Sveuilite u Splitu Prirodoslovno-matematiki fakultet Odjel za kemiju prof. dr. sc.

Maja Pavela-Vrani

Preparativne i analitike metode Metode koje se temelje na razliitoj topljivosti Kromatografske metode Elektroforeza Ultracentrifugiranje Spektrometrija masa MALDI-MS (Mass Assisted Laser Desorption/Ionisation) ESI-MS (Electrospray Ionisation) Metode za odreivanje trodimenzionalne strukture proteina Rendgenska strukturna analiza NMR (Nuklearna Magnetska Rezonancija)

Izvor proteina:
tkivo ili stanine kulture (Escherichia coli, kvasac)

sterilna klupa (laminar) Rad sa staninim kulturama u sterilnim uvjetima

Uzgoj staninih kultura

u hranjivom tekuem mediju

Termostatirana tresilica

Fermentor ili bioreaktor

pri stalnoj temperaturi

, u kontroliranim uvjetima: temperatura, pH, protok kisika

Taloenje centrifugiranjem
Odvajanje organela od tekueg medija pri poveanoj gravitacijskoj sili

rotor prije supernatant talog poslije

rotacija

Centrifugiranje u gradijentu gustoe

gradijent saharoze uzorak

utracentrifuguranje

Razdvajanje sedimentacijom kroz gradijent guste tvari razdvajanje na osnovu plutanja uzrokovanog uzgonom (neovisno o veliini i obliku), do postizanja ravnotee gustoe estica i gustoe otopine

Priprava staninog ekstrakta

Razbijanje stanica i centrifugiranje
Enzimska razgradnja razgradnja lizozimom (G+) permeabilizacija vanjske membrane (G-) Mehaniko razbijanje trenjem u tarioniku ili mljevenjem u homogenizatoru ultrazvukom lt k (sonikator) ( ik t ) suspenzija stanica se uz hlaenje viekratno izlae zvunim valovima visoke frekvencije naglom promjenom tlaka prea po French-u

Isoljavanje

Odvajanje proteina na temelju razlike u topljivosti

Topljivost proteina T

Dodatkom zasiene otopine amonijeva sulfata slabe vodikove veze izmeu proteina i vode: proteini se taloe Proteini se mogu odvojiti od supernatanta centrifugiranjem

otapanje

isoljavanje

Koncentracija soli

Nakon taloenja amonijevim sulfatom treba ukloniti viak iona

Dijaliza
Odvajanje proteina od malih molekula (manje od 15 000 Da) i iona

crijevo za dijalizu (polupropusna membrana) koncentrirana otopina p pufer

poetak dijalize

ravnotea kraj dijalize

Gel-filtracija
Razdvajanje na osnovu veliine estica
Primjena proiavanje proteina odreivanje molekulske mase odsoljavanje
uzorak proteina polimerni gel porozna polimerna zrnca (matriks)

male molekule zadravaju se u porama zrnaca

velike molekule prolaze izmeu zrnaca

smjer protoka

10

Fast Performance Liquid Chromatography (FPLC)

Ureaj za kromatografsko razdvajanje i proiavanje proteina

11

Kromatografija na ionskom izmjenjivau

Razdvajanje proteina na osnovu razliitog naboja
pufer niske ionske jakosti pufer visoke ionske jakosti

Kon ncentracija proteina

smjesa proteina

niska visoka konc. konc. soli soli

broj frakcije, ili volumen otapala

frakcije

12

Nepokretna (stacionarna) faza ionskog izmjenjivaa (matriks)

Kationski izmjenjiva: negativno nabijena polimerna zrnca
celuloza ili agaroza

Kationski izmjenjiva
pozitivno nabijeni proteini veu se za negativno nabijena polimerna zrnca

Karboksimetil (CM) skupina A i Anionski ki izmjenjiva i j ji : pozitivno nabijena polimerna zrnca

negativno nabijeni proteini prolaze

celuloza ili agaroza

13

Dietilaminoetil (DEAE) skupina

Vezani protein ispire se (eluira) rastuom koncentracijom soli

Afinitetna kromatografija
Razdvajanje proteina na osnovu afiniteta prema specifinim kemijskim skupinama (ligandima)
smjesa proteina

ciljni protein ligand ligand vezan na matriks

Interakcije enzim-inhibitor hormon-receptor antitijelo-antigen protein-ugljikohidrat enzim-koenzim metaloprotein-ion metala

kruti nosa

14

ciljni protein vee se na ligand

Protein se ispire s kolone istiskivanjem s visokom koncentracijom liganda

Odreivanje koncentracije proteina po Bradfordu

Apsorbancija (595 nm)na A

badarni pravac

mg proteina t i

15

spektrofotometrijsko odreivanje koncentracije proteina mjerenje apsorbancije kod 595 nm a albumin koncentracija proteina badarni Rastu pravac: gove eg seruma (BSA)

Aktivnost enzima

spektrofotometrijskim mjerenjem promjene absorbancije UV ili vidljive svjetlosti u jedinici vremena fluorimetrijskim mjerenjem promjene fluorescencije u jedinici vremena UV/VIS spektrometar Fluorimetar

16

Elektroforetske tehnike

Razdvajanje temeljem razliite pokretljivosti nabijenih estica u elektrinom polju

papir

Vrste nosaa za elektroforezu papir celuloza acetat k b i gel krobni l agarozni gel poliakrilamidni gel

pufer

17

negativni mjesto pozitivni ioni nanoenja ioni uzorka

SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulphate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

Koristi se najee u analitike svrhe Dikontinuirana denaturirajua elektroforeza

18

Polimerizacija akrilamida

akrilamid monomer je kancerogen

akrilamid

metilen-bisakrilamid
persulfat

sulfatni radikal (zapoinje polimerizaciju)

Vinilna polimerizacija monomera akrilamida Unakrsno povezivanje dodatkom metilen-bisakrilamida

poliakrilamidni porozni gel

19

Priprema uzorka proteina za SDS- PAGE

merkaptoetanol denaturira protein SDS ( (natrijev t ij dodecilsulfat) d dna il lf t) SDS se vee detergent protein u omjeru + [CH3 (CH CH 1 SDS na 1,4 2)10 2OSO3 ]Na
aminokiseline

20

svi proteini imaju isti omjer naboja i mase aminokiselina:SDS = 2:1

SDS

10

Razdvajanje proteina u poliakrilamidnom gelu (SDS - PAGE)

pufer jaice

uzorak katoda
smjesa makromolekula elektroforeza smjer j elektroforeze porozni gel

gel
anoda pufer

Razdvajanje proteina na temelju molekulske mase

21

Proteinske vrpce postaju vidljive bojanjem

Bojanje bojom Coomassie brilliant blue

Bojanje srebrom (vea osjetljivost)

22

11

Odre ivanje molekulske mase proteina Odreivanje molekulske mase proteina s SDS-PAGE pomuu SDS-PAGE
1,000,000

Mr 66,200
Mo olekulska masa

apoferitin katalaza (tetramer) amilaza

100,000

29,000

katalaza (dimer) albumin lb i goveeg seruma

14,300

10,000

23

Marker poznate Mr

Uzorak nepoznate Mr

23

25 27 29 Retencijsko vrijeme (min)

31

Praenje izolacije i proiavanja proteina pomou gel elektroforeze

1. stanini ekstrakt 2. isoljavanje 3 kromatografija na ionskom 3. izmjenjivau 4. gel filtracija 5. afinitetna kromatografija

24

12

Dvodimenzionalna elektroforeza
Razdvajanje proteina slinih svojstava
smjer protoka otapala A razdvajanje u prisutnosti otapala B

ishodite

smjer protoka otapala B

razdvajanje uzastopnom primjenom otapala AiB

25

razdvajanje u prisutnosti otapala A

Izoelektrino fokusiranje
Razdvajanje proteina u gradijentu pH

niski pH

visoki pH

niski pH

visoki pH

26

Protein se kree u gradijentu pH do toke u kojoj pH odgovara izoelektrinom pH proteina

13

Western blot
Prijenos razdvojenih vrpci proteina s gela na membranu i detekcija
vezanje primarnog protutijela preslik na nitrocelulozi vezanje enzimski-vezanog sekundarnog protutijela imunoblot

gel koji sadri protein

27

Enzimski kataliziranom pretvorbom supstrata u obojeni produkt proteinska vrpca postaje vidljiva

SDS-PAGE

Western blot

28

14

Aminokiselinski sastav proteina

Elucijski profil proteinskog hidrolizata

Elucijski profil standardnih aminokiselina

29

Elucijski volumen

Edmanova odgradnja

Odreivanje slijeda aminokiselina u polipeptidnom lancu

fenil-izotiocijanat

obiljeavanje N-terminalne aminokiseline

odgradnja

30

peptid skraen za jednu aminokiselinu PTH-alanin

15

HPLC (High pressure liquid chromatography)

Razdvajanje aminokiselina, peptida i malih molekula pod visokim pritiskom

31

MALDI- MS
(Mass Assisted Laser Desorption/Ionisation)

ionizacija proteinskog uzorka

elektrino polje ubrzava ione

cijev proleta laserska zraka matriks protein detektor

32

uzorak

Kristalizacija proteina s matricom koja ima maksimum apsorpcije na valnoj duljini lasera

16

Nuklearna magnetska rezonancija (NMR)

en nergija

Razlika u energiji

Prijelaz izmeu spinskih stanja daje liniju u NMR spektru

energija

Kemijski pomak (ppm)

zraenje Jakost magnetskog polja

33

Kemijski pomak (ppm)

Difrakcija rendgenskih zraka na kristalu proteina

Izvor X-zraka X-zraka

Kristal

34

Difrakcijska slika

17

Od difrakcijske slike do kristalne strukture

Difrakcijska slika

Elektronska gustoa

3D struktura

35

3D-struktura aktivnog mjesta

36

18