kada ta metoda odnosno
laboratorija ucestvuje u medulaboratorijskom ispitivanju perIormansi metode (takoder poznatoj
kao zajednicki studij ili zajednicka evaluacija metode). Medutim, potpuna validacija analiticke
metode nije uvijek prakticna ili neophodna. U odredenim okolnostima 'jedno-laboratorijska
validacija metode moze biti relevantna iupac, 838|. Jedno-laboratorijska studija (unutar-
laboratorijska validacija) podrazumijeva analiticku studiju od strane jedne laboratorije koja
koristi jednu metodu za analizu istih ili razlicitih ispitnih materijala u razlicitim uslovima tokom
opravdano dugih vremenskih intervala EC]. Kada je u pitanju validacija metode od strane jedne
laboratorije ili unutar-laboratorijska validacija potrebno je uzeti u obzir sljedece preporuke za
upotrebu ovog oblika validacije metode:
W Kad god je moguce i kada je to prakticno laboratorija treba prvenstveno da koristi metode
analize cije su karakteristike perIormansi utvrdene interlaboratorijskom studijom koja je u skladu
s medunarodnim protokolima.
W Kada takve metode nisu dostupne, metoda koja se koristi mora biti validirana u laboratoriji (in-
house validacija) prije nego sto se pocne koristiti za dobijanje analitickih podataka za korisnike
takvih rezultata.
W Postupak validacije metode od strane jedne laboratorije koji se naziva i jedno-laboratorijska
validacija zahtjeva od laboratorije odabir odgovarajucih odnosno relevantnih perIormansi
metode za karakterizaciju. Laboratorija mora voditi racuna i o zahtjevu klijenta pri izboru
perIormansi cije karakteristike treba utvrditi.
W Dokazi da su te perIormanse okarakterisane (utvrdene) moraju biti dostupni korisnicima
laboratorije ako se to zahtijeva od strane korisnika iupac, 844|.
Zbog toga je validacija metode od strane jedne laboratorije prikladna u sljedecim okolnostima:
W kada je potrebno osigurati odrzivost i samu upotrebu metode prije nego sto se pristupi
Iormalnoj medulaboratorijskoj procjeni i potvrdi
W kada je potrebno osigurati dokaze o pouzdanosti analitickih metoda, ukoliko podaci o
medulaboratorijskoj procjeni (potvrdi) nisu dostupni ili gdje nije moguce ili nije prakticno
sprovesti Iormalnu intrlaboratorijsku evaluaciju i
W kako bi se osiguralo da se novo razvijene validirane metode koriste ispravno iupac, 838|.
Potrebno je jos jednom istaci da je tokom unutar-laboratorijske validacije (in-house validacija)
vrlo vazno da laboratorija sa korisnikom rezultata tacno utvrdi i deIinise koje karakteristike
metode treba ispitati. Medutim, u mnogim situacijama ove karakteristike mogu biti i zakonski
utvrdene (npr., ostaci veterinarskih lijekova ili pesticida u hrani). Opseg validacije tih
karakteristika mora biti u skladu prvenstveno sa zakonskom legislativom. Treba napomenuti da
upotreba metoda koje su okarakterisane zajednickom studijom vise laboratorija znatno umanjuje
napore koje laboratorija treba poduzeti tokom validacionog procesa, prije rutinske eksploatacije
metode. Laboratorija koja koristi takvu metodu za koju je utvrdeno da je odgovarajuca za
odredenu namjenu, treba samo da demonstrira da je u stanju ostvariti karakteristike perIormansi
navedenih u metodi. Ukoliko je ta provjera dala potvrdne rezultate, tada takva metoda moze sa
povjerenjem biti koristena. Ta limitirana validacija u kojoj je sve to uradeno i kojom se potvrduje
da dobijene objavljene perIormanse metode mogu biti ostvarene u nasoj laboratoriji, naziva se
veriIikacijom. Takva potvrda (veriIikacija) o ispravnoj upotrebi metode je manje zahtjevnija
nego kompletna jedno-laboratorijska validacija iupac, 838|.


2.7.5. Obim ili nivo validacionog procesa
2.7.5.1. Opsti slucaj
Obim ili nivo validacije koji laboratorija mora poduzeti za nove, modiIicirane, ili nepoznate
metode zavisi od stepena njihove validiranosti i nadleznosti laboratorija odnosno od detalja
problema i postojecih dostupnih inIormacija iupac, 844|. Slika 13. ilustruje jedan pristup koji
moze biti koristen da se procijeni potrebni obim validacije i odnosi se na opsti slucaj.




















Slika 13. Jedan od nacina odlucivanja o potrebnom nivou validacije metode- neki izbori (QA,75)

Tamo gdje sumnjamo da validacija standardne metode nije adekvatna (npr. gdje se stara i slabo
validirana metoda koristi za vazno mjerenje, ili gdje se validacioni podaci odnose samo na
idealan uzorak, a metoda se koristi za realne teske uzorke), potrebna je dodatna validacija.
Generalno, minimum koji laboratorija treba da ispuni jeste da demonstrira da moze udovoljiti
zahtjevima navedenim u mjernoj speciIikaciji, cime potvrduje svoju sposobnost generiranja
adekvatnih i pouzdanih inIormacija, a sto je svrha validacionog procesa QA, 74].

oLpuno
valldlrana?
MeLoda
Cpsezne valldaclone
lnformacl[e dosLupne?
rlkupl dosLupne
lnformacl[e
krlLlcno
m[eren[e?
onovo prov[erl
zahL[eve
Zadovol[ava[uce
lnformacl[e?
kor|st| meLodu
sa pov[eren[em
8evalldacl[a
ua ne
ua
Ne
ua
Ne
ua
Ne
2.7.5.2. Obim validacije ovisno o vrsti dostupne metode i okolnosti u laboratoriji
U nastavku su date sugestije o potrebnom nivou validacionih i veriIikacionih mjera koje je
potrebno sprovesti u navedenim slucajevima koji se odnose na vrstu dostupne metode koju ce
laboratorija koristiti i promjena u laboratoriji. Osim gdje je navedeno drugacije, u svim
navedenim situacijama pretpostavlja se da je metoda namijenjena za rutinsku upotrebu.

1. aboratorifa koristi "potpuno" validiranu metodu. Obzirom da je metoda okarakterisana
interlaboratorijskom studijom, laboratorija koja koristi tu metodu, mora samo potvrditi da je
sposobna ostvariti objavljene karakteristike perIormansi metode ( ili je u stanju udovoljiti
zahtjevima analitickog problema ). Iako je rijec o "potpuno" validiranoj metodi, laboratorija
mora provjeriti preciznost, bias ( ukljucujuci i provjere varijacije matriksa), a po potrebi jos i
linearnost, dok neke karakteristike kao sto su npr. robusnost metode mogu biti izostavljene.

2. aboratorifa primfenfufe 'potpuno` validiranu metodu, ali koristi novi matriks. Obzirom da
je metoda okarakterisana interlaboratorijskom studijom, laboratorija koja ce koristiti tu metodu,
mora samo potvrditi da novi matriks ne predstavlja nove izvore gresaka u sistemu. Isti nivo ili
obim validacije je potreban kao i u prethodnom slucaju.

3. aboratorifa primfenfufe dobro okarakterisanu metodu, kofa nife interlaboratorifski
studirana. Isti nivo ili obim validacije je potreban kao i u prethodnom slucaju.

4. Metoda fe obfavlfena u naucnof literaturi, :afedno s nekim analitickim karakteristikama.
Laboratorija mora provjeriti preciznost, bias (ukljucujuci i varijacije u matriksu), robusnost i
linearnost.

5. Metoda fe obfavlfena u naucnof literaturi, be: analitickih karakteristika ili fe ra:vifena unutar
laboratorife. Potreban nivo validacije isti je kao u prethodnom slucaju.

6. Metoda fe empirifska. Empirijska metoda je ona u kojoj je vrijednost neke velicine dobijena
jednostavnim sprovodenjem postupaka navedene procedure. Ova metoda se razlikuje od ostalih
mjerenja, cija je svrha utvrdivanje vrijednosti velicina koje su neovisne o metodi kao sto su
koncentracije pojedinih analita u uzorku, u tome sto je za nju dogovoreno da je bias metode
jednak nuli, i da su varijacije u matriksu (tj., unutar dogovorenih okvira) nebitne. Medutim,
laboratorijski bias ne smije biti ignorisan, ali vjerojatno ce biti tesko ga procijeniti u toku jedno-
laboratorijskog eksperimenta. Pored toga u vecini slucajeva, reIerentni materijal vjerojatno nece
biti na raspolaganju. U nedostatku podataka interlaboratorijske evaluacije metode, neke procjene
interlaboratorijske preciznosti mogu biti dobijene iz posebno dizajniranih studija robusnosti
metode ili procijenjene pomocu Horwitz Iunkcije.

7. Anali:a fe "ad hoc". "Ad hoc" analiza je ponekad potrebna za utvrdivanje opceg raspona
vrijednosti, bez velikih izdataka i sa niskim kriterijiima. Napor koji je potrebno uloziti za
validaciju, je u skladu s tim, strogo ogranicen. Bias, u ovom slucaju, treba provjeravati
metodama kao sto su rikaveri ili metoda standarnog dodatka a preciznost ponavljanjem mjerenja.

8. !romfene u osoblfu i opremi. Vazni primjeri bitnih promjena ukljucuju: promjene u glavnim
instrumentima; nove serije vrlo osjetljivih reagenasa; promjene laboratorijskih prostorija,
metode koje se koriste prvi put od strane novog osoblja, ili validirane metode koje se uvode u
upotrebu nakon odredenog perioda nekoristenja. U ovom slucaju je vrlo bitno pokazati da ni
jedan od navedenih primjera nije prouzrokovao stetnu promjenu. Minimalna potvrda ili provjera
ispravnosti metode, koja je potrebna u ovom slucaju predstavlja testiranje biasa; dakle potrebno
je sprovesti eksperiment "prije i poslije" na tipicnom ispitnom ili kontrolnom materijalu.
Opcenito, sprovedeni testovi bi trebali odrazavati moguci uticaj promjena na analiticku
proceduru.

2.7.5.3. Obim validacije u odnosu na tip analize
Hemijske analiticke metode koriste se za ispunjavanje razlicitih svrha, od kvantiIiciranja niske
koncentracije analita pa sve do utvrdivanja identiteta materijala. S takvom raznolikoscu metoda,
logicno je zakljuciti da ce razlicite metode ispitivanja zahtijevati i razlicit obim validacije. Radi
jednostavnosti diskusije, metode ispitivanja su podijeljene u sest razlicitih vrsta, na osnovu
njihove namjene ili svrhe. Za svaku vrstu metode ispitivanja, u procesu validacije metode,
trebaju biti ukljucene samo relevantne karakteristike perIormansi. Sest vrsta hemijskih
analitickih metoda su:
1. IdentiIikacijske metode, su metode kojima se potvrduje identiIikacija analita od interesa.
2. KvantiIikacijske metode za niske koncentracija analita.
3. Metode kojima se utvrduje da li je analit prisutan iznad ili ispod speciIicirane, niske
koncentracije (obicno nazvani i limit testovi). SpeciIicirana koncentracija je blizu LOQ.
4. KvantiIikacijske metode za visoke koncentracija analita.
5. Metode kojima se utvrduje da li je analit prisutan iznad ili ispod speciIicirane, visoke
koncentracije (obicno nazvani i limit testovi). SpeciIicirana koncentracija je znatno iznad LOQ.
6. Kvalitativne metode.
Karakteristike perIormansi metode koje je potrebno odrediti tokom validacije svih sest
navedenih kategorija hemijskih ispitnih metoda predstavljeni su u Tabeli 10. Ukoliko neka od tih
karakteristika nije potrebna za validaciju onda ona nije potrebna ni za veriIikacioni process. U
Tabeli 10 'Da, znaci da karakteristika perIormanse mora biti obuhvacena validacijom dok 'Ne
znaci da ta karakteristika ne mora biti obuhvacena validacijom alacc guide, 5]. Naravno nije
bitan redoslijed parametara navedenih u tabeli. Zapravo i ne postoji dogovoreni redoslijed
odredivanja tih karakteristika. Validacija metode je slicna procesu sklapanja slagalice. Sto je vise
dijelova na mjestu to je jasnija slika. Razlika je jedino sto kod validacije svi dijelovi nisu uvijek
neophodni. Medutim, vrlo je bitno da validacija predstavlja planiranu aktivnost kako ne bi
postala beznacajna operacija QA, 77]. U konacnici obim sprovedene validacije mora osigurati
da su izvrsena odgovarajuca mjerenja, imajuci na umu nivo rizika ili nesigurnosti u rezultat koji
je prihvatljiv i za laboratoriju i za korisnika rezultata. Npr. za veoma vazna mjerenja ne postoji
alternativa rigoroznoj validaciji metode. Za mjerenja srednje vaznosti je moguce napraviti neku
skracenu provjeru ali je tada potrebno uloziti vise napora u procjenu mjerne nesigurnosti kako bi
se izaslo na kraj sa povecanjem ukupne nesigurnosti.
Tabela 10. Parametri perIormansi bitnih za validaciju razlicitih tipova analize
Vrsta metode
Niska konc. Niska konc. Visoka konc. Visoka konc.
Karakteristika

analita analita analita analita

performanse dentifikacija 1 Kvantitativna 2 Limit test 3 Kvantitativna 4 Limit test 5 Kvalitativna 6
@acnosL
ne
ua ne ua ua ne
reclznosL
ne
ua ne ua ua ne
SpeclflcnosL
ua
ua ua ua ua ua
LCu
ne
ua ua ua/ne ne ne
LCC
ne
ua ne ua/ne ne ne
8obusnosL
ne
ua ne ua ne ne
LlnearnosL/
ne
ua ne ua ne ne
8adno podruc[e
ne
ua ne ua ne ne


Odluku o vaznosti provjere pojedinih parametara metode treba da donese laboratorija u dogovoru
sa korisnikom rezultata, ukoliko to nije adekvatno navedeno u zahtjevima mjerne speciIikacije.
Takode jasno je da se nivo vaznosti moze promijeniti sa vremenom i da ce biti potreban dodatni
posao tamo gdje se poveca znacaj nekog parametra. Postojace i slucajevi kada je potrebno
napraviti izvjesnu modiIikaciju metode zbog promjena u nacinu poslovanja laboratorije ili zbog
prilagodavanja laboratorije malo drugacijoj aplikaciji, npr. metoda se koristi od strane druge
laboratorije, za sire koncentraciono podrucje nego sto je predvideno. U takvim situacijama
potpuna validacija nije potrebna, ali je potrebno napraviti odredenu provjeru koristeci prethodno
okarakterisane uzorke ili reIerentne materijale odgovarajuceg matriksa. Parametre koje je tada
potrebno analizirati su preciznost, bias, linearnost, i ako je neophodno limit detekcije. Te
promjene se mogu odnositi na zamjenu jedne metode drugom, npr. recimo promjena sa GC-FID
na GC-MS tehniku. U situacijama kada ne postoje nikakvi podaci o validaciji metode, tada je
potrebno sve relevantne parametre metode ispitati. Ozbiljnost i sam pristup koji ce biti
primjenjeni prilikom tih ispitivanja zavisice od vaznosti mjerenja kao i od dostupnosti podataka
o validaciji slicnih metoda. Moguce su i situacije kada laboratorija vec duze vrijeme koristi
metodu, koja zadovoljava kriterije, a da ne postoje dokumenti koji demonstriraju perIormanse
metode. U ovom slucaju izgleda nelogicno raditi punu revalidaciju kada se metoda uspjesno
primjenjuje vec npr. nekoliko godina. Medutim, potreba za objektivnim dokazima sprijecava da
se validacija takvih metoda ne uradi QA, 74].

2.7.6. Validacioni alati
U nastavku su dati validacioni alati pomocu kojih je moguce odrediti parametre perIormansi
metode:
1. $lifepe probe. Upotrebom raznih tipova slijepih proba omoguceno je odredivanje dijela
mjernog signala koji je posljedica prisustva mjerenog analita i dijela koji je posljedica prisustva
interIerirajucih supstanci u matriksu. Analiticaru su dostupni razliciti tipovi slijepih proba:

1.1. $lifepe probe reagenasa. Reagensi koristeni tokom analitickog procesa (ukljucujuci i
rastvarace koristene u procesu ekstrakcije ili digestije) odvojeno se analiziraju primjenom
identicnih koraka koji su se koristili tokom analize uzorka, kako bi se utvrdio njihov doprinos
mjernom signalu. Nakon utvrdivanja tog doprinosa mjerni signal proistekao samo zbog prisustva
analita moze tada biti odreden.

1.2. $lifepe probe u:oraka. Ovaj vid slijepe probe predstavlja matrikse ispitnih uzoraka koji ne
sadrze samo mjereni analit. Vrlo tesko ih je dobiti odnosno obicno su nedostupni, ali ovaj vid
slijepe probe je neophodan ukoliko se zeli dobiti realna procjena interIerencija koje bi se pojavile
tokom analize ispitnih uzoraka.

2. Ispitni/testni materifali. Ispitni materijali napravljeni od realnih uzoraka su korisni zbog
dobijanja mnogih inIormacija kao npr. o interIerencijama i dr. koje bi se realno pojavljivale u
svakodnevnom radu. Ukoliko je stvarni sadrzaj analita u ispitnom mmaterijalu poznat ili utvrden
tada takav materijal moze biti koristen kao sredstvo kojim se utvrduje tacnost metode. Medutim,
odrediti stvarnu vrijednost sadrzaja analita je obicno tesko odnosno prakticno nemoguce osim
ako ne postoji mogucnost upotrebe drugih metoda za koje se zna ili je utvrdeno da imaju
zanemariv bias.

3. Obogaceni materifali/rastvori. To su materijali ili rastvori koji su spajkovani odnosno u koje
je dodat analit od interesa. Obogacivanje se obicno vrsi metodom spajkovanja. Ti materijali ili
rastvori mogu u svom sastavu vec sadrzavati analit od interesa pa je potrebna posebna paznja pri
dodavanju tog analita jer bi se moglo desiti da dodata kolicina zajedno sa vec prisutnim analitom
bude izvan koncentracionog podrucja primjenljivosti date metode. Dodavanjem poznate kolicine
analita dolazi do povecanja mjernog odziva analita, koji je moguce izmjeriti za dodatu kolicinu
(pretpostavljajuci 100 rikaveri) cak iako tacne kolicine analita prije i poslije dodavanja nisu
poznate. Treba imati na umu da se kod mnogih metoda dodatka dodaje analit na takav nacin da
on nece u konacnici imati isti odnos sa matriksom uzorka kakav bi imao da se prirodno
pojavljuje. Zbog toga se za rikaveri procjene dobijene dodatkom analita moze ocekivati da budu
nerealne.

4. Materifali :a spafkovanfe. Dosta su slicni materijalima za obogacivanje i zaista u nekim
slucajevima ovi termini se medusobno preplicu. Spajkovanje nije ograniceno ili ne odnosi se
samo na analit od interesa. Ono moze predstavljati bilo sta dodano uzorku kako bi se izmjenio ili
odredio eIekat dodatka. Npr. uzorak moze biti spajkovan sa razlicitim kolicinama odredene
interIerirajuce supstance kako bi se procijenilo koja koncentracija te supstance utice na
odredivanje analita. Dakle, piroda spajka ocigledno treba biti identiIikovana.

5. Ne:avisno okarakterisani materifali. Vrlo je tesko odrediti bias metode bez znanja stvarnog
sadrzaja analita u ispitnom materijalu. Ukoliko je supstanca okarakterisana drugim nacinom ili
sredstvima, npr. metodom za koju je utvrdeno da ima zanemariv bias tada ta supstanca moze biti
koristena kao reIerentni materijal, a odgovarajuca usporedba moze biti napravljena kako bi se
odredio ili utvrdio bias metode koja se istrazuje.
6. Mferni) $tandardi. U ovom slucaju potrebna je obazrivost kada se govori o standardima jer
se termin standard obicno odnosi na pisane standarde kao sto su ISO standardi. Kada se taj
termin odnosi na supstance koristene za kalibracione ili identiIikacione svrhe adekvatan naziv u
tom slucaju je mjerni standardi ili kalibracioni standardi. Oni su se tradicionalno shvatali kao
rastvori jedne supstance ali u praksi to moze biti bilo koja supstanca ciji je odredeni parameter ili
osobina okarakterisana do te mjere da bi se mogla koristiti za reIerentne ili kalibracione svrhe.
Izraz standardno ukljucuje stavke u kojima se moze kalibrirati odredeni raspon Iizickih
parametara (npr. kalibracija termometra). Ovdje se strogo radi o Iizickim standardima.

7. Referentni materifali. Uobicajena je zabuna izmedu reIerentnog i certiIicirano reIerentnog
materijala. ReIerentni materijal moze biti skoro svaki materijal koji je koristen kao reIerentna
osnova, i moze se odnositi na laboratorijske reagense poznate cistoce, industrijske hemikalije, ili
druga sredstva. Osobina ili analit od interesa treba biti stabilan i homogen ali takvav materijal ne
mora imat visok nivo karakterizacije, sljedivosti i certiIikat jer su to osobine koje su
karakteristika CRM.

8. Certificirani Referentni Materifal CRM). Karakterizacija parametara od interesa kod CRM je
generalno mnogo strozije zahtjevano nego kod RM i kao dodatak o okarakterisanoj vrijednosti
izdaje se certiIikat sa navedenom izjavom o nesigurnoscu od strane poznate reIerentne
institucije. Karakterizacija se obicno vrsi pomocu nekoliko razlicitih metoda, kako bi se koliko je
to god moguce, bilo kakav bias tokom tog procesa smanjio ili cak eliminisao.

9. $tatistika. Statistika je korisna pri analizi varijabilnosti koja je sastavni dio analitickog
mjerenja. Analiticari trebaju biti upoznati sa barem nekoliko osnovnih elemenata statisticke
teorije, prvenstveno radi lakseg odredivanja nekih parametara kao sto su tacnost, preciznost,
linearno podrucje, LOD, LOQ, i mjerna nesigurnost.

10. !onavlfanfe. Ispravno koristeno daje analiticaru vise inIormacija o bitnoj statistici koja je
potrebna za odredeno mjerenje. Eksperimenti koji ukljucuju ponavljanja tokom analize trebaju
biti dizajnirani tako da uzmu u obzir sve varijacije u uslovima izvodenja tih operacija a koji se
mogu ocekivati tokom rutinske upotrebe metode. Cilj je da se odrede tipicne a ne minimalne
varijacije |eurachem, 31|.

2.7.7. Upotreba validiranih metoda
Pri koristenju necije metode bilo da se radi o metodi razvijenoj unutar druge laboratorije,
objavljenij metodi, ili cak o standardnoj ili regulatornoj metodi potrebno je razmotriti dvije
stvari. Prvo, da li su postojeci validacioni podaci adekvatni za odredenu svrhu ili je dodatna
validacija neophodna. Drugo, ukoliko su postojeci podaci adekvatni da li je laboratorija
sposobna da ostvari navedene perIormanse metode. Drugim rijecima da li je analiticar dovoljno
kompetentan? Da li su dostupna oprema i prostor adekvatni? Ukoliko je metoda validirana
sveobuhvatnim provjerama u svim ekstremnim radnim uslovima, tada ce novi kompetentan
analiticar vjerovatno zadovoljavajuce vrsiti svoju duznost unutar postojecih podataka
perIormansi, iako je zapravo mnogo relevantnije provjeriti perIormanse analiticara u odnosu na
zahtjeve analiticke speciIikacije, nego u odnosu na postojece objavljene podatke. Bez obzira, to
je ono sto bi u najmanju ruku uvijek trebalo provjeriti. Vazan je nivo perIormansi koje analiticar
moze ostvariti u datom trenutku a ne sta su drugi analiticari postigli u proslosti. Obicno,
standardne metode su uglavnom produkt nekog oblika medulaboratorijskih studija i
standardizacijska tijela koja ih produkuju obicno imaju statisticke strucnjake kako bi se osigurali
da su validacione studije pravilno dizajnirane, izvedene i evaluirane. Nivo validacije metoda se
stalno poboljsava ali je i dalje opasno ili neozbiljno pretpostaviti da samo zato sto je metoda
standardna znaci da je objavljena validacija adekvatna. Isto tako, cesto se pretpostavlja da se
standardne metode mogu direktno koristiti u laboratoriji i da se objavljeni podaci o
perIormansama mogu odmah postici od strane bilo koga ko koristi tu metodu. To nije sigurna
pretpostavka. Cak i oni koji su upoznati ili su strucnjaci u odredenom polju hemije na koje se
metoda odnosi moraju dosta vjezbati prije nego sto postanu potpuno vjesti ili uspjesni u
koristenju metode |eurachem, 33|.

2.7.8. Parametri performansi metode
U daljnem tekstu, bit ce opisani parametri perIormansi koji karakteriziraju metodu analize i koji
prema tome deIinisu prikladnost metode za planiranu svrhu analize, sa kvantitativnog aspekta.
Tipicni parametri perIormansi metode, koji se obicno odreduju tokom procesa validacije su:
selektivnost, preciznost, bias, linearnost, radno podrucje, limit detekcije, limit kvantiIikacije,
kalibracija i robusnost. Sustina validacionog procesa je upravo u odredivanju vrijednosti
navedenih parametara da bi se potvrdilo da su zadovoljeni kriteriji perIormansi koje laboratorija
mora ostvariti kako bi datu metodu mogla primjeniti sa pouzdanjem za rutinsku upotrebu. U
prakticnom smislu ti kriteriji se deIinisu kao vrijednosti relevantnih parametara perIormansi, npr.
preciznosti i tacnosti, ostvarene pri rutinskoj upotrebi metode u laboratoriji, na osnovu kojih bi
bilo moguce potvrditi da metoda odgovara svojoj namjeni i da generira pouzdane podatke.
Validacione provjere treba da uzmu u obzir sve Iaze eksperimenta, kroz koje prolazi uzorak, od
njegove pripreme, ekstrakcije pa sve do analize kao sto je i slucaj tokom rutinske primjene
metode alacc, 22].
2.7.8.1. Selektivnost
Jedan od ciljeva validacije metode jeste i potvrdivanje da je jedino analit od interesa zapravo
izmjeren. Stepen do kojeg metoda moze nedvosmisleno detektovati i odrediti odredeni analit u
smjesi, bez interIerencija drugih komponenata u smjesi, naziva se selektivnost ili speciIicnost.
SpeciIicnost se opcenito posmatra kao 100 selektivnost ali taj dogovor nije univerzalan QA,
78]. Ova karakteristika metode je predominantno Iunkcija upotrijebljene mjerne tehnike (Slika
14), ali moze varirati ovisno o vrsti supstance ili matriksa EC]. U nekim podrucjima mjerenja
ovi izrazi se naizmjenicno koriste i to moze uzrokovati odredenu konIuziju. Selektivnost je izraz
koji se preporucuje za upotrebu u analitickoj hemiji za izrazavanje stepena do kojeg odredena
metoda moze biti upotrijebljena za odredivanje analita, u datim uslovima, u prisustvu
komponenata slicnog ponasanja. Selektivnost se utvrduje mjerenjem jedinstvenog svojstva
analita, kao sto je apsorbanca na tacno speciIiciranoj talasnoj duzini i odvajanjem analita od
ostalih supstanci prisutnih u uzorku. Ukoliko selektivnost nije adekvatno provjerena tokom
razvoja metode, potrebno je analizirati uzorke u rasponu od cistog mjernog standarda
spajkovanog sa potencijalnim interIerentom, pa sve do kompozicije smjese koja odgovara
kompoziciji stvarnog uzorka.

















Slika 14. Zavisnost selektivnosti analize od upotrijebljene mjerne tehnike

Ozbiljne interIerencije treba ukloniti, ali manji uticaji mogu biti tolerisani i ukljuceni u procjenu
biasa metode i njegove odgovarajuce nesigurnosti. Za kompleksne tipove uzorka, ukoliko postoji
bilo kakva sumnja koja se odnosi na sposobnost metode da nedvosmisleno identiIikuje i izmjeri
analit od interesa, takvu metodu je potrebno provjeriti upotrebom odgovarajuceg matriks
reIerentnog materijala, ili ispitati uzorak upotrebom alternativne validirane metode QA, 78]. U
vecini slucajeva moze biti neprakticno razmatrati ili ispitati svaku potencijalnu interIerirajucu
komponentu u smjesi. U takvim situacijama preporucljivo je da se provjere moguci najgori
slucajevi. Opci princip je da selektivnost bude dovoljno dobra da bi se bilo kakva interIerencija
mogla ignorirati iupac, 844|. Selektivnost i speciIicnost su parametri koji su primjenljivi i na
kvantitativne i kvalitativne analize. Selektivnost u kvalitativnoj analizi se deIinise kao obim do
kojeg druge supstance interIeriraju pri odredivanju analita prema datoj proceduri. Selektivnost u
kvantitativnoj analizi se deIinise kao termin koji se koristi u sprezi sa jos jednom materijalnom
velicinom (npr. konstanta, koeIicijent, indeks, Iaktor, broj) za kvantitativnu karakterizaciju
interIerencija |eurachem, 49|. U tom smislu, kvantitativna mjera je i indeks selektivnosti
predstavljen kao b
an
/b
int
, gdje je b
an
osjetljivost metode (nagib kalibracione krive) a b
int
nagib
odziva koji je karakteristika samo potencijalnog interIerenta, koji predstavlja kvantitativnu mjeru
interIerencije. b
int
moze biti priblizno odredeno sprovodenjem kroz proceduru slijepe probe
matriksa i slijepe probe matriksa spajkovane sa odredenom koncentracijom potencijalnog
interIerenta. Ukoliko je slijepa proba matriksa nedostupna, a umjesto njega koristen neki tipicni,
priblizno odgovarajuci materijal, b
int
moze biti odredeno i iz takvog jednostavnog eksperimenta
SelekLlvnosL
vagan[e
klsellnsko
bazna LlLracl[a
SpekLrofoLomeLrl[a
Lu@A LlLracl[a
PromaLografl[a
CCMSMS
neuLron akLlvacl[ska
anallza
SpeclflcnosL
vlsoka Sredn[a nlska
samo pod pretpostavkom da su uzajamni opci eIekti matriksa odsutni iupac, 844|. Ukoliko su
prisutne interIerencije koje ili nije moguce odvojiti od analita, ili su u pitanju interIerencije za
koje analiticar nije svjestan, tada ce takve interIerencije imati nekoliko eIekata. Ovisno o tome
kako je identitet analita utvrden interIerencije mogu omesti potvrdivanje identiteta, npr.
iskrivljavanjem signala koji dolazi od analita. One takode mogu uzrokovati eIekte prividnog
povecanja koncentracije analita doprinoseci povecanju signala koji se pripisuje analitu, (ili
obrnuto doprinose smanjenju koncentracije analita ukoliko doprinose povecanju negativnog
signala). InterIerencije obicno uticu na nagib kalibracione krive drugacije nego analit, pa ce zbog
toga nagib kalibracione krive u metodi dodatka mozda uticati na linearnost krive. Ovaj eIekt ima
potencijal da indicira moguce prisustvo skrivene interIerencije, ali nije od neke koristi ukoliko je
rikaveri kriva sama po sebi nelinearna. Selektivnost metode se obicno ispituje studiranjem njene
sposobnosti da izmjeri analit od interesa u ispitnim uzorcima u koje su namjerno uvedene
speciIicne interIerencije (za koje se pretpostavlja da su prisutne u realnim uzorcima). U
slucajevima kada nije poznato da li su ili nisu interIerencije vec ptisutne, selektivnost odredene
metode moze biti razmatrana proucavanjem njene sposobnosti da izmjeri analit u poredenju sa
drugim nezavisnim metodama/tehnikama |eurachem, 14|.

2.7.8.2. Preciznost
Preciznost se koristi za opisivanje reproduktivnosti rezultata i moze se deIinisati kao bliskost
slaganja izmedu nezavisnih mjernih rezultata dobijenih pod identicnim mjernim uvjetima. Pod
'nezavisnim mjernim rezultatima svrstavaju se rezultati dobijeni na takav nacin da na njih ne
utice bilo kakav prethodni rezultat koji se odnosi na isti ili slican ispitni predmet |eurachem,
45|. Procjene preciznosti su kljucni parametri perIormansi metode a takoder su potrebni kako bi
se izveli i drugi aspekti validacije metode, kao sto su studije biasa i robusnosti QA, 82].
Preciznost i bias uticu na rezultat mjerenja kao sto je prikazano na Slici 15.







9obo|[san[e prec|znost|
Slika 15. Preciznost i bias
bias
S
m
a
n
j
i
v
a
n
j
e

b
|
a
s
a


U numerickom smislu, visoka vrijednost preciznosti indicira razbacanost rezultata, tj. slabu
preciznost QA, 57]. Zbog toga se preciznost obicno izrazava u smislu nepreciznosti i racuna se
kao standardna devijacija (s), relativna standardna devijacija (RSD), ponekad nazvana i kao
koeIicijent varijacije (CV), i standardna devijacija srednje vrijednosti (SDM) odredenog broja
ponovljenih mjerenja QA, 78]. Preciznost zavisi samo od distribucije slucajnih gresaka i ne
odnosi se na stvarnu vrijednost. Kvantitativna mjera preciznosti striktno ovisi od promjenljivosti
uslova tokom mjerenja QA, 57], odnosno od promjenljivosti mnogih Iaktora, ukljucujuci i broj
parametara koji se mijenjaju tokom studija preciznosti i nivoa promjena u radnim uslovima kao
sto je prikazano na Slici 16.







Slika 16. EIekti variranja uslova tokom validacionih studija
Zbog toga studije preciznosti treba izvoditi u istovjetnim uslovima koji vladaju tokom rutinske
upotrebe metode. Individualni izvori nepreciznosti kao sto su promjeme operatora ili tipa
instrumenta mogu biti studirane ali se obicno dva tipa ukupne preciznosti procjenjuju, tj.
preciznost u uslovima ponovljivosti i u uslovima reproducibilnosti QA, 79]. Ponovljivost (r) je
vrijednost ispod koje se moze ocekivati da se nalazi, sa deIinisanom vjerovatnocom; u odsustvu
drugih indikacija koristi se vjerovatnoca od 95 , apsolutna razlika izmedu dva rezultata analize
koji su dobijeni upotrebom iste metode na identicnom ispitnom materijalu u istim uslovima
analize (isti operator, ista aparatura, ista laboratorija i kratak vremenski interval izmedu
ponovljenih mjerenja) QA, 57]. Standardna devijacija ponovljivosti, s

, deIinise se kao
standardna devijacija rezultata mjerenja dobijenih u uslovima ponovljivosti. Ona predstavlja
mjeru disperzije pri distribuciji mjernih rezultata u uslovima ponovljivosti. Slicno gore
navedenom 'varijansa ponovljivosti i 'koeIicijent varijacije ponovljivosti mogli bi se deIinisati
i koristiti kao mjera disperzije mjernih rezultata u uslovima ponovljivosti |eurachem, 48|.
Ponovljivost je mjera kratkotrajnih varijacija u mjernim rezultatima i predstavlja vrstu
preciznosti koju je vrlo cesto lahko odrediti. Obicno se koristi za utvrdivanje uskladenosti sa
kriterijima perIormansi metode. Iako je ponovljivost odnosno s

, koristan parametar perIormanse

metode ona sama ne moze biti pokazatelj distribucije rezultata koja se moze ocekivati tokom
dugorocnog perioda QA, 79]. Pomocu standardne devijacije ponovljivosti

ili s

moguce je
izracunati 'limit ponovljivosti r koji omogucava analiticaru da odluci da li je razlika izmedu


o

|zmedu
|aborator|[a
keproduc|b||nost
|zmedu ser|[a unutar ser|[a
(para|e|ke)
|zmedu
oc|tan[a
ponov|[|vost
paralelnih analiza uzorka, koje se obavljaju u uslovima ponovljivosti, znacajna |eurachem, 26|.
Limit ponovljivosti 'r se deIinise kao vrijednost, za koju se ocekuje sa 95 vjerovatnocom, da
bude manja ili jednaka apsolutnoj razlici izmedu dva rezultata dobijena u uslovima ponovljivosti.
Racuna se pomocu Iormule:
r t
v,u
s
r
(2.7.1.)
gdje je t
v,u
Studentova t- vrijednost za v stepeni slobode a u se odnosi na navedenu vjerovatnocu,
s

je standardna devijacija ponovljivosti. Za v , u 95 vrijednost Studentovog koeIicijenta

t 1,960 |eurachem, 48|. Reproducibilnost (R) je vrijednost ispod koje se moze ocekivati da
se nalazi, sa deIinisanom vjerovatnocom; u odsustvu drugih indikacija koristi se vjerovatnoca od
95 , apsolutna razlika izmedu dva rezultata analize koji su dobijeni upotrebom iste metode na
identicnom ispitnom materijalu u razlicitim uslovima analize (drugi operator, razlicita
aparatura, razlicite laboratorije i/ili razliciti vremenski intervali izmedu ponovljenih mjerenja)
QA, 57]. Standardna devijacija reproducibilnosti (obnovljivosti), s
R
, deIinise se kao standardna
devijacija rezultata mjerenja dobijenih u uslovima reproducibilnosti. Ona predstavlja mjeru
disperzije pri distribuciji mjernih rezultata u uslovima reproducibilnosti. Slicno gore navedenom
'varijansa reproducibilnosti i 'koeIicijent varijacije reproducibilnosti mogli bi se deIinisati i
koristiti kao mjera disperzije mjernih rezultata u uslovima reproducibilnosti |eurachem, 48|.
Pomocu
R
ili s
R
moguce je izracunati 'limit reproducibilnosti R koji omogucava analiticaru da
odluci da li je razlika izmedu paralelnih analiza uzorka, koje se obavljaju u uslovima
reproducibilnosti, znacajna |eurachem, 27|. Limit reproducibilnosti 'R se deIinise kao
vrijednost, za koju se ocekuje sa 95 vjerovatnocom, da bude manja ili jednaka apsolutnoj
razlici izmedu dva rezultata dobijena u uslovima reproducibilnosti. Racuna se pomocu Iormule:
R t
v,u
s
R
(2.7.2.)
gdje je s
R


je standardna devijacija u uslovima reproducibilnosti izracunata iz (v 1) rezultata,
dok ostali clanovi ove jednacine imaju ista znacenja kao u jednacini 2.7.1. |eurachem, 48|.
Reproducibilnost je vrsta preciznosti koja se odnosi na situaciju kada su se okolinski uslovi i
ostali Iaktori tokom mjerenja promijenili i rezultati su obicno dobijeni u razlicitim laboratorijama
i vremenima QA,80]. Srednja ili unutar-laboratorijska preciznost je cesto mnogo vaznija u
odnosu na prethodna dva tipa preciznosti jer ona izrazava unutar-laboratorijske varijacije ili
unutar-laboratorijsku reproducibilnost (razliciti dani, razliciti analiticari, razlicita oprema , itd.)
QA, 58]. Ovaj tip preciznosti je izraz koji je cesto koristen za opisivanje podataka dobijenih
tokom duzeg perioda u jednoj laboratoriji. Moguce je, medutim, brze procijeniti srednju
preciznost namjerno mijenjajuci uslove (analiticare, instrumente, itd.) a zatim izvrsiti analizu
varijance (ANOVA test) QA, 80]. Sto je veci broj ponovljenih mjerenja izvrsen za procjenu
preciznosti, to je vece povjerenje u procjenjenu preciznost, ali to povjerenje se neznatno mijenja
nakon napravljenih 15 mjerenja. Svako mjerenje treba da bude 'nezavisno jedno od drugog.
Npr. treba odvagati zasebno svaku porciju uzorka, rastvoriti, ekstrahovati, itd. Obicno nije
dovoljno vrsiti ponavljanje mjerenja jednog te istog pripremljenog ispitnog rastvora. Da bi se
utvrdila i preciznost metode i preciznost mjerenja potrebno je izvesti ponovljanje mjerenja na
nekoliko nezavisnih ispitnih porcija. Za vecinu svrha, dva (ili radije tri) istovremena
mjerenja izmedu sedam i petnaest nezavisnih mjernih porcija bit ce dovoljno. Tamo gdje je
vecina nepreciznosti u Iinalnoj mjernoj Iazi, obim radne opterecenosti moze biti reduciran, bez
ozbiljnog narusavanja kvaliteta procijenjene preciznosti, smanjenjem broja ispitnih porcija i
povecanjem broja ponovljenog mjerenja za svaki ispitni rastvor. Studije preciznosti treba da se
izvode u radnim uslovima koji su vjerna kopija uslova koji preovladavaju tokom rutinske
upotrebe metode. Npr. spektar radnih uvjeta, kao sto su promjene temp. u laboratoriji treba da
odrazavaju promjene koje bi se pojavile u praksi. Zavisnost preciznosti od koncentracije analita
takode treba utvrditi. Standardna devijacija ne mora biti konstantna za odredeno koncentraciono
podrucje ali je cesto RSD (CV) priblizno konstantna za sire koncentraciono podrucje. Upravo
zbog toga se ovaj vid prikazivanja preciznosti (CV) i primjenjuje u mnogim slucajevima.
Odredivanje prihvatljivih vrijednosti pojedinih parametara perIormansi je znatno olaksano kada
su potrebni nivoi tih parametara zakonski deIinisani QA, 80]. Evropska unija implementirajuci
Direktivu Vijeca 96/23/EC je Odlukom Komisije iz avgusta 2002 godine, izmedu ostalog na
strani L221/15 u odjeljku 2.3.2 identiIicirala dodatne kriterije perIormansi i druge zahtjeve za
kvantitativne metode analize. Njihove preporuke za preciznost kvantitativnih analitickih metoda
u odnosu na koncentraciju analita koja se odreduje prikazane su u Tabeli 11.

Tabela 11. Zahtjevana preciznost za kvantitativne metode analize u uslovima reproducibilnosti u
odnosu na koncentracijsko podrucje

Sadrza[ (g kg
1
(frakcl[a mase)) 8eproduclbllnl Cv ()
1
(433)
a

10 (32)
a

100 23
1000 ( 1 mg kg
1
) 16




Postotak medulaboratorijskog koeIicijenta varijacije (CV) za ponovljene analize reIerentnog
ili spajkovanog materijala (rastvora), u uslovima reproducibilnosti, ne smije prelaziti vrijednosti
u Tabeli 11, izracunate pomocu Horwitz jednacine koja je data izrazom:

% = 2
(1- .5 g C)
ili s
R
= 0.02 C
0.8459
(2.7.3.)

gdje je s
R
medulaboratorijska standardna devijacija reproducibilnosti a C je Irakcija mase
koncentracija (g g
-1
) izrazena kao eksponent baze 10 ( npr. 1 mg/g 10
-3
, 1 mg/kg 10
-6
, log C
- 6 ) i :
%CV = 100 x
s
R
C
(2.7.4.)
Primjeri tih granicnih vrijednosti su navedeni u Tabeli 11. Navedene vrijednosti u Tabeli 11
odnose se na rasipanje rezultata koje se ocekuje kada se navedeni uzorak analizira u nekoliko
razlicitih laboratorija. Za analize koje su izvedene u uslovima ponovljivosti (isti operator, ista
a
Za koncentracije manje od 100 g kg
1
[ednaclna (273) da[e vrl[ednosLl Cv
ko[e su neprlhvaLl[lvo vlsoke Zbog Loga vrl[ednosLl Cv Lreba da budu sLo [e
moguce man[a
oprema itd.), unutar laboratorijski CV bi obicno trebao imati vrijednosti izmedu jedne polovine
(1/2) i dvije trecine (2/3) vrijednosti navedenih u Tabeli 11. Za analize izvedene u uslovima
unutar-laboratorijske reproducibilnosti, CV ne bi trebao biti veci od reproducibilnog CV za
navedene koncentracije u Tabeli 11. U slucaju supstanci koje imaju deIinisane dozvoljene
granice, unutar-laboratorijska reproducibilnost koju metoda mora ostvariti ne smije biti veca od
odgovarajuceg CV u uslovima reproducibilnosti za koncentraciju 0.5 x dozvoljena granica
EC]. Upotreba jednacine (2.7.3.) za niske koncentracije (100 g kg
-1
) daje nerealno visoke
(precijenjene) laboratorijske perIormanse odnosno preciznost, kao sto je i navedeno u tabeli 11.
Medutim, savremeni model koji se bazira na rezultatima iz sema za ispitivanje strucnosti
laboratorija pokazuje da je ta veza izmedu koncentracije i preciznosti najbolje predstavljena
ukoliko se koriste sljedece tri jednacine koje pokrivaju podrucje od niskih do visokih
koncentracija, kao sto je prikazano u jednacini (2.7.5.). Izraz u sredini predstavlja originalnu
jednacinu (2.7.3.):


R
=


Zog toga je u slucajevima niskih koncentracija analita (100 g kg
-1
) za utvrdivanje preciznosti
potrebno koristi umjesto jednacine (2.7.3.) neku od jednacina prikazanih u jednacini (2.7.5)
ovisno o koncentraciji analita, kako se ne bi dobile nerealno visoke vrijednosti.

2.7.8.2.1. Standardna devijacija
Standardna devijacija (o) je najbolje mjerilo preciznosti dobijenih rezultata, odnosno preciznosti
metode. U distribuciji vrijednosti mjerenja ona predstavlja velicinu koja pokazuje nacin na koji
su pojedinacne vrijednosti mjerenja dispergovane oko srednje vrijednosti ukupnog broja datog
mjerenja. Izracunava se prema jednacini:
=
_
_ (x

- )
2 n
=1
N
( 2.7.6.)
Ova jednacina je striktno primjenljiva samo u slucaju ako se radi o beskonacno velikom broju
mjerenja iste velicine cija je srednja vrijednost . U praksi se, medutim, redovno vrsi ogranicen
broj mjerenja, a srednja vrijednost tog ogranicenog broja mjerenja je , i ne postoji garancija da
ce i biti identicni. Zato se, za razliku od o, kod ogranicenog broja eksperimentalnih mjerenja
za standardnu devijaciju takvog niza mjerenja uvodi drugi znak, s, i ona se izracunava pomocu
jednacine:
s =
_
_ (x

- x)
2 n
=1
n-1
(2.7.7.)
Velicina (n-1) u imeniku u jednacini (2.7.7.) naziva se brojem stepena slobode, uobicajeno
predstavljena u statistickim tablicama parametrom v (grcko slovo, izgovara se 'nu) Savic,
453]. U principu broj stepeni slobode predstavlja broj napravljenih mjerenja (n) koji je umanjen
za broj parametara procijenjih iz tih mjerenja. U slucaju standardne devijacije ogranicenog broja
0.22 c, ukoliko je c 1.2 x 10
-7

0.02 c
0.8495
, ukoliko je 1.2 x 10
-7
_ c _ 0.138 (2.7.5)
0.01 c
0.5
, ukoliko je c ~ 0.138
mjerenja, npr. v n-1 obzirom da je srednja vrijednost ( koja je upotrijebljena u racunanju s) vec
procijenjena iz istih podataka QA, 144]. Standardna devijacija s je, prema tome, samo procjena
prave standardne devijacije o, kao sto je i srednja vrijednost procjena stvarne vrijednosti .
Povecanjem broja napravljenih mjerenja, s o, a . Kada je broj odredivanja veci od 25-
30, izracunata s je izvrsna aproksimacija za o Savic, 453].

2.7.8.2.2. Relativna standardna devijacija (RSD) i KoeIicijent varijacije (CV)
Relativne mjere rasipanja podataka se obicno koriste narocito tamo gdje je, npr. uoceno
povecanje rasipanja rezultata sa koncentracijom analita. Relativna standardna devijacija (RSD) je
mjera rasipanja tih podataka u odnosu na njihovu srednju vrijednost i data je izrazom:
RSD =
s
x
(2.7.8.)
RSD se ponekad naziva i koeIicijentom varijacije (CV) i obicno se izrazava u postotcima:
%RSD = %CV = 100 x
s
x
(2.7.9.)
2.7.8.2.3. Standardna devijacija srednje vrijednosti
Standardna devijacija srednje vrijednosti, s( ) je mjera disperzije srednjih vrijednosti i izrazava
se kao:
s ( ) =
s
n
(2.7.10.)
gdje je s standardna devijacija ogranicenog broja mjerenja, a n je broj izvedenih mjerenja.
Utvrdeno je da standardna devijacija srednjih vrijednosti postaje manja kako se broj mjerenja, n,
za svaki seriju povecava. Standardna devijacija srednje vrijednosti uvijek ce biti manja od s za
J puta, gdje je n broj napravljenih mjerenja QA, 145].

2.7.8.2.4. Postupak za procjenu preciznosti u uslovima ponovljivosti

Preciznost u uslovima ponovljivosti (isti analiticar, oprema, laboratorija, kratak vremenski
razmak izmedu ponovljenih mjerenja) odreduje se tako sto se analiziraju: standardi, reIerentni
materijali ili slijepe probe uzorka koje su spajkovane razlicitim koncentracijama analita u odnosu
na radno podrucje. Potrebno je napraviti deset nezavisnih ponavljanja mjerenja a iz dobijenih
podataka izracunati standardnu devijaciju (s) svakog mjerenja. Na taj nacin se odreduje
standardna devijacija ponovljivosti (s

) svakog mjerenja, koja se racuna prema jednacini (2.7.7.)

|eurachem, 26|.

2.7.8.3. Tacnost
Tacnost se obicno koristi da bi se opisala ukupna sumnja u mjerni rezultat QA,58]. Postoji
veliki broj deIinicija koje se odnose na ovaj termin, a razlikuju se samo u detaljima. Prema
VIM
3
-u tacnost se deIinise kao bliskost slaganja izmedu izmjerene vrijednosti i stvarne
vrijednosti mjerene velicine. Za razliku od preciznosti koja se moze izraziti sa potpunom

3
lnLernaLlonal vocabulary of meLrology (vlM)
sigurnoscu, ako se napravi jedna serija mjerenja iste mjerene velicine na identican nacin, tacnost
nije moguce izraziti sa potpunom sigurnoscu jer je za to potrebno poznavati stvarnu vrijednost
mjerene velicine. Obzirom da stvarnu vrijednost mjerene velicine prakticno nije moguce utvrditi,
uvodi se koncept, prihvacene stvarne vrijednosti ili reIerentne vrijednosti, koji je rezultat
dogovora. Zbog toga prethodna deIinicija tacnosti dobija prakticni smisao ako kazemo da je
tacnost bliskost slaganja izmedu izmjerene vrijednosti mjerene velicine i prihvacene stvarne ili
reIerentne vrijednosti mjerene velicine |eurachem, 39|. Mogli bi zakljuciti iz prethodnog da je
jedina ispravna upotreba ovog termina kada se koristi u kontekstu jednog rezultata. Termin
'tacnost kada se odnosi na seriju vrijednosti mjerene velicine, opisuje posljedice kombinovanja
slucajnih varijacija i uobicajene sistematske greske ili komponente biasa QA,58]. U tom slucaju
tacnost se deIinise kao bliskost slaganja izmedu srednje vrijednosti rezultata serije mjerenja i
prihvacene stvarne (tacne) vrijednosti mjerene velicine |eurachem, 41|. Proces validacije
metode nastoji kvantiIicirati mogucu tacnost rezultata utvrdivanjem slucajnih i sistematskih
eIekata koji uticu na taj rezultat. Tacnost se prema tome razmatra u kontekstu dviju komponenti:
'istinitosti i 'preciznosti. Osim toga sve popularniji izraz tacnosti je 'mjerna nesigurnost,
koja danas predstavlja kvantitativnu mjeru kvaliteta mjernog rezultata |eurachem, 22|.

2.7.8.3.1. Istinitost
Prema VIM-u 'istinitost se deIinise kao bliskost slaganja izmedu srednje vrijednosti mjerene
velicine dobijene nakon beskonacno velikog broja ponovljenih mjerenja i reIerentne vrijednosti
mjerene velicine. Prakticno odredivanje istinitosti zasniva se na poredenju srednje vrijednosti
rezultata dobijenih primjenom kandidatske metode, sa poznatom vrijednoscu, odnosno, sa
reIerentnom vrijednoscu (tj. stvarnom vrijednoscu ili prihvacenom stvarnom vrijednoscu). U tu
svrhu mogu se koristiti dva pristupa: poredenje u odnosu na reIerentne vrijednosti
okarakterisanog materijala (obicno CRM-a) ili poredenje u odnosu na druge okarakterisane
metode |eurachem, 22|. Evropska unija implementirajuci Direktivu Vijeca 96/23/EC je
Odlukom Komisije iz avgusta 2002 godine, izmedu ostalog na strani L221/15 u odjeljku 2.3.2
identiIicirala dodatne kriterije perIormansi i druge zahtjeve za kvantitativne metode analize.
Njihove preporuke za istinitost (bias) kvantitativnih analitickih metoda u odnosu na
koncentraciju analita koja se odreduje prikazane su u Tabeli 12.
Tabela 12. Minimalna istinitost kvantitativnih metoda
Stvarni sadrzaj ( k
1
)
(frakcija mase)
Prihvatljivi raspon (%)
> 1

> 1 do 10

< 10
od 50 do + 20

od 30 do + 10

od 20 do + 10

Dobijene vrijednosti biasa (istinitosti), korigovane sa srednjom vrijednoscu rikaverija (jednacina
(2.7.16)), su prihvatljive samo onda kada se nalaze unutar navedenih podrucja prikazanih u
Tabeli 12 EC].
Za ocekivati je da se dobiju tacniji rezultati (blizi stvarnoj vrijednosti) pri visoj koncentraciji
analita. Iako raspon od -50 do 20 koji je dat u Tabeli 12 moze predstavljati neprihvatljivo
veliko podrucje, ono je djelimicno bazirano na onome sto se moze ostvariti u praksi. Osim toga
treba imati na umu da cak i zakonski limiti sadrze veliki budet nesigurnosti zbog toga sto su
navedene vrijednosti zavisne od toksikoloskih procjena QA, 65]. Istinitost se obicno izrazava u
kontekstu biasa, u smislu da manji bias indicira vecu istinitost |iupac, 847|.
2.7.8.3.1.1. Bias
Bias
4
se deIinise kao razlika izmedu srednje ( ) vrijednosti velikog broja mjerenja i prihvacene
reIerentne vrijednosti (

) za ispitni materijal. Iz prethodne deIinicije izvodi se jasan zakljucak

da je bias, zapravo, mjera 'istinitosti metode. On moze biti izrazen na razlicite nacine, tj.
jednostavno se izrazava kao razlika ili omjer dobijene i prihvacene vrijednosti QA, 58]. Bias
karakterizira totalnu sistematsku gresku date analiticke procedure i predstavlja (pozitivnu ili
negativnu) devijaciju srednje vrijednosti analitickog rezultata od (poznate ili pretpostavljene)
stvarne vrijednosti |eurachem, 41|. Povecanjem broja mjerenja mogu se reducirati slucajni
eIekti (poboljsati preciznost) ali sistematska greska (bias) se ne smanjuje. Ona kasnije mora biti
uklonjena ili uzeta u obzir. Kao i u slucaju ostalih aspekata mjerenja, i ovdje ce postojati
nesigurnost koja je pridruzena bilo kakvoj procjeni biasa, a koja zavisi od nesigurnosti koja se
odnosi na ispitni rezultat
x
i nesigurnosti koja se odnosi na reIerentnu vrijednost
RM
, kao sto
je prikazano na Slici 17 QA, 82].
Rezultat mjerenja Referentna vrijednost

Slika 17. Ilustracija biasa
Ukupni bias se obicno sastoji od nekoliko komponenti. Potencijalni uzroci mjernog biasa mogu
biti: hemijske interIerencije, eIekti matriksa (kao sto su promjene u jacini kiseline ili viskozitetu)
koji mogu povecati ili smanjiti mjerni signal; bias mjerne aparature, kao sto je nerealan odziv

4
8las engleska rl[ec a u prevodu znacl sklonosL prslsLrasnosL predrasuda slsLemaLska greska lLd
8las

RM

x

instrumenta, ili nelinearnost; i nepotpuna ekstrakcija (rikaveri) analita iz matriksa uzorka. Prema
tome, postoji veliki broj eIekata koji mogu uticati na bias, a koji mogu biti pozitivni ili negativni.
Neki od njih mogu biti povezani sa uzorkom koji se analizira dok neki mogu biti povezani sa
metodom a neki sa laboratorijom koja izvodi mjerenje. Za mjernu velicinu koja je deIinisana
metodom mjerenja (empirijska metoda), bias metode je prema deIiniciji jednak nuli, ali bez
obzira na to moze postojati laboratorijski bias. Individualni eIekti mogu biti i odvojeno
razmatrani, ali je uobicajenije da se procjenjuju ukupni eIekti biasa koji zajedno predstavljaju
mjerni bias, kao sto je prikazano na Slici 18. SpeciIicni eIekti biasa, koji mogu biti veliki i koje
treba razumjeti i minimizirati, treba razmatrati tokom razvijanja metode, npr. prisustvo ili
odsustvo interIerirajuce supstance, ili eIekti zbog promjene vremena reakcije. Ovi eIekti trebaju
biti adresirani i tokom validacije metode i to kao dio studije parametra robusnosti metode. Bias
mjerenja se odreduje poredenjem srednje vrijednosti rezultata mjerenja dobijenih za reIerentni
materijal, koristeci metodu koja se validira, sa navedenom vrijednoscu mjerene osobine datog
reIerentnog materijala. Potreban broj ponovljenih mjerenja (n) zavisi od preciznosti metode (s) i
nivoa biasa (o) koji je potrebno detektovati. Korisna aproksimacija prikazana je u sljedecoj
jednacini:
J = (so)
2
+ (2.7.11.)
Na osnovu 'grube procjene prethodne jednacine, potrebno je napraviti najmanje sedam
ponavljanja. Sa ovim brojem ponovljenih mjerenja bias velicine dvostruke standardne devijacije
moze biti otkriven QA, 83].










Slika 18. Tipovi biasa
Napomena . Bias laboratorife i metode u ovom slucafu fe prika:an kao da imafu isti pravac dfelovanfa. U
stvarnosti to nife uvifek slucaf.

2.7.8.3.1.1.1. Racunanfe parametara biasa
Mjerni bias, B, moze biti izracunat kao omjer ( obicno izrazen kao procenat) razlike izmedu
srednje vrijednosti rezultata mjerenja ispitnog uzorka, dobijenih u uslovima ponovljivosti, i
lzm[erena laboraLorl[ska
sredn[a vrl[ednosL
8las meLode
@acna (referenLna)
vrl[ednosL
LaboraLorl[skl blas
ukupnl blas
lnLerlaboraLorl[ska
sredn[a vrl[ednosL
'tacne odnosno prihvacene tacne vrijednosti za taj ispitni uzorak, kao sto je prikazano u
sljedecoj jednacini :
% =

=
(x -x
0
)
x
0
(2.7.12.)
gdje je srednja vrijednost dobijena ponavljanjem mjerenja reIerentnog materijala (obicno
CRM) koristeci metodu koja se ispituje i

je deIinisana vrijednost reIerentnog materijala.

Mjerni bias se cesto naziva 'rikaveri, koji se izrazava kao omjer (R) ili u postotcima (R) i
moze biti veci ili manji od 100. U nekim podrucjima mjerenja, rikaveri se odnosi na dodatu
kolicinu analita (spajk) koja se nakon dodatka moze izmjeriti u uzorku tokom analize(ponovo
razmotriti recenicu)(jednacina xxx). U drugim podrucjima, rikaveri se shvata kao procjena
kolicine ukupnog analita (prirodno prisutnog plus dodati spajk) prisutnog u uzorku koji je
mjeren (izvucen) koristenjem date metode. Veza izmedu biasa irikaverija data je u jednacini
(bb):
% =
x
x
0
(2.7.13.)
% = +% (2.7.14.)
Tamo gdje se rikaveri odreduje spajkovanjem, rikaveri u se racuna na osnovu sljedece
jednacine:
% =
(C
sp
-C
b
)
C
s
(2.7.15.)
gdje je
sp
srednja vrijednost dobijena iz ponovljenog mjerenja uzorka, nakon dodatka spajka,

b
je srednja vrijednost dobijena iz ponovljenog mjerenja uzorka, prije spajkovanja, i
s
je
izracunato povecanje koncentracije u uzorku nakon dodatka spajka. Tamo gdje postoji statisticki
znacajan bias, rezultat rutinskog mjerenja moze biti ispravljen kako je prikazano u sljedecoj
jednacini:

co
=
C
cbs
%R
(2.7.16.)
gdje je
co
korigovani mjerni rezultat za ispitni uzorak i
obs
je dobijeni mjerni rezultat za
ispitni uzorak QA, 85].

2.7.8.3.2. Uslovi za eksperimente utvrdivanja biasa/istinitosti
Bias se moze pojaviti na razlicitim nivoima analitickog sistema u laboratoriji, kao sto je npr. bias
tokom izvodenja analize, laboratorijski bias, i bias metode. Vrlo je vazno zapamtiti koji je od
navedenih biasa treba tretirati adresirati odgovarajucom metodom. Posebno treba znati da:
Srednja vrijednost serije mjerenja, koja su potpunosti sprovedena za svaku seriju po jedno
mjerenje, da je inIormacije o eIektima metode, laboratorije, i eIektima koji se javljaju tokom
izvodenja mjerenja samo za to izvedeno mjerenje. Obzirom da se eIekti tokom mjerenja
mijenjaju od mjerenja do mjerenja, rezultat ce prema tome takode varirati od mjerenja do
mjerenja vise nogo sto se ocekuje od dobijene disprzije rezultata, i to treba uzeti u obzir tokom
procjene rezultata (npr. provjerom izmjerenog biasa u odnosu na standardnu devijaciju izmedu
mjerenja koja je odvojeno razmatrana. Srednja vrijednost ponovljenih mjerenja reIerentnog
materijala iz nekoliko serija, procjenjuju se kombinovani eIekti laboratorijskog i biasa metode u
datoj laboratoriji (osim gdje je ta vrijednost utvrdena koristeci odredenu metodu) |iupac, 847|.
2.7.8.3.3. Referentne vrijednosti za eksperimente istinitosti/biasa
2.7.8.3.3. 1. CertiIicirani reIerentni materijal (CRM)
CRM-i su sljedivi do internacionalnih standarda sa poznatom nesigurnoscu i prema tome mogu
biti koristeni za utvrdivanje svih aspekata biasa (metode, laboratorije, i unutar laboratorije)
istovremeno, pretpostavljajuci da ne postoji neuskladenost matriksa. Idealan CRM je onaj koji je
certiIiciran i koji najblize odgovaraju uzorku u odnosu na njegovu Iormu, sastav matriksa i
koncentraciju analita. CRM-i trebaju u skladu stim biti koristeni, u validaciji istinitosti/biasa gdje
god je to prakticno. Vrlo je vazno osigurati da je certiIicirana vrijednost nesigurnosti dovoljno
mala da bi se omogucila detekcija biasa vazne velicine. Gdje to nije slucaj, upotreba CRM-a se i
dalje preporucuje, ali dodatne potrebe treba sprovesti. Tipicni eksperimenti istinitosti generiraju
srednju vrijednost rezultata mjerenja dobijenih za reIerentni materijal. Pri interpretaciji rezultata,
nesigurnost povezana sa certiIiciranom vrijednosti trebaju biti uzeti u obzir zajedno sa
nesigurnoscu proizasla iz statistickih varijacija u laboratoriji. Kasniji moze se bazirati na
standardnoj devijaciji unutar mjerenja, izmedu mjerenja, ili izmedu laboratorija u zavisnosti od
svrhe eksperimenta. Gdje je certiIicirana vrijednost nesigurnosti mala, studentov t test se obicno
sprovodi koristeci odgovarajuci nivo preciznosti. Gdje je neophodno i prakticno, broj
odgovarajucih CRM-a, sa odgovarajucim matriksom i koncentracijom analita treba biti ispitan.
Gdje je ovo uradeno, i gdje su nesigurnosti certiIiciranih vrijednosti manje od nesigurnosti
analitickih rezultata, prilicno je sigurno koristiti jednostavnu regresiju za procjenu rezultata. Na
ovaj nacin, bias moze biti izrazen kao Iunkcija koncentracije, i moze biti predstavljen kao
odsjecak koji je razlicit od nule ('tranzicionalni ili konstantni bias) nonunity nagib
('rotacionalni ili proporcionalni bias)
2.7.8.3.3.2. ReIerentni materijali
Tamo gdje CRM-i nisu dostupni, mogu se koristiti bilo kakvi materijali koji su dovoljno dobro
okarakterisani za datu svrhu (reIerentni materijali), imajuci uvijek na umu da je nemoguce
dokazati da je zanemarljivi bias jednak nepostojanju biasa, znacajan bias bilo kojeg materijala
ostaje uzrok zbog kojeg se to istrzuje. Primjeri reIerentnih materijala ukljucuju: materijale koji su
okarakterisani od strane reIerentnoog proizvodaca, ali cije vrijednosti nisu pracene izjavom o
sigurnosti ili koje nisu na bilo koji nacin kvaliIikovane, materijali okarakterisani od strane svog
proizvodaca, materijali okarakterisani u nutar laboratorije za upotrebu kao reIernih materijala, i
materijali koristeni u testovima strucnosti laboratorija. Iako je sljedivost ovih materijala mozda
upitna, bolje je i njih koristiti nego da se ne sprovedu nikakve procjene biasa. Ovi materijali
trebaju biti koristeni na isti nacin kao i CRM-i, s obzirom da nemaju navedenu nesigurnost bilo
kakvi znacajni testovi oslanjaju se u potpunosti na dobijenu preciznost rezultata.


2.7.8.3.3.3. Upotreba reIerentnih metoda
ReIerentna metoda u principu moze biti koristena za testiranje biasa druge metode koja se
validira. Ovo je korisna opcija kada provjeravamo alternativnu, ili modiIiciranu metodu u odnosu
na ustanovljenu standardnu metodu koja je vec validirana i koja se rutinski primjenjue u
laboratoriji. Obje takve metode se koriste da bi se analizirao odredeni broj tipicnih ispitnih
materijala, koji po mogucnosti obuhvataju odgovarajuce podrucje koncentracija sto
vjerodostojnije. Komparacija rezultata dobijenih za navedeno koncentracion podrucje upotrebom
odgovarajucih statistickih metoda( npr. uporedni t-test, zajedno sa provjerom homogenosti
varijansi i normality (normalnost) moze demonstrirati bias izmedu metode koja se evaluira i
reIerentne metode sa poznatim biasom |iupac, 848|.

2.7.8.3.3.4. Upotreba metode spajkovanja/rikaverija
U odsustvu odgovarajuceg CRM-a kombinacija najboljeg dostupnog matriks reIerentnog
materijala i 'eksperimenti spajkovanja su najbolja opcija procjene biasa. Eksperimenti
spajkovanja obuhvataju analizu realnih uzoraka prije i poslije dodavanja, 'spajka, tj. poznate
kolicine cistog analita. Rikaveri predstavlja kolicinu analita od interesa koju je moguce
ekstrahovati iz matriksa i izmjeriti. Kod metoda koje su oslobodene od biasa, razlika izmedu dva
rezultata bi bila jednaka dodatoj kolicini analita, zajedno sa nesigurnostima mjerenja, kao sto je
prikazano na Slici 19.






Ukoliko je R
4
dodata kolicina spajka, R
4
R
3
= bias (B)
Slika 19. Odredivanje biasa koristenjem gravimetrijskog spajkovanja
Medutim, gravimetrijsko spajkovanje daje realnu procjenu biasa samo onda kada su analit sa
kojim se spajkuje uzorak i prirodno prisutni analit u datom matriksu u ravnotezi. Npr. prirodni
analit koji je vec prisutan u matriksu, moze biti cvrsce vezan unutar matriksa, dok spajkovani
analit moze biti samo slabo adsorbovan na povrsini cestica uzorka. Osim toga, iako je ravnotezu
mozda moguce uspostaviti pri visim koncentracijama, to ne mora biti situacija kada je u pitanju
koncentracija analita na nivou tragova. Ta situacija nije problem u koliko su uzorci u potpunosti
rastvoreni, bias se moze pojaviti ukoliko je ekstrakcija analita iz cvrstog stanja sastavni dio
metode. Posebnu paznju treba posvetiti tome da se sastav matriksa ne mijenja znatno tokom
spajkovanja i da je koncentracija materijala za spajkovanje bliska koncentraciji analita u

8ezulLaL 8
1

lzm[erena
kollclna spa[ka
8
3


8ezulLaL 8
2


uzorak
+ spa[k
M[eren[e
M[eren[e
8
2
8
1


uzorak

uzorcima koji ce se analizirati. Uspostavljanje ravnoteznih uslova je vazno i oni mogu biti
postignuti ostavljanjem rastvora za spajkovanje u kontaktu sa uzorkom nekoliko sati, a ako je
moguce i preko noci, i kontrolisanjem svojstava kao sto je velicina cestica. Kada god je moguce
rastvarac koristen za dodavanje spajka treba biti razlicit od rastvaraca koristenog u bilo kojoj
prethodnoj ili naknadnoj ekstrakciji. Takode je potrebno procijeniti uticaj koncentracije analita
na bias, kao i bilo koji koncentracijski uticaj na ponasanje prisutnog i spajkovanog materijala .
Spajkovanje/rikaveri studije se danas intenzivno razmatraju i dok dobar rikaveri nije garancija
istinitosti, slab rikaveri je zasigurni indikacija slabe istinitosti metode QA, 83].
2.7.8.3.4. Postupak za procjenu tacnosti i istinitosti odnosno biasa metode
Bias se odreduje tako sto se analiziraju: standardi, reIerentni materijali ili slijepe probe uzorka
koje su spajkovane razlicitim koncentracijama analita u odnosu na radno podrucje. Potrebno je
napraviti deset nezavisnih ponavljanja mjerenja a iz dobijenih podataka izracunati standardnu
devijaciju (s) svakog mjerenja. Na taj nacin se odreduje standardna devijacija ponovljivosti (s

)
svakog mjerenja, koja se racuna prema jednacini (2.7.7.) |eurachem, 26|.

(EC Direktiva)Procedura za procjenu istinitosti.
U ovom pararafu opisano je odredivanje istinitosti(koja je jedna komponenta tacnosti). stinitost
je jedino mouce odrediti sredstvima kao sto je CRMa. Zbo toa CRM treba koristiti dje je
od to mouce. Primjer je naveden ispod:
O analiziraj sest paralelki CRM u skladu sa procedurom metode
O odredi koncentraciju analita prisutnu u svakoj paralelki
O izracunaj srednju vrijednost, stan. dev. i CV (%) za svaku koncentraciju
O izracunaj istinitost dijeljenjem dobijene srednje vrijednosti sa certificiranom
vrijednoscu(mjerena kao koncentracija) i pomnozi sa 100 da bi rezultat izrazili u
procentima.
O stinitost (%) = srednja vrijednost rikaverija koriovana dobijena konc. x 100/
certificirana vrijednost
Ukoliko CRM nije dostupan, umjesto istinitosti, rikaveri moze biti odreden.

(Eurachem)Procedura za procjenu tacnosti i istinitosti

Analiziraj

Broj
ponavljanja
zracunaj Komentari

a) Slijepu probu
reaenata i referentni
materijal upotrebom
kandidatske metode

10

Srednju vrijednost slijepe
probe koja je oduzeta od
srednje vrijednosti analita za
referentni materijal

Usporedi sa stvarnom
vrijednoscu ili prihvacenom
stvarnom vrijednoscu za
referentni materijal
Predmet je nesiurnosti
slijepe probe kao
stvarne slijepe probe,
karakterizacija
referentno materijala

b) Slijepu probu
reaenasa i
refrentni/ispitni
materijal upotrebom
kandidatske metode i
nezavisne (po
moucnosti) primarne
metode

10


Srednju vrijednost slijepe
probe koja je oduzeta od
srednje vrijednosti analita za
referentni/ispitni materijal
Dobijena vrijednost
predstavlja mjeru biasa
metode

Usporedi sa slicnim
mjerenjima napravljenim sa
nezavisnom/primarnom
metodom

Dobijena vrijednost
predstavlja mjeru biasa
metode u odnosu na
nezavisnu/primarnu metodu


Nezavisna metoda
moze imati vlastiti bias
pa stoa nije apsolutna
mjera tacnosti




Primarna metoda u
idealnom slucaju nema
bias pa je stoa bolja
mjera tacnosti


(QA 86) Tokom validacije, uspostavlja se odnos izmedu odziva (odovora) instrumenta i
mjerene koncentracije. Potrebno je napraviti odovarajuce provjere kako bi se osiurali da
linearnost metode ne predstavlja preveliki doprinos mjernoj nesiurnosti ( proistekla iz
kalibracije treba imati doprinos ukupnoj nesiurnosti manji od 20% u odnosu na najvecu
komponentu nesiurnosti). Kalibracioni raspored kalendar koji se izvodi tokom rutinske upotrebe
metode se takode uspostavlja u svakodnevnoj praksi. Vrlo je mudro napraviti dovoljan broj
provjera na nekim ili na svim sljedecim parametrima performansi, kako bi ustanovili da njihove
vrijednosti zadovoljavaju specificirane ranice.
xxx Limit Detekcije (LOD)
(eurachem) Termini "limit detekcije ili "detekcioni limit nisu eneralno prihvaceni iako su u
upotrebi u nekim dokumentima. SO kao opcu definiciju ovo pojma koristi izraz "minimalna
mjerljiva (stvarna) vrijednost. UPAC predlaze oprez pri upotrebi termina "limit detekcije,
preferirajuci termin "minimalna mjerljiva koncentracija. U ovm radu ce se zbo uvrijezenosti
izraza limita detekcije (LOD) koristiti u daljnem tekstu, imajuci u vidu prethodno navedeno.
Dakle, (QA 56)limit detekcije (LOD) individualne analiticke procedure predstavlja najmanju
kolicinu analita u uzorku koja moze biti detektovana a koja ne mora biti kvantifikovana sa
prihvatljivom nesiurnoscu. (IUPAC COMPENDIUM. 1985) Limit detekcije izrazen kao
koncentracija c
L
ili velicina q
L
izvedena je iz najmanje koncentracije x
L
, koja moze biti
detektovana sa razumnom siurnoscu za datu analiticku proceduru. Kod te koncentracije
metoda ce indicirati prisustvo odredene kolicine analita, za navedeni nivo znacaja, ali ta kolicina
nece moci biti specificirana. Vrijednost x
L
data je jednacinom (xx):

=

+ s
bI
(ii)
dje je

srednja vrijednost rezultata dobijenih mjerenjem rastvora slijepe probe, s
bI
je
standardna devijacija tih mjerenja i je numericki factor izabran na osnovu zahtjevano nivoa
povjerenja. (QA 56) Za mnoe svrhe, potrebna je samo priblizna vrijednost limita detekcije i on
je izracunat koristenjem jednacine (ii) ili (oo). Ukoliko je omjer sinala i suma dobijen kao odziv
instrumenta potrebno a je prevesti u odovarajuce koncentracione jedinice:
H = s
bI
(ii)
H = or sJII I (oo)

(eurachem ) Ova aproksimacija je vjerovatno adekvatna tokom validacije metode jer daje
indikaciju koncentracije ispod koje detekcija postaje problematicna. (QA56)Ona indicira da
mjerni sinal za s
bI
puta veci od vrijednosti sinala slijepe probe uzorka moze poticati samo
od slijepe probe u manje od 5% mjerenja pa se zbo toa sa 95% pretpostavkom tvrdi da je taj
sinal posljedica prisustva analita koji se mjeri (mjerne velicine). Kada se ne moze upotrijebiti
rastvor slijepe probe, umjesto njea moze se uzeti rastvor koji sadrzi nisku koncentraciju
analita. Limit detekcije je posebno vazan u analizama traova, kada je potrebno odluciti da li je
kontaminant ispod ili iznad zakonski utvrdene ranice. dealno bi bilo, LOD izabrane metode
iznosi barem (najmanje) jednu desetinu koncentracije koja predstavlja zakonsku ranicu. Npr.
ako je zakonski utvrdena ranica za olovo u vodi sa slavine 50.00 L
1
upotrijebljena analiticka
metoda treba da bude u moucnosti izmjeriti prisustvo olova u koncentraciji do 5.0 L
1
.
(QA 87) LOD predstavlja minimalnu koncentraciju analita koja se moze detektovati sa
statistickom siurnoscu(povjerenjem), baziranoj na konceptu dovoljno nisko rizika neuspjeha
detekcije analita(determinanta). Samo je jedna vrijednost prikazana na slici xx ali postoje razliciti
nacini procjene vrijednosti LOD i izbor odovarajuce nacina zavisi od kvaliteta nivoa koji treba
definisati. (iupac 850) Bez o kakvom pristupu je rijec svi oni se baziraju na procjeni preciznosti
na ili blizu nulte koncentracije, ali jos nije sasvim jasno da li se ona treba odredivati u uslovima
ponovljivosti ili u druim uslovima odredivanja. Odreduje se ponovljanim analiziranjem slijepe
probe ili ispitne porcije koja sadrzi malu kolicinu analita. zmjereni sinal koji je tri puta veci od
standardne devijacije sinala slijepe probe ( s
bI
) se vjerovatno nece dooditi slucajno i obicno
se uzima kao pribliznom procjenom LOD. Ovakav pristup je obicno adekvatan ukoliko su svi
analiticki rezultati znatno iznad te vrijednosti. Upotrijebljena vrijednost s
bI
treba da predstavlja
standardnu devijaciju rezultata dobijenih iz veliko broja serije slijepih proba ili rastvora
spajkovanih niskim koncentracijama. Zatim, aproksimacija se jedino odnosi na rezultate koji
imaju normalnu distribuciju i koji su navedeni sa nivoo povjerenja od 95%. ndustrija vode
Velike Britanije koristi H = s
w
, dje je s
w
"unutarserijska standardna devijacija rezultata
za slijepu probu, i t je Studentov koeficijent koji se odnosi na statistiku za broj stepena slobode
dodijeljenih standardnoj devijaciji. To je Priblizno 4.65 s
w
i zahtjeva da se jedna korekcija slijepe
probe primjeni na odzive za ispitne uzorke iz jedne serije. LOD dobijen tokom validacionih
studija predstavlja indikaciju "svrsishodnosti metode. Treba a redovno provjeravati tokom
upotrebe metode kako bi se osiurali da nije doslo do kakvih sustinskih promjena.



Slika xxx. lustracija nekih kljucnih parametara performansi
Neki od nacina utvrdivanja limita detekcije prikazani su sledecim jednacinama:
H
1
=
3 x S
b
m
(xx)
H
2
=
3 x S
lc
m
(yy)
H
3
=
I
+
Ic
(ii)
H

=
sb
+
b
(oo)
dje je LOD detekcioni limit,
b
standardna devijacija slijepe probe,
Ic
standardna devijacija
najnize koncentracije, naib kalibracione krive,
sb
koncentracija slijepe probe, a
I
najniza
koncentracija analita u standardnom rastvoru.
(IUPAC 850 str) Medutim treba imati na umu da limit detekcije koji je utvrden tokom razvoja
metode, mozda nece biti identican konceptu ili numerickoj vrijednosti koji je koristen za
karakterizaciju kompletne analiticke metode. Na primjer, "instrumentalni limit detekcije, kako je
naveden u literature ili u brosurama instrumenta koji je koriovan za razblazenja, je cesto
znatno manji od "prakticno limita detekcije i nije prikladan za validaciju metode. (QA
87)Razlika izmedu limita detekcije instrumenta (LD) i limita detekcije metode (LDM) je u tome
na sta se oni odnose. LD je parametar instrumenta i predsatavlja najnizu koncentraciju analita
0
02
04
06
08
1
12
0 02 04 06 08 1 12 14 16

d
g
o
v
o
r

(
o
d
z
|
v
)
koncentrac|[a
LCC
8adno podruc[e
Llnearno podruc[e
LCu
koj rezultira pouzdanim odzivom na instrument. Ovo moze biti dobijeno mjerenjem cisto
analita. Za razliku od LD, LDM bazira se na mjerenju slijepe probe stvarno uzorka ili male
kolicine spajka koji je sproveden kroz sve faze metode. Jasno je, da je drui relevantniji ta
ispitne uzorke. LD moze takode biti odreden iz omjere sinala i suma; i i priblizno je tri puta veci
od to omjera.
Tabela xx Odzivi iz deset ponovljenih mjerenja za razlicite koncentracione nivoe
Koncentracija (
1
) Pozitivan/neativan
200
100
75
50
25
0
10/0
10/0
5/5
1/9
0/10
0/10

Za testove koji su dizajnirani za detektovanje prisustva ili odsustva analita (kvalitativna
mjerenja), ranicna koncentracija koja moze biti detektovana moze biti odredena ponovljanjem
mjerenja kroz raspon koncentracija. Takvi podaci mou posluziti za donosenje odluke o
koncentraciji pri kojoj je mouce napraviti razliku izmedu pouzdane detekcije i nedetekcije. Za
svaki koncentracijski nivo, moze biti neophodno napraviti izmjeriti priblizno deset ponavljanja
mjerenja. Ta odluka moze zavisiti od broja neativnih rezultata koji mou biti tolerisani. U tabeli
xx se to jasno vidi da za dati primjer pozitivna identifikacija analita nije pouzdana ispod 100

1
.
(Eurachem)Procedura za procjenu LOD

Limit detekcije (LOD)


Analiziraj

zracunaj iz dobijenih podataka

a) 10 nezavisnih slijepih proba uzorka svaka
izmjerena jedanput

ili


b) 10 nezavisnih slijepih proba uzorka koje su
oboacene sa najmanjom prihvatljivom
koncnetracijom i svaka je izmjerena po
jedanput


Standardnu devijaciju "s prema formuli za
oranicen broj mjerenja a) vrijednosti slijepih
proba uzorka, ili b) vrijednosti slijepih proba sa
uzorka standardnim dodatkom(fortified)

zrazi LOD kao koncentraciju analita na
odovarajuci nacin kao a) srednja vrijednost
slijepe probe uzorka + 3s ili b) 0 + 3s



Ovakav pristup pretpostavlja da sinal cija je vrijednost veca od 3s vrijednosti slijepe probe
uzorka moze jedino proizaci iz slijepe probe samo u mnoo manje od 1% vremena, pa je prema
tome velika vjerovatnoca da je taj sinal proistekao iz nece druo, kao sto je analit. Nacin a)
je jedino koristan tamo dje se standardna devijacija slijepe probe uzorka razlikuje od nule.
Dobijanje postojanje odovarajuce slijepe probe uzorka moze biti tesko.


c) 10 nezavisnih slijepih proba uzorka koje su
oboacene sa najmanjom prihvatljivom
koncnetracijom i svaka je izmjerena po
jedanput






Standardnu devijaciju, prema formuli za
oranicen broj mjerenja "s, vrijednosti slijepih
proba uzorka sa standardnim
dodatkom(fortified)

zrazi LOD kao koncentraciju analita kojoj
odovara vrijednost slijepe probe uzorka +
4.65s (proizilazi iz testirane hipoteze)


"Najmanja prihvatljiva koncentracija predstavlja najmanju koncentraciju za koju je mouce
postici odovarajuci stepen nesiurnosti.

Pretpostavka je da se tokom normalne prakse uzorak i slijepa proba odreduju odvojeno i
koriuju za slijepu probu oduzimanjem koncentracije analita koja odovara sinal slijepe probe
od koncnentracije koja odovara sinal uzorka.

Ukoliko je mjerenje izvedeno u uslovima ponovljivosti, ovo takode predstavlja mjeru preciznosti
u uslovima ponovljivosti.


(EC Direktiva za LOD o sprovodenju LOD navesti kasnije)

xxx Limit kvantifikacije (LOQ)
(QA 57)U nekim slucajevima, potrebno je razmotriti limit kvantifikacije, tamo dje je neophodno
ne samo detektovati prisustvo analita neo i odrediti prisutnu kolicinu analita sa prihvatljivom
statistickom siurnoscu. (eurachem 43) Limiti kvantifikacije predstavljaju karakteristike
performansi koje oznacavaju sposobnost hemijsko mjerno procesa da adekvatno
"kvantifikuje(izmjeri) analit. Ta sposobnost kvantifikovanja se eneralno izrazava u odnosu na
dobijeni sinal ili (stvarnu) vrijednost analita u uslovima kada je specificna standardna devijacija
(RSD), obicno 10%. Prema tome: H

, dje je H

kvantifikacioni limit,

standardna
devijacija za datu tacku,

je mnozilac koji je proporcionalan izabranom kvantificirajucem RSD.

UPACova standardna vrijednost za

je 10. (QA 57)Limit kvantifikacije (LOQ) individualne

analiticke procedure predstavlja najmanju kolicinu analita u uzorku koja moze biti kvantitativno
odredena sa prihvatljivom nesiurnoscu (Slika xx). Ovo treba uspostaviti upotrebom
odovarajuce referentno materijala ili uzorka. Ne bi trebala biti odredena ekstrapolacijom.
(QA 88) Raznim konvencijama je definisano da priblizan limit bude 5, 6 ili 10 veci od standardne
devijacije broja izvedeno mjerenja na slijepoj probi ili rastvorima spajkovanim sa niskom
koncentracijom analita. Ovi pristupi opisani iznad daju priblizne vrijednosti LOD i LOQ. Oni su
zadovoljavajuci ukoliko je kolicina analita u ispitnim uzorcima znatno iznad LOD i LOQ. Ukoliko
je detekcioni limit kritican, tada treba koristiti znatno riorozniji pristup. Zatim, LOD i LOQ
ponekad variraju sa tipom uzorka i minornim varijacijama u mjernim uslovima. Kada su ti
parametri znacajni, neophodno je utvrditi ocekivani nivo promjena tokom validacije metode i
napraviti protokol za provjeru tih parametara, za odovarajuce intervale, kada je metoda u
rutinskoj upotrebi. Postoji nekoliko jednacina pomocu kojih je mouce izracunati LOQ:
H
1
=
1 x S
sb
m
(xx)
H
2
=
1 x S
lc
m
(yy)
H
3
=
I
+
Ic
(ii)
H

=
sb
+
sb
(oo)
dje je LOQ limit kvantifikacije,
b
standardna devijacija slijepe probe,
Ic
standardna devijacija
najnize koncentracije, naib kalibracione krive,
sb
koncentracija slijepe probe, a
I
najniza
koncentracija analita u standardnom rastvoru. Loq je idikativna vrijednost i ne bi trebala biti
koristena pri odlucivanju.



Limit detekcije (LOD)


Analiziraj

zracunaj iz dobijenih podataka

a) 10 nezavisnih slijepih proba uzorka svaka
izmjerena jedanput






Nabavljanje stvarne slijepe probe uzorka
moze biti tesko

Standardnu devijaciju "s prema formuli za
oranicen broj mjerenja za vrijednosti slijepih
proba uzorka

zrazi LOQ kao koncentraciju analita koja
odovara vrijednosti slijepe probe uzorka plus
ili: i) 5s ii) 6s, iii) 10s


b) dodaj u alikvote slijepih proba uzorka
razlicite koncentracije analita LOD

Standardnu devijaciju "s vrijednosti svake
koncentracije analita. Plot s aainst
concentracion and put assin value to the LOQ
by inspection

Napravi za svaku koncentraciju 10 nezavisnih zrazi LOQ kao najmanju koncentraciju analita
ponavljanja mjerenja koja moze biti odredena sa prihvatljivim nivoom
nesiurnosti

Naravno LOQ predtsavlja dio studija za utvrdivanje radno podrucja. Ne treba se odredivati
ekstrapolacijom ispod najmanje koncentracije standardno dodatka slijepe probe

Ukoliko su mjerenja izvedena u uslovima ponovljivosti, mjera preciznosti u uslovima
ponovljivosti je takode dobijena za ovu koncentraciju.


(EC Direktiva) za LOQ
xxx Radno (mjerno) podrucje
(eurachem46) Prema definiciji radno podrucje predstavlja seriju vrijednosti mjerene velicine za
koju reska mjerno instrumenta lezi unutar specificiranih ranica. (eurachem 20) Za bilo koju
kvantitativnu metodu, neophodno je odrediti podrucje koncentracije analita ili vrijednosti osobine
unutar koje metoda se moze primjenjivati. Pomenuto podrucje odnosi se na podrucje
koncentracija ili vrijednosti osobina unutar rastvora koji se zapravo mjere radije neo na
podrucja u oriinalnom uzorku. Pri dnu koncnentracijsko podrucja limitirajuci faktori su
vrijednosti limita detekcije i/ili kvantifikacije. Na vrhu to koncentraciono podrucja limitirajuci
faktori ce biti nametnuti od strane razlicitih efekata ovisno od sistema odziva odovora
instrumenta. Evaluacija radno i linearno podrucja je korisnai u slucajevima planiranja stepena
potrebne kalibracije pri svakodnevnom koristenju metode. Preporucljivo je ispitati variranje koje
se javlja unutar radno podrucja. Unutar linearno podrucja, jedna kalibraciona tacka je
dovoljna, da bi se utvrdio naib kalibraciono pravca. Bilo dje drudje unutar radno podrucja
neophodno je vise kalibracionih tacaka ( vise od 6). Veza izmedu odziva instrumenta i
koncentracije nemora biti perfektno linearna da bi metoda bila efektivna ali kalibraciona kriva
treba biti ponovljiva iz dana u dan. Takode radno i linearno podrucje mou biti razliciti za
razlicite matrikse sto je u skladu sa efektima interferencija koji poticu iz matriksa. (QA 86)
Linearnost i radno podrucje metode se odreduju analiziranjem uzoraka sa razlicitom
koncentracijom analita i odredivanjem koncentraciono podrucja unutar koje su postinuta
prihvatljiva kalibraciona linearnost i mjerna nesiurnost. Kalibracioni odovor ne mora biti
perfektno linearan da bi metoda bila upotrebljiva. Ono sto je neophodno jeste jednacina koja
povezuje odziv sa koncentracijomsto je poznato kao kalibraciona funkcija. Dakle, radno
podrucje je reion dje rezultati imaju prihvatljivu nesiurnost i moze biti vece od linearno
podrucja. Donji kraj radno podrucja definisano je limitom kvantifikacije (LOQ) a ornji kraj
tackom u kojo je nedovoljna promjena odziva u odnosu na jedinicnu promjenu koncentracije kao
sto je prikazanao na Slicixxx.
xxx OsjetIjivost
(eurachem 49) Osjetljivost se definise kao promjena u odovoru (odzivu) mjerno instrumenta
podijeljena sa odovarajucom promjenom u pobudi. Pobuda moze biti npr. koncentracija
prisutno analita. ako se ova definicija jasno odnosi instrument ona takode moze biti
primjenjena in a analiticku metodu u cjelini, uzimajuci u ozir i drue faktore kao sto su efekti
koncentracionih koraka.(QA 86) Osjetljivost je, prema tome, mjera promjene odovora
instrumenta pri promjeni koncentracije. Ovo je bolje poznato kao naib kalibraciono rafika.
Dakle, sto je veca osjetljivost, to metoda ima vecu moucnost razlikovanja izmedu slicnih
koncentracija, obzirom da ce mala razlika u koncentraciji voditi do vecih razlika u posmatranom
odovoru.Osjetljivost se moze mijenjati sa koncentracijom, kao sto je prikazano na Slici 4.9, ali
za kalibracioni rafik se cesto moze ocekivati da bude linearan za sire koncentraciono podrucje.





Slika xxx prikaz osjetljivosti

xx Linearnost
(eurachem 43)Linearnost, prema definiciji, je mjera sposobnosti metode za dobijanje mjernih
rezultata(odovora) koji su proporcionalni koncentraciji analita koji se mjeri. Linearno podrucje
je, prema definiciji, podrucje koncentracija analita unutar koje metoda daje mjerne sinale koji
su proporcionalni koncentraciji analita. Linearnost moze biti utvrdena vizuelnim preledom
rafika zavisnosti mjerno sinala od koncentracije standarda, ili statistickim mjerama.
(QA88)Kvantitativna evaluacija linearnosti moze biti dobijena iz razlicitih statistika koje se
odnose na odabir linearne ili vece funkcije za podatke????. Pri uspostavljanju linearnosti
potrebno je vise standarda (i vise ponavljanja mjerenja svake koncentracije) neo sto je to
tipicno za kalibraciju validiranih metoda u normalnoj upotrebi. Medutim, treba imati na umu da
prilikom uspostavljanja linearnosti rastvori sa poznatom koncentracijom ne moraju biti nezavisni.
Linearnost treba da obuhvati podrucje na koje se odnosi metoda u smislu i kombinacije matriksa
i treba da obuhvati koncentraciono podrucje koje je vece od ocekivano podrucja za uzorke za,
npr, 20%.
Za pouzdanu studiju linearnosti:
O distribuiraj koncentracione vrijednosti (x) kalibracionih rastvora podjednako kroz
podrucje od interesa. Jedna ili dvije vrijednosti na krajevima to podrucja mou
uzrokovati savijanje kalibraciono pravca.
O analiziraj minimalno sest razlicitih koncentracionih nivoa (standardnih rastvora). zmjeri
ih metodom slucajno odabira slucajnim redoslijedom
O Napravi od dva do pet ponavljanja mjerenja za svaki kalibracioni standard.
Cdgovor slgnal
obuda koncenLracl[a
naglb pravca
odgoo
pobudu

O Osiuraj da odovori odzivi iz uzoraka budu blizu srednje vrijednosti odovora, ,
kalibraciono seta. Na ovaj nacin ce se smanjiti doprinos reske pri procjeni najmanjih
kvadrata reresione linije.
O Cisti(pure) materijali mou biti koristeni za procjenu linearnosti odovora instrumenta.
O CRMi odovarajuce matriksa ili spajkovani uzorci trebaju biti koristeni za za
odredivanje linearnosti metode.
O Utvrdi linearnost vizuelnom inspekcijom rafika sinal (instrumenta) u ovisnosti od
koncentracije.
Veoma je vazno utvrditi homoenost varijanse (homoscedasticity) metode za identifikovano
radno podrucje. To moze biti uradeno izvodenjem deset ponavljanja mjerenja na ekstremnim
krajevima to podrucja (najmanje i najvece koncentracije to podrucja). Varijansa ova dva seta
mjerenja je izracunata i izveden je statisticki test (F test) kako bi se provjerilo da li se te dvije
varijanse statisticki znatno razlikuju. Linearnost uvijek prvo treba procijeniti vizuelnim preledom
raficko prikaza podataka (kalibraciona rafik, npr. A = f(c)) a tek onda statistickim procjenom.
Linearnost odziva (odovora sinala) instrumenta treba uspostavljena jer bez te informacije
veoma je tesko adresirati uzroke nelinearnosti. Statisticke mjere potpore linearnosti ukljucuju
korelacioni koeficijent (r, r
2
, itd.), raficki prikaz rezidua, rezidualna standardna devijacija i
testovi znacajnosti za naib i odsjecak kalibraciono pravca. Treba imati na umu, da korelacioni
koeficijent, r, nije mjera linearnosti, on samo indicira obim odnosa izmedu zavisnih i nezavisno
promjenljivih velicina, odnosno odziva instrumenta i koncentracije analita. Linearnost metode
treba biti karakterizirana kako bi se ustanovio kalibracioni protokol za buducu upotrebu metode.
Vrlo je vazno sprovesti vizuelnu inspekciju rezidualno rafika, kako bi se provjerili trendovi
distribucije rezidua o odnosu na njihovu odovarajucu koncnentraciju???.
xxx Graficki prikaz rezidua (pIot of the residuaIs)
Vec je receno da je jedan od statistickih nacina procjene linearnosti i pomocu raficko prikaza
rezidua. Rezidue predstavljaju razliku izmedu izmjerene vrijednosti y
i
i vrijednosti y, izracunate
pomocu kalibracione jednacine = I +b isto mjerenja za svaku x vrijednost i matematicki se
predstavlja kao = (y
i
y). (JCR 28)raficki prikaz zavisnosti rezidua od odovarajucih
vrijednosti koncentracija (x) ili fitted value je mocan alat za potvrdivanje dvije pretpostavke a to
su linearnost i konstantnost rezidualne standardne devijacije. Ukoliko su ove dvije pretpostavke
potvrdene, tada taj rafik treba da prikaze nasumicno distribuirane tacke rasporedene oko nule
(kao sto je prikazano na Slici xx)

02
01
0
01
02
0 3 10 13 20 23
k
e
z
|
d
u
e
var|[ab|a x (koncentrac|[a)
Graf|ck| pr|kaz rez|dua
Slika xx: Dijaram rezidua.
Ukoliko model nije linearan, tada je mouce vidjeti uociti sistematski sablon izmedu rezidua i
vrijednosti koncentracija (kao sto je prikazano na Slici xx)

Slika xx: Dijaram rezidua
Departure from the assumption of constant residual standard deviation is indicated by
dispersion in the data that increases or decreases with the fitted value. Odstupanje od
pretpostavke o konstantnoj rezidualnoj standardnoj devijaciji indicirano je disperzijom vrijednosti
koje se povecavaju ili smanjuju sa fitted value. Ukoliko pretpostavka o konstantnoj rezidualnoj
standardnoj devijaciji nije potvrdena tada podaci skupljeni tokom kalibraciono eksperimenta
moraju biti ponovo analizirani.

(eurachem)

Radno i Linearno podrucje

Anliziraj

1. Slijepu probu i
referentne materijale
ili slijepe probe
uzorka u koje su
dodate razlicite
koncentracije analita



Potrebno je najmanje
6 koncentracija i
slijepa proba

2. Referentne
materijale ili slijepe
probe uzorka koje su
spajkovane sa
najmanje 6 razlicitih
ponavljanja

1












3
zracunaj iz podataka

Nacrtaj rafik zavisnosti mjerno
odovora (y osa) od
koncentracije analita (x osa)

Vizuelno preledaj rafik kako bi
priblizno identificirao linearno
podrucje i ornje i donje ranice
radno podrucja

zatim idi na 2.



Nacrtaj rafik zavisnosti mjerno
odovora (y osa) od
koncentracije analita (x osa).
Vizuelno utvrdi rube reske koje
mozda nisu obuhvacene
Komentari

dealno bi bilo da se
razlicite koncentracije
pripremaju nezavisno
a ne kao alikvoti
jedno isto lavno
rastvora

Na taj nacin ce se
dobiti vizuelna
potvrda da li je ili nije
radno podrucje
linearno

Ovaj korak je
neophodan za
ispitivanje radno
podrucja, za koje se
pretpostavlja da je
01
003
0
003
01
0 3 10 13 20 23 k
e
z
|
d
u
e
Var|[ab|a x (koncentrac|[a)
Graf|ck| pr|kaz rez|dua
koncentracija analita
unutar linearno
podrucja



















3. sto kao i za LOQ
pod (b)
reresijom

zracunaj odovarajuci koeficijent
korelacije (reresije). zracunaj i
raficki predstavi rezidualne
vrijednosti (koje predstavljaju
razliku izmedu mjerene (actual) y
vrijednosti i y vrijednosti koja se
dobija iz kalibraciono pravca, za
svaku x vrijednost). Nasumicna
distribucija tih vrijednosti oko
pravca potvrduje linearnost.
Sistematski trendovi distribucije
indiciraju ne linearnost



zatim idi na 3.




sto kao i za LOQ

LOQ efektno formira donji kraj
radno podrucja
linearno i tamo dje
se namjerava koristiti
kalibracija pomocu
jedne tacke

Ukoliko je varijansa
ponavljanja
proporcionalna
koncentraciji tada za
proracun treba radije
koristiti weihted
reression neo non
weihted reression

U nekim okolnostima
bit ce bolje pokusati
uklopiti dobijene
podatke u nelinearnu
krivu. Vece od
kvadratnih funkcija se
ne preporucuju

Radi postepeno sa
nizim koncentrcijama
sve dok tacnost i
preciznost postanu
neprihvatljivi

xxx Mjerna nesigurnost
U ranijem pisanju je istaknuto da, mjerna nesiurnost, danas predstavlja kljucni indikator
"svrsishodnosti i pouzdanosti rezultata, koju treba odrediti i predstaviti na nacin koji je siroko
priznat, interno konzistentan i koji se lako interpretira. Odnosno nesiurnost je danas,
kvantitativna mjera kvaliteta mjerno rezultata koja mu omoucava da se uporedi sa druim
rezultatima, referencama, specifikacijama ili standardima. Vecina informacija potrebnih za
procjenu nesiurnosti mou se dobiti tokom validacije metode, a u nekim slucajevima sam
proces validacije predstavlja dio procesa procjene nesiurnosti. Zbo toa ce se mjernoj
nesiurnosti u ovom radu posvetiti malo veci znacaj.

xx Proces mjerenja
(QA 156)Opcenito, kada od se izvrsi bilo kakvo kvantitativno mjerenje dobijena vrijednost je
samo procjena stvarne vrijednosti mjerene velicine ili mjerene osobine. Postoje mnoi faktori
koji uticu da se dobijena i stvarna ("tacna) vrijednost mjereno svojstva ili velicine medusobno
razlikuju. To su sljedeci faktori, koji se ukratko mou izloziti kao:
nedostatak ili nesavrsenstvo mjerno instrumenta
nedostatak ili mana metode mjerenja
uticaji operatora
Bitno je istaci da puko dobijanje rezultata neko kvantitativno hemijsko mjerenja ne
predstavlja svrhu ili cilj samo mjerenja. Svaki rezultat ima svoju cijenu pa prema tome i svoju
svrhu. Bez obzira na razlo njeovo dobijanja, rezultat hemijsko mjerenja ima odredenu
vaznost, jer su mnoe odluke cesto zasnovane ili su posljedica dobijeno rezultata mjerenja. Te
odluke mou znatno da uticu na zdravlje i sudbinu miliona ljudi. Pored navedeno
liberalizacijom svjetske trovine tezi se ka tome da se izbjene ponavljanje analiziranja
proizvoda koji prelaze nacionalne (drzavne) ranice. To znaci da bi kvantitativni analiticki
rezultati trebali biti prihvatljivi za sve potencijalne korisnike bez obzira da li se oni nalaze unutar
ili izvan oranizacije ili zemlje koja je dobila te rezultate. Medutim, loicno je da su potrebni
odredeni indikatori kvaliteta kako bi se osiurala ta prihvatljivost i pouzdanost rezultata
hemijsko mjerenja. Takvi indikatori moraju ispuniti sljedece kriterije, a to su:
univerzalna primjenljivost
konzistentnost
kvantitativnost
i znacenje koje je jasno i nedvosmisleno
ndikator koji zadovoljava ore navedene kriterije je mjerna nesiurnost.
xxx Definicija nesigurnosti
(VIM 2008, str 25) Nesiurnost se definise kao parametar, koji karakterizira rasipanje vrijednosti
koje bi iz opravdanih razloa mole biti pripisane mjerenoj velicini, bazirano na upotrijebljenim
informacijama. Taj parametar moze biti npr. standardna devijacija, nazvana kao standardna
mjerna nesiurnost.(QUAM str4) U opstoj upotrebi, termin nesiurnost odnosi se na opsti
koncept sumnje. Prema tome, nesiurnost se odnosi, ili na parametar predstavljen u definiciji, ili
na nase limitirano (oraniceno) znanje o stvarnoj vrijednosti mjerene velicine. Nesiurnost
rezultata mjerenja, ni u kom slucaju se ne odnosi na smanjenje validnosti ili kvaliteta to
mjerenja, neo naprotiv, poznavanje nesiurnosti doprinosi povecanju povjerenja u validnost ili
kvalitet mjerno rezultata. (QA 157) Dakle, kao sto se i da naslutiti iz definicije, nesiurnost je
parametar koji karakterizira podrucje ili raspon vrijednosti, unutar koje se ocekuje da se nalazi
stvarna vrijednost mjerene velicine. To znaci, da rezultat neko kvantitativno mjerenja, nije
ispravno predstaviti samo jednom vrijednoscu npr. pH = 3.7, zbo toa sto ce uvijek postojati
odredena sumnja u vezi sa mjerenom vrijednoscu. Jednostavno, ne mozemo biti siurni da ta
jedna vrijednost, dobijena na kraju mjerno procesa je zapravo i stvarna vrijednost mjerene
velicine. Ali zato mozemo imati vise povjerenja u dobijeni rezultat, ako kazemo da je on samo
procjena stvarne vrijednosti, jer je to znatno blaza tvrdnja. Naravno, jednostavno smanjenje
pouzdanosti rezultata na ovaj nacin, nece biti od neke narocite koristi za korisnike to rezultata.
Potencijalno korisnika dobijeno rezultata svakako zanima stvarna vrijednost mjerene velicine.
Medutim, stvarna vrijednost je hipoteticki koncept obzirom da se ona ne moze izmjeriti. U tom
slucaju najbolje sto mozemo uciniti, jeste da prikazemo podrucje vrijednosti, ciji je centar nasa
procijena stvarne vrijednosti i izjava, sa navedenim nivoom statisticko povjerenja, da se
stvarna vrijednost mjerene velicine nalazi nedje unutar to podrucja. Zapravo, sustina mjerne
nesiurnosti je upravo u odredivanju navedeno podrucja (intervala) moucih vrijednosti
(poledati prosirenu nesiurnost na strani xx).
xx Greska i Nesigurnost
(QA 157)Nesiurnost i reska su dva razlicita koncepta ili pojma koja ne bi trebalo mijesati.
Dakle, reska se moze definisati kao razlika izmedu dobijeno individualno rezultata i stvarne
vrijednosti mjerene velicine. Obzirom da stvarnu vrijednost nije mouce odrediti, slijedi, iz
navedene definicije da i resku takode nije mouce tacno utvrditi. Zbo toa bi se navedena
definicija reske mola preformulisati i definisati na sljedeci nacin: kao razlika izmedu dobijene i
referentne vrijednosti mjerene velicine(VIM 22). (QUAM 5)Kao takva, reska predstavlja jednu
numericku vrijednost. U principu kada je poznata vrijednost reske ona moze posluziti za
korekciju dobijeno mjerno rezultata. Medutim, vrijednost nesiurnosti, nikada ne moze
posluziti za korekciju dobijeno rezultata. Zbo toa, nesiurnost rezultata mjerenja nikada ne
bi trebala biti interpretirana kao reska ili kao reska nastala nakon korekcije. reske se obicno
klasificiraju na slucajne (neodredene) i sistematske (odredene). (VIM 23)Slucajna reska se
definise kao komponenta mjerne reske, koja u ponovljenom mjerenju varira na nepredviden
nacin. (QA 158)Slucajna reska nastaje dakle, kao rezultat promjene odredenih nepoznatih
faktora koji uticu na vrijednost mjerene velicine, a koji su izvan kontrole osobe koja izvodi
mjerenje (kao sto je npr. vanjska temperatura). Ovaj tip reske, ciji uzroci nisu tacno poznati,
dovode do toa da rezultat varira na nepredviden nacin od jedno do druo mjerenja. Prema
tome, nije mouce ispraviti dobijeni individualni rezultat slucajnom reskom, ali na svu srecu
one su obicno male i pokoravaju se zakonu vjerovatnoce. Zbo toa slucajnu resku analiticko
rezultata nije mouce kompenzovati, ali zato obicno ona moze biti smanjena (redukovana)
povecanjem broja mjerenja i racunanjem srednje vrijednosti to mjerenja. (QUAM 5)Treba
istaci da eksperimentalna standardna devijacija aritmeticke srednje vrijednosti ili srednje
vrijednosti serija mjerenja, nije slucajna reska srednje vrijednosti, iako je tako prikazana u
nekim publikacijama o nesiurnosti. Ona je, umjesto toa, mjera nesiurnosti srednje
vrijednosti, koja je posljedica nekih slucajnih efekata. Tacna vrijednost slucajne reske, koja
proizilazi iz ovih efekata, u srednjoj vrijednosti ne moze biti poznata. (VIM 22)Sistematska
reska je takode prema definiciji komponenta mjerne reske koja u ponovljenim mjerenjima
ostaje konstanta ili se mijenja na predviden nacin. (QA 158)Ovaj tip reske, moze se objasniti
odredenim uzrocima, pa se prema tome njihova pojava u mnoim slucajevima moze predvidjeti,
a njihova velicina (u principu, ako ne i uvijek u praksi) mjeriti i uzeti u obzir uvodenjem
odovarajuce korekcije. Ona se razlikuje od slucajne reske u tome sto ne moze biti
redukovana povecanjem broja mjerenja pri konstantnim mjernim uslovima. Vec smo rekli da je
sistematsku resku mouce ispraviti (ukloniti) ukoliko se otkrije, ali ta korekcija nece biti u
potpunosti tacna (precizna) jer ce zasiurno uvijek postojati odredena nesiurnost o stvarnoj
vrijednosti sistematske reske. Npr., u analitickoj hemiji cesto koristimo slijepu probu da bi
procijenili uticaj reaenasa na mjerni odovor, kada je utvrdeno prisustvo analita. zmjerena
vrijednost slijepe probe je oduzeta od vrijednosti za uzorak i standard prije neo sto je konacni
rezultat izracunat. Da ne oduzimamo (ili uzimamo u obzir) vrijednost slijepe probe
(pretpostavljajuci da je razlicita od nule) od rezultata izvedeno mjerenja, tada bi sistematska
reska bila uvedena u nas krajnji rezultat. (QUAM 5)Konstantne sistematske reske, kao sto su
nemoucnost da se napravi odovarajuca slijepa proba ili neprecizno napravljeni standardni
rastvori tokom vise tackaste kalibracije instrumenata, su konstantni za odredeni nivo mjerene
vrijednosti, ali mou varirati ovisno o vrijednosti mjerene velicine. Efekti koji se sistematski
mijenjaju tokom analize, uzrokovani npr. neadekvatnom kontrolom eksperimentalnih uslova,
doprinose povecanju sistematskih resaka koje nisu konstantne. (QA 158)Zbo toa dje je
od sistematska reska prepoznata ili moze biti izracunata ona treba biti koriovana u odnosu
na krajnji rezultat. Bilo kakva korekcija koju napravimo, kako smo vec rekli, vrlo je malo
vjerovatno da je tacna, pa je zbo toa potrebno napraviti procjenu u kolikoj mjeri bi ta nasa
korekcija mola biti poresna. Ta procjena treba biti ukljucena u izracunavanje nesiurnosti.
Slika xxx. ilustruje razliku izmedu navedena dva tipa reski, koristenjem primjera o kolicini
ispustene tecnosti iz pipete od 25 ml klase A.











Slika xxx. lustracija razlike izmedu slicajnih i sistematskih reski, koja je prikazana na primjeru
o kolicini ispustene tecnosti iz pipete od 25 mL klase A.
Na pipeti je naveden volumen od 25 mL. Medutim, zahvaljujuci primjenjenom procesu
proizvodnje, utvrdeno je da stvarni volumen tecnosti kada je pipeta napunjena do kalibracione
oznake (inorisuci bilo kakve slucajne reske) iznosi 25.02 mL. Ta vrijednost je unutar
dozvoljeno podrucja tolerancije za pipetu klase A od 25 ml (koja iznosi 0.03 mL prema BS
1583:1986). Ovo je sistematska reska, s obzirom da ce volumen tecnosti ispustene iz pipete
uvijek biti veci za 0.02 mL u odnosu na naznaceni volumen, svaki put kad se pipeta koristi.
Pored toa, svaki put kada analiticar koristi pipetu, tacna pozicija meniskusa u odnosu na
klaibracionu liniju (oznaku) ce neznatno varirati. Ovo je slucajna reska, obzirom da ce pozicija
meniskusa varirati na nepredviden nacin. To je ilustrovano na Slici xxx malim promjenama u
poziciji meniskusa iz jedno eksperimenta u drui. Prisustvo obje ove vrste reski znaci da ce
volumen ispustene tecnosti iz pipete neznatno varirati pri svakoj njenoj upotrebi. To nas dovodi
do nesiurnosti u volumenu ispustene tecnosti pipetom. U svakom mjernom procesu, mouce je
primjetiti vise od jedno slucaja svako tipa reske. Zbo toa su reske nedovoljne za
opisivanje kvaliteta mjerno rezultata. Mjerna nesiurnost, u druu ruku, kombinira sve efekte
razlicitih faktora koji mou uticati na mjerni rezultat, u jedno podrucje vrijednosti.
xxx Proces procjene mjerne nesigurnosti rezuItata mjerenja
(QA 162)Kao sto smo i rekli u ranijem pisanju, rezultat mjerenja nije kompletan (potpun) ukoliko
tom rezultatu nije pridruzena odovarajuca mjerna nesiurnost. U bilo kojoj mjernoj proceduri,
postoji odredeni broj operacija koje povecavaju (doprinose) ili uticu na nesiurnost. Nesiurnost
se pojavljuje kao posljedica prisustva obje vrste reski, i slucajne i sistematske. Da bi prikazali
vrijednost nesiurnosti, koja je pridruzena rezultatu, potrebno je identificirati sve mouce izvore
nesiurnosti, odrediti njihovu velicinu (ili uticaj), a zatim ih kombinovati (medusobno povezati)
kako bi dobili jednu vrijednost u kojoj su sadrzani uticaji svih znacajnih izvora reske. Postupak
(proces) procijene nesiurnosti mjerenja moze, u skladu s tim, biti podijeljen na cetiri dijela:
specifikacija mjerne veIicine, identifikacija izvora nesigurnosti, kvantifikacija
kallbraclona
oznaka 2302 ml
kspetlmeot 1
menlskus lspod llnl[e
kspetlmeot 2
meolskos lzooJ llolje

kspetlmeot J
menlskus na llnl[l
komponenata nesigurnosti i racunanje kombinovane standardne nesigurnosti. Jasno je
da ce se pojedini dijelovi ovo procesa, kao sto su specifikacija mjerne velicine i identifikacija
izvora nesiurnosti, medusobno razlikovati, ovisno o vrsti analiticko problema, ali zbo
objektivne nemoucnosti, i same teme ovo rada sve te razlike nece biti razmatrane. Zbo toa,
ce se za razmatranje navedenih dijelova procesa procjene mjerne nesiurnosti pored opste
pristupa, kao primjer, koristiti i analiticki problem koji se odnosi na temu rada, tj. sadrzaj
ukupno zeljeza u uzorku cesticne tvari zraka.
xxx.Specifikacija mjerne veIicine
(QA 162)Da bi nesiurnost bila pravilno utvrdena potrebno je postaviti odovarajuci "model
jednacine koji na adekvatan nacin opisuje metodu analize. Polazna osnova jeste jednacina
koja se koristi za racunanje krajnje rezultata. (GUM 8) U mnoim slucajevima, mjerni
parametar (krajnji rezultat) Y, ne mjeri se direktno, vec se odreduje iz N druih parametara X1,
X2, ., X
N
preko funkcionalno odnosa :
I = (X
1
, X
2
, ., X
N
) (iii)
funkcija modela 1 prikazuje mjerni postupak i metodu odredivanja vrijednosti izlazne velicine.
Sada mozemo reci da je model mjerne procedure, zapravo funkcionalni odnos izmedu ulaznih
parametara( X
N
) i izlazno parametra ili mjerene velicine (Y). Vrijednost parametra Y, dobijena
pomocu Jednacine (iii) koristenjem vrijednosti ulaznih x1, x2, ., xN, N parametara X1, X2, .,
Xn, obiljezava se sa y. Prema tome, vrijednost izlazno parametra y, koji ujedno predstavlja i
rezultat mjerenja dat je izrazom:
= (, , ., ) (ii)
Model mjerne procedure je dakle, jednacina koju koristimo za racunanje rezultata y. Ulazni
parametri (X
N
) mou biti parametri cije su vrijednosti i nesiurnost direktno odredeni mjerenjem
(procjena Tipa A, statisticka analiza serije mjerenja) ili su preuzeti iz mjerenja iz vanjskih izvora
(procjena Tipa B, prethodni eksperimenti, literaturni podaci, informacije od proizvodaca i dr.).
Naravno, sve ce biti puno jasnije kada svaki od ovih koraka procesa procjene nesiurnosti,
prikazemo na konkretnom primjeru analiticko problema. Taj problem u ovom slucaju ce biti,
kako je vec receno, sadrzaj ukupno zeljeza (Fe) u uzorku cesticne tvari zraka (kompletna
mjerna procedura nalazi se u eksperimentalnom dijelu ovo rada, na strani xx, pod stavkom xx).
Dakle, mjerni model jednacine, prema kojem se racuna krajni rezultat, za navedeni analiticki
problem bi bio:

Fc
=
(c
1
x V
1
x I
1
)-(c
2
x V
2
x I
2
)
m
2
-m
1
g g
-1
(12)
dje je
Fc
, sadrzaj ukupno zeljeza u uzorku cesticne tvari zraka (g g
-1
), c
1
, je koncentracija
Fe u uzorku cesticne tvari zraka ocitana sa kalibracione krive (g L
-1
), v
1
je volumen odmjerno
suda u kojem je bio rastvor uzorka cesticne tvari iz koje je vrseno ocitavanje koncentracije
analita na instrumentu (L), f
1
je faktor razblazenja uzorka, bez jedinice, koji iznosi 100 (50
mL/0.5 mL), c
2
je koncentracija slijepe probe metode koja je ocitana sa iste kalibracione krive
(g L
-1
), a koja se oduzima od c
1
kako bi se dobila vrijednost koncentracije koja se odnosi samo
na zeljezo, v
2
je volumen odmjerno suda u kojem je bio rastvor slijepe probe metode iz koje
je vrseno ocitavanje koncentracije na instrumentu (L), f
2
je faktor razblazenja uzorka, bez
jedinice, koji iznosi 100 (50 mL/0.5 mL), m
1
je masa prazno filter papira (), m
2
je masa filter
papira sa uzorkom cesticne tvari (). Za pocetak treba razmotriti nesiurnost parametara koji se
pojavljuju u datoj jednacini. Ne treba iskljuciti moucnost prosirenja te jednacine kako bi se uzeli
u obzir i ostali parametri koji mou uticati na finalni rezultat i koji takode doprinose mjernoj
nesiurnosti. Takoder je neophodno imati dobro razumijevanje analita ili osobine koja se
odreduje. Npr. analiticar odreduje sadrzaj olova prisutno u boji koja se nalazi na irackama.
Jedna moucnost je da se u tom slucaju za odredivanje olova koristi metoda kojom se odreduje
ukupan sadrzaj prisutno olova. Drua opcija jeste da je analiticar zainteresovan samo za
kolicinu olova koja se oslobodi iz uzorka boje uzeto sa iracke, kada se taj uzorak podvrne
ekstrakciji sa smjesom kiselina koje simuliraju zelucani sadrzaj. U oba slucaja krajnji ishod
mjerenja je isti, a to je koncentracija olova u rastvoru. Medutim dobijeni rezultat ove dvije vrste
analize veoma ce se razlikovati. U prvom slucaju uzorak je diestiran sa jakim kiselinama
usljed cea bi svo prisutno olovo trebalo biti rastvoreno. U druom slucaju ocekujemo da taj
rezultat za olovo bude nizi jer se metoda odnosi na procjenu kolicine olova koje se oslobodi
pod odredenim uslovima. Drua opcija ore navedene metode ponekad se naziva i empirijska
metoda. To je metoda u kojoj je dobijeni rezultat u potpunosti ovisan o vrsti analiticke metodi. U
ore navedenom primjeru, ukoliko se promjeni koncentracija kiseline koja simulira zelucani
sadrzaj ili se promjene uslovi ekstrakcije, tada se i rezultat mijenja. Pri procjeni nesiurnosti,
veoma je vazno razumjeti razliku izmedu empirijskih i neempirijskih metoda, jer od te razlike
zavisi nacin procjene nesiurnosti. U slucaju neempirijkih metoda bilo kakav bias rezultata koji
je posljedica metode analize ili npr. specificne vrste analita, treba uzeti u obzir kao dio procesa
procjene nesiurnosti. Ako kao primjer uzmemo metodu kojom se odreduje ukupna kolicina
kadmijuma u tlu, ali se iz neko razloa ekstrahuje samo 90% kadmijuma prisutno u tlu, tada
taj 10% bias treba uzeti u obzir pri procijeni nesiurnosti. Jedan od nacina na koji bi se to molo
postici bila bi korekcija rezultata za pomenuti dobijeni bias. Medutim, ta korekcija bi imala svoju
nesiurnost a pored toa bi postojala i nesiurnost pri odredivanju biasa. Za empirijske metode
bias je prema definiciji jednak nuli (metoda odreduje vrijednost dobijeno rezultata). No bez
obzira, kada utvrdujemo nesiurnost rezultata dobijeno empirijskom metodom, i u tom slucaju
je potrebno uzeti u obzir nesiurnost koja je sastavni dio biasa utvrdeno u laboratoriji tokom
primjene metode. Drui nacin, je da se analizira referentni materijal koji je okarakteriziran istom
empirijskom metodom. Ukoliko ne postoji odovarajuci referentni materijal tada mora biti
odredena svaka vrsta biasa karakteristicna za svaki korak metode koja se primjenjuje u datoj
laboratoriji.
xxx Identifikacija izvora nesigurnosti
(QA163)Sljedeci korak u procesu procjene nesiurnosti, jeste pisanje liste na kojoj su
identificirani svi mouci izvori nesiurnosti mjerne procedure. U ovom koraku nije bitan njihov
kvantitativni doprinos. Neki od identificiranih izvora u ovoj fazi mou se pokazati beznacajnim,
ali to ce u potpunosti biti objasnjeno u narednom koraku procesa procjene nesiurnosti. Da bi
se u odredenoj metodi identificirali izvori nesiurnosti od pomoci mou biti i dijarami toka
(poznati i kao cause and effect dijarami i dijarami u vidu "riblje kosti) u kojem su predstavljeni
koraci metode. Na taj je nacin mouce identificirati izvore nesiurnosti povezane sa svakim
korakom. (QUAM 13) Prilikom formiranja navedene liste izvora nesiurnosti pozeljno je
startovati od osnovno izraza za racunanje mjerene velicine. Svi parametri u tom izrazu mou
imati nesiurnost kao sastavni dio njihove vrijednosti pa se stoa mou smatrati potencijalnim
izvorima nesiurnosti. Takoder mou postojati i drui parametri koji se eksplicitno ne pojavljuju
u izrazu za proracun vrijednosti mjerene velicine, a koji ipak uticu na mjerni rezultat, kao sto su
npr., vrijeme ekstrakcije ili temperatura. Oni su takode potencijalni izvori nesiurnosti. Pomenuti
dijarami su veoma poodan nacin predstavljanja izvora nesiurnosti, koji pokazuju medusobni
odnos izvora nesiurnosti i njihov uticaj na nesiurnost rezultata. Takode pomazu i da se
izbjene dupliciranje izvora. ako se lista nesiurnosti moze prikazati i na drui nacin ovi
dijarami se danas koriste u znacajnoj mjeri. Jedan takav dijaram, koji se odnosi na opsti
slucaj prikazan je na Slici xxx.

Slika xxx: Opsti primjer dijarama toka najznacajnijih komponeneata mjerne nesiurnosti
Kada je sastavljena lista izvora nesiurnosti, njihov uticaj na rezultat u principu moze biti
predstavljen kao formalni mjerni model, u kojem je svaki uticaj povezan sa parametrom ili
promjenljivom u jednacini. Tada ta jednacina predstavlja kompletan (potpun) model mjerno
procesa u uslovima kada su svi individualni faktori koji uticu na rezultat uzeti u obzir. Ova
funkcija moze biti veoma komplikovana i mozda nece postojati moucnost njeno eksplicitno
predstavljanja. Medutim, tamo dje je od to mouce, to treba biti uradeno, jer ce napisani izraz
odrediti nacin kombinovanja individualnih izvora (doprinosa) nesiurnosti. Takoder korisno
moze biti i posmatranje mjerne procedure kao serije odvojenih operacija, dje se svakoj moze
pristupiti zasebno, da bi se dobila ili procijenila nesiurnost vezana za njih. Ovo je posebno
koristan pristup kada slicne mjerne procedure dijele pojedine zajednicke operacije. U tom
slucaju nesiurnost svake operacije predstavlja doprinos ukupnoj nesiurnosti. U praksi
analiticko mjerenja, mnoo je uobicajenije razmatrati nesiurnost povezanu sa elementima
lobalnih ili sveukupnih performansi metode, kao sto su mjerna preciznost i bias mjereni u
odnosu na odovarajuci referentni materijal. Ovi doprinosi, eneralno predstavljaju najvaznije
doprinose pri procjeni nesiurnosti i najbolje se odreduju kada se odvojeno analizira njihov
uticaj na rezultat. Drui izvori koji doprinose nesiurnosti tada se analiziraju samo da bi se
provjerio njihov znacaj, a kvantificiraju se samo oni koji su znacajni. Tipicni izvori nesiurnosti
su:
(QA 164)xx Uzorkovanje
Ako uzorkovanje predstavlja dio specificnosti u prvom koraku procesa procjene (uzorkovanje i
analiza su provedeni u istoj laboratoriji), tada nesiurnost povezana sa varijacijama
izmedu razlicitih uzoraka ili bilo kakav bias u proceduri uzorkovanja treba uzeti u obzir. Ako
laboratorija analizira uzorke odmah nakon prijema, onda uticaji uzorkovanja, koje je izvedeno
izvan laboratorije ne moraju biti uzeti u obzir. Medutim, nesiurnost povezana sa bilo kojim
uzorkovanjem koje se vrsi u laboratoriji da bi se dobili ispitni uzorci koji ce se analizirati, treba
uzeti u obzir.
xx Efekti uzorka
Na izdvajanje analita (rikaveri analita) iz kompleksno matriksa mou uticati drue komponente
matriksa. Homoenost uzorka ce takode uticati na rezultat, a to je povezano sa ore opisanim
uzorkovanjem. Fizicki ili hemijski oblik analita moze dovesti do netacno rezultata, npr. jedan
element moze postojati u vise od jedno oksidacijsko stanja u uzorku i na osnovu toa nece u
potpunosti biti odreden metodom koja zahtjeva samo jedno odredeno oksidacijsko stanje.
Uzorak i/ili analiti mou biti nestabilni uzrokujuci promjene u sastavu uzorka tokom izvodenja
analize.
xx UsIovi cuvanja (skIadistenja)
Ako se uzorci cuvaju odredeni period do pocetka analize, uslovi cuvanja mou uticati na
rezultat. Prema tome, uslove kao i vrijeme skladistenja treba uzeti u obzir kao mouce izvore
nesiurnosti.
xx Uticaj instrumenta/opreme
Primjeri ukljucuju kalibraciju i preciznost analiticko sistema, zatim specificnu tolerantnost
volumetrijsko posuda i reulator temperature koji odrzava trazenu temperature koja se
razlikuje (unutar navedene specifikacije) od prikazane vrijednosti temperature.
xx Cistoca reagenasa
Cistoca mnoih reaenasa je specificirana od strane proizvodaca kao, ne ispod navedene
specificirane vrijednosti. Bilo kakva sumnja u navedeni nivo cistoce doprinosi nesiurnosti.
Takode je bitna i vrsta prisutnih necistoca. Cistoca supstance kao sto je CRM imaju prikazanu
vrijednost cistoce zajedno sa odredenom nesiurnoscu koja se odnosi na tu vrijednost.
xx Mjerni usIovi
Ako vanjski uslovi (temp. i vlaznost) imaju znacajni uticaj na mjerni rezultat tada je potrebno
posvetiti posebno paznju na kontroliranje tih uslova tamo dje je to mouce. zvor nesiurnosti
predstavlja i ocitanje vrijednosti volumena sa volumetrijsko posuda na temperaturama
razlicitim od onih na kojima je to posude kalibrisano. Tu cinjenicu moramo uzeti u obzir pri
procjeni nesiurnosti mjerno volumena koristeci volumetrijsko posude.

xx Efekti pripreme uzorka
Mnoe metode zahtjevaju odredeni tretman uzorka prije determinacije analita. To su npr.
susenje, mljevenje ili mjesanje, ekstrakcija i diestija uzorka. Promjena uslova u kojima se ove
operacije odvijaju (npr. temperatura, ekstrakcija i vrijeme, sastav rastvaraca i dr.) mou uticati
na krajnji rezultat.
xx Uticaj operatora
Analiticar moze uporno poresno ocitavati neku mjernu skalu, zatim ce skoro uvijek postojati
razlicita tumacenja ili procjene npr. zavrsne tacke titracije.
(QUAM 15) xx Efekti racunanja
zbor modela kalibracije uticace na rezultat. Npr. koristenjem podataka koji ne daju dobar
kalibracioni pravac rezultirace dobijanjem vrijednosti sa kalibraciono pravca koje imaju vecu
nesiurnost. Skracivanje i zaokruzivanje pri racunanju takode mou voditi ka netacnom
finalnom rezultatu.
xx SIucajni efekti (uticaji)
Slucajni uticaji doprinose nesiurnosti u svim mjernim procedurama. Prema tome slucajne
uticaje treba uvijek ukljuciti u listu izvora nesiurnosti. Pretpostavljena (napisana) stehiometrija,
dje se pretpostavlja da jedan analiticki proces slijedi odredenu stehiometriju, moze se desiti da
se konstatuje odstupanje od predvidene stehiometrije usljed nekompletne reakcije ili nezeljenih
reakcija.
xx Korekcija sIijepom probom

Postojace odredena nesiurnost kako za dobijenu vrijednost tako i za korekciju odovarajucom
slijepom probom. Ovo je narocito vazno u analizi traova (ili vrlo niskih koncentracija).
(QA 165)Pomenuta lista izvora nesiurnosti treba u svom sastavu imati neke od stavki ore
nabrojanih, ali je mouce identificirati i drue izvore nesiurnosti. Ne smije se zaboraviti, da se
nesiurnost ne odnosi na resku. Krajnja namjera odredivanja (procjene) nesiurnosti jeste da
se prikazu varijacije u rezultatu kada je metoda ispravno interpretirana i statisticki kontrolirana.
U listu izvora nesiurnosti ne treba ukljuciti bilo kakve velike reske kao sto su kontaminacija
uzorka, reske u racunanju ili reske nastale usljed nepravilno interpretiranja i provodenja
standardnih operacija procedure od strane analiticara. Ako bi sada, imajuci u vidu sve
navedeno, razmatrali jednacinu (12), identificirali bi sljedece izvore nesiurnosti (odovarajuci
dijaram toka prikazan je u eksperimentalnom dijelu ovo rada na strani xxx pod stavkom xx):

xx KaIibraciona kriva
Kalibracija je proces uspostavljana odnosa izmedu sinala instrumenta koji mjerimo i poznate
kolicine analita. Uzorci sa poznatom kolicinom analita upotrijebljeni za uspostavljanje sinal
koncentracijsko odnosa nazivaju se "kalibracioni standardi". Proces konstrukcije kalibracione
krive pocinje pripremom i mjerenjem kalibracionih standarda sa odovarajucim rasponom
koncentracije analita. Vrijednosti mjerno sinala svako standarda, koji zavisi od koncentracije
analita, mou se upotrijebiti za raficki prikaz te zavisnosti, y = f (x), linijskim spajanjem serije
tacaka (x
i
, y
i
) dje je x
i
koncentracija ili kolicina analita u standardima a y
i
je mjerni sinal
svako standarda. Kada se uspostavi ovaj odnos koji se naziva kalibraciona kriva (pravac)
mouce je izracunati koncentraciju analita u nepoznatom uzorku, mjerenjem njeovo sinala.
Kalibraciona kriva predstavlja, dakle empirijsku jednacinu koja povezuje odziv (sinal)
specificno instrumenta sa odredenom koncentracijom analita u uzorku odredeno matriksa
(hemijsko okruzenja uzorka). Pravilno konstruisana kalibraciona kriva je neophodna da bi se
enerirali pouzdani rezultati. Svaki instrument koji se koristi u hemijskoj analizi karakterizuje se
tom specificnom funkcijom odziva, a to je, kako smo vec rekli, zapravo jednacina koja povezuje
izlazni sinal instrumenta (y) sa ulaznim sinalom, u ovom slucaju koncentracijom analita (x).
Ova funkcija odziva ili odovora instrumenta u zavisnosti od koncentracije analita moze biti
linearna, loaritamska, eksponencijalna, ili bilo koje druo odovarajuce matematicko
oblika, ovisno o prirodi ponasanja sistema koji se mjeri, i samo procesa mjerenja. Neki
uobicajeni primjeri navedeni su u nastavku:

Vrsta kalibracione krive Jednacina
Linearna (bez odsjecka na yosi) y = a x
Linearna (sa odsjeckom na yosi) y = a x + b
Loaritamske y = b + a ln x ili y = b + 2.303 a lo x

Dok su ove stvari mozda teoretski poznate, postoje razliciti faktori (kao sto su specificnost
analita koji se mjeri, smetnje ili interferencije sa ostalim komponentama matriksa uzorka, ili
slucajne eksperimentalne reske) koji zahtijevaju da se kalibrira svaki instrument za odredenu
vrstu analita i uvjete mjerenja koji ce se koristiti u odredenom eksperimentu. Analiticki metod ili
instrument se cesto kalibrise, mjerenjem odziva instrumenta, y, u odnosu na razlicite
koncentracije (kolicine) analita, x. U vecini slucajeva taj odnos je linearan i predstavlja se
jednacinom:
= I +b (ii)
Ovaj kalibracijski pravac se zatim koristi za odredivanje koncentracije analita (x) iz uzorka koji
daje mjereni odziv (y)

prema jednacini :
=
(-b)
u
(ii)
dje parametri u jednacini imaju uobicajeno znacenje i dati su unastavku. Obzirom da je
najcesca funkcija odziva sinala u instrumentalnoj analitickoj hemiji linearna, potrebni su
odredeni kriteriji za utvrdivanje i kvalifikovanje najoptimalnije prave linije koja prolazi kroz
kalibracione tacke. Prvi korak u tom procesu jeste provjera linearnosti kalibraciono rafika,
odnosno da li y i x varijable linearno koreliraju. Prije raspravljanja o tome, treba imati na umu da
cak i kada ocekujemo linearnu funkciju odziva instrumenta, ne smijemo pretpostaviti da
kalibracioni podaci uvijek moraju biti linearni.(stat 110) Uobicajena metoda procjene pasovanja
eksperimentalnih tacaka pravoj liniji odnosno linearnosti je racunanjem trenutno ili
Pearsonovo korelaciono koeficijenta r (koji moze biti oznacen i sa R). U statistici on se cesto
naziva jednostavno kao "korelacioni koeficijent zbo toa sto je u kvantitativnoj nauci jedan od
najcesce koristenih tipova korelaciono koeficijenta. U praksi, uz kalibracioni krivu obicno se
prikazuje jednacina pravca i koeficijent korelacije R odnosno koeficijent determinancije
2
.
Postoje zapravo razliciti koeficijenti korelacije, medutim, onaj o kome cemo mi u nastavku
ovoriti je Pearsonov ili trenutni koeficijent korelacije. Vrijednost Pearson koeficijenta korelacije
(R) predstavlja stepen ili nivo do koje vrijednosti x i y linearno koreliraju. To mozemo vizuelno
ocijeniti pomocu xy dijarama (Slika y), na kojem smo obiljezili centroid podataka ( , y).

Slika y XY dijaram na kojem je prikazan centroid podataka ( , y).
Ako x i y linearno koreliraju, trebalo bi ocekivati da se sve tacke nalaze na pravoj liniji koja
prolazi kroz centroid (Slika xxx). Kao rezultat toa, ocekujemo da sve vrijednosti x budu
jednoliko distribuirane sa bilo koje strane u odnosu na centroid, slicno, sve vrijednosti y bi
trebale biti ravnomjerno rasporedene oko . Pearsonov koeficijent korelacije R izracunava se
po formuli:

dje je

vrijednost to mjerenja ulazno parametra (koncentracije) x, je srednja vrijednost

te serije mjerenja svih ulaznih parametara (koncentreacija) x,

je vrijednost to mjerenja
izlazno parametra (mjerno sinala) y, y je srednja vrijednost te serije mjerenja svih izlaznih
parametara (mjernih sinala) y. Ako x i y savrseno linearno koreliraju, u tom slucaju vrijednosti
R mou biti +1, 1, 0, ovisno o tome da li se y povecava (pozitivni naib ili pozitivna korelacija) ili
smanjuje (neativan naib ili neativna koreacija) sa x, ili ne postoji linearna korelacija izmedu
izmedu x i y. z iskustva je poznato da su R vrijednosti dobijene u instrumentalnoj analizi obicno
veoma visoke, iako podaci ne moraju nuzno biti linearni, stoa je pored njeove vrijednosti,
potrebno nacrtati i odovarajuci kalibracioni rafik, jer tek tada mozemo biti siurni da je
uspostavljen linearan odnos vizuelnom provjerom to rafika (Slika xx a). U vecini slucajeva,
mjerni instrumenti ce pokazivati linearnost samo u odredenoj reiji, a izvan to podrucja, bit ce
nelinearni. Zbo toa je vrlo vazno odabrati ispravnu reiju za linearnu analizu kako bi se
smanjile reske zbo nelinearnosti. Jedan od brzih i prakticnijih nacina da se to postine je da
se vizuelno preleda dijaram i odabere podrucje tacaka koje pokazuje linearnost (poledati
linearnost na strani xx). Vec smo rekli da su potrebni odredeni kriteriji za utvrdivanje i
kvalifikovanje najoptimalnije prave linije koja prolazi kroz kalibracione tacke. Nakon potvrdivanja
linearnosti, to moze biti uradeno pomocu reresijske analize, koja predstavlja metodu
odredivanja specificnih funkcija odnosa izmedu x i y (jednacina mjerno modela iiii), odnosno
reresijsko modela pomocu koje procjenjujemo vrijednost zavisno promjenljive varijable (y) u
odnosu na vrijednost nezavisno promjenljive varijable (x). Reresijski model moze se sasvim
jasno objasniti u slucaju tzv. linearne reresijske analize. Naime, svaka ravna linija u
kordinatnom sistemu moze biti predstavljena kao jednacina y = ax + b , dje su y i x vrijednosti
dvije varijable. U ovoj jednacini b je jednako vrijednosti y kada je x jednako 0, dok a predstavlja
naib te linije u kordinatnom sistemu a b odsjecak na yosi. Ako su poznate vrijednosti a i b tada
mozemo izracunati y za svaku vrijednost x. Reresijska analiza je, dakle tehnika za
uspostavljanje reresijske jednacine kojom predstavljamo eometrijsku liniju koja prolazi
najblize svim tackama distribuiranih vrijednosti dvije varijable u koordinatnom sistemu.
Reresijska jednacina je matematicki opis odnosa izmedu varijabli i omoucava nam zakljuciti
vrijednost y onda kada znamo vrijednost x. Da bismo pokazali zbo cea je kalibraciona kriva
izvor nesiurnosti mjerenja koristicemo tzv. dijarame rasipanja sa reresijskom linijom, y = ax
+b, prikazanim na Slici xx.

Slika xxx. XY dijaram koji prikazuje centroid (crni kru), reresijsku liniju, yrezidue
Prvi korak u istrazivanju zavisnosti varijabli x i y jeste crtanje raficko prikaza koji se naziva
dijaram rasipanja. Dijaram rasipanja u pravoulom koordinatnom sistemu tackama (xi, yi)
prikazuje parove vrijednosti dviju promatranih numerickih varijabli. Na osnovu takve slike mou
se odmah uociti osnovne veze medu promatranim varijablama. Na Slici xxx su prikazana dva
dijarama rasipanja. Slika (a) prikazuje funkcionalnu vezu izmedu dvije varijable x i y. Linija koja
povezuje sve tacke na slici je pravac. Matematicki oblik veze ovih dviju, posmatranih varijabli je
jednacina pravca y. Od te linije nema znacajnije odstupanja (sve tacke se skoro idealno nalaze
na pravcu), stoa se kaze da je ova veza stroo funkcionalna. Nacrtani pravac je rastuci,
odnosno porast vrijednosti jedne varijable prati porast vrijednosti drue posmatrane varijable
zbo cea je ova veza (korelacija) pozitivna. Cest slucaj u praksi prikazan je na Slici xxx(b). Ako
se izmedu tacaka ovo dijarama povuce linija, to bi opet bio pravac. Medutim ovdje su prisutna
i pozitivna i neativna odstupanja tacaka od to pravca a to se tumaci raznim uticajima druih
varijabli u prakticnom radu. Stoa ova veza nije vise stroo funkcionalna, vec se za nju kaze da
je statisticka (stohasticka ili slucajna) veza. Vec smo rekli da se stepen ili nivo do koje
vrijednosti x i y linearno koreliraju opisuje pomocu koeficijenta korelacije R. Pod pojmom
korelacije , za slucaj pod b na Slici xx, podrazumijeva se meduzavisnost ili povezanost slucajnih
varijabli. Vec smo rekli da po smjeru korelacija moze biti pozitivna i neativna. Za razliku od
korelacijske analize zadaca reresijske analize je da pronade analitickomatematicki oblik veze
izmedu jedne zavisne i jedne ili vise nezavisnih varijabli. Osim objasnjavanja prirode zavisnosti
promatranih pojava na temelju to analiticko oblika moze se vrsiti predvidanje vrijednosti
zavisne varijable pri odredenim vrijednostima nezavisneih varijabli. U slucaju postojanja samo
jedne zavisne i samo jedne nezavisne varijable kaze se da je to jednostavni reresijski model. U
suprotnom radi se o slozenom reresijskom modelu. Na temelju uzorka parova vrijednosti
varijabli x i y: (x1,y1), (x2, y2),..(xn, yn) crta se dijaram rasipanja koji je prikazan na Slici xxx.
Dijaram rasipanja pokazuje pozitivnu statisticku vezu izmedu varijabli x i y. Povucena linija
(pravac) na dijaramu je opcenito oblika:
= I +b (ii)
Medutim, svaka tacka

, na dijaramu rasipanja zadovoljava jednacinu:

= I +b lll

= I +b + (ll)
x

y = ax + b
x
?
a)
b)
y = ax + b
odnosno svaka tacka,

odstupa od kalibraciono pravca za pozitvnu ili neativnu razliku
(Slika xx) koja se naziva reziduom a koja nastaje kao posljedica predvidanja y u zavisnosti od x.
Reresijskom analizom traze se parametri a i b tako da pravac y prolazi izmedu tacaka
posmatranih varijabli na nacin da najbolje tumaci vezu izmedu njih, odnosno pravac mora biti
takav da odstupanja ( ), svake tacke (

) od kalibraciono (reresijsko) pravca y budu sto je
mouce manja. Postoji vise razlicitih metoda za procjenu ovih parametara, a najcesce koristena
metoda je metoda najmanjih kvadrata koja se upravo zasniva na ore navedenom. Ona daje
najbolje linearne nepristrasne ocjene i vrlo je cesto primjenjivana metoda za procjenu tih
parametara. Odstupanja ili razlika (), izmedu stvarnih vrijednosti (

) i ocekivanih (reresijskih
ili kalibracionih) vrijednosti () mou biti pozitivna i neativna (

= ili

= + ), stoa
da se ne bi medusobno ponistile te pozitivne i neativne vrijednosti, ova metoda minimizira
sumu kvadrata tih razlika odnosno rezidua () prema sljedecoj jednacini:
J _
2 n
1
= min_ ( y
I
y)
2 n
I1
= min_ | y
I
(a + b)]
2 n
I1
(ii)
Druim rijecima, potrebno je konstruisati pravu liniju kod koje je zbir kvadrata ukupnih
odstupanja stvarnih vrijednosti (y
I
) u odnosu na odovarajuce reresijske vrijednosti (y) tj.
rezidua, minimalan. Prava linija koja je konstruisana na tom principu mora proci kroz centroid
podataka ( , y) Slika xxx. Matematicki se moze dokazati da je ta prava linija, nazvana linijom
najmanjih kvadrata data sljedecim izrazom:
I =
_ {( x
i
-x )(
i
-)]
n
i=1
_ (x
i
-x )
2 n
i=1
(ii) i b = I (ii)
dje je b reresijski parametar koji definise odsjecak na y osi odnosno tacka u kojoj linija
najmanjih kvadrata sijece os y, uz pretpostavku da je apscisa te tacke x = 0. Reresijski
parametar a, pokazuje prosjecnu promjenu zavisne varijable kada nezavisna varijabla poraste
za jedinicu. Ovaj parametar interpretira se i kao koeficijent smjera, odnosno naiba reresijsko
pravca koji moze imati pozitivni i neativni predznak, ovisno o smjeru veze izmedu posmatranih
varijabli. Linija koja je odredena pomocu dvije prethodne jednacine naziva se linijom reresije y
u odnosu na x, tj. linijom koja pokazuje kako se y mijenja sa promjenom x vrijednosti. Nakon
procjene parametara reresijsko modela postavlja se pitanje reprezentativnosti, odnosno
sposobnosti reresijsko modela da objasni kretanje zavisne varijable y u odnosu na odabranu
nezavisnu varijablu x. U tu svrhu koriste se neki apsolutni i relativni pokazatelji. Ovi pokazatelji
temelje se na raspodjeli odstupanja stvarne vrijednosti zavisnih varijabli (

) u reresijskom
modelu od njene aritmeticke sredine () i njenih ocekivanih vrijednosti (y). Reprezentativnost
reresijsko modela bit ce objasnjena pomocu slike 2.8.


ST SR



x

?

ax +b
S9
Slika 2.8. Dijaram rasipanja
Na slici 2.8. prikazan je dijaram rasipanja varijabli x i y s kalibracionim pravcem i njeovom
odovarajucom jednacinom y. Na slici je oznacena i aritmeticka sredina( ) varijabli . Pri
racunanju sume odovarajucih odstupanja, zbo vec ranije navedeno razloa, da se
medusobno ne bi ponistile pozitivne i neativne razlike racunaju se njihovi kvadrati:
= _ ( y y)
2 n
I1
(ll)
Pri cemu je SP suma kvadrata protumaceno ili objasnjeno dijela ukupnih odstupanja
vrijednosti varijable y od aritmeticke sredine, odnosno suma kvadrata ukupnih odstupanja
procjenjenih (reresijskih) vrijednosti varijable y od aritmeticke sredine y.

= _ ( y
I
y)
2 n
I1
(ii)
SR je suma kvadrata neprotumaceno ili neobjasnjeno dijela ukupnih odstupanja vrijednosti
varijable y od aritmeticke sredine, odnosno suma kvadrata ukupnih odstupanja empirijskih
(stvarnih) vrijednosti (y
I
) varijable y od procijenjenih (reresijskih) vrijednosti (y). Ova
odstupanja ili rezidue ( ) su ustvari posljedica slucajne reske. Rezidue dakle, predstavljaju
onaj dio varijabilnosti (odstupanja) koji nije mouce objasniti reresijskim modelom.
ST je suma kvadrata ukupnih odstupanja stvarnih vrijednosti varijabli (y
|
) od aritmeticke
sredine y . Odnosno slijedi da je:
= _ ( y
I
y)
2 n
I1
(ii)
ST = SP + SR (cc)
sto se vidi i na Slici 2.8. Ovaj izraz koji je u skracenom obliku dat pomocu (cc) zove se
jednacinom analize varijance i predstavlja temelj analize reprezentativnosti reresijsko modela.
Standardna reska reresije je apsolutni pokazatelj reprezentativnosti reresijsko modela, a
pokazuje prosjecni stepen varijacije stvarnih vrijednosti zavisne varijable (

) u odnosu na
ocekivane (reresijske) vrijednosti varijable (y) Slika 2.8. i izrazava se na sljedeci nacin:
o
y
= _
SR
n-2
=
_
_ ( y

- y)
2 n
=1
n-2
=
_
_ | y
i
(a+b)]
n
i=
J
(oo)
Jednacina (oo) predstavlja standardnu resku reresije jednostruko modela. Ova jednacina je
po obliku slicna jednacini za standardnu devijaciju serije ponovljenih mjerenja (jednacina xx), a
opisuje slucajne reske u y vrijednostima. Obzirom da slucajne reske u y vrijednostima poticu
od rezidua, jednacina (oo) naziva i standardnom rezidualnom devijacijom i obiljezava se sa S
(o
y
= S). Ova jednacina izrazava se u oriinalnim jedinicama mjere zavisne varijable y. Da
bismo prikazali kolicinu varijacija y vrijednosti koje su objasnjenje sa x vrijednostima koristi se
koeficijent determinacije koji je pokazatelj reprezentativnosti ili koji je mjera korisnosti
reresijsko modela a koji se temelji na analizi varijance. On se definira kao omjer sume
kvadrata ukupnih odstupanja protumacenih ili objasnjenih reresijom i sume kvadrata ukupnih
odstupanja i dat je sljedecim izrazom:
r
2
=
2
=

Za jednostavnu linearnu reresiju koeficijent determinacije je kvadrat korelacijsko koeficijenta (
r ili R) izmedu x i y. Koeficijent determinacije kaze koliko postotaka (%) je sume kvadrata
ukupnih odstupanja vrijednosti varijable y od aritmeticke sredine protumaceno reresijskim
modelom. Prema jednacini (cc) slijedi da je:
r
2
=

Vrijednost koeficijenta determinancije krece se u intervalu 0 r
2
. Reresijski model je
reprezentativniji ako je njeova vrijednost bliza 1 odnosno veci r
2
znaci i vecu snau modela u
objasnjavanju reresijske funkcije i dakle, bolju predikciju zavisne varijable. Teorijska ranica
reprezentativnosti je 0,9. Pri formiranju reresijsko modela postavljaju se i pretpostavke
slucajne reske (tzv. aussMarkovljevi uvjeti). Statistickom obradom tih uvjeta dolazi se do
zakljucka da je slucajna reska ili rezidua ( ) distribuirana normalnom distribucijom (vidi
normalnu distribuciju). Upravo je, navedena razlika izmedu stvarne ( y
I
) i reresijske vrijednosti
(y) koja se oznacava sa , koja moze biti pozitivna i neativna ( =

_), i koja se naziva
reziduom, devijacijom ili reskom (Slika xx), jedna od ako ne i najznacajnija komponenta
nesiurnosti kalibraciono pravca. Ta pozitivna ili neativna odstupanja od reresijsko pravca
(slika xx crveni pravac) svake tacke na dijaramu rasipanja mouce je iskazati pomocu
rezidualne standardne devijacije koja je predstavljena jednacinom (oo). Treba imati na umu da
se, kao sto je to obicno i slucaj u praksi, pretpostavlja da svaka reska u x vrijednostima lezi
iskljucivo u yvrijednosti. Tehnicki ledano, kako smo i naveli najoptimalnija prikazana prava
linija koja prolazi izmedu kalibracionih tacaka naziva se "linijom reresije y na x ". Ova metoda
linearne reresije pretpostavlja da se, reske normalno distribuisu oko reresijsko
(kalibraciono) pravca. Ostale metode koje postoje ne zasnivaju se na ovoj vrsti pretpostavke.
Potrebno je istaci da reske u y vrijednostima za vece vrijednosti x iskrivljuju najoptimalniji
pravac. To se moze uzeti u obzir koristeci robusne reresijske tehnike, sto nije predmet ovo
rada. U konkretnom primjeru za jednacinu (12) koncentracija c
1
i c
2
u uzorku cesticne tvari i
slijepe probe metode nakon razblazivanja maticnih uzoraka 100 puta odredena je rafitnom
tehnikom atomske absorpcione spektrometrije i izracunata pomocu jednacine kalibracione krive
koja slijedi:

= I c

+ bodnosno c

=
(A
i
- b)
u
L
1
dje je c

koncentracija zeljeza u uzorku cesticne tvari zraka ili koncentracija slijepe probe
metode,

je odovarajuca apsorbanca analita u uzorku, b je odsjecak kalibracione krive i I je

naib kalibracione krive. Kako su obje ove koncentracije odredene sa iste kalibracione krive, to
znaci da ce trebati uzeti u obzir nesiurnost kalibraciono pravca kada je on upotrijebljen za
ocitanje vrijednosti c
1
ali isto tako i za ocitanje vrijednosti c
2
.

xxx VoIumen
1
i
2

Volumen neko rastvora koji se nalazi u volumetrijskom sudu podlozan je trijema vecim
izvorima nesiurnosti:
nesiurnost kalibracije (od proizvodaca, bilo sa certifikata ili sa samo laboratorijsko posuda)
koja je posljedica nesavrsene kalibracije laboratorijsko posuda od strane proizvodaca
varijacije u punjenu volumetrijsko suda do marke (nesiurnost kalibracije suda u laboratoriji
uzima se u obzir jer i sami analiticari imaju uticaj, pa je i tu odredena vrijednost nesiurnosti, te
ju treba uzeti u obzir ) obicno se oznacava kao nesiurnost ponovljivosti punjenja ili mjerenja
temperature posude i rastvora razlikuju se od temperature na kojoj je volumen posude
kalibrisan, obicno se oznacava kao nesiurnost zbo ekspanzije volumena ili temperaturni
efekat
xxx Masa
1
i
2

Razlika izmedu mase prazno filtera,
1
i filtera sa uzorkom
2
predstavlja masu uzorka
cesticne tvari, koja je odredena je vaanjem, bez tariranja. Takoder je i masa koja se odreduje
vaanjem podlozna trijema vecim izvorima nesiurnosti:
nesiurnost kalibracije vae (od proizvodaca u vidu certifikata )
nesiurnost ponovljivosti mjerenja (vaanja)
nesiurnost preciznosti vae

xx Faktor razbIazenja F
1
i F
2


Maticni rastvori uzorka i slijepe probe razblazeni su 100 puta. Ta vrijednost faktora razblazenja
dobijena je tako sto je mikropipetom uzeto 0,5 mL maticno rastvora i prenijeto u odmjerni sud
od 50 mL. Zbo toa se nesiurnost faktora razblazenja sastoji od dvije komponente:
nesiurnosti volumena koji je uzet mikropipetom i nesiurnosti volumena odmjerno suda u
kojem je bio maticni rstvor analita. Obje ove komponente su takode podlozne trijema vecim
izvorima nesiurnosti kao sto je navedeno za volumen V1 i V2.

xxx Kvantifikacija komponenata nesigurnosti

(QA 165) Nesiurnosti identificirane u prethodnom koraku moraju sada biti kvantifikovane.
Postoje dva uobicajena nacina da se to postine, a to su:
O procjena nesiurnosti iz svako individualno izvora i njihova medusobna kombinacija
koristenjem matematickih pravila koja ce naknadno biti opisana (ovakav pristup procjene
nesiurnosti ponekad se oznacava kao "od dna prema vrhu)
O koristenjem podataka o performansama metode, kao sto su utvrdena preciznost i bias
(koji su odredeni u odnosu na odovarajucu referentnu vrijednost), da bi se procijenili
kombinovani efekti odredeno broja identifikovanih izvora nesiurnosti (ponekad nazvan
kao "od vrha prema dnu pristup). Ovakve procjene mou biti dobijene iz studija o
validaciji metode i podataka o kontroli kvaliteta.
U praksi kombinacija ova dva pristupa ili nacina mou biti koristena. Sve procjene nesiurnosti
moraju biti prikazane brojcano kao standardna nesiurnost. Termin standardna nesiurnost je
identican statistickom terminu standardne devijacije. Prema tome standardna nesiurnost je
utvrdena nesiurnost izrazena kao standardna devijacija. Standardna nesiurnost se obicno
oznacava simbolom . (QUAM 4)Nesiurnost mjerenja, opcenito obuhvata, vidjeli smo mnoe
komponente. Neke od tih komponenti se procijenjuju pomocu statisticke distribucije rezultata
serije ponovljenih mjerenja i mou biti kvantitativno okarakterisane standardnim devijacijama
odnosno standardnim nesiurnostima. Drue komponente (u vidu informacija sa npr.
kalibracionih certifikata, specifikacije proizvodaca, itd.) koje ne mou biti direktno procijenjene
statistickom analizom ponovljenih mjerenja, takode mou biti kvantitativno okarakterisane
standardnim devijacijama, koje se procjenjuju pomocu pretpostavljene vjerovatnoce distribucije
vrijednosti koja se bazira na iskustvu ili druim informacijama. SO vodic definise ova dva
razlicita slucaja kao procjene Tipa A i Tipa B. (GUM 6)Svrha klasifikacije na Tip A i B jeste da se
prikazu dva razlicita nacina evaluacije nesiurnosti iz razlicitih izvora i da bi se samo
pojednostavila diskusija vezana za tu problematiku; ova klasifikacija ne indicira postojanje bilo
kakve razlike u prirodi komponenti koje su odredene pomocu ova dva tipa evaluacije. Oba tipa
evaluacije nesiurnosti baziraju se na distribuciji vjerovatnoce, i komponenta nesiurnosti kao
rezultanta bilo koje tipa, kvantificira se kao varijansa ili kao standardna devijacija tj. standardna
nesiurnost.

xx Procjena nesigurnosti Tipa A

(VIM 26) Predstavlja evaluaciju komponenata mjerne nesiurnosti statistickom analizom serije
ponovljenih mjerenja napravljenih pod definisanim mjernim uslovima. (QA 166) Procjena
nesiurnosti Tipa A se prema definiciji izrazava dakle, standardnom devijacijom mjerenih
vrijednosti. Standardna nesiurnost proizasla iz slucajnih efekata obicno se odreduje na osnovu
studija o preciznosti i kvantificira se se kao standardna devijacija mjerenih vrijednosti. Kao
primjer, uzmimo seriju ponovljenih vaanja da bi utvrdili slucajnu resku koja se odnosi na
vaanje. Ako masa mjereno objekta iznosi tacno 10 , vrijednosti dobijene tokom vaanja su:
10.0001,10.0000,10.0002, 10.0002, 10.0001, 10.0000, 10.0001, 10.0000, 10.0002, 10.0000.
Kao sto se i vidi u ovoj seriji napravljeno je 10 mjerenja. Srednja vrijednost dobijenih rezultata
mjerenja je 10.00009 . Standardna devijacija ove serije mjerenja je, s = 0.000087559 .
zracunata standardna devijacija se, kako je vec receno sada naziva standardnom nesiurnosti i
izrazava se kao (o) = 0.000087559 , dje (o) predstavlja standardnu nesiurnost u
rezultatu (o) jedne serije vaanja, koja proizilazi iz slucajnih resaka koje se odnose na proces
vaanja. Ukoliko se ova procjena nesiurnosti zeli koristiti u buducem proracunu nesiurnosti,
tada je potrebno zadrzati sve znacajne cifre. Medutim, kada se prikazuje dobijena nesiurnost
ta vrijednost se obicno zaokruzuje na maksimalno dvije znacajne cifre. U prethodnom primjeru
nesiurnost bi bila prikazana kao (o) = 0.000088 . Ako rezultat neko mjerno procesa
predstavlja srednju vrijednost serija mjerenja, tada je standardna devijacija srednje vrijednosti
( sJ ) ispravan nacin procjene proracuna standardne nesiurnosti. Druim rijecima, u
poredenju sa nesiurnoscu rezultata jedne serije mjerenja, standardna nesiurnost rezultata,
koji predstavlja zapravo srednju vrijednost vise serija mjerenja je smanjena za faktor J ( dje
je n broj izvedeno mjerenja). Kao sto je vec receno, procjene nesiurnosti koje nisu direktno
dobijene statistickom evaluacijom podataka potrebno je prevesti u odovarajuci oblik tj.
standardnu nesiurnost, prije finalne kombinacije individualno procijenjenih nesiurnosti. Taj
postupak naziva se procjena nesiurnosti Tipa B i objasnjen je u nastavku.

xxx Procjena nesigurnosti Tipa B

(VIM 26)Prema definiciji predstavlja procjenu komponenata mjerne nesiurnosti koja se vrsi na
drui nacin u odnosu na procjenu nesiurnosti Tipa A. (QA 167) Vec smo vidjeli da nesiurnost
moze biti utvrdena iz veliko broja razlicitih izvora, zbo toa ce ona biti dostupna u vidu
razlicitih informacija. Medutim, tu nesiurnost, iz razlicitih izvora u vidu razlicitih informacija, koja
nije uvijek izrazena kao standardna nesiurnost, treba prevesti u odovarajuci oblik koristeci
odredeni broj pravila koja ce biti navedena u nastavku ovisno o vidu dostupne informacije.

xx Podaci izrazeni kao podrucje iIi intervaI povjerenja

Primjer: koncentracija standardno rastvora predstavljena je kao 1000 3 m/L, pri cemu 3
m/L predstavlja 95 % interval povjerenja. Podrucje povjerenja se racuna iz sljedece formule
s J . Da bi odredili standardnu nesiurnost treba izracunati vrijednost sJ , a da bi to
uradili moramo znati odovarajucu vrijednost Studentovo tkoeficijenta. Medutim, ovakvi
podaci su obicno dati bez navodenja stepena slobode. U takvim okolnostima, ukoliko se
pretpostavi da je proizvodac takve standardne otopine sproveo odovarajuci broj mjerenja da bi
odredio prikazanu vrijednost, prihvatljivo je da se upotrijebi vrijednost tkoeficijenta za
beskonacan broj stepeni slobode koji iznosi 1.96 pri 95%tnom intervalu povjerenja. Ukoliko je
broj stepena slobode poznat tada odovarajuca vrijednost tkoeficijenta moze biti procitana iz
statistickih tablica. U ovom primjeru standardna nesiurnost se racuna kao 3/1.96 = . mL
1
.

xx Podaci izrazeni kao prosirena nesigurnost ( U)
Primjer: koncentracija standardno referentno rastvora je 1000 3 m/L, dje je prikazana
nesiurnost zapravo prosirena nesiurnost, izracunata koristeci faktor prekrivanja, k = 2, koji
daje nivo povjerenja od priblizno 95%. Faktor prekrivanja (obicno oznacen sa slovom k) se
koristi da poveca (prosiri) standardnu nesiurnost kako bi se dobio trazeni nivo povjerenja
(obicno 95%). Da bi preveli prosirenu nesiurnost u standardnu nesiurnost, jednostavno njenu
vrijednost podijelimo sa navedenim faktorom prekrivanja. Kako je u ovom primjeru, k = 2, tada
se standardna nesiurnost racuna kao =3/k = 3/2 = 1.5 m/L.

xx Podaci predstavIjeni kao toIerancija

Primjer: tolerancija proizvodaca za pipetu od 25 mL klase A iznosi 0.03 mL, u skladu sa BS
1583. U ovom primjeru dat je interval vrijednosti bez indikacije distribucije ili nivoa povjerenja.
Zbo toa, moramo napraviti neke pretpostavke o moucoj distribuciji vrijednosti unutar
navedeno podrucja tolerancije. Jasno je da ne bi trebale postojati vrijednosti koje su izvan
navedeno podrucja tolerancije, jer bi to znacilo da je oprema "izvan specifikacije. Takoder bi
moli pretpostaviti da se vrijednosti pojavljuju bilo dje unutar navedeno podrucja tolerancije
sa jednakom vjerovatnocom. U primjeru pipete, pretpostavljamo da kada bi uzeli nekoliko pipeta
od 25 mL, i odredili prisutnu kolicinu tecnosti u svakoj od njih (inorirajuci bilo kakve slucajne
reske), rezultat bi se trebao nalaziti nedje izmedu 24.97 mL i 25.03 mL. Nijedan rezultat ne bi
trebao biti izvan ovo podrucje, i ako bi testirali dovoljno pipeta, zakljucili bi da su rezultati
ravnomjerno rasporedeni unutar to podrucja vrijednosti. Ovakav vid distribucije vrijednosti
naziva se pravouaona distribucija (raspodjela) i ilustrovana je na slici u Tabeli xxx. z te tabele
se jasno vidi da se pravouaona distribucija veoma razlikuje od normalne distribucije vrijednosti.
Normalna distribucija vrijednosti je neoranicena odnosno bez ranica, i vrijednosti koje su
raporedene oko najbolje procjenjene srednje vrijednosti, su vise vjerovatne, neo vrijednosti
koje se nalaze na vecim distancama od srednje vrijednosti. Standardna devijacija pravouaone
distribucije se odreduje dijeljenjem polovine podrucja distribucije (a na slici u Tabeli xx) sa . U
navedenom primjeru, uz pretpostavku pravouaone distribucije standardna nesiurnost je
0.03/ = 0.017 mL. U nekim slucajevima, pored navedeno podrucja tolerancije, mou
postojati i neke dodatne informacije koje nas upucuju da povjerujemo da su vrijednosti koje su
blize centru to podrucja verovatnije, neo vrijednosti koje su na krajevima to podrucja. U
takvim slucajevima, pretpostavlja se trouaona distribucija (raspodjela) vrijednosti, kao sto je
prikazano u Tabeli xx. Standardna devijacija odnosno nesiurnost trouaone distribucije,
odreduje se dijeljenjem polovine podrucja distribucije (a na slikama u Tabeli xx), sa . Obicno
je prihvatljiva pretpostavka o pravouaonoj distribuciji, kako bi se dobila prvobitna procjena
nesiurnosti koja se odnosi na tolerancije od strane proizvodaca. Medutim, ovakva
pretpostavka, nekad moze precjeniti nesiurnost. Vecina literature, pretpostavlja trouaonu
distribuciju za podrucje tolerancije koje se odnosi na volumetrijsko posude. Obrazlozenje takve
pretpostavke, je u cinjenici sto se smatra da je vjerovatnije da jedan renomirani proizvodac,
proizvodi laboratorijsku opremu, kod koje je vjerovatnije da su vrijednosti blize nominalnoj
vrijednosti neo krajevima dozvoljeno podrucja tolerancije. U praksi pretpostavka pravouaone
ili trouaone distribucije ne utice znacajno na ukupnu nesiurnost rezultata hemijsko mjerenja
obzirom da je tolerancija prisutna na volumetrijskom posudu vrlo rijetko znacajan izvor
nesiurnosti. U prethodnom pisanju naveli smo nacine ili pravila prevodenja dostupnih
informacija u standardnu nesiurnost. U Tabeli xx ukratko je prikazan nacin izracunavanja
standardne nesiurnosti pomocu parametara triju najvaznijih funkcija distribucije vrijednosti, sa
naznakom slucajeva kada svaka od njih treba biti koristena.

(QUAM 102)Tabela xxx Funkcije distribucije vrijednosti sa naznakama njihove upotrebe

Pravougaona distribucija

Forma
Koristi se kada je dostupna informacija u
vidu:
Standardna
nesiurnost











O Certifikata ili neke drue specifika
ije koja daje ranice bez navodenja
nivoa povjerenja (npr. 25 0.05 mL)

O Procjene nesiurnosti koja je data u
obliku maksimalno podrucja ( a )
bez znanja forme distribucije i kada
postoji podjednaka vjerovatnoca
nalazenja vrijednosti unutar cijelo
podrucja
() =
I

Trougaona distribucija

Forma Koristi se kada su:
Standardna
nesiurnost











O Dostupne informacije koje se odnose
na x manje oranicene neo za
pravouaonu distribuciju. Vrijednosti
blize x su vjerovatnije od vrijednosti
koje su blize krajevima

O Procjene koje su napravljene u formi
maksimalno podrucja ( a ) opisane
simetricnom distribucijom
() =
I

2a ( a)
Z a
O
2a ( a)
1/ a
O

NormaIna (Gaussova) distribucija

Forma Koristi se kada je:
Standardna
nesiurnost












O Procjena nesiurnosti napravljena iz
ponovljenjih mjerenja koja su
podlozna slucajnim uticajima

O Nesiurnost data u obliku standardne
devijacije s, relativne standardne
devijacije s/ , ili koeficijenta varijanse
CV% bez navodenja vrste distribucije

O Nesiurnost data u formi 95%tno (ili
druo) intervala povjerenja x U bez
navodenja tipa distribucije



() = s



() = s
() = (s )
() =
%

() =
(za U na 95%)
() =
(za U na 99.7%)


Vidjeli smo da kod kvantifikovanja komponenata mjerne nsiurnosti sve doprinose nesiurnosti
moramo prevesti u odovarajucu standardnu nesiurnost koja je karakteristika Normalne
(aussove) distribucije vrijednosti i koja ce zbo svo znacaja u nastavku biti ukratko opisana.

xxx NormaIna (Gaussova) distribucija podataka
(Savic 450)Ako se neko mjerenje ponovi veliki broj puta, a dobijeni rezultati ili opservacije
svrstaju u rupe bliskih vrijednosti, i ako se broj opservacija u svakoj rupi (y) nanese na
ordinate, a mjerene vrijednosti rupa (x) na apcisu, dobija se tzv. historam. Jedan historam u
nesto idealizovanom obliku prikazan je na Slici xx pod (a).
(a) (b)





Slika xx (a) Historam, Kriva normalne raspodjele (b).
Ukupan broj svih mjerenja naziva se populacijom. Ako bi broj izvrsenih mjerenja bio
beskonacno veliki, a rezultati svrstani u beskonacno uske (po vrijednosti x) rupe, dobijeni
rezultati bi se raspodijelili prema krivoj na Slici xx pod (b) poznatoj kao kriva normalne
raspodjele ili aussova kriva. (QA 141) Normalna ili aussova distribucija opisuje nacin na koji
se mjerni rezultati obicno distribuisu ili rasporeduju. Ovaj vid distribucije vrijednosti moze biti
okarakterisan sa dva parametra. Centar populacije opisuje se parametrom , koji je poznat i kao
2 o
O
M[erena vellclna x
l
r
e
k
v
e
n
c
l
[
a

y

M[erena vellclna x
l
r
e
k
v
e
n
c
l
[
a

y

srednja vrijednost populacije dok se sirenje ili rasijavanje svih vrijednosti populacije u odnosu na
karakterizira parametrom koji je poznat kao standardna devijacija populacije (Slika xx).
Vecina rezultata mjerenja, kada se dato mjerenje ponovi odredeni broj puta, slijedi normalnu
distribuciju. U normalnoj distribuciji, vecina rezultata je rasporedena oko centralne vrijednosti
dok je manji broj tih vrijednosti rasporeden na vecim udaljenostima od centra. Ovaj vid
distribucije rezultata nije omeden ranicama, pa se zbo toa neke vrijednosti mou pojaviti na
znatno vecim udaljenostima od centra distribucije iako je vjerovatnoca da se to desi veoma
mala. (Savic 451) Raspodjela rezultata na Slici xx (b) matematicki se moze opisati pomocu tri
parametra kako se vidi iz jednacine:
=
c
-
1
2

x-
o

c2n
(ii)
dje je yfrekvencija pojavljivanja pojedinih vrijednosti mjerenja, xvrijednost individualnih
mjerenja, aritmeticka sredina veliko broja mjerenja, (x ) odstupanje mjerenja x od srednje
vrijednosti i standardna devijacija, konstanta karakteristicna za svaki pojedini niz
beskonacno veliko broja mjerenja. Analizirajuci krivu normalne raspodjele, moze se izvuci
nekoliko zakljucaka:
1. Kriva je simetricna oko srednje vrijednosti ( ) beskonacno veliko broja mjerenja. Dobijeni
rezultati su, prema tome, s podjednakom vjerovatnocom i visoki i niski, sto ujedno znaci da je
srednja vrijednost u nekom nizu mjerenja pouzdanija neo ma koje individualno mjerenje u tom
nizu. Pod uslovom da ne postoji sistematska reska, srednja vrijednost je, u stvari, jednaka
pravoj ili stvarnoj vrijednosti. Ako dobijeni rezultati, medutim, pored slucajnih nose u sebi i
sistematsku resku, kriva normalne raspodjele ne mijenja svoj oblik, ali se pomjera duz
apscisne ose nalijevo ili nadesno, zavisno od velicine i pravca sistematske reske ( Slikaxxx).
ako oblik krive ostaje isti, srednja vrijednost ni u kom slucaju ne moze tada biti identicna s
stvarnom vrijednoscu.
2. Broj mjerenja s manjim odstupanjem od srednje vrijednosti je veci od broja mjerenja s vecim
odstupanjem. Vrlo je mala vjerovatnoca, dakle, da ce slucajne reske dovesti do neko
rezultata koji ce znatnije odstupati od srednje vrijednosti.

(a) (b)





Slika xx Uticaj odredene reske na krivu normalne raspodjele (a), Kriva normalne raspodjele sa
razlicitim standardnim devijacijama
0 +
CdsLupan[e od prave vrl[ednosLl
o 03
o 10
o 23
3. Kriva ima dvije tacke infleksije. Udaljenost svake od ovih tacaka od srednje vrijednosti
naziva se standardnom devijacijom ili standardnom reskom i oznacava se rckim slovom .
Sto su mjerenja preciznije izvedena, standardna devijacija ce biti manja, pa ce kriva normalne
raspodjele biti uza i visa ( Slika xxx (b)). Povrsina oranicena aussovom krivom i osom x
predstavlja 100% svih dobijenih rezultata. Matematicki se moze pokazati da ce se 68.3 % svih
rezultata nalaziti u intervalu _ (povrsina ispod krive u ranicama + i predstavlja
68.3% ukupne povrsine), 95,4% svih rezultata u interval _ (podrucje ispod krive u tim
ranicama predstavlja 95,5% ukupne povrsine), 99,7% rezultata ce se nalaziti u intervalu
_ , a 99,99% u intervalu _ , kao sto je prikazano na Slici xx.





Slika xxx. Povrsine ispod normalne krive
Sve identificirane izvore nesiurnosti za jednacinu (12) sada je potrebno kvantificirati odnosno
brojcano iskazati kao standardnu nesiurnost.
xx Standardna nesigurnost kaIibracione krive (x

)
Poznato je da svako mjerenje ima svoju nesiurnost, u tom smislu kalibraciona kriva ne
predstavlja izuzetak. Postoje cetiri lavna izvora nesiurnosti koja treba razmotriti prilikom
odredivanja nepoznate koncentracije

, pomocu kalibraciono pravca. To su:

slucajne varijacije pri mjerenju mjerno sinala y, koje uticu i na referentni odnosno
kalibracioni odziv y
ref
ali i na mjerni odziv y


slucajni efekti koji rezultiraju reskom u pripisanoj referentnoj odnosno standardnoj
vrijednosti x
ref

vrijednosti x
i
i y
i
mou biti pod uticajem konstantnih nepoznatih efekata npr. uvelicavanje
reske kada su vrijednosti x dobijene nakon serije razblazivanja osnovno rastvora
pretpostavka o linearnosti mozda nije ispravna
Referentne vrijednosti xi mou takode imati nesiurnost koja utice na krajnji rezultat. U praksi
nesiurnosti u ovim vrijednostima su znatno nize u poredenju sa vrijednostima koje se odnose
na odziv instrumenta yi, i mou biti inorisane. Vrijednosti x i y mou biti pod konstantnim
uticajem nepoznatih efekata (npr. uvelicavanje reske kada su vrijednosti x dobijene serijom
razblazivanja osnovno rastvora koji ima nesiurnost na svojoj certificiranoj vrijednosti).
Nesiurnost proizasla iz pretpostavke o linearnom odnosu izmedu y i x, u praksi nije dovoljno
velika da bi zahtijevala dodatnu procjenu. Utvrdivanjem rezidua pokazuje se da ne postoji
znacajna sistematska devijacija za ovaj pretpostavljeni odnos, pa je nesiurnost proizasla iz ove
pretpostavke (zajedno sa nesiurnoscu koja rezultira povecanjem y varijansi) moze biti
zanemarena. Ukoliko rezidue pokazuju sistematski trend ili uticaj onda ce mozda biti neophodno


o + o

2o +2 o
683
934
u proracun ukljuciti slozeniju kalibracionu funkciju. Od svih nabrojanih izvora, u svakodnevnoj
praksi najznacajnije su slucajne varijacije u y vrijednosti, koje su detaljnije opisane pod tackom
xx, i metode procjene nesiurnosti iz ovo izvora bit ce u nastavku ukratko objasnjene.
Pretpostavimo, da su reske u mjernom sinalu y, znatno vece neo bilo kakve reske u
poznatim koncentracijama satandarda x. U tom slucaju najbolje konstruisana kalibraciona kriva
je ona koja minimizira vertikalne devijacije individualnih tacaka oko te krive, odnosno kriva kod
koje je zbir kvadrata devijacija individualnih tacaka oko krive minimalan. Ovakav nacin
optimiziranja kalibracione krive naziva se metodom najmanjih kvadrata (poledati tacku x.x). Za
date vrijednosti x
i
, y
i
, i jednacinu pravca y = ax + b vertikalna devijacija u y vrijednosti potice od
rezidua (Slika xx). Rezidue predstavljaju razliku izmedu stvarne vrijednosti (y
i
)

i reresijske
vrijednosti (y), koja je odredena pomocu jednacine kalibraciono pravca i matematicki se
predstavlja kao = (y
i
y) (Slika xxx reesijski pravac). Odredivanjem rezidua mozemo donijeti
sud o kvaliteti mjerenja i o mjernoj tehnici. Kada su poznate vrijednosti rezidua tada mozemo
izracunati rezidualnu standardnu devijaciju odnosno rezidualnu standardnu nesiurnost y
vrijednosti, koja je mjera slucajne reske prema jednacini (oo):
() = s =
_
_ | y

- (ax+b)]
2 n
=1
n-2
(oo)
dje n2 predstavlja broj stepena slobode. Pravilo je da postoji po jedan stepen slobode za
svaku tacku. Medutim u ovoj jednacini koristimo dvije pretpostavke:
a) da broj izvrseno mjerenja reprezentuje ili obuhvata sve mouce vrijednosti i
b) da

predstavlja zaista stvarne y vrijednosti.

Za svaku napravljenu pretpostavku moramo ukloniti po jedan stepen slobode, a stim standardna
devijacija postaje veca. Rezidualna standardna devijacija moze se zatim upotrijebiti za proracun
standardnih devijacija naiba pravca i odsjecka na yosi koristeci formule:
(I) = s
u
= _
s
2
_(

)
2

(b) = s
b
= s_

J (_

)
2
_

2

dje jednacina (I) predstavlja standardnu nesiurnost naiba kalibraciono pravca a, i
jednacina (b) predstavlja standardnu nesiurnost odsjecka na yosi. Kada znamo jednacinu
reresivne prave i njene parametre a i b, mozemo lako izracunati koncentraciju (

vrijednost)
koja odovara bilo kojem izmjerenom sinalu instrumenta (

vrijednost). Medutim, obzirom da

na osnovu y vrijednosti procijenjujemo x vrijednost (umjesto obratno) potrebno je odrediti
standardnu devijaciju

vrijednosti, s
(x
0
)
. reska u

vrijednosti zavisi od niza faktora ali ce u

ovom radu biti razmotrena samo dva od tih faktora. Prvi faktor predstavlja replikacija (
ponavljanje ) mjerenja a drui se odnosi na to da li je vrijednost odredena interpolacijom ili
ekstrapolacijom. Nesiurnost izmjerene vrijednosti x
0
, koja je odredena sa kalibraciono pravca,
predstavlja kombinaciju svih navedenih nesiurnosti.Tri moucnosti bit ce objasnjene:
1). bez ponavljanja mjerenja, interpolirana vrijednost
2). sa ponavljanjem mjerenja, interpolirana vrijednost
3). bez ponavljanja mjerenja, ekstrapolirana vrijednost
1). Bez ponavljanja mjerenja uzorka kada se mjerni sinal nalazi unutar kalibracijsko podrucja
instrumenta a njeova vrijednost je odredena interpolacijom kalibraciono pravca, standardna
devijacija

, s
(x
0
)
koja ujedno predstavlja i standardnu nesiurnost (

), data je jednacinom:
s
(x
0
)
= (

) =
S
u
_ +
1
n
+
(x
0
-x )
2
S
xx
(ii)
dje je:
xx
= (_

)- (_

J) = _(

, S je rezidualna standardna devijacija data

jednacinom (oo), a je naib kalibraciono pravca, n je ukupni broj mjerenja kalibracionih
standarda,

je odredena vrijednost mjerene velicine, je srednja vrijednost svih kalibracionih

standarda, i je indeks za broj kalibraciono standarda, j je indeks za broj izvrseno mjerenja da
bi se dobila kalibraciona kriva. Ova formula se koristi samo u slucajevima kada se ne ponavlja
jedno te isto mjerenje vise puta.
2). U praksi kada se vrsi mjerenje uzoraka, obicno se izvodi vise od jedno mjerenja za svaki
uzorak, a to ponavljanje mjerenja naziva se replikacijom. Replikacija je vazna u statistickom
odredivanju odziva sinala u cilju smanjenja nesiurnosti i povecanja tacnosti mjerenja.
Slucajne fluktuacije koje se javljaju u bilo kojem sistemu mou dovesti do manjih reski pri
svakom mjerenju. Ponavljanje svako mjerenja, neke ili vecina reski koje se odnose na
slucajne fluktuacije mou biti izbjenute. Ukoliko je vrsena replikacija, izracunavanje reske u x
je modifikovano da bi se uzeli u obzir dodatni stepeni slobode kao rezultat dodatno mjerenja.
Formula za standradnu devijaciju u x
o
, s
(x
0
)
, sa p replikacija je:
s
(x
0
)
= (

) =
s
u
_
1
p
+
1
n
+
(x
0
-x )
2
S
xx
(ii)
dje je p broj ponovljenih mjerenja da bi se odredila vrijednost x
0
, ostale varijable iste su kao i u
prethodnoj jednacini.
3). U nekim slucajevim izmjerena vrijednost mjereno sinala za uzorak moze biti izvan mjerno
podrucja kalibraciono pravca. Obzirom da ovo nije pozeljna situacija jer postoji moucnost
nelinearno odnosa izvan mjerno podrucja, ponekad su takve situacije neizbjezne, ali rezultat i
tada moze biti validan. Sve to zahtjeva znanje o razlicitim nacinima racunanja standardne
devijacije za ekstrapolaciju koja je data sljedecom jednacinom:
s
(x
0
)
= (

) =
s
I
_

J
+

2

xx

dje su varijable iste kao i u prethodnim jednacinama. Razlika izmedu ove i prethodnih
jednacina je u tome sto ovdje nisu uzete u obzir replikacije mjerenja i sto je x
0
= 0 a sto se vidi iz
jednacine.
U konkretnom primjeru za jednacinu (12) koncentracija zeljeza u uzorku izracunata je na
osnovu automatski pripremljene kalibracioneke krive. Od primarno standardno rastvora
zeljeza koncentracije 998 2 m L
1
napravljen je pocetni rastvor zeljeza koncentracije 0,1 m
L
1
. Za pripremanje kalibracione krive od takvo rastvora automatski je pripremljeno, na
instrumentu FAAS, pet kalibracionih standarda koncentracije 20, 40, 60, 80, 100 L
1
.
zracunavanje standardne nesiurnosti koncentracije zeljeza i slijepe probe metode, (c
1
) i
(c
2
), kada je sa kalibracione krive vrseno ponovljeno ocitavanje deset puta, uradeno je
pomocu jednacine (ii) i detaljno je prikazano u eksperimentalnom dijelu na strani xx.
xx Standardna nesigurnost VoIumena
1
i
2
, (
1
,
2
)
Nesiurnost volumena, kako smo vec rekli ima tri lavna izvora: kalibracija od strane
proizvodaca, ponovljivost punjenja suda, i temperaturni efekat.
xxx KaIibracija suda od strane proizvodaca
Proizvodac na volumetrijskom sudu obicno navodi njeov volumen kome je pridruzena
odovarajuca nesiurnost npr. 100 _ 0.1 mL. U ovom slucaju vrijednost nesiurnosti data je
bez navodenja nivoa povjerenja ili informacija o tipu distribucije, zbo cea je potrebno napraviti
odredenu pretpostavku. Ovdje je standardna nesiurnost izracunata uz pretpostavku trouaone
distribucije.
(
kuI.
) =
.1 m

= . H
Trouaona distribucija je izabrana zbo toa sto se tokom efektivno procesa proizvodnje
pretpostavlja da su vrijednosti blize sredini neo krajevima navedeno podrucja nesiurnosti (_
0.1 mL). Rezultujuca distribucija vrijednosti je bolje prezentovana trouaonom neo
pravouaonom distribucijom.
xxx PonovIjivost punjenja suda
Nesiurnost zbo varijacija u punjenu suda moze biti procijenjena na tipicnom primjeru
upotrijebljene posude. Potrebno je napraviti seriju od deset (ili manje) punjenja i vaanja puno
suda, a zatim izracunati standardnu devijaciju tih ponovljenih mjerenja (vaanja) (
pon.
).
Dobijena standardna devijacija moze direktno biti koristena kao standardna nesiurnost. Neka
je standardna devijacija punjena suda 0.02 mL.
xxx Temperaturni efekat
Prema proizvodacu volumetrijski sud je kalibriran na temperaturi od 20 C, dok temperatura
laboratorije varira izmedu ranica npr. _ 4 C. Nesiurnost zbo ovo efekta moze biti
izracunata iz procjene temperaturno podrucja i koeficijenta ekspanzije volumena. Ekspanzija
volumena tecnosti je znatno veca u odnosu na sud, zbo cea samo ona treba biti uzeta u
obzir. Koeficijent ekspanzije volumena za vodu iznosi 2.1 x 10
4
C
1
, sto vodi do varijacije
volumena, u volumetrijskom sudu npr 100 mL, od
_ (100 x 4 x 2.1 x 10
4
) = _ .8 H
Standardna nesiurnost izracunata je koristenjem pretpostavke o pravouaonoj distribuciji za
temperaturnu varijaciju tj.:
(
t.c].
)
.8 mL

= . H
Ova tri doprinosa kombinuju se kako bi se dobila standardna nesiurnost (v) volumena V
prema sljedecoj jednacini:
(v) = (.)
2
+(.)
2
+ (.)
2
= . mL
Ukoliko neki od clanova navedenih u jednacini (iii) nije poznat tada se ta jednacina redukuje za
taj clan.
xxx Standardna nesigurnost mase
1
i
2

Nesiurnost mase, kako smo vec rekli ima tri lavna izvora: 1. nesiurnost kalibracije vae od
strane proizvodaca koja je obicno navedena na certifikatu koji dolazi sa vaom (
1
), 2.
nesiurnost ponovljivosti vaanja (standardna devijacija ponovljivosti vaanja) koja uzima u
obzir slucajne varijacije tokom vaanja (
2
) i 3. nesiurnost preciznosti vae koja se odnosi na
citljivost mjerne skale na vai (odnosno najmanje podioka na mjernoj skali, npr. 0.1 ili 0.01 m)
(
3
). Ova tri doprinosa medusobno se kombinuju kako bi se dobila standardna nesiurnost,
(m), mase m prema sljedecoj jednacini:
(m) = (
1
)
2
+(
2
)
2
+(
3
)
2
(iii)
Ukoliko neki od clanova navedenih u jednacini (iii) nije poznat tada se ta jednacina redukuje za
taj clan. Odredivanje standardne nesiurnosti mase, koja se odnosi na jednacinu (12),
prikazano je u eksperimentalnom dijelu ovo rada na strani xxx.
xxx Standardna nesigurnost faktora razbIazenja (F
1
, F
2
)
Vec smo rekli da se nesiurnost faktora razblazenja sastoji od dvije komponente: nesiurnosti
volumena koji je uzet mikropipetom i nesiurnosti volumena odmjerno suda u kojem je bio
primarni rastvor uzorka. Obje ove komponente treba posebno posmatrati i nesiurnost svake
komponente odrediti kao sto je prikazano u standardnoj nesiurnosti volumena (tacka xx).
xxx Kombinovana standardna nesigurnost
(VIM 26)Kombinovana standardna nesiurnost predstavlja standardnu mjernu nesiurnost koja
je dobijena kombinovanjem individualnih standardnih mjernih nesiurnosti ulaznih velicina u
modelu mjerne jednacine (jednacina (ii)). (QA 170) Sve procjene ili proracuni standardne
nesiurnosti koji su dobijeni u prethodnom koraku, prema definiciji trebaju sada biti medusobno
objedinjeni ili kombinovani da bi se dobila jedna ukupna ili sveobuhvatna vrijednost
nesiurnosti. Razmotrimo mjernu velicinu y, koja je funkcija nekoliko varijabli,
1
,
2
,.... Model
(poledati tacku xx) je y = f (
1
,
2
,.). Opsti izraz za kombinovanje standardnih nesiurnosti
koje su pridruzene nezavisnim varijablama je kako slijedi:

c
() = _

x
1

2
(
1
)
2
+

x
2

2
(
2
)
2
+ . (ii)
dje je (), (
1
), i (
2
), predstavljaju standardne nesiurnosti u rezultatu y i u parametrima

1
i
2
, (o o
1
) je parcijalni diferencijal od y u odnosu na
1
. Parcijalni diferencijali su poznati i
kao koeficijenti osjetljivosti. Oni pokazuju kako se rezultat y mijenja sa promjenom parametara

1
,
2
, .. U mnoim slucajevima opsti izraz moze biti redukovan na relativno jednostavnije
izraze za kombinovanje nesiurnosti. Opsti izraz u jednacini (ii) treba biti koristen u slucajevima
koji nisu pokriveni jednacinama prikazanim u Tabeli xx.




Tabela xx zrazi za kombinovanje standardnih nesiurnosti (u odnosu na jednacinu (ii))
Jednacina za proracun
rezultata, y

Kombinovana standardna nesiurnost

Broj
jednacine
y = a + b

c
() = (I)
2
+ (b)
2

(xx)
y = a b

c
() = (I)
2
+ (b)
2


y = a x b

c
() =
_

(I)
I

2
+
(b)
b

2


(xxx)
y =
u
b

c
() =
_
_
(I)
I

2
+ _
(b)
b

2



y = Bx

c
() = ()

(xx)*
y = I
n

c
() = J
(I)
I

(xx)
* U jednacini (xx), B je konstanta bez nesiurnosti.





Slika xx. lustracija kombinacije standardnih nesiurnosti: (a) je mnoo vece od (b) pa je
zbo toa kombinovana nesiurnost priblizno jednaka (a).
Ukoliko model jednacine sadrzi mjesavinu operacija, npr. y = (a b) / (c +d), u tom slucaju takvu
jednacinu bi trebalo razloziti na izraze koji se sastoje samo od operacija potkrijepljenih
slucajevima u jednacinama od (xx) do (xx) koje su prikazane u Tabeli xx. Npr. u skladu sa
prethodno navedenim, prethodni izraz bi trebao biti razlozen na elemente (a b) i (c + d), a
nesiurnost za svaki element bi trebala biti izracunata koristeci jednacinu (xx). Nesiurnosti
takvih proracuna bi tada trebalo kombinovati koristeci jednacinu (xxx) kako bi se dobila
kombinovana standardna nesiurnost. Jedna posljedica jednacina za kombinovanje standardnih
nesiurnosti je u tome sto ce u kombinovanoj standardnoj nesiurnosti dominirati najveca
komponenta nesiurnosti. lustracija takve tvrdnje prikazana je na slici xx. Za navedeni primjer
jednacine (12) kombinovana standardna nesiurnost,
c
(c
Pc
), treba uzeti u obzir sve navedene
standardne nesiurnosti parametara u datoj jednacini koje su kombinovane prema jednacini xxx
prikazanoj u Tabeli xx. Kompletan proces prikazan je u eksperimentalnom dijelu na strani xx, a
izraz za kombinovanu standardnu nesiurnost,
c
(c
Pc
), dat je izrazom u nastavku.
(I)
2
+ (b)
2
= .
(a) = 7.60
(b) = 1.50

c
(c
Fc
)
c
Fc
=
_

(c
1
)
c
1

2
+
(v
1
)
v
1

2
+ _
(v
mp
)
v
mp

2
+
(v
cs
)
v
cs

2
+
(c
2
)
c
2

2
+
(v
2
)
v
2

2
+ _
(v
mp
)
v
mp

2
+
(v
cs
)
v
cs

2
+
(m
1
)
m
1

2
+
(m
2
)
m
2

2

dje je
mp
volumen koji je uzet mikropipetom (0.5 mL) iz primarno rastvora uzorka koji je bio u
odmjernom sudu od 50 mL,
os
volumen odmjerno suda (50 mL) u koji je prenijeto tih 0.5 mL iz
mikropipete, a iz koje su ocitane vrijednosti c
1
i c
1
.
xxx Prosirena nesigurnost
(QUAM 27)Finalni korak u procesu procjene nesiurnosti jeste mnozenje kombinovane
standardne nesiurnosti sa izabranim faktorom prekrivanja da bi se dobila prosirena
nesiurnost.(GUM 23)ako kombinovana standardna nesiurnost moze biti univerzalno
primjenjljiva za prikazivanje nesiurnosti mjerno rezultata, u nekim komercijalnim, industrijskim
i reulatornim aplikacijama, a posebno kada su u pitanju zdravlje i siurnost, cesto je
neophodno dati mjeru nesiurnosti koja definise interval oko mjerno rezultata, koji se naziva i
intervalom prekrivanja, a od koje se ocekuje da obuhvati veliki dio rasutih vrijednosti koje bi
opravdano mole biti pripisane mjerenoj velicini. (VIM 27)Taj interval prekrivanja definise se kao
interval koji sadrzi seriju "tacnih vrijednosti mjerene velicine sa navedenom vjerovatnocom,
bazirano na dostupnim informacijama. nterval prekrivanja ne smije biti imenovan kao "interval
povjerenja da bi se izbjela konfuzija sa statistickim konceptom (ovo staviti u fusnotu).(VIM 28)
Vjerovatnoca prekrivanja, pak, definise se kao vjerovatnoca prema kojoj je serija "tacnih
vrijednosti mjerene velicine sadrzana unutar specificirano naznaceno intervala prekrivanja.
Vjerovatnoca prekrivanja naziva se i "nivoom povjerenja u UM
x
u. Ta dodatna mjera
nesiurnosti koja ispunjava zahtjeve odnosno koja obezbjeduje ore opisani interval naziva se
prosirena nesiurnost, i oznacava se sa U. Dakle, prosirena nesiurnost (U) se dobija
mnozenjem kombinovane standardne nesiurnosti (
c
()) sa faktorom prekrivanja k, koji je
veci od jedinice (VIM 27):
=
c
()
(VIM 27) Faktor prekrivanja, k, zavisi od tipa vjerovatnoce distribucije vrijednosti zavisno
promjenljive velicine u mjernom modelu i od vjerovatnoce prekrivanja, sto ce u nastavku biti
pojasnjeno. (QA 174) Vidjeli smo da je nakon kombinovanja standardnih nesiurnosti, taj korak
u procesu procjene nesiurnosti zavrsen, dobijanjem vrijednosti kombinovane standardne
nesiurnosti,
c
(). Ovim postupkom smo sve doprinose distribuciji reske, bilo da se radi o
normalnoj, pravouaonoj ili trouaonoj distribuciji, pretvorili u ekvivalentnu normalnu distribuciju
i kombinovali ih razlicitim nacinima (Tabela xx). Kombinovana standardna nesiurnost jednaka
je jednoj standardnoj devijaciji normalne distribucije. Podsjetimo se da, povrsina koja je
omedena jednom standardnom devijacijom (_ 1s) normalne distribucije pokriva 68,3 % svih
vrijednosti u distribuciji (Slika xxx, poledati normalnu distribuciju pod tackom xx). Doovorom je
utvrdeno, da se stvarna vrijednost mjerno rezultata nalazi nedje unutar ranica odnosno
podrucja nesiurnosti koje ima 95 %tnu vjerovatnocu pokrivanja. Te ranice, za navedeni
postotak vjerovatnoce, priblizno odovaraju podrucju od dvije standardne devijacije (_ s)
(zapravo 1.96) kojima je omedena povrsina ispod normalne krive, i koje obuhvataju 95,4%
svih vrijednosti u distribuciji (Slika xx). Zbo toa, da bi utvrdenu mjernu nesiurnost prikazali na
adekvatan nacin, u skladu sa prihvacenim doovorom, neophodno je da je pomnozimo sa
faktorom prekrivanja k = 2. Sada u nasem izvjestaju (ili konacnom rezultatu) mozemo dodati da
nivo povjerenja u navedenu nesiurnost iznosi 95%, odnosno da je dobijen interval koji sadrzi
priblizno 95% svih distribuiranih vrijednosti. Ukoliko zelimo biti posebno siurni, mozemo korisiti
faktor prekrivanja k = 3 da bi dobili nivo povjerenja od 99,7%. (GUM 23)Rezultat mjerenja se
sada zodno izrazava kao I = _ , koji se interpretira tako da je y, najbolja procjenjena
vrijednost mjerene velicine Y, i da je y U do y + U interval u kojem se ocekuje obuhvatanje
veliko dijela rasutih vrijednosti koje bi iz opravdanih razloa mole biti pripisane mjerenoj
velicini Y. Taj interval se obicno izrazava i kao y U Y y + U. Razmotrimo sada primjer koji
se odnosi na racunanje koncentracije zeljeza u cesticnoj tvari zraka. Kombinovana standardna
nesiurnost,
c
(c
Pc
), se mnozi sa faktorom prekrivanja k = 2 da bi se dobila prosirena
nesiurnost, koja je prikazana u eksperimentalnom dijelu na strani xxx.

xxx Upotreba i prikazivanje prosirene nesigurnosti

(QUAM 29)Ukoliko druacije nije zahtijevano, rezultat y treba biti napisan zajedno sa
prosirenom nesiurnoscu (U) upotrebom faktora prekrivanja k = 2. (QA 175)Treba imati na umu
da je nesiurnost definisana kao podrucje vrijednosti unutar koje se ocekuje da se nalazi
vrijednost mjerene velicine. Za razmatrani rezultat to znaci da se stvarna vrijednost mjerene
velicine nalazi bilo dje unutar podrucja od y U do y + U. Sljedeca forma (oblik) krajnje
rezultata je preporucljiva:
"(Rezultat): (y _ U) (jedinica)
(dje je) napisana nesiurnost (prosirena nesiurnost, kao sto je definisana u nternacionalnom
rijecniku osnovnih i opcih pojmova u metroloiji, 3 izdanje, SO 2008), izracunata upotrebom
faktora prekrivanja k = 2 (koji daje nivo povjerenja od priblizno 95%). Pri numerickom
izrazavanju rezultata y i nesiurnosti (bilo prosirene ili standardne) treba koristiti ne vise od dvije
znacajne cifre. Potrebno je zapamtiti da se faktor prekrivanja koristi samo za konacnu (krajnju)
kombinovanu nesiurnost. Takode je vrlo vazno pri objavljivanju rezultata nalasiti na sta se
odnosi vrijednost navedena iza _ (tj. da li je to standardna ili prosirena nesiurnost) kako bi
korisnici to rezultata znali o kakvoj se vrsti nesiurnosti radi. Faktor prekrivanja bi trebao biti
koriovan, ukoliko je potrebno da se prikaze njeova stvarna upotrijebljena vrijednost. Naime, u
vecini slucajeva preporucljivo je da vrijednost k bude 2. Medjutim, ova vrijednost k je nedovoljna
(nije adekvatna) dje je kombinovana nesiurnost bazirana na statistickim opservacijama sa
relativno malim brojem stepena slobode (manje od sest). Vrijednost k tada zavisi od efektivno
broja stepeni slobode. (QUAM 27)Dakle, tamo dje u kombinovanoj standardnoj nesiurnosti
dominira doprinos jedne komponente sa manje od sest stepeni slobode, preporucljivo je da
vrijednost faktora prekrivanja (k) bude jednaka two-taiIed vrijednosti Studentovo t koeficijenta
za broj stepeni slobode koji se odnose na tu komponentu i za trazeni nivo povjerenja (obicno 95
%). Npr. two-taiIed vrijednost t koeficijenta za 4 stepena slobode i 95% povjerenja je, iz tabele,
2.8; u tom slucaju vrijednost faktora prekrivanja s kojim se mnozi kombinovana nesiurnost da
bi se dobila prosirena nesiurnost je 2.8.

xxxPoboIjsanje kvaIiteta rezuItata
Vrijednosti nesiurnosti imaju i dodatnu svrhu koja se zasniva na njihovoj potencijalnoj
moucnosti poboljsanja eksperimentalnih procedura. Pri racunanju nesiurnosti mjerenja,
sastavljamo listu standardnih nesiurnosti za velicine (promjenljive) u mjernom modelu. Ukoliko
zelimo da poboljsamo kvalitet nase mjerenja prvo provjeravamo komponentu mjerno sistema
koja doprinosi najvecu nesiurnost. Ukoliko ona predstavlja dominantan doprinos kombinovanoj
nesiurnosti, onda bilo kakav pokusaj poboljsanja druih aspekata mjerno procesa bit ce
uzaludan. Ali, ako smanjimo uticaj (ili velicinu) dominantne nesiurnosti, to ce svakako biti
produktivno i uticace na nas rezultat pozitivno.