Cultivo Continuo

Laboratorio de Bioprocesos
Ing.Agroindustrial - UNS
CULTIVO CELULAR CONTINUO AIREADO
I.- RESUMEN Se desarrollo el Cultivo Celular Continuo Aireado de la Levadura Kluyveromyces marxianus ATCC-16045, la cual se inicio desde la resiembra del medio de mantencin usando Extracto de Levadura 10 gr, Extracto de malta20 gr, Peptona 20 gr, Agar 20 gr la cepa utilizada estaba refrigerada. Se uso como sustrato limitante la sacarosa, siendo la concentracin celular mxima final esperada de 3g/l el pH es de 5.98. Se empez con la preparacin de los medios de activacin sacarosa 20 g/l, extracto de levadura 5 g/l y la solucin de sales (K2HPO4 = 5g/l (NH4)2SO4 =5 g/l ; MgSO4.7H2O= 0.5 ;g/l )y HCl =0.57 g/l se llevo al shaker para la fermentacin obtener el cultivo por lote. Del cual se obtuvo la grafica de la cintica de crecimiento microbiano, curva de calibrado de biomasa y azucares reductores (sacarosa) por medio del mtodo de DNS. La grafica de la cintica de crecimiento nos sirvi para poder observar en que momento la levadura alcanzo los 2/3 de su crecimiento exponencial, para este fin se prepararon dos medios de fermentacin uno que sirvi como control para el incremento de la biomasa y el otro para la experiencia en el Quimiostato. Luego se prosigui con la puesta en marcha del Quimiostato, el cual se inicio con el montaje e instalacin de este sistema y su respectiva esterilizacin, luego se prosigui ala inoculacin del medio liquido del Quimiostato y se controlo el lote hasta que este alcanzara los 2/3 de crecimiento logartmico el cual fue al cabo de 3 horas, dato que se igual al obtenido en el cultivo celular por lote. Paralelo a esto se prepararon los medios de alimentacin para los estados estaciones a volumen ya calculado. De aqu en adelante se prosigui con el muestreo y anlisis de X y S para los cinco estados estacionarios, siendo estos tomados segn los tiempos calculados 43h (F=0,8ml/min), 29h (F=1,2ml/min), 19h (F=1,80ml/min) ,14h(F=2,5ml/min), 12h(F=3,0ml/min) para cada estado. Con estos datos se obtuvo la curva caracterstica del cultivo continuo con cinco estados estacionarios. Paralelo a la toma de muestras del cuarto y quinto estado estacionario se prepararon los medios de fermentacin bajo limitacin de nitrgeno reducindolo a la mitad (( NH4)2SO2 =1g/l) y perturbacin del estado estacionario por aumento de la concentracin de sacarosa(15 g/l) en volmenes ya calculados.
La toma de la muestra bajo limitacin de nitrgeno con un flujo de 2.5ml/min. Nos sirvi para comprar este punto con el obtenido en la curva caracterstica de la grafica de los e. e. siendo el resultado que el hecho de limitar al microorganismo de la fuente de nitrgeno no afecta considerablemente su crecimiento. La perturbacin nos indica que a niveles altos de la fuente de carbono el microorganismo mantiene un equilibrio en su crecimiento. Se preparo el medio para el mtodo de lavado en volumen necesario dado por la velocidad de dilucin y el flujo requerido (F=12ml/min ) estos datos son un tiempo de 4 h. El mtodo de lavado nos permiti determinar la velocidad especfica de crecimiento mximo, Finalmente se prosigui con el desmontaje y lavado cuidadoso continuo montado en el laboratorio de Bioprocesos. del sistema
II.- INTRODUCCIN La vasta mayora de las levaduras son mesfilas, con una temperatura mxima de crecimiento entre 24 y 48C. Solo unas pocas (2%) son psicrfilas con una temperatura mxima de crecimiento por debajo de 24C, pero mayor es el nmero de las levaduras que tienen la temperatura ptima de crecimiento por debajo de 20C. No hay levaduras que puedan crecer a 50C y solamente unas pocas pueden desarrollar cerca de 0C, entre las que se encuentran Yarrowia lipolytica, Debaryomyces hansenii y Pichia membranaefaciens. Por otra parte, Kluyveromyces marxianus crece a 48C. En general, la presencia de etanol o bicarbonato aumenta la temperatura mnima de crecimiento (Dak & Beuchat 1996). La mayora de las levaduras que causan deterioro de alimentos crece a una actividad de agua mnima de 0,90-0,95. Sin embargo Zygosaccharomyces rouxii puede crecer sobre substratos azucarados a una actividad de agua igual a 0,62, pero son pocas las levaduras que desarrollan en presencia de altas concentraciones de azcar o sal. En general las levaduras toleran mejor altas concentraciones de azcar que de sal.(Dak & Beuchat 1996). La mayora de las levaduras toleran un rango de pH entre 3 y 10, pero prefieren un medio
ligeramente cido con un pH de 4,5 a 6,5. las clulas son inactivadas a presiones entre 7 y 20 MPa, a 25-35C (Dak & Beuchat 1996). Las levaduras son organismos aerobios y aunque unas especies son fermentadoras otras no lo son, como por ejemplo los gneros Cryptococcus y Rhodotorula. Saccharomyces y unos pocos gneros ms, son fermentadores enrgicos de los azcares pero pronto detienen su crecimiento y multiplicacin por falta de oxgeno. Solo unos pocos glcidos, principalmente hexosas y oligosacridos, pueden ser fermentados por las levaduras, pero el rango de compuestos que pueden asimilar es mucho ms amplio incluyendo adems, pentosas, alcoholes, cidos orgnicos, aminocidos y glicsidos. La utilizacin de nitratos est confinada a ciertas especies de levaduras, mientras que las fuentes comunes de nitrgeno son amonio, urea y aminocidos. Muchas especies sintetizan todas las vitaminas necesarias pero otras requieren biotina y otros compuestos. Los aceites esenciales de ajedrea, ajo, canela, cebolla, clavo de olor, organo, pimienta de Jamaica y tomillo son inhibidores de varios gneros de levaduras. El aceite esencial de ajo inhibe a una concentracin de 25 mg/L y los de cebolla, organo y tomillo a 100 mg/L. La cafena presente en cacao, caf, nuez de cola, yerba mate y t, inhibe el crecimiento de las levaduras. Sin embargo, las levaduras casi no son afectadas por 20 mg de taninos/mL (Davidson 1997). El agua desionizada con 0,188 mg ozono/L causa la reduccin instantnea en 5 unidades logartmicas del nmero de clulas vivas por mL, de la levadura Z. bailii (Restaino et al. 1995)
III.- OBJETIVOS:
3.1
Objetivos generales:
16045 3.2
Disear y realizar una experiencia de cultivo celular continuo en
quimiostato empleando una cepa de Kluyveromyces marxianus ATCC-
Objetivos especficos: Disear medio de cultivo. Activar clulas y desarrollar el inculo. Obtener la curva caracterstica del cultivo continuo considerando al menos cinco estados estacionarios. Obtener y caracterizar un estado estacionario bajo limitacin por nitrgeno. Perturbar un estado estacionario mediante aumento de la concentracin del nutriente limitante en la alimentacin y su seguimiento hasta el nuevo estado estacionario. Determinar la velocidad especfica mxima de crecimiento mediante operacin de lavado.
IV.- FUNDAMENTO TERICO 4.1 Las levaduras : Son los microorganismos ms antiguamente conocidos, mejor estudiados y generalmente mejor aceptados por los consumidores. Las levaduras son raramente txicas o patognicas y pueden ser utilizadas en la alimentacin humana. A pesar de que su contenido de protenas no excede el 60%, su concentracin de aminocidos esenciales tales como la lisina, el triptofano y la treonina es satisfactoria, aunque tiene un bajo contenido de metionina y cisteina. Las levaduras son muy ricas en vitaminas (grupo B) y su contenido en cidos nucleicos es bajo ya que est en el rango de 4 a 10%.
En cuanto a su tamao las levaduras son ms grandes que las bacterias, lo que facilita la separacin. CUADRO DE CLASIFICACION Especies mas frecuentes Gnero Saccharomyces cerevisiae Saccharomyce unisporus LEVADURAS Candida kefir Kluyveromyces marxianus var. marxianus. Caractersticas Levaduras no fermentadoras de la lactosa, que producen alcohol y CO2 a partir de glucosa. Levaduras fermentadoras de la lactosa. Responsables de formacin de CO2 y contribuyendo al caracterstico sabor y aroma. Fuente : SCHENEIDER, A; MERKLE, R.; CARVALHO, M.; JONAS, R.; BURLAN, S. Oxygen tranfer on b galactosidase production by Kluyveromyces marxianus using Sugar Cane molasses as Carbon Source. Biotechnol. Letters. 23 (7):547-550. 2001 4.1.1 Levaduras (Kluyveromyces marxianus ATCC-16045) Estas levaduras pertenecen a la divisin Ascomycotina. Las levaduras de este gnero se reproducen por gemacin multilateral, es una de las levaduras que ms abunda en los productos lcteos, son los microorganismos ms antiguamente conocidos, mejor estudiados y generalmente mejor aceptados por los consumidores. Las levaduras son raramente txicas o patognicas y pueden ser utilizadas en la alimentacin humana. A pesar de que su contenido de protenas no excede el 60%, su concentracin de aminocidos esenciales tales como la lisina, el triptofano y la treonina es satisfactoria, aunque tiene un bajo contenido de metionina y cisteina. Las levaduras son muy ricas en vitaminas (grupo B) y su contenido en cidos nucleicos es bajo ya que est en el rango de 4 a 10%. En cuanto a su tamao las levaduras son ms grandes que las bacterias, lo que facilita la separacin. Las levaduras son hongos unicelulares, con una morfologa caracterstica esfrica u ovalada.
Figura 4.1.A : clulas de levadura Kluyveromyces marxianus s de agar placas petri usado para la inoculacin de glucosa media
Figura 4.1.B: clulas de lavadura Kluyveromyces marxianus en medio de glucosa media bajo condiciones aerobicas - shaker Fuente : KINETIC ANALYSIS OF KLUYVEROMYCES MARXIANUS YEAST STRAIN Erika Guimares Madeira Reeves B.S., Louisiana State University, 2001 May 2004 Las levaduras se hallan ampliamente distribuidas en la naturaleza y se encuentran frecuentemente en forma de polvillo blanco que cubre los frutos y las hojas.
4.1.2 Composicin tpica de las levaduras
Algunos de estos usos estn basados en la composicin de las levaduras. Los componentes principales de la biomasa de levadura estn presentados en la siguiente tabla: Componentes % Componentes Protenas 45,0-55,0 Calcio Hidratos de carbono 25,0-35,0 Fsforo grasas 2,0-5,0 Potasio Cenizas 6,0-8,0 Magnesio Hierro 9,3-35,0 mg/% Cobre Molibdeno 1,3-12,3 mg/% Cinc Fuente: Departamento de Investigacin Agosto 2005 % 0,6-1,3 1,4-1,7 1,2-1,9 0,1-0,2 2,0-13,4 mg/% 3,3-16,3 mg/%
Alrededor del 70% del nitrgeno total de las levaduras esta en forma de protenas, el 8 10% como purina y el 4% como pirimidina. El resto esta en forma de aminocidos y nucletidos. Por ejemplo, analizando el extracto de la levadura Saccharomyces cerevisiae, que se usa en la industria alimentaria, se puede observar el alto contenido de aminocidos esenciales. Esta caracterstica de la levadura S. cerevisiae se utiliza para la produccin del complemento dietario.
Aminocidos Lisina Histidina Arginina Leucina
% 8.2 4.0 5.0 7.9
Aminocidos Valina Isoleusina tirosina
% 5.5 5.5 5.0
Fuente: Departamento de Investigacin Agosto 2005 4.1.3 Importancia de la levadura Kluyveromyces marxianus: a) Obtencin de la inulinasa , se sabe que la inulinasa es una enzima que es utilizada para la hidrolisis de la inulina en una nica etapa, obtenindose productos con 95% de frutosa esta puede ser obtenida de plantas o atravs de microrganismos como bactrias, hongos o levaduras. Las levaduras Kluyveromyces marxianus ATCC 16045 e NRRL Y-7571 es de gran interes industrial debido las caractersticas fisiolgicas de accecibidad. 7
b) Obtencin de la lactasa o b-galactosidasa es una enzima exclusivamente intracelular en Kluyveromyces marxianus ATCC 8554, es una enzima que ha despertado gran inters biotecnolgico por razones bsicamente nutricionales e industriales. La enzima causa la hidrlisis del enlace b-1,4 de la lactosa hasta sus monmeros glucosa y galactosa, originando un producto con mayor poder edulcorante. Los jarabes obtenidos de esta hidrlisis sirven como sustituto del jarabe de maz o sacarosa en las industrias de heladeras, reposteras y panaderas; adems su adicin a productos lcteos como leche, yogurt, crema agria y mantequilla mejora el sabor sin que ocurra un incremento calrico, beneficiando el consumo en individuos con intolerancia a la lactosa. La hidrlisis enzimtica de la lactosa del suero permite el aprovechamiento de este subproducto de la industria lctea, el cual se ha convertido en un grave problema de contaminacin ambiental, debido a que generalmente se descarga en cuerpos de aguas, esto ha conllevado a que actualmente existe una amplia informacin sobre la b-galactosidasa obtenida de diferentes fuentes y donde se han considerado aspectos como seleccin de gneros, condiciones de cultivo, procedimientos de extraccin, purificacin, estabilidad, obtencin de plsmidos y mutantes, entre otras . Su aplicabilidad involucra mayoritariamente sistemas alimenticios, por lo que resulta idneo trabajar con enzimas generalmente reconocidas como seguras (GRAS) y aceptadas por agencias de control de alimentos y drogas como la Food and Drug Administration (FDA). Actualmente el estatus GRAS es validado slo para las lactasas de Aspergillus nger, Aspergillus orizae, Kluyveromyces lactis y Kluyveromyces marxianus [9]. La lactasa ms conveniente para utilizar en leche, productos lcteos y sueros dulces es la proveniente del gnero Kluyveromyces, donde representa un producto estrictamente intracelular . Varios mtodos han sido usados para solubilizar este tipo de enzimas, dependiendo de su localizacin dentro de la clula, intenciones de uso y estabilidad; los mtodos mecnicos son predilectos en aplicaciones a gran escala, pero requieren alta inversin, costos operacionales y adems el extracto obtenido resulta cargado de fragmentos celulares, sumando as mayor grado de dificultad al momento de purificar la enzima. La autlisis no es un mtodo apropiado, porque requiere de temperaturas que comprometen la estabilidad de la enzima y los detergentes. son difciles de remover de las preparaciones enzimticas.
Uno de los mtodos ms utilizados para la extraccin de la b-D-galactosidasa a partir de levaduras es el uso de solventes orgnicos como el tolueno, cloroformo y alcohol isoamlico. El anlisis por MET de las clulas de K. marxianus revel que el tolueno ejerce un efecto permeabilizante, ya que ninguna clula mostr rompimiento de la pared celular. En la FIG. 1 se observa el efecto plasmolizante producto del tratamiento con el solvente, manifestado por la formacin de pliegues de la membrana (_), vescula en el espacio intra y extracelular ( lo cual puede explicarse por la salida de compuestos marcadores del ), espacio intracelular y corroborado por la valoracin de la actividad de la enzima. Tambin se observa una desorganizacin de los organelos citoplasmticos con ausencia de ncleo y mitocondrias y la presencia de fragmentos de membrana ( que podran ser considerados ) como restos de organelos dentro de un citoplasma que se observa muy denso.
Fig : Muestra de clulas de Kluyveromyces marxianus ATTC 8554 tratada con tolueno en la extraccin de enzimas
c) Obtencin de concentrados proteicos: Se puede obtener un concentrado proteico a partir de biomasa microbiana Kluyveromyces marxianus var. marxianus cultivada en suero lcteo desproteinizado. El suero lacteo que se ha propuesto su empleo como sustrato de fermentacin para microorganismos capaces de asimilar la lactosa, tales como la levadura Kluyveromyces marxianus var. marxianus, con el propsito de obtener biomasa microbiana, tambin conocida como protena unicelular . Esta tiene un contenido proteico que oscila entre 40 y 80% en base seca y su calidad la asemeja ms a la protena animal que a la vegetal . Sin embargo, el uso de protena unicelular para consumo humano presenta importantes limitaciones: la presencia de las paredes celulares, pues stas reducen la biodisponibilidad de las protenas, adems contienen factores antignicos y alergnicos; el alto contenido de cidos nucleicos (bsicamente ARN) los cuales pueden ocasionar trastornos renales y gota, y por ltimo las reducidas propiedades funcionales que exhibe la biomasa celular deshidratada . Estas limitaciones pueden superarse mediante la elaboracin de concentrados proteicos, tal y como ha sido descrito para Candida tropicalis y para Kluyveromyces
marxianus var. marxianus utilizando la extraccin alcalina y precipitacin isoelctrica; sin embargo, esto no es suficiente, dado que los niveles de cidos nucleicos deben ser reducidos, bien sea por mtodos qumicos o mtodos enzimticos. Entre los mtodos qumicos, uno de los ms aceptados es la fosforilacin con oxicloruro de fsforo o alternativamente con trimetafostato de sodio, donde se han obtenido concentrados proteicos a partir de Saccharomyces cerevisiae, los cuales han sido luego deshidratados a travs de mtodos sofisticados, como la liofilizacin o el secado por aspersin, respectivamente. La suplementacin de productos crnicos y de panadera con concentrados proteicos bajos en cidos nucleicos, mejora las propiedades funcionales de dichos alimentos. Se ha ensayado la incorporacin de harinas y autolizados obtenidos de Candida utilis y Saccharomyces cerevisiae en la elaboracin de los mencionados productos con excelentes resultados .
d) Obtencin de etanol : Tabla: Resumen de artculos de trabajo para parmetros de crecimiento cintico con especies de Kluyveromyces en la obtencin de etanol:
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Fuente : KINETIC ANALYSIS OF KLUYVEROMYCES MARXIANUS YEAST STRAIN Erika Guimares Madeira Reeves B.S., Louisiana State University, 2001 May
4.2 Sacarosa. La sacarosa (azcar de mesa) es un disacrido de glucosa y fructosa. Se sintetiza en plantas pero no en animales superiores. No contiene
ningn tomo de
carbono anomrico libre, puesto que los carbonos anomricos de sus dos
unidades monosacridos constituyentes se hallan unidos entre s covalentemente 12
mediante un enlace O-glucosdico. Por esta razn, la sacarosa no es un azcar reductor y tampoco posee un extremo reductor.
4.3 Quimiostato: El tipo ms frecuente de cultivo continuo es el quimiostato en el que se introduce medio fresco a un flujo constante denominado velocidad de dilucin (D) a la vez que se elimina cultivo viejo al mismo flujo. El medio de cultivo de un quimiostato contiene un nutriente esencial en una cantidad limitante (nutriente limitante). Estos parmetros se relacionan de acuerdo a la siguiente ecuacin:
Donde f es la velocidad de flujo (ml h-1) y V el volumen del recipiente en ml. Por consiguiente, las dimensiones de D son [h-1]. El valor D indica el nmero de volmenes de reactor (volmenes de fermentador) que pasan a travs el reactor por unidad de tiempo. Este valor es el recproco del tiempo de residencia o tiempo que una unidad de substrato est dentro del reactor. Tanto la tasa de crecimiento como el nivel de poblacin microbiana estn relacionados con el valor de D.
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Fuente: Microbiologa General, Cultivo de microorganismos.
A velocidades de D muy bajas, pequeos incrementos de la velocidad de dilucin producen un cierto incremento de la densidad del cultivo debido a que se aportan ms nutrientes al medio y el microorganismo no ve limitada su tasa de crecimiento () segn lo indicado en la ecuacin de Monod. La velocidad de crecimiento aumenta ( aumenta y disminuye) cuando la energa aportada por los nutrientes entrantes supera la energa de mantenimiento de los microorganismos del cultivo. A valores bajos de D la concentracin de nutriente limitante (S) en el efluente es baja porque es consumido casi completamente por los microorganismos del cultivo que alcanzan unas poblaciones de gran tamao creciendo a una tasa () baja porque se encuentran en condiciones de limitacin de nutrientes (S<Ks). A valores ms altos de D no todo el nutriente es consumido por los microorganismos del cultivo por lo que S en el efluente aumenta. En una situacin de equilibrio, velocidad de dilucin D se iguala a la tasa de crecimiento , de forma que el control de la tasa de dilucin (control del flujo f) permite regular la tasa de crecimiento y, de esa forma, la situacin fisiolgica del organismo. A valores de D> max, el microorganismo no es capaz de crecer lo suficiente como para evitar ser eliminado del cultivo por el rebosadero y, por consiguiente S alcanza un valor mximo (el nutriente limitante no es consumido en el cultivo y la concentracin del substrato en el efluente es igual a la del substrato en el medio inicial) y la tasa de crecimiento de microorganismos () dentro del cultivo se hace nula (el cultivo desaparece). La evolucin de la biomasa de un quimiostato se ajusta a la ecuacin siguiente: 14
Microbiologa General, Cultivo de microorganismos.
4.4.- Metabolismo:
4.5 Factores Fisicoqumicos que Afectan la Rapidez de Crecimiento. Dentro de los factores ambientales que afectan el crecimiento de las levaduras tenemos: La temperatura puede, en parte, determinar la velocidad de crecimiento y
el grado total de desarrollo de los microorganismos, adems las variaciones de temperatura tambin pueden influir en los procesos metablicos y en la morfologa celular. Pelczar et al. (1977) report, cada especie de levadura crece a la temperatura que esta dentro de cierto lmite de 28 a 48 C ejemplo el Kluyveromyces marxianus crece a 48 C. (www.unsa.edu.ar)
El pH es un parmetro crtico en el cultivo de microorganismos ya que
estos slo pueden crecer en un rango estrecho de pH fuera del cual mueren rpidamente. El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las clulas ya que, en muchos casos, la obtencin de energa metablica depende de la existencia de una diferencia en la concentracin de protones a ambos lados de la membrana citoplsmica.
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Hay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el pH del medio de cultivo suele tender a bajar durante el cultivo. El decremento del pH se puede deber a varios factores, uno de los cuales es la liberacin de cidos orgnicos de cadena corta .Por consiguiente, es necesario controlar el pH de los cultivos para evitar que un descenso excesivo pueda producir la auto esterilizacin del cultivo. Por ejemplo el pH ptimo de crecimiento de las levaduras esta en el rango de 3 a10. (www.unsa.edu.ar) El potencial redox y el oxgeno son factores determinantes del crecimiento
y del metabolismo del cultivo. El potencial redox del medio de cultivo nos indica su capacidad para aceptar o donar electrones, esto es: sus caractersticas oxidantes o reductoras. Uno de los factores que intervienen en el potencial redox, aunque no el nico, es la concentracin de oxgeno, O2. Hay microorganismos que requieren ambientes oxidantes para crecer, mientras que otros necesitan ambientes reductores. El requerimiento de condiciones oxidantes o reductoras no debe confundirse con la necesidad de presencia o ausencia de oxgeno para que se produzca el crecimiento. Un microorganismo es aerobio cuando necesita oxgeno para vivir y es anaerobio cuando o bien no lo necesita (anaerobios facultativos) o anaerobios aerotolerantes como las bacterias lcticas o cuando muere en presencia de oxgeno (anaerobios estrictos como los clostridios). El rendimiento Yx/s de los procesos fermentativos es menor que el de los respiratorios: las levaduras producen menos biomasa cuando crecen fermentando que cuando lo hacen respirando. Actividad de agua: Se denomina actividad de agua a la relacin entre la
presin de vapor de agua del substrato de cultivo (P) y la presin de vapor de agua del agua pura (P0). El valor de la actividad de agua est relacionado con el de la humedad relativa (HR). El valor de la actividad de agua nos da una idea de la cantidad de agua disponible metablicamente. Por ejemplo: comparemos el agua pura donde todas las molculas de agua estn libremente disponibles para reacciones qumicas con el agua presente en una disolucin saturada de sal comn (NaCl) donde una parte importante de las molculas de agua participa en la solvatacin 16
de los iones de la sal disuelta. En este ltimo caso, la actividad de agua es mucho menor que en el primero. Conforme aumenta la cantidad de solutos en el medio, disminuye su actividad de agua. Cuando un microorganismo se encuentra en un substrato con una actividad de agua demasiado baja, su crecimiento se detiene. Esta detencin del crecimiento no suele llevar asociada la muerte del microorganismo, sino que ste se mantiene en condiciones de resistencia durante un tiempo ms o menos largo. En el caso de las esporas, la fase de resistencia puede ser considerada prcticamente ilimitada. La gran mayora de los microorganismos requiere unos valores de actividad de agua muy altos para poder crecer. De hecho, los valores mnimos de actividad para diferentes tipos de microorganismos son, a ttulo orientativo, los siguientes: bacterias aw >0.90, levaduras aw>0.85, hongos filamentosos aw >0.80. La concentracin de los compuestos que se necesitan para el crecimiento es importante porque puede provocar una disminucin de la tasa de crecimiento a causa de la alta presin osmtica del medio. 4.6 Extracto de Levadura Los extractos de levadura son excelentes para muchos microorganismos. Son producidos a partir de la levadura de panadera mediante autlisis a 50 55 C o mediante plasmlisis en presencia de altas concentraciones de NaCl. El extracto de levadura contiene aminocidos, pptidos, vitaminas solubles en agua y carbohidratos. Muestra algunos anlisis tpicos, la composicin del extracto vara parcialmente debido a que los substratos utilizados para el cultivo de las levaduras afectan la calidad del extracto de levadura.
Tabla N xxxx. Composicin del Extracto de Levadura. 17
Extracto de Levadura producido mediante Autlisis Composicin (%) Materia seca Nitrgeno total Protena (N*6.25) NaCl Aminocidos (%) Alanina cido aminobutrico Arginina Asparagina Cistina cido glutmico Glicina Histidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Ornitina Fenilalanina Prolina Serina Treonina Tirosina Valina Contenido en vitaminas (ppm) Tiamina Riboflavina Piridoxina Niacinamida 20-30 50-70 25-35 600 10-15 50-70 20-30 100 350 3.4 0.1 2.1 3.8 0.3 7.2 1.6 0.9 2.0 2.9 3.2 0.5 0.3 1.6 1.6 1.9 1.9 0.8 2.3 2.3 0.1 1.1 3.1 0.2 5.1 1.6 0.8 1.6 2.3 2.9 0.5 0.9 1.6 1.5 1.5 1.4 0.5 1.9 70 8.8 55 <1 80 7.4 46 18 Plasmlisis con NaCl
Ac. Pantotnico 200 Fuente: Ohly Gmbh y Hamburg, citado en Wulf C., 1989.
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4.7 Antiespumantes: 4.7.1 Silicona liquida: El Dimetilpolisiloxano (Simeticona), es una silicona inerte derivada del silicio desprovista de accin sistmica que desarrolla un efecto espumolticoantiflatulento. Qumicamente es un polmero linear de siloxanos metilados, con un nmero de unidades entre 200 y 350 dependiendo de su viscosidad.
4.8 Crecimiento microbiano en medio lquido Si la bacteria crece en un medio lquido, en la mayora de los casos las clulas que se producen en cada divisin continan su vida independientemente formndose una suspensin de clulas libres. En un cultivo discontinuo de bacterias en medio lquido, se pueden diferenciar cuatro fases en la evolucin de los parmetros que miden el crecimiento microbiano: 19
Fase lag o de adaptacin durante la que los microorganismos adaptan su
metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones de cultivo) para iniciar la fase de crecimiento exponencial. Fase exponencial o logartmica: en ella la velocidad de crecimiento es
mxima y el tiempo de generacin es mnimo. Durante esta fase las bacterias consumen a velocidad mxima los nutrientes del medio. La evolucin del nmero de clulas durante esta fase se explica con los modelos matemticos que describiremos a continuacin.
Fase estacionaria: en ella no se incrementa el nmero de bacterias (ni la
masa u otros parmetros del cultivo). Las clulas en fase estacionaria desarrollan un metabolismo diferente al de la fase exponencial y durante ella se produce una acumulacin y liberacin de metabolitos secundarios que pueden tener importancia industrial. Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algn nutriente esencial del medio o porque los productos de desecho que han liberado durante la fase exponencial hacen que el medio sea inhspito para el crecimiento microbiano.
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La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente con mayor fidelidad el estado metablico real de los microorganismos en los ambientes naturales. Fase de muerte: se produce una reduccin del nmero de bacterias viables
del cultivo. 4.9 Cultivo por Lotes La fermentacin por lotes se refiere a un sistema completamente cerrado donde todos los materiales requeridos estn cargados en el fermentador, previamente desinfectados antes del proceso de fermentacin y los residuos removidos al final. Los nicos materiales extrados y agregados durante el curso de una fermentacin por lotes son el intercambio de gases y las soluciones de control de pH, respectivamente. En este modo de funcionamiento, las condiciones estn cambiando continuamente con el tiempo, y el fermentador es un sistema de estado inestable. La ventaja principal es el menor riesgo de contaminacin con respecto a otros procesos de fermentacin (cultivo continuo y cultivo por lote alimentado) La desventaja principal del cultivo por lotes es el alto tiempo improductivo entre lotes, comprendiendo la carga y descarga del fermentador, la limpieza, esterilizacin y procesos de salida. Otra desventaja es la inhibicin del crecimiento por metabolitos primarios, secundarios y por la ausencia de nutrientes. 4.10 Cultivo por Lote Alimentado En el cultivo por lote alimentado, el inicio es una fermentacin por lotes y posteriormente se alimenta con un nutriente limitante o un precursor continuamente o intermitentemente, durante el curso de la fermentacin, a modo de controlar la cantidad disponible del mismo en el medio. Al final del ciclo el fermentador puede vaciarse parcialmente y repetir un nuevo ciclo. Bsicamente, el crecimiento de las clulas se da bajo un cultivo por lotes durante algn tiempo, normalmente hasta cerca del extremo de la fase de crecimiento exponencial. A estas alturas, el biorreactor se alimenta con una solucin de nutrientes. Este alimento debe ser bastante equilibrado para persistir el crecimiento de los microorganismos en una proporcin de crecimiento especfica deseada y
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reduciendo la produccin de derivados simultneamente (se puede ser crecimiento o produccin del producto inhibitorio). Es el proceso ms usado en la produccin de metabolitos complejos. La ventaja de esta tcnica es la produccin de densidades celulares altas debido a la extensin de tiempo (particularmente importante en la produccin de productos crecimiento-asociados) por lo que existe un mayor rendimiento y productividad. Otra ventaja es reducir la formacin de productos secundarios formados cuando hay exceso de nutrientes (sobrealimentacin). La desventaja es que requiere instrumentacin adicional para el control, operarios entrenados para operar el biorreactor y la toma de decisiones, especialmente cuando no se dispone de elementos de control automtico. Otra desventaja es que existen riesgos de contaminacin del medio de cultivo. V.- MATERIALES Y METODOS EXPERIMENTALES: 5.1 Diseo del medio de cultivo y preparacin de los medios. 5.1.1 Medio de mantencin y resiembra del microorganismo. 5.1.1.1 Materiales y equipos Balanza analtica Olla a presin Mechero Bunsen Pipetas de 10 ml. Aza bacteriolgica Tubos de ensayo con tapas (8 tubos) Varilla de vidrio Matraz erlenmeyer (250ml) Guantes. Esptula Probeta graduada Capachos de papel
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5.1.1.2 Reactivos Muestra: Kluyveromyces marxianus ATCC-16045 Sustrato: sacarosa Agua destilada. Extracto de levadura. Peptona. Agar. 5.1.1.3Procedimiento Se iniciara teniendo en cuenta la referencia de composicin
de medios de cultivo de mantencin para Kluyveromyces marxianus ATCC-16045. (Tabla N 1 de anexos) Luego de acuerdo a la tabla N 1 de anexos se pesan las Medir en una probeta graduada 50 ml de agua destilada. Mezclar todos los compuestos en un matraz Erlenmeyer Calentar con el mechero Bunsen la mezcla disuelta en el cantidades requeridas de cada compuesto, con mucho cuidado.
adicionando el agua destilada. matraz; agitando constantemente con la ayuda de una varilla de vidrio, hasta la aparicin de la primera burbuja, a partir de lo cual se controla de 1 a 2 minutos. Preparar 8 tubos de ensayo con tapa, y en caliente Colocar los tubos en un vaso de precipitado, y llevarlos a la adicionar 6ml de la mezcla a cada tubo, e inmediatamente taparlos. olla a presin, previamente aflojar las tapas, para permitir el intercambio de gases. Calentar hasta que la temperatura alcance los 121C y a controlar de 15 a 20 minutos, finalizando la partir de ello esterilizacin.
23
ambiente.
Ajustar las tapas de los tubos estando estos aun dentro de la
olla, luego colocarlos en posicin inclinada y dejarlos a temperatura Luego preparamos nuestra rea de trabajo, desinfectando
con alcohol. para tener una rea estril prendemos el mechero cinco minutos antes de realizar el resiembro con el Kluyveromyces marxianus Abrimos los tubos de ensayo cerca al mechero bunsen , flameando para evitar la contaminacin , teni8endo el aza bacteriolgica calentado al rojo vivo esperamos un momento que se enfre . Sacamos 2 a 3 azadas y colocamos en el tubo con agar , flameamos y cerramos el tuvo y as en los 8 tubos con agar 5.1.2 Medio de activacin 5.1.2.1 Materiales y equipos Matraz de 250ml. Matraz de 125 ml tubos de ensayo con tapa Algodn Gasa Varilla de vidrio Balanza analtica Esptula Agua destilada Pinzas Guantes Shaker Mechero Bunsen, trpode y rejilla. Olla a presin
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Pipetas Capachos de papel PHmetro
5.1.2.2 Reactivos Componentes segn Tabla N 2 Alcohol HCl cc. 5.1.2.3 Procedimiento Pesar los componentes descritos en la tabla N 2 de
anexos.
Se esterilizan: la mezcla de extracto de levadura y sales en un tubo de ensayo (enrazar hasta 14 ml con agua destilada), la sacarosa en un matraz de 125 ml (14 ml con agua destilada). sacarosa. Mezclar estos componentes para el medio de activacin Tener el resiembro activado en una estufa por un Sacamos tres azadas y colocamos en el medio de bajo mechero para evitar la contaminacin. promedio de 1.5 a 2 horas. activacin. Colocar en el shaker hasta que la concentracin sea de 3gr/l para un tiempo de 12h. Previamente a la esterilizacin utilizar NaOH y acido ortofosforico para ajustar el pH a 5.0 de la solucin que contiene
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levadura.
Luego se inocula en un matraz de 250 ml con un medio
liquido de 136 ml que contiene sacarosa, sales y extracto de
5.1.3Medio de fermentacin y proliferacin 5.1.3.1 Matraz de 1 L Matraces de 125 ml Varilla de vidrio Capachos de papel Balanza analtica pHmetro 5.1.3.2 Reactivos Materiales y equipos
Segn la tabla N 3 de anexos Agua destilada Alcohol 5.1.3.3 Procedimiento Pesar los componentes descritos en la tabla N 3 de anexos. Se diluye completamente cada compuesto con agua destilada de la siguiente manera: Sacarosa en un matraz de 1 L con 400 ml de agua destilada Extracto de levadura y el sulfato de amonio en un matraz con 212 ml. de agua destilada Las sales, K2HPO4, MgSO4. 7H2O
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Regular el H de la solucin de sales con acido Esterilizar las diluciones por separado. Dejar enfriar Mezclar el extracto con el azcar (sacarosa) y Colocar en Bao Maria con el agitador magntico e
ortofosforico e hidrxido de sodio hasta un pH de 5.0
adicionar el inoculo. iniciar el cultivo continuo con adicin de nutrientes
5.1.4 Medio para el quimiostato V= 680 (viernes 29/02/08 8:00m.) Se mezclaron los componentes de la siguiente manera (tabla 4 de anexos): sacarosa, 220 ml de agua destilada en el quimiostato Solucin de sales MgSO4.7H2O y K2HPO4 (NH4)2SO2 en un matraz de 250 ml con 100 ml de agua destilada Extracto de levadura y sulfato de amonio en un matraz de 125 ml con 100 ml de agua destilada Se taparon, esterilizaron 121 C tiempo 20 minutos y se dejo enfriar hasta su posterior uso. 5.1.5 Medios para el flujo de alimentacin de los estados estacionarios V=2.4 L (viernes 31/02/08 9:00 am) Se mezclaron los componentes de la siguiente manera (tabla 5 de anexos): Sacarosa,220 ml de agua destilada en un botelln mbar de 2.5 L
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Solucin de sales 11.5 ml, 100 ml de tampn, MgSO4.7H2O y K2HPO4 c en un matraz de 125 ml Extracto de levadura y sulfato de amonio en un matraz de 125 ml con 100 ml de agua destilada. Se taparon, esterilizaron 121 C tiempo 20 minutos y se dejo enfriar hasta su posterior uso.
5.2
Medio bajo limitacin por nitrgeno: Se mezclaron los componentes de la siguiente manera (tabla de anexos 7): sacarosa, y agua destilada en un botelln mbar de 2.4 L Solucin de sales, tampn, MgSO4.7H2O y K2HPO4 (NH4)2SO2 en un matraz de 125 ml Sulfato de amonio en un matraz de 125 ml con 100 ml de agua destilada Se taparon, esterilizaron y se dejo enfriar hasta su posterior uso.
5.3
Medio para perturbacin con alta concentracin de sacarosa: Se mezclaron los componentes de la siguiente manera (tabla 8 de anexos): sacarosa, 220ml de agua destilada en un botelln mbar de 2.4 L Solucin de sales ml, tampn, MgSO4.7H2O y K2HPO4 (NH4)2SO2 en un matraz de 125 ml Extracto de levadura y sulfato de amonio en un matraz de 125 ml con 100 ml de agua destilada Se taparon, esterilizaron y se dejo enfriar hasta su posterior uso. 5.4 Medio para el lavado Se mezclaron los componentes de la siguiente manera (tabla 9 de anexos): sacarosa, tampn y ml de agua destilada en un botelln mbar de 2.4L
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Solucin de sales ml, ml de tampn, MgSO4.7H2O y K2HPO4 (NH4)2SO2 en un matraz de 125 ml Extracto de levadura y sulfato de amonio en un matraz de 125 ml con 100 ml de agua destilada Se taparon, esterilizaron y se dejo enfriar hasta su posterior uso. 5.5 Puesta en marcha del quimiostato De la cintica seguida en los matraces se determino el tiempo para las 2/3 partes del crecimiento logartmico para dar inicio al cultivo continuo 5.6 Obtencin de la curva caracterstica de crecimiento de una levadura Se trabajo con 5 e.e. para la obtencin de esta curva, es haciendo variar la velocidad de dilucin de acuerdo al tiempo calculado en el Anexo N... Estados estacionarios: dp dx ds =0 ; ; dt dt dt Considerando que en estado estacionario se cumple que: =D 5.7 Obtencin y caracterizacin de un estado estacionario bajo limitacin por nitrgeno. Nutriente limitante: nitrgeno Concentracin celular final de 3g/l Para este estado estacionario consideraremos los siguientes datos: con la experiencia 4
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= 0.2206 h-1 F = 2.5 ml/min t = 14 h *V = 2.4 L *Este volumen es la cantidad de medio a preparar para la alimentacin. 5.8 Perturbacin de un estado estacionario mediante aumento de la concentracin del nutriente limitante en la alimentacin. Habindose obtenido los 5 estados estacionarios en el crecimiento de la levadura, se perturba este estado aumentando la concentracin de sacarosa (Nutriente limitante) en la alimentacin. Este nuevo flujo trabajo una concentracin de sacarosa = 15 g/l. Para este estado estacionario consideraremos los siguientes datos: = 0.2650 h-1 F = 3.00 ml/min t = 12 h *V = 2.4 L *Este volumen es la cantidad de medio a preparar para la alimentacin. Se tomaron 11 muestras cada hora 5.9 mtodo de lavado Se aumento el flujo para determinar el max D = 1.0588 h-1
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F = 12 ml/min t=3h VL = 680 ml Donde VL = Volumen del Quimiostato *V = 2.4 L *Este volumen es la cantidad de medio a preparar para la alimentacin. Se tomaron 11 muestras cada hora
VI.- RESULTADOS Y DISCUSION:
La Inoculacin Kluyveromyces Marxianus Del Fue De La Siguiente Manera

1 SHAKER
1
SHAKER
SHAKER
SHAKER
Muestreo para seguimiento de la cintica del cultivo por lote
SHAKER
Muestreo para obtencin de la Curva de calibrado de biomasa y sustrato
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CULTIVO POR LOTE CULTIVO CONTINUO
1.- EL CULTIVO POR LOTE Del matraz N 3 se extrajo las muestras para realizar la curva de calibrado o curva patrn para biomasa que nos fue proporcionado por el profesor del curso y azucares reductores por mtodo rpido DNS presentamos los datos en el cuadro N 2 , obtenindose as los resultados : Se tomaron 20 ml, cada muestra de 5 ml, se midi absorbancia 540 nm y para la biomasa de 640 nm se centrifugo para hallar peso seco.
METODO D.O (Datos para la curva de calibrado para la concentracion celular Biomasa):
CUADRO N 1: DATOS PARA LA CURVA DE CALIBRADO DE BIOMASA
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N Capacho Dilucin 1 01:01 2 01:02 3 01:05 4 01:10
ml Caldo 5 2.5 1 0.5
ml de H2O 0 2.5 4 4.5
Absorbancia Capachos Capachos Celulas (640nm) 1.23 0.9 0.487 0.272 (gr) 0.2156 0.2126 0.2046 0.2082
+ Celulas secas (g) (g/L) 0.2244 0.0088 1.76 0.2191 0.0065 1.3 0.2072 0.0026 0.52 0.2094 0.0012 0.24
GRAFICA N1: CURVA DE CALIBRADO DE BIOMASA

Curva de Calibrado de Biomasa (Kluyveromyces marxianus ATCC-16045)
1.4 1.2 Absorbancia (640nm) 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 CC de Biomasa (G/L)
y = 0.6094x + 0.1403 R2 = 0.9955
Obtenindose un
mm=0.452 h-
33
y = 0.6094x + 0.1403
R2 = 0.9955
El tiempo de muestreo para la fermentacin del cultivo por lotes fue de 10 hr y se ha considerado los 2/3 del crecimiento logartmico, porque a este tiempo las clulas son ms viables y estn en pleno crecimiento exponencial, pues es en ese momento en la que se puede dar inicio al cultivo continuo. La inoculacin al quimiostato es la primera etapa para dar inicio a este cultivo, a esta etapa se le llama puesta en marcha y con ella empezara el conteo hasta luego de las 4h Como se muestra a continuacin para un m =0.452h-1 obtenido por el profesor. C1V1 = C2V2 2 (g/l)*20(ml)= X0*680(ml) 0.0588 g/l= X0 Ln(X / X0) = m t Ln((3g/l)/(0.0588g/l)) = 0.452h-1 t 3.777=t T=4h En las que las clulas se encuentren en pleno crecimiento. En la experiencia las clulas inoculadas tuvieron una absorbancia de 0.206 y luego en el quimiostato tardaron 4 horas hasta alcanzar los dos tercios de su crecimiento logartmico pues durante este lapso de tiempo las clulas se adaptan al nuevo medio siendo este el momento ideal para iniciar el cultivo continuo La determinacin experimental de este momento se logro gracias a la medicin de la absorbancia, cuyo valor al cabo de las 4 horas fue de 0.830 , que al comprobarla con la absorbancia del cultivo por lote existe una semejanza significativa con lo obtenido en la
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cintica
de
crecimiento
en
el
cultivo
por
lotes.
2/3 T
Fuente : instituto Tecnolgico y de Estudios Superiores de Occidente.
A. METODO DNS (Datos para la curva de calibrado de sacarosa (6 g/L) )
CUADRO N 2: DATOS PARA LA CURVA PATRON DE SACAROSA N TUBOS 1 2 3 4 5 ml de caldo V1 2 1.6 1.2 1 0.8 ml de H2O 0 0.4 0.8 1 1.2 C2 de Sacarosa (g/L) 6 4.8 3.6 3 2.4 ABSORBANCIA 0.951 0.646 0.597 0.488 0.317 35
6 7 8
0.4 0.2 0
1.6 1.8 2
1.2 0.6 0
0.21 0.07 0
GRAFICA N2: CURVA PATRON DE LA SACAROSA

Curva de Calibrado de Sacarosa
1 0.9 0.8 Absorbancia (540 nm) 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 CC de Sacarosa (g/L)
y = 0.1528x - 0.0028 R2 = 0.9785
2.- CULTIVO CELULAR CONTINUO AIREADO: 2.1PUESTA EN MARCHA DEL QUIMIOSTATO La puesta en marcha se realiza luego de montaje del quimiostato. Tal como se muestra en la figura
Fig N1: Montaje de
36
Fig N2: Quimiostato listo para
Siendo las 8: 00 am del da viernes se inoculo el matraz N 3 en el quimiostato se saco una muestra y se ley la absorbancia dando ABS = 0.206, lo cual indica que el inicio del cultivo continuo aun no debe empezar.
37
Toma de muestra para la lectura de la absorbancia.
Por lo que luego de aproximadamente 4 horas se toma una muestra mas dando la ABS.= 0.830 esto indica que se debe dar inicio al cultivo continuo. 2.1 parmetros para cultivo continuo. Las variables que comnmente se controlan en un cultivo continuo son: el pH, la temperatura, la cantidad de espuma formada, la velocidad de agitacin, etc( Instituto Tecnolgico y de Estudios Superiores de Occidente, A) pH.- En trabajo realizado en el laboratorio se trabajo con un pH inicial de 5.88 y se termino con un pH de 5.5 contrastando de acuerdo a la teora las levaduras como Kluyveromyces marxianus toleran mejor altas concentraciones de azcar que de sal, pero toleran un rango de entre 3 y 10, pero prefieren un medio ligeramente cido con un pH de 4,5 a 6,5.Kluyveromyces marxianus (1) La temperatura. En trabajo realizado en el laboratorio se trabajo con una temperatura de bao Maria de 30 C; La vasta mayora de las levaduras son mesfilas, pero en el caso de Kluyveromyces marxianus es aerobia porque es una especie fermentadora as mismo la mayora de las levaduras tienen una temperatura mxima de crecimiento entre 24 y 48C. La temperatura optima se encuentra por lo general entre 30 45 C, (Elsevier, 1990). La filtracin.- En la practica de laboratorio se utilizo el sulfato de cobre como un filtrador que permite eliminar las partculas en suspensin en el aire y as eliminar a los microbios que son, generalmente, adsorbidos .La gran mayora de partculas tienen un dimetro comprendido entre un dcimo y algunos micrones .En el aire seco, estn animadas de un movimiento browniano que les da una talla aparente diez veces superior a su tamao real .Es posible eliminar las gracias a dos formas diferentes de filtracin. (Scriban, R. (1984). La agitacin.- en la prctica realizada se utilizo un agitador magntico para que acelere el contacto entre dos o varias fases. En la fermentacin, la fase soporte es con frecuencia 38
el medio cultivo .La agitacin tiene por objeto mezclar con esta base soporte varias fases que se adicionan .Una fase slida (especial) constituida por las clulas microbianas, la operacin mezcla consiste en llevar a cabo una suspensin que debe ser lo mas homognea posible, pero conservando la integridad de las clulas , en la practica se utilizo para tener en suspensin a las clulas y tener una mejor distribucin de los nutrientes agregados al medio. Una segunda fase gaseosa constituida por el gas de oxigenacin para los procedimientos aerobios .La operacin en este caso es una emulsin. (Scriban, R. (1984). Una fase liquida constituida por los reactivos que se adicionan en el curso de la fermentacin: silicona liquida, nutrimentos, soluciones para corregir el pH. La operacin que se realiza es una mezcla. La agitacin mecnica, adems de realizar las operaciones de mezcla y de suspensin, mejora la emulsin dividindolo las burbujas de gas introducidas hacindolas circular en el lquido (Scriban, R. (1984). La produccin de espumas: la formacin espuma puede ser un problema serio en la fermentacin. Si se permite su formacin puede bloquear los filtros de salida, estimular la contaminacin o reducir el rendimiento. Lamentablemente la mayor parte de los medios de fermentacin facilitan la formacin de espuma y su reduccin puede conseguirse mecnica o qumicamente. Existen un conjunto de antiespumantes en el mercado que incluyen aceites naturales , alcoholes superiores,, siliconas , n- parafinas. Algunos antiespumantes son metabolisados por los microorganismos y es necesaria la diccin regular al fermentador ; en efecto , por diseo cuidadoso del medio el antiespumante puede ser utilizado como una fuente adicional de carbono, frecuentemente mas eficientemente que la principal fuente de carbono. (J BULOCK; B.KRISTIANSEN. 1991) Durante el proceso de fermentacin, puede ser tolerable en cierta cantidad, pero este llega a un punto que es necesario reducirlas para evitar que se desborden dado los inconvenientes y los riesgos que esto entraa. La espuma aparece cuando la dispersin de gas en la fase liquida se estabiliza a causa de pelculas liquidas resistentes que envuelven las burbujas de gas .Aparece tanto mas fcilmente y con mayor abundancia cuando mas dbil es la tensin superficial. La temperatura, el pH y la viscosidad del fluido de fermentacin juegan tambin un papel importante en la formacin y persistencia de espumas. 39
Las sustancias antiespumas como los productos a base de silicones , recurre a la accin global sobre la tensin superficial , adems su eleccin de producto para contrarrestar en el problema de las espumas , es debido a que este producto presenta un poder inhibidor mnimo o nulo sobre el microorganismo que se cultiva, a comparacin de medio qumicos ( sustancias inicas) .Las espumas pueden disminuir la capacidad de transferencia de oxigeno de la instalacin .As mismo pueden provocar una especie de envenenamiento de las interfases de intercambio gas liquido .Asimismo pueden perturbar los intercambios celulares por envenenamiento , en este caso , de las envolturas de la clula .Se les puede imputar un aumento del tamao medio de las burbujas de gas en el seno del liquido , de donde resulta un aumento de la velocidad media ascensional del gas y por consecuencia una disminucin de la retencin gaseosa y del aire interfacial especifico que puede llegar hasta el 25%.La transferencia de oxigeno es globalmente disminuida hasta el 60% , con la consecuente e inevitable baja de productividad (Scriban, R. (1984). Otro de los motivos de la formacin de espuma es a causa de las protenas que contiene el extracto de levadura y los metabolitos que se van formando durante la fermentacin.
Formacin de espumas en el bioreactor
La transferencia de oxigeno.- De las burbujas gaseosas hacia los sitios de su utilizacin en las clulas se hace en varias etapas, representa una transferencia unidireccional. Esta transferencia se efecta a travs de varias pelculas, cada una de ellas ejerce cierta resistencia .Se considera que en la interfase gas-liquido del lado gaseoso esta recubierta de una pelcula gaseosa ( etapa 1) y del lado liquido , de una pelcula liquida (etapa 2),
40
esta ultima ejerciendo una gran influencia sobre la transferencia. El oxigeno disuelto difunde entonces hacia las clulas (etapa 3 ) , al contacto de las cuales se encuentra de nuevo a una pelcula liquida (etapa 4 ).Finalmente el oxigeno debe penetrar a la clula ( etapa 5)se puede considerar lo que paso dentro de la clula en donde el oxigeno debe difundir hacia el sitio donde es efectivamente utilizado para el metabolismo .En las levaduras las enzimas respiratorias estn localizadas dentro del mitocondrias. El oxigeno debe entonces difundir en el citoplasma y atravesar la pared mitocondrial. A esto se le agrega , el fenmeno ya considerado de la formacin del micelio en pelota que hace mas difcil aun la transferencia del oxigeno al seno del amontonamiento microbiano. El oxigeno juega un papel fundamental en el metabolismo aerobio productor de energa, como receptor final de los electrones y de los protones producidos en las reacciones de oxidacin. El oxigeno interviene en ciertos mecanismos de regulacin del metabolismo en forma directa, como inductor o como represor de la sntesis de enzimas respiratorias, pero tambin en forma indirecta en su papel en el metabolismo energtico La instalacin debe concebirse en su conjunto en forma que permita: La esterilizacin y el mantenimiento de asepsia, la distribucin de aire, en procesos aerobios, la reduccin o eliminacin de espumas, la transferencia de fluidos y de suspensin de una cuba a otra. . (Scriban, R. (1984). Para que un microorganismo se multiplique, es necesario que se desarrolle en un medio donde haya oxgeno, ya que este le sirve para producir energa e incrementar la oxidacin (que es una de las causas por las cuales crece). Los requerimientos de oxgeno pueden ser expresados en trminos de qo2, esta es la cantidad de oxgeno consumido por unidad de tiempo y por unidad de biomasa, esta varia de acuerdo al microorganismo y del estado fisiolgico de las clulas, substratos de carbono y los parmetros fisicoqumicos. (Instituto Tecnolgico y de Estudios Superiores de Occidente, A)
41
Medidor de oxigeno.
DATOS EXPERIMENTALES OBTENIDOS.
CUADRO N 3: DATOS EXPERIMENTALES DE LOS 5 ESTADOS ESTACIONARIOS OBTENIDOS EN LA PRACTICA Fecha Hora Absorbancia pH Responsable d/m/a (h) 640 nm 29/02/2008 07:30 a.m. 0.206 (Xi) 5.88 Grupo D1,2 29/02/2008 11:30 a.m. 0.83 (X2/3) 4.492 Grupo D1,2 Observaciones N Experiencia Cambio OK OK Experiencia N3 (19 01/03/2008 07:00 a.m. 01/03/2008 08:00 a.m. 01/03/2008 07:00 p.m. 01/03/2008 08:00 p.m. 0.928 0.817 0.922 0.785 5 Grupo A1 Cesar 5.5 Moreno h) F= 1.8 ml/min Experiencia N5 (12 h) F= 3 ml/min Experiencia N1 (43 03/03/2008 01:00 p.m. 03/03/2008 02:00 p.m. 03/03/2008 03:00 p.m. 0.975 0.896 Augusto B1 no se presento h) F= 0.8 ml/min Experiencia N2 (29 04/03/2008 07:00 p.m. 04/03/2008 08:00 p.m. 0.866 0.848 5.5 h) F= 1.20 ml/min Cambio de F=3 ml/min Hora 8:00 pm (Exp. 42 1:00 pm se observa en el frasco de alim. solidos en suspension. Cambio de F=3 ml/min Hora: 8:15 am Cambio de F=0.8 ml/min Hora: 8:15 pm
N5) 05/03/2008 07:00 a.m. 05/03/2008 08:00 a.m. 0.937
1. CULTIVO CELULAR CONTINUO AIREADO: ESTADOS ESTACIONARIOS
Para alcanzar los estados estacionarios se tiene en cuenta que deben pasar 3 tiempos de residencia (siendo 3: tiempo de residencia y = D-1, donde se ha alcanzado aproximadamente el 90% de equilibrio celular, por este motivo la toma de la absorbancia de realiza una hora antes y una hora despus para verificar que la clula esta llegando o se encuentra en su estado estacionario. En la experiencia se tomaron tres muestras siendo la segunda muestra la que corresponde a la hora central; para afirmar que se ha alcanzado el estado estacionario se comprobaron con las lecturas del espectrofotmetro no habiendo mucha diferencia, +/- 5% entre cada dato. En general los clculos para los tiempos de fermentacin son casi exactos, pues luego de este tiempo la clulas se encontraban en su estado estacionario. Cerca de las 12:00 pm. se da inicio al cultivo continuo la toma de muestras se realizo de acuerdo a los clculos realizados; los muestreos obtenidos se presentan en la siguiente tabla. Sabiendo que en los estados estacionarios D = se opta por dar las velocidades de dilucin que se presentan; con sus respectivos flujos. Los sobrenadantes guardados en los viales, sirvieron para la evaluacin del consumo de sustrato segn el mtodo DNS y utilizando la curva de calibrado para azucares reductores hallamos la variacin de concentracin del sustrato, lo obtenido se presenta en la siguientes tabla. En este tipo de cultivo continuo hay una aportacin continua de los substratos para la alimentacin de los microorganismos, el propsito de el estado estacionario es mantener constante la produccin de biomasa. Esto se logra alimentando al quimiostato a un ritmo estable, el volumen es mantenido constante quitando la misma cantidad que se (3).
43
La adicin de nutrientes al medio como, como sales de amonio y extracto de lavadura puede tener un efecto beneficioso
CUADRO N 4: DATOS OBTENIDOS DE LOS 5 ESTADOS ESTACIONARIOS F Absorbancia X (g/L) Absorbancia S (g/L) 0.1099 0.975 1.3697 0.007 0.8 0.1361 0.896 1.2401 0.009 0.1492 0.866 1.1908 0.01 1.2 0.0838 0.848 1.1613 0.005 0.5419 0.928 1.2926 0.04 *1.8 0.1623 0.817 1.1104 0.011 0.0969 0.778 1.0464 0.006 2.5 0.1361 0.723 0.9562 0.009 1.1963 0.922 1.2827 0.09 0.1492 3 0.785 1.0579 0.01 0.1492 0.686 0.8955 0.01 * Para el flujo de 1.8 ml/min tuvimos que hacer un promedio de los dos valores de absorbancia y tomar este promedio para hallar el X (g/L) (1.2015) como valor para nuestro grafico N 3 y N 4. * Los valores que se encuentran de color rojo, son los valores que se han tomado en cuenta para el grafico N 3 y N 4. (ml/min)
CUADRO N 5: VALORES TOMADOS DE X y S PARA LAS GRAFICAS N 3 y N4. =D (h-1) 0.0706 0.1059 0.1588 X (g/L) 1.2401 1.1908 1.2015 S (g/L) 0.1361 0.1492 0.5419 44
0.2206 0.2647 0.4520
1.0464 1.0579 0
0.1361 1.1963 5.93
GRAFICA N3: CULTIVO CONTINUO AIREADO
CULTIVO CONTINUO AIREADO

1.4000 1.2000 1.0000 0.8000 3.0000 0.6000 0.4000 0.2000 0.0000 0.0706 0.1059 0.1588 0.2206 0.2647 0.452 2.0000 6.0000
5.0000
Biomasa X (g/L)
4.0000
Sustrato S (g/L)
X (g/L) S (g/L)
1.0000
0.0000
D (h-1)
GRAFICA N 4: CULTIVO CONTINUO AIREADO CON LINEA DE TENDENCIA
45
Cultivo Continuo Aireado

1.4000 1.2000 1.0000 0.8000 3.0000 0.6000 0.4000 0.2000 0.0000 0.0706 0.1059 0.1588 0.2206 0.2647 0.452 2.0000 6.0000
5.0000
Biomasa X (g/L)
4.0000
Sustrato S (g/L)
X (g/L) Linea Tendencia S (g/L) Linea Tendencia
1.0000
0.0000
D (h-1)
Los valores tomados en el laboratorio se supone que sebe ser el mismo para cada estado estacionario por tener una alimentacin constante de sustrato; se tomaron para el grafico N3 y N4 se encuentran en el cuadro N 4, y el criterio que tuvo el grupo para escoger estos valores fue por lo siguiente; inicialmente tomamos el promedio de estos valores pero al ver que no nos proporcionaba una grafica adecuada ni dada por referencias bibliografcas; decidimos en el caso de sustrato que tenia que ir aumentado la concentracin y en el caso de biomasa disminuir tomando valores que se ajusten a la curva dada por referencias bibliograficas.
Si observamos el grafico anterior N 3 y N 4 podemos comprobar que en los resultados si hay un aumento de la velocidad de dilucin (D), entonces menor ser la concentracin de
46
biomasa, por consiguiente tendremos una mayor concentracin de sacarosa cuando aumentemos la velocidad de dilucin ya que al formase menos biomasa consumirn menos sacarosa. Esto se puede contrastar con las siguientes bibliografas: La productividad de biomasa de 1,61 g / L h en estado puro hidrolizado a pH 4 y 38 C, a una tasa de dilucin de 0,1 h -1, fue mayor que el valor de 1,13 g / L h obtenido en el 50% diluido en el hidrolizado El mismo pH y la temperatura, pero a una tasa de dilucin de 0,15 h-1. No substrato de carbono residual fue detectado en ninguna de las anteriores condiciones de cultivo. (Cultivo en Quimiostato de Candida blankii en Bagazo de la caa de azcar hemicelulosa hidrolizado P.S. Meyer, J.C. du Preez, * y S.G. Filian). Otro autor nos menciona: En la Figura se aprecia la disminucin en la concentracin de biomasa conforme aumenta el valor de la tasa de dilucin, pasando de un valor inicial de 3,3 g/L para una tasa de dilucin de cero, que corresponde a una operacin del sistema en forma batch, hasta una concentracin de 0,2 g/L para una tasa de dilucin igual a 0,5 h-1.
Para la ltima tasa de dilucin (0,5 h-1), la concentracin de azcares totales en el medio de cultivo se mantuvo aproximadamente igual a la concentracin del medio de cultivo fresco con que se alimenta el proceso, indicando que la operacin del sistema continuo tuvo lugar con una tasa de dilucin lo suficientemente alta que provoc el lavado de clulas o producto, lo cual se debe evitar. La tasa mxima de dilucin, Dmax, con un valor de 0,19 h1, se obtuvo grficamente donde las curvas de concentracin de biomasa y sustrato en la Figura 5, se interceptan.
47
De igual forma, la tasa de dilucin crtica, Dcri, corresponde al valor aproximado de 0,30 h-1, este valor tiene lugar donde la concentracin de azcares totales en el medio de cultivo comienza a mantener un valor constante y similar a la concentracin de azcares totales del medio de cultivo fresco, adems, se da inicio al lavado de clulas. Ambos parmetros son posibles de conocer a partir de los resultados cinticos obtenidos previamente. (Evaluacin de parmetros cinticos para la
Sacharomyces cerevisiae utilizando agua de coco como sustrato. Oscar Ramrez Snchez).
DETERMINACION DE max Y Ks EN LOS ESTADOS ESTACIONARIOS: CUADRO 6: DATOS PARA LA DETERMINACION DE max Y Ks S (g/L) 0.1361 0.1492 0.5419 1.1963 1/S 7.3475 6.7024 1.8454 0.5895 D(h-1) 0.0706 0.1059 0.1588 0.2647 1/D 14.1643 9.4429 6.2972 3.7779
GRAFICO N 5: CURVA DE max Y Ks EN LOS ESTADOS ESTACIONARIOS
48
DETERMINACIN DE m Y Ks EN LOS ESTADOS ESTACIONARIOS

16.0000 14.0000 12.0000 10.0000 y = 1.221x + 3.3885
1/D
8.0000 6.0000 4.0000 2.0000 0.0000 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Datos dispersos Lineal (Datos dispersos)
1/S
Para determinar m y Ks se deben obtener datos de varios estados estacionarios, lo que permite construir experimentalmente un grafico tipo Monod. En principio, de este grafico se podra calcular Ks como el valore de S al cual = m/2 ya que: m/2 = m*(S/(Ks+S) y S = Ks Por otra parte m se podra calcular del grafico como el mayor valor de , lo que equivale a su valor asinttico. Sin embargo el valor as estimado resulta muy impreciso, lo cual repercute en el calculo de Ks, que es un numero sensible a pequeas variaciones, por lo que esta forma de calculo no es recomendable. Una mejor forma de determinar m y Ks es graficando los valores recprocos de = D y S, obteniendo un m del intercepto de la recta con el eje de 1/ y Ks del intercepto con el eje de 1/S o de la pendiente Ks/m. este mtodo es formalmente inobjetable, pero aun asi los valores obtenidos pueden presentar variaciones apreciables. Ello es debido a que los datos experimentales se ubican relativamente alejados de los ejes, por ser ellos valores recprocos. Por lo tanto pequeas diferencias en la pendiente de la recta trazada se amplifica notoriamente en la interseccin y afecta de m. tambin es importante el hecho que obtener 5 o 6 estados estacionarios requiere de una semana o ms de trabajo.
(copias de ingeniera de fermentacin y enzimas Ing Augusto Castillo)
Ecuacin para determinar el m y el Ks:
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y = 1.221x + 3.3885 El m se calcula intersectando la recta con el eje Y(1/D): 1/m = 3.3885 Entonces:
m = 0.295 h-1
El Ks se calcula de la pendiente de la recta: Pendiente = Ks/m Entonces: Ks = m * 1.221 Ks = 0.36h-1 La velocidad de crecimiento en los microorganismos es funcin del nutriente limitante, la velocidad de adicin de medio determina la velocidad de crecimiento del microorganismo y el sistema est autorregulado. De acuerdo al trabajo de investigacin de otro autor. el crecimiento de Kluyveromyces marxianus en lactosuero, dicho medio estuvo caracterizado por una fase exponencial con una duracin de 6 a 7 horas aproximadamente .El valor de la velocidad mxima de crecimiento especfico (max) fue de 0,42 h1 (promedio de 5 procesos fermentativos independientes) lo que corresponde a un tiempo de generacin de 1,65 h . (5) La concentracin de biomasa alcanzada al final del crecimiento oscil entre 3,67 y 4,65 g/L, consumindose casi la totalidad de la lactosa, con un valor promedio de 93,21%, correspondiente a 14,6 g/L. Estos datos permitieron calcular el rendimiento en biomasa referido a lactosa consumida, el cual oscil entre 0,28 y 0,33 g/g. Es importante destacar que los valores de los distintos parmetros de cultivo determinados en el presente estudio guardan cierta similitud con los reportados por otros autores a pesar de que en algunos casos las condiciones de operacin fueron marcadamente diferentes. As, Vananuvat y Kinsella [36], utilizando tanques agitados reportan valores de max en el rango de 0,35 h1 y 0,44 h1 para velocidades de agitacin de 300 rpm y 700 rpm respectivamente; Castillo y Snchez [3], empleando fiolas agitadas obtienen valores de max de 0,41 h1 a 35C, y Chinappi y Snchez [5] hicieron determinaciones de max entre 0,34 y 0,62 h
50
1, al emplear diversos tipos de biorreactores operados a altas tasas de aireacin y agitacin. (5) En nuestra investigacin obtuvimos un m = 0.295 h-1 a una agitacin de 200rpm.
DETERMINACIN DEL COEFICIENTE DE MANTENCIN REAL: CUADRO 7: D(h-1) 0.0706 0.1059 0.1588 0.2206 0.2647 y(x/y) 0.2098 0.2057 0.2112 0.1910 0.2335 qs 0.3365 0.5149 0.7520 1.1552 1.1334
GRAFICO 6: CURVA DEL COEFICIENTE DE MANTENCION REAL
DETERMINACION DEL COEFICIENTE DE MANTENCIN REAL

1.4000 1.2000 1.0000
y = 4.4681x + 0.0451 R2 = 0.9531
qs(g/g*h)
0.8000 0.6000 0.4000 0.2000 0.0000 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3
qs Lineal (qs)
D(h-1)
Ecuacin para determinar el coeficiente de mantencion: y = 4.4681x + 0.0451 El coeficiente de mantencion se calcula del intercepto de la recta con el eje qs. m = 0.0451 m = coeficiente de mantencion.
51
DETERMINACION DE m POR LAVADO (F = 12 g/L) CUADRO N 8: DATOS PARA EL m POR LAVADO Fecha d/m/a 07/03/2008 07/03/2008 07/03/2008 07/03/2008 07/03/2008 07/03/2008 07/03/2008 Hora (h) 08:00 a.m. 08:30 a.m. 09:00 a.m. 09:30 a.m. 10:00 a.m. 10:30 a.m. 11:00 a.m. Absorbancia (640 nm) 0.723 0.643 0.553 0.407 0.301 0.236 0.181 X (g/L) 0.9562 0.8249 0.6772 0.4376 0.2637 0.1570 0.0668 LNX -0.044802392 -0.192481296 -0.38975393 -0.826350435 -1.332935594 -1.851256568 -2.706246774 Tiempo 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
GRAFICA N7: CURVA DE m POR LAVADO X(g/L) vs T (h)
DETERMINACION DE m POR LAVADO

1.2000 1.0000 [ ] BIOMASA (g/L) 0.8000 0.6000 0.4000 0.2000 0.0000 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 TIEMPO (h)
GRAFICA N 8: CURVA DE m POR LAVADO LnX vs T (h)
52
DETERMINACION DE m POR LAVADO (F = 12 g/L) 0 0 -0.5 -1 Ln X -1.5 -2 -2.5 -3 Tiempo (h) 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
GRAFICA N 9: DETERMINACION DE m POR LAVADO; POR LA PENDIENTE

DETERMINACION DE m POR LAVADO
0 -0.2 -0.4 -0.6 -0.8 Ln(X) -1 -1.2 -1.4 -1.6 -1.8 -2 TIEMPO (h) y = -0.8521x + 0.3597 R2 = 0.9776
Serie1 Lineal (Serie1)
0.5
1.5
2.5
53
As como se calcula el m por el mtodo de los estados estacionarios, otra alternativa es el denominado mtodo del lavado, que consiste en aumentar el valor de D de un cultivo en estado estacionario sobre el Dc, de forma de producir intencionalmente l lavado y graficar los datos obtenidos en la forma de LnX vs tiempo. En la situacin de lavado rige la ecuacin diferencial: m = D + ((1/X)*(dX/dt)) = D + (dLnX/dt) Y dado que D es mayor al Dc las clulas crecern a su mxima velocidad m. Por lo tanto m se calcula determinando la pendiente de un grafico LnX vs tiempo, restndola (la pendiente es negativa) del valor de D escogido para producir el lavado. El experimento debe prolongarse lo suficiente para obtener una buena recta dejando de lado los primeros puntos que corresponden a un periodo transitorio de ajuste a las nuevas condiciones. El valor de m obtenido del lavado es tan bueno como lo es su determinacin a partir de la fase de crecimiento exponencial de un cultivo por lotes. En ambos casos se trata solo de una aproximacin, ya que m es un lmite terico ( a infinita concentracin de sustrato) y no se la puede medir directamente, sino que aproximar u obtener por extrapolacin, como en el mtodo de los recprocos. El valor obtenido por el mtodo e lavado ms bien es Dc que m. Ecuacin para determinar el max por el lavado: y = -0.8521x + 0.3597 max = D pendiente max = 1.0588 + (-0.8521) max = 0.2067 h-1 Tericamente, el kluyveromyces marxianus presenta un =0.48 h-1 pero como se puede notar el calculado prcticamente, es mucho menor que el terico, esto debido a que la excesiva fase de latencia por las condiciones que no fueron las favorables, ya que el volumen del matraz empleado ha sido muy pequeo, el cual no permiti una aireacin correcta por el rea de contacto de la muestra con el aire, todos estos propiciaron que el tiempo de fermentacin se incrementara de forma notable, y con estos resultados el =0.55 h-1 . Una consecuencia de las ecuaciones que describen el quimiostato simple es que la velocidad mxima de dilucin esta limitada a un valor ligeramente menor que la velocidad
54
mxima de crecimiento especifico um .Esta se denomina velocidad de dilucin critica para el lavado ,Dc. El lavado tiene lugar cuando las celulas estan siendo sacadas del fermentador a una velocidad Dc.xvo que es igual a la velocidad maxima uxvo-dc xvo a la que pueden crecer en el fermentador, de forma que el unico valor estable para la concentracin de celulas es cero. En el lavado el estado de equilibrio es aquel en el que no existen celulas o crecimiento y el substrato pasa sin cambio por el fermentador. Para poder determinar el F =12 ml/min tomamos como referencia la grafica:
Determinando el Dc= m = 0.452 y con este valor podemos calcular el F de lavado F = V*Dc F = 680ml*0.452h-1*1/60 F = 5.12 ml/min, este seria el flujo de lavado a utilizar porque si observamos en el grafico a un Dc la concentracin de biomasa se hace cero con lo cual realizamos el lavado, pero para poder garantizar el verdadero lavado en la practica tomamos un F mucho mayor que el terico y este F = 12 ml/min Comparando los m del cultivo por lote, m de los estados estacionarios y el m del lavado podemos ver que este ultimo es mucho menor que los otros esto debido justamente que en el lavado el crecimiento es mas lento porque se esta sometiendo a una velocidad de dilucin mas grande en comparacin a los otros. El ma en los estados estacionarios es menor que en el por lote debido a la existencia del Ks, y mientras sea mayor el valor de ser menor. PERTURBACION DE E.E (Incremento) [Sacarosa] = 15g/L 55
CUADRO N 9 perturbacin por sacarosa en el experimento n 5. Tiempo F (ml/min) Experiencia N 5 F=3 (h) 0 2 4 6 8 10 12 Absorbancia 0.686 0.806 0.93 0.961 0.71 0.641 0.721 X (g/L) 0.8955 1.0924 1.2959 1.3467 0.9349 0.8216 0.9529 X (g/L) 0.8955 1.0924 1.2959 1.3467 1.8697 1.6433 1.9058 Absorbancia 0.18 0.102 0.013 0.015 0.005 0.006 0.009 S (g/L) 1.19634 0.68586 0.10340 0.11649 0.05105 0.05759 0.07723
............. Dilucin: 1:2 CUADRO N 10 Tiempo (h) 0 2 4 6 8 10 12 14 X (g/L) 1.2827 0.8955 1.0924 1.2959 1.3467 1.8697 1.6433 1.9058 S (g/L) 0.6073 1.1963 0.6859 0.1034 0.1165 0.051 0.0576 0.0772
GRAFICA N10 perturbacin por sacarosa
56
PERTURBACIN POR [ ] SACAROSA [ ] BIOMASA VS [ ] SACAROSA

1.4 1.2 [ ] SACAROSA (g/L) 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 2 4 6 8 10 12 14 TIEMPO (h) 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 [ ] BIOMASA (g/L)
S (g/L) X (g/L)
De acuerdo al grfico N 10 observamos que la sacarosa es el nutriente limitante. Donde en las dos primeras horas la sacarosa acta inhibiendo ala produccin de biomasa (inhibicin por sustrato), demorando un tiempo de 2 horas para adecuarse al medio con alta concentracin de sustrato, despus de 4 horas la biomasa empez a aumentar consumiendo el sustrato agregado, siendo el sustrato a partir de la 4 y 5 hora inverso ala produccin de biomasa. PERTURBACION DE E.E (Disminucin) [(NH4)2SO4] = 1g/L CUADRO N 11 F (ml/min) Absorbancia Experiencia 0.856 N 4 0.882 F = 2.5 0.852 X (g/L) 1.1744 1.2171 1.1679 Absorbancia 0.02 0.04 0 S (g/L) 0.149215 0.280105 0.018325
Ecuacin para determinar la biomasa: Y= 0.6094X + 0.1403 Ecuacin para determinar la [ ] de sacarosa: Y= 0.1528X - 0.0028
57
GRFICO N 11
PERTURBACION DE E.E POR NITROGENO
1.4000 1.2000 1.0000 0.8000 0.6000 0.4000 0.2000 0.0000 0.0706 0.1059 0.1588 0.2206 0.2647 0.452 D (h-1)
7.0000 6.0000 5.0000 4.0000 3.0000 2.0000 1.0000 0.0000

X (g/L)
S (g/L)
X (g/L)
Linea tendencia S (g/L) Linea tendencia
En el grafico N 11 se observa que el nitrogeno no es sustrato limitante, cuando se disminuyo el nitrgeno en el medio, la concentracin de biomasa no se vio afectada porque aumento de 1.0497g/l a 1.2171 g/l, pero segn las bibliografas es importante la agregacin de nitrgeno al medio, esto no se vio afectado porque en el extracto de levadura contiene nitrgeno con 7 aminocidos esenciales. (6). Ya vez el extracto de levadura es precursor en el crecimiento de levaduras. Hablar del ph
CUADRO N 12
F (ml/min) 2.5 Absorbancia 0.778 0.723 X (g/L) 1.0464 0.9562 Absorbancia 0.006 0.009 S (g/L) 0.0576 0.0772
58
CONCLUSIN Kluyveromyces marxianus ATCC-16045, es una levadura fermentativa que necesitan los azcares para su catabolismo, es decir para obtener la energa necesaria para sus procesos vitales, pero adems necesitan otros substratos para su anabolismo como son nitrgeno, fsforo, carbono, azufre, potasio y magnesio ; adems de las vitaminas, protenas y aminocidos ( proporcionadas por el extracto de levadura ), adems de sales .Por ello es de vital importancia que el medio disponga de una base nutricional adecuada. Para el crecimiento celular aireado en quimiostato para una cepa de Kluyveromyces marxianus ATCC-16045, la sacarosa es un nutriente limitante. Para el crecimiento celular aireado en quimiostato para una cepa de Kluyveromyces marxianus ATCC-16045, el nitrgeno no es un nutriente limitante. Los parmetros obtenidos experimentalmente para nuestra cintica de crecimiento son : max = 0.2067 h-1(Operacin en condicin de lavado),
m = 0.295 h-1
y Ks = 0.36h-1(Operacin en los 5 estados estacionarios), qs = 0.0451 Los parmetros ptimos para la fermentacin de la sacarosa en quimiostato con Kluyveromyces marxianus ATCC-16045 son a una a una temperatura de 30C en bao Mara, adems de un pH entre 5.5 y 6, y utilizando un VVM de 200 ml/min para un volumen de 680 ml del fermentador, Adems el rango de la velocidad de dilucin debe encontrarse entre 0.0452 h-1 < D < 0.3616 h-1 (Para un max=Dc=0.452 h-1).
59
El tiempo de muestreo para la fermentacin del cultivo por lotes fue de 10 hr y se ha considerado los 2/3 del crecimiento logartmico igual a 4h
RECOMENDACIN Es necesario controlar las variables ms importantes del medio de cultivo, por medio de controladores que permitan que las condiciones del medio de cultivo se mantengan estables. Al igual que el control, la instrumentacin es importante para conocer los valores de las variables que se requieren controla. El birreactor debe tener los siguientes controladores como ,Controladores PID lazos simples de realimentacin, Control de Producto, Control de Sustrato, Control de Biomasa: Bibliografia http://www.monografias.com/trabajos11/sara/sara.shtml http://www.unsa.edu.ar/matbib/hongos/09htextolevaduras.pdf (1)OPTIMIZACIN DEL PROCESO DE EXTRACCIN DE LA LACTASA DE Kluyveromyces marxianus ATTC 8554, PARA SU APLICABILIDAD EN LA INDUSTRIA LCTEA Departamento de Biologa, Facultad Experimental de Ciencias, Universidad del Zulia, Apartado 526. Maracaibo, Estado Zulia, Venezuela. E-mail: xyo_mon@hotmail.com; xyo_mon@cantv.net. (2)OBTENCIN Y CARACTERIZACIN DE DOS
CONCENTRADORES PROTEICOS A PARTIR DE BIOMASA DE KLUYVEROMYCES MARXIANUS VAR. MARXIANUS CULTIVADA EN SUERO LCTEO DESPROTEINIZADO Marta Elena Cori de Mendoza1, Nilo Rivas2, Blas Dorta3, Emperatriz 60
Pacheco de Delahaye4 y Antonio Bertsch51,2,4,5Instituto de Qumica y Tecnologa, Facultad de Agronoma, Universidad Central de Venezuela, Apdo. 4579. Maracay, 2101, Venezuela. E-mail: martacori@cantv.net . Telf: (0243)-2465360,5507304. 3Instituto de Biologa Experimental, Facultad de Ciencias, UCV. Scriban, R. (1984). Biotecnologa. Segunda edicin. Editorial El Manual Moderno, S.A. Mxico.
(3)Instituto Tecnolgico y de Estudios Superiores de Occidente, A
J BULOCK; B.KRISTIANSEN. biotecnologia bsica. 1991.primera edicin .editorial acriba S.A, zaragoza espaa.
(4) Paper Agronoma sudamericana universidad de costa rica, seleccin de una levadura para la produccin de biomasa ,crecimiento en suero de leche. 2006
(5) Revista Cientfica, FCV-LUZ / Vol. XVI, N 3, 315 - 324, 2006 OBTENCIN Y CARACTERIZACIN DE DOS CONCENTRADOSPROTEICOS A PARTIR DE BIOMASA DE Kluyveromyces marxianus var. marxianus CULTIVADA EN SUERO LCTEO DESPROTEINIZADO.
P.S. Meyer, J.C. du Preez, * y S.G. KilianCultivo en Quimiostato de Candida blankii en Bagazo de la caa de azcar hemicelulosa hidrolizado
(6) Las tesinas Belgrano UNIVERSIDAD DE BELGRA ,Facultad

de Ciencias Exactas y Naturales, Carrera de Licenciatura en Farmacia
61
Estudio de algunas caractersticas de las cepas de levaduras y de su rendimiento celular utilizando un medio de cultivo a base de suero lcteo
62
Diseo del medio de cultivo 63
Tabla N 1: Composicin de medio slido de mantencin (para 50 ml de solucin) Nutrientes Extracto de Levadura Extracto de malta Peptona Agar So (g/l) 10 20 20 20 So (g/50ml) 0.50 1.00 1.00 1.00
Tabla N 2: Composicin de medio de Activacin (para 20 ml de solucin)
Elemento C N Mg
Nutriente Sacarosa C12H22O11 Extracto de Levadura Sulfato de magnesio heptahidratado MgSO4.7H2O Sulfato de amonio (NH4)2SO4 Fosfato diacido de potasio KH2PO4 Fosfato diacido de potasio KH2PO4
%Clula %Nutriente 52 -----0.4 42.10 -----9.756
Yx/s 0.505 -----24.39
So(g/L) 5.94
So(g/20ml) 0.1188
2.50 0.1845
0.0500 0.0037
N P
9.0 0.8
21.212 22.794
2.3567 28.4925
1.9095 0.1579
0.0382 0.0032
2.52
28.676
11.38
0.3954
0.0079
Tabla N 3: composicin del medio de fermentacin y proliferacin (para 68 ml de solucin)

Elemento C N Nutriente Sacarosa C12H22O11 Extracto de Levadura %Clula 52 -----%Nutriente 42.10 -----Yx/s 0.505 -----So(g/L) 5.94 2.50 So(g/68ml) 0.404 0.17
64
Sulfato de magnesio Mg heptahidratado MgSO4.7H2O Sulfato de amonio N P (NH4)2SO4 Fosfato diacido de potasio KH2PO4 Fosfato diacido de potasio K KH2PO4 2.52 9.0 0.8 0.4
9.756
24.39
0.1845
0.0125
21.212 22.794
2.3567 28.492 5
1.9095 0.1579
0.1298 0.0107
28.676
11.38
0.3954
0.0269
Tabla N 4: composicin del medio de fermentacin en el Quimiostato (para 680 ml de solucin)

Elemento C N Mg Nutriente Sacarosa C12H22O11 Extracto de Levadura Sulfato de magnesio heptahidratado N P MgSO4.7H2O Sulfato de amonio (NH4)2SO4 Fosfato diacido de potasio KH2PO4 K Fosfato diacido de potasio KH2PO4 2.52 28.676 11.38 0.3954 0.2689 9.0 0.8 21.212 22.794 2.3567 28.492 5 1.9095 0.1579 1.2985 0.1074 0.4 9.756 24.39 0.1845 0.1255 %Clula 52 -----%Nutriente 42.10 -----Yx/s 0.505 -----So(g/L) 5.94 2.50 So(g/680ml) 4.0392 1.70
Tabla N 5: composicin del medio de alimentacin en el Quimiostato (para 2.4 L de solucin)
Elemento C N Mg
Nutriente Sacarosa C12H22O11 Extracto de Levadura Sulfato de
%Clula %Nutriente 52 -----0.4 42.10 -----9.756
Yx/s 0.505 -----24.39
So(g/L) 5.94
So(g/2.4L) 14.256 6 0.4428
2.50 0.1845
65
magnesio heptahidratado N P MgSO4.7H2O Sulfato de amonio (NH4)2SO4 Fosfato diacido de potasio K KH2PO4 Fosfato diacido de potasio KH2PO4
9.0 0.8
21.212 22.794
2.3567 28.4925
1.9095 0.1579
4.5828
0.37896
2.52
28.676
11.38
0.3954
0.94896
Aireacin: Estando el cultivo ya en el quimiostato, se tienen que tomar en cuenta consideraciones tales como la velocidad del flujo de aire que ingresa. El flujo de aire para una concentracin de 3 g/ L. se tiene que:
*X NA = YO2
Yo2 = Rendimiento de oxgeno en clula (0.5 2.0 g cel/ g O2) Consideramos: Yo2 = 1.14 g cel/g O2 , = 0.25 (Eficiencia de
absorcin) y m = 0.452 h-1 Entonces reemplazamos datos:
*X NA = YO2
NA = 1.192 g/ L. h Por lo tanto la demanda de oxgeno para un crecimiento de X = 3 g/ l
66
VVM = 2.035 * 10 4
N A *T ; T = 30 C = 303 K
VVM = 0.294 L/L.min. Como el caudal del aire es: Qaire = VVM*Vmedio Qaire = (0.3344L/Lmin)(0.680L) Qaire = 0.2 L/min = 200 ml/min Este ltimo valor es la velocidad de aireacin especfica con la que se trabajara para alcanzar la concentracin deseada.
Obtencin de la curva caracterstica de crecimiento de una levadura Para la obtencin de esta curva, es necesario considerar 5 estados estacionaros. Estados estacionarios: dx =0 dt Considerando que en estado estacionario se cumple que: Calculo de parmetros de fermentacin Consideramos que para valores de D en un proceso de cultivo continuo tenemos: 0.1Dcritico < D < 0.8 Dcritico El valor de Dcritico = m obtenido en el cultivo por lote, entonces el intervalo de D para el trabajo en el laboratorio es: =D
67
0.0452 h-1 < D < 0.3616 h-1 Por lo tanto los valores de F, para los siguientes estados estacionarios se presenta en la siguiente tabla. Adems tenemos un VL=680 ml. Calculo del los tiempos de residencias mediante la siguiente formula: =1/D , =D
Tiempo en que se logra el estado estacionario: t = 3 x Para la estimacin del gasto en alimentacin hacia el quimiostato se considera la siguiente formula, para los 5 e.e.: Gi = Fi x Ti Donde: Gi: gasto Fi: flujo Ti: tiempo de fermentacin.
Tabla N 6: Flujos para los 5 estados estacionarios F ( ml/ min) 0.80 1.20 1.80 2.50 3.00 Gasto medio (ml) 2064 2088 2052 2100 2160 10464
N e.e 1 2 3 4 5 Total
D (h-1) 0.0706 0.1060 0.1588 0.2206 0.2650
3(h) 43 29 19 14 12 117
68
Alcanzando un gasto total de alimentacin para los 5 e.e. de 10.464 litros que es equivalente a 10.5 litros. Este ltimo valor es la velocidad de aireacin especfica con la que se trabajara para alcanzar la concentracin deseada. Obtencin y caracterizacin de un estado estacionario bajo limitacin por nitrgeno. Nutriente limitante: nitrgeno Concentracin celular final de 3 g/l Control de pH a 6. Para este estado estacionario consideraremos los siguientes datos: D = 0.2206
Tabla N 7: Composicin de alimentacin para obtencin de estado estacionario por limitacin de nitrgeno. % % Y x/s (g/g) 0.505 -----24.39 So (g/l) 8.91 2.50 0.1845 So (g/2.4l) 21.38 6 0.4428
Elemento C N Mg
Nutriente Sacarosa C12H22O11 Extracto de Levadura Sulfato de magnesio heptahidratado MgSO4.7H2O Sulfato de amonio (NH4)2SO4
clula nutriente 52 -----0.4 42.10 -----9.756
9.0
21.212
2.3567
1.0
2.4
69
Fosfato diacido de potasio KH2PO4 Fosfato diacido de potasio
0.8
22.794
28.4925
0.1579
0.37896
2.52
28.676
11.38
0.3954
0.94896
KH2PO4 Antes de ingresar al flujo esterilizar el medio a 121C por 15 min.

51.1
Perturbacin de un estado estacionario mediante aumento de la concentracin del nutriente limitante en la alimentacin. Habindose obtenido los cinco estados estacionarios en el crecimiento de la levadura, se perturbara este estado aumentando la concentracin de sacarosa (Nutriente limitante) en la alimentacin, con el cual el estado estacionario en el que se encontraba terminar, dando lugar a un comportamiento logartmico.
Tabla N 8: Composicin de alimentacin para la perturbacin del medio por sacarosa. Este nuevo flujo tendr una concentracin de Sacarosa = 15.0 g/l. Para este estado estacionario consideraremos los siguientes datos:
Elemento C N Mg
Nutriente Sacarosa C12H22O11 Extracto de Levadura Sulfato de magnesio heptahidratado MgSO47H2O
%Clula %Nutriente 52 -----0.4 42.10 -----9.756
Yx/s 0.505 -----24.39
So(g/L) So(g/2.4l) 15 36 6 0.4428
2.50 0.1845
70
N P
Sulfato de amonio (NH4)2SO4 Fosfato diacido de potasio KH2PO4 Fosfato diacido de potasio KH2PO4
9.0 0.8
21.212 22.794
2.3567 28.4925
1.9095 0.1579
4.5828
0.37896
2.52
28.676
11.38
0.3954
0.94896
Antes de ingresar al flujo esterilizar el medio a 121C por 15 min.
1. Determinacin del contenido de azcares reductores mediante el mtodo del DNS. La preparacin del reactivo DNS se requiere de lo siguiente: 10 g /L de cido 3,5 dinitrosalicilico (DNS) 200 mL / L de NaOH 2N 300 g/L de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado Para la preparacin de este reactivo, se disuelve el tartrato en aproximadamente 500 600 mI de agua, paralelamente se disuelve el cido DNS. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 1 litro y se agita hasta la completa disolucin de todos los componentes, para posteriormente aforar hasta un litro. Se precisa realizar los siguientes pasos para el anlisis de la muestra: Se aade un volumen del reactivo DNS a un volumen de muestra a analizar. Se mantiene la mezcla en un bao de agua a ebullicin durante 5 minutos para luego dejar enfriar. Se aaden 10 volmenes de agua destilada. Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco. La concentracin se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la curva de calibrado. La curva de calibrado para el azcar se obtiene a partir de muestras de concentracin conocida y analizadas segn este procedimiento.
2.
Determinacin de la concentracin celular por densidad ptica.
El mtodo se basa en el aument de la turbidez del medio, al incrementarse la concentracin de microorganismo s, esto puede ser detectado fcilmente por espectrofotometra a 640 nm. Para sta determinacin es necesario que previamente' se elabore una curva de calibrado, para lo cual las concentraciones
71
de microorganismos en el medio son determinadas por peso seco de acuerdo al siguiente procedimiento: 1. Se toma una muestra de volumen conocido, y se centrifuga a 1200 rpm durante 20 minutos. 2. Se elimina el sobrenadante y se resuspende el centrifugado con agua destilada. 3.- Se vuelve a centrifugar en las mismas condiciones a fin de eliminar restos de sustrato que pudieran alterar la determinacin. 3. Se elimina el sobrenadante, se redisueIve el precipitado y se seca en la estufa a 80C hasta peso constante. Hidrlisis de la sacarosa La hidrlisis se realiza con la finalidad de liberar los extremos carbonilos del azcar, para que estos puedan reducir al DNS y as cambiar su color y este cambio pueda ser medido con el espectrofotmetro: 1. 2. 3. 4. 5. Agregar 0.5mL de HCl concentrado a la muestra y agitar. Mantener la solucin restante en bao maria a 60 por 10min. Enfriar la solucin con hielo por 3 min. Neutralizar el acido agregando 3.5mL de NaOH 1.70N y agitar. Tomar 1 mL de la solucin resultante y trabajar con DNS.
72
52.1
Determinacin de la velocidad especfica mxima de crecimiento mediante lavado Para poner en marcha esta actividad, comenzamos realizando los siguientes pasos: Cortar el flujo de alimentacin, despus de haber transcurrido el tiempo de fermentacin; en donde se alcanza una reduccin de X y = max.= 0.452h-1 Utilizando la ecuacin de balance general de clulas:
dx = Dx + x dt
Obtenemos la grfica Ln X vs. t. Utilizando la siguiente frmula: Ln(X/Xo) = (-D)t, Luego trazamos una recta tangente a la curva, considerando un D >> max, entonces D = 1, y obtenemos el max a travs de la funcin tangente.
73

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Laboratorio de Bioprocesos

CULTIVO CELULAR CONTINUO AIREADO

Disear y realizar una experiencia de cultivo celular continuo en

quimiostato empleando una cepa de Kluyveromyces marxianus ATCC-

4.1.2 Composicin tpica de las levaduras

Aminocidos Lisina Histidina Arginina Leucina

% 8.2 4.0 5.0 7.9

Aminocidos Valina Isoleusina tirosina

% 5.5 5.5 5.0

Fuente: Microbiologa General, Cultivo de microorganismos.

Microbiologa General, Cultivo de microorganismos.

El pH es un parmetro crtico en el cultivo de microorganismos ya que

Tabla N xxxx. Composicin del Extracto de Levadura. 17

Fase lag o de adaptacin durante la que los microorganismos adaptan su

Fase estacionaria: en ella no se incrementa el nmero de bacterias (ni la

Ajustar las tapas de los tubos estando estos aun dentro de la

Pipetas Capachos de papel PHmetro

Luego se inocula en un matraz de 250 ml con un medio

liquido de 136 ml que contiene sacarosa, sales y extracto de

ortofosforico e hidrxido de sodio hasta un pH de 5.0

adicionar el inoculo. iniciar el cultivo continuo con adicin de nutrientes

VI.- RESULTADOS Y DISCUSION:

La Inoculacin Kluyveromyces Marxianus Del Fue De La Siguiente Manera

Muestreo para seguimiento de la cintica del cultivo por lote

Muestreo para obtencin de la Curva de calibrado de biomasa y sustrato

CUADRO N 1: DATOS PARA LA CURVA DE CALIBRADO DE BIOMASA

N Capacho Dilucin 1 01:01 2 01:02 3 01:05 4 01:10

ml Caldo 5 2.5 1 0.5

ml de H2O 0 2.5 4 4.5

GRAFICA N1: CURVA DE CALIBRADO DE BIOMASA

Fuente : instituto Tecnolgico y de Estudios Superiores de Occidente.

A. METODO DNS (Datos para la curva de calibrado de sacarosa (6 g/L) )

GRAFICA N2: CURVA PATRON DE LA SACAROSA

Fig N1: Montaje de

Fig N2: Quimiostato listo para

Toma de muestra para la lectura de la absorbancia.

Formacin de espumas en el bioreactor

DATOS EXPERIMENTALES OBTENIDOS.

N5) 05/03/2008 07:00 a.m. 05/03/2008 08:00 a.m. 0.937

1. CULTIVO CELULAR CONTINUO AIREADO: ESTADOS ESTACIONARIOS

0.2206 0.2647 0.4520

0.1361 1.1963 5.93

GRAFICA N3: CULTIVO CONTINUO AIREADO

CULTIVO CONTINUO AIREADO

GRAFICA N 4: CULTIVO CONTINUO AIREADO CON LINEA DE TENDENCIA

Cultivo Continuo Aireado

X (g/L) Linea Tendencia S (g/L) Linea Tendencia

GRAFICO N 5: CURVA DE max Y Ks EN LOS ESTADOS ESTACIONARIOS

DETERMINACIN DE m Y Ks EN LOS ESTADOS ESTACIONARIOS

8.0000 6.0000 4.0000 2.0000 0.0000 0 1 2 3 4 5 6 7 8

Datos dispersos Lineal (Datos dispersos)

Ecuacin para determinar el m y el Ks:

GRAFICO 6: CURVA DEL COEFICIENTE DE MANTENCION REAL

DETERMINACION DEL COEFICIENTE DE MANTENCIN REAL

y = 4.4681x + 0.0451 R2 = 0.9531

GRAFICA N7: CURVA DE m POR LAVADO X(g/L) vs T (h)

DETERMINACION DE m POR LAVADO

GRAFICA N 8: CURVA DE m POR LAVADO LnX vs T (h)

GRAFICA N 9: DETERMINACION DE m POR LAVADO; POR LA PENDIENTE

GRAFICA N10 perturbacin por sacarosa

PERTURBACIN POR [ ] SACAROSA [ ] BIOMASA VS [ ] SACAROSA

7.0000 6.0000 5.0000 4.0000 3.0000 2.0000 1.0000 0.0000

Linea tendencia S (g/L) Linea tendencia