5.3.

1 无菌技术
器具（三角瓶、移液管、平皿、试管等）
微生物的特点：
设备（发酵罐等）
分布广泛、繁殖迅速、所需条件简单
接种环、接种钩、接种铲
（目标微生物＋其他微生物）均非常容易在营养基
无菌箱、超净工作台
质上生长
空间
无菌技术 隔离衣

5.3 微生物的分离和纯培养
棉塞、纱布
微生物研究及生产中，防止 消毒剂
其他微生物污染 火焰（酒精灯、煤气喷灯等）
培养基

移液管的包扎 p216
主要手段有：
高压蒸汽灭菌 器具（三角瓶、移液管、平皿、试管等）
设备（发酵罐等）
高温干热灭菌
接种环、接种钩、接种铲
甲醛熏蒸 无菌箱、超净工作台
紫外线 空间
75％乙醇
无菌技术 隔离衣
棉塞、纱布
火焰烧灼
消毒剂
空气过滤 火焰（酒精灯、煤气喷灯等）
等等 培养基

吸口端塞入少许脱脂棉

棉塞的制作 p216
牛皮纸、报纸、锡箔纸
棉塞：防止杂菌污染，并保证通气良好
棉塞优劣对实验结果有很大影响：
形状、大小、松紧合适
棉花：纤维长的较好。不用脱脂棉（纤维
间孔隙大，过滤除菌效果差；易吸
水变湿，造成污染；价格较高）

功能：防止灭菌后棉塞遇冷，空气中微生物
进入棉塞内部，造成棉塞污染；防止湿热灭
菌时蒸汽打湿棉塞

1
 无菌环境
超净工作台（无菌箱）
1）火焰中上部无菌区

无菌操作 无菌操作
无菌环境

2）超净工作台、无菌室
3）过滤空气
棉塞、多层纱布等

其他示意图：p223, 10-6；p243, 10-16；

p244, 10-18；p251, 10-23，10-24
PIII Movie 1－4

5.3.2 微生物的分离方法 筛选
用途广泛 育种
无菌技术的两个目的 纯化

1）获得纯培养
2）防止污染
? 平皿划线分离法
方法 稀释分离法
单细胞挑取法

2
1. 平皿划线分离法
1. 平皿划线分离法
步骤：
1）接种环烧灼灭菌，冷却
2）取菌
3）放置平板，使第一次划线的地方尽量靠近不
拿接种环的一只手内侧
3）如图第一次划线
4）烧灼
5）第二次划线，开始先经过第一次划线2～3次
6）依据情况，重复3～4次
7）烧灼
注意划线的力量均匀，平滑。
Movie 1－6

2. 稀释分离法 3. 单细胞挑取法
采用显微操作仪，用毛细吸管或显微针
挑取单个细胞或孢子，进而培养
涂布平板法
稀释倒平板法

P129，图5-9下：Movie 1-11

1. 好氧培养 曲种的生产 － 通风槽法

5.3.3 微生物的培养
氧气来源：空气（无菌）

好氧培养 & 厌氧培养 实验室：平皿，斜面培养（表面培养）

分批培养 & 连续培养

固体
混菌培养
生产：自然对流或机械通风
实验室 & 生产

3
1. 好氧培养 通用式发酵罐 2. 厌氧培养

氧气来源：空气（无菌） 生产：
无通气装置
实验室：三角瓶（摇床培养，
减少装液量）
液体 半固体
生产：发酵罐（搅拌 ＋ （深层培养）
压缩无菌空气）

液体
（深层＋还原
剂） 巯基醋酸盐液体培养基

厌氧培养皿、厌氧罐
3. 分批培养 4. 连续培养

传统发酵工业采用（分批发酵法） 培养过程中，不断补充新鲜营养物质，
同时以同样速度排出老菌液
菌体接种到一定量营养基质中，经过培
养，最终一次性收获菌体或代谢产物。 分恒化连续培养、恒浊连续培养
也可以中间补料。
特点：发酵效率高，自动化水平高，节
特点：营养利用率高，但发酵效率较连 省人力
续培养低。微生物生长符合典型生长曲
线。
使用时，先装入待培养的对象，然后密闭罐盖，接着可采
用抽真空→灌氮→抽真空→灌氮→抽真空→灌混合气
(N2∶CO2∶H2=80∶10∶10，V/V)。这样，罐内少量剩余氧
在钯催化剂作用下，可被灌入的混合气中的H2还原成水，
从而造成很高的无氧状态。这时指示剂美蓝被还原成无色

恒化器 恒化连续培养法
依据生长曲线
恒化器是一种设法使培养液流速保持不变，并
使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行
生长繁殖的一种连续培养装置。

无菌培养 通过流加限制性生长因子来控制 ：生长速

基贮存器 度可以通过控制各种营养物质的浓度很大范围调
控，而最终产量只与限制性生长因子有关。
恒化器
泵
常用作生长规律研究，如某种营养要素的作
用。

4
 恒化器 恒浊连续培养法
恒浊器是根据培养器内微生物的生长密度，并
借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体
密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养
器 。
无菌培养
基贮存器 通过浊度计来控制 ：最大生长速度

恒浊器
泵 常用工业生产，获得大量菌体及代谢物

浊度计

思考？ 固定化细胞连续培养法
某微生物最适生长温度37，但发酵
近年来的新技术
温度33，如何实现连续培养 4. 混菌培养
通过包埋、微胶囊、吸附等种种手段，将细胞固
定在载体内部或表面
优点：菌体密度高；减少细胞流失，反复使 例如，酸奶双株发酵
两级连续培养
用；简化分离工艺 活性污泥