PERFIL ENA

Xavier Emerson Bayona Figueroa Estudiante-FMH UNSAAC

 En la poblacin normal, los autoanticuerpos parecen tener relacin con la edad y el sexo. Mayor frecuencia en mujeres ancianas, y menor en hombres jvenes. Criterios para la defincin de una enfermedad autoinmune. Witebsky y cols (1957). Hay a menudo tendencia a la aparicin de ms de un trastorno autoinmune en la misma persona. Mayor frecuencia de anticuerpos para antgenos especficos no relacionados.

DETECCIN DE AUTOANTICUERPOS

 El mtodo para demostrar anticuerpos se basa en la posicin y las propiedades del antgeno y el nivel deseado de sensibilidad.
Se usan pruebas de aglutinacin De fijacin de ltex o precipitacin. Una de las pruebas ms usadas es la inmunofluorescencia indirecta (IFI).

DETECCIN DE AUTOANTICUERPOS

 Es uno de los procedimientos ms comunes para el diagnstico de la enfermedad autoinmune. Los sueros de pacientes con trastornos del tejido conjuntivo pueden contener anticuerpos de los constituyentes nucleares. Estos anticuerpos no son especficos de tejidos ni especies. Se puede usar cortes de tejido animal nucleado como sustrato. Los cortes se incuban en el suero de prueba individual. El exceso de globulina se quita por lavado y se aplica al tejido un reactivo antiglobulnico fluorescente.

PRUEBA INMUNOFLUORESCENTE INDIRECTA PARA ANTICUERPOS ANTINUCLEARES

VARIABLES QUE INTERVIENEN PARA UNA TCNICA UNIFORME

1. Tipo de sustrato, incluyendo, fuente, almacenamiento y preparacin. 2. Duracin de la tincin y el lavado. 3. Especificidad y sensibilidad del conjugado. Una parte esencial de cada prueba es la incorporacin de sueros reactivos conocidos positivos y negativo.

PRUEBA INMUNOFLUORESCENTE INDIRECTA PARA ANTICUERPOS ANTINUCLEARES

MATERIALES Y MTODOS

El tejido ms apropiado es el hgado de ratones o ratas jvenes. El animal se exanguina y se extrae el hgado de inmediato para cortarlo en cubos de 5mm y congelarlo rpidamente con hielo seco o nitrgeno lquido. Los bloques de tejido se montan en un medio hidrosoluble. Los cortes deben tener 4 um. Se usan antisueros de conejo o cabra, preparados por inmunizacin con globulina humana o con clases individuales de inmunoglobulinas conjugadas con isocianato de fluorescena, para localizar el sitio de la reaccin de sustrato tisular y anticuerpo del suero del paciente.

PRUEBA INMUNOFLUORESCENTE INDIRECTA PARA ANTICUERPOS ANTINUCLEARES

MATERIALES Y MTODOS

El nmero de grupos de fluorescena por molcula de protena se llama proporcin F/P. Casi todos los conjugados para IFI tienen una proporcin F/P de 1.0 a 4.5

Una proporcin demasiado grande puede dar una coloracin no especfica; si es demasiado pequea la intensidad de coloracin baja. El plasma es inapropiado para las pruebas porque considerable tincin no especfica del sustrato tisular. El suero concentrado tambin causa coloracin inespecfica.

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MATERIALES Y MTODOS

La fuente de luz del microscopio fluorescente debe ser capaz de excitar a la fluorescena. El mejor contraste se logra con un condensador de campo oscuro.

PRUEBA INMUNOFLUORESCENTE INDIRECTA PARA ANTICUERPOS ANTINUCLEARES

PROCEDIMIENTO

Cubrir los corte de tejido con diluciones de suero del paciente o soluciones de control e incubar en cmara hmeda por 30 Drenar los portaobjetos, enjuagar sumergiendo en PBS y luego lavar en esta ltima por 30 agitando suavemente. Secar suavemente el lquido sobre el tejido. Cubrir los cortes con una dilucin de antiglobulina conjugada con FITC en incubar en cmara hmeda otros 30 Se utiliza glicerol como lquido de montaje y sellar con barniz de uas. Conservar el portaobjetos a 4 C.

PRUEBA INMUNOFLUORESCENTE INDIRECTA PARA ANTICUERPOS ANTINUCLEARES

RESULTADOS

Una reaccin positiva es verde brillante. Diferentes sueros de pacientes pueden producir diferentes formas de coloracin nuclear. Las formas ms frecuentes son: Forma homognea.- Anticuerpos contra histona nuclear. Forma perifrica.- Anticuerpos contra DNA. Forma manchada.- Anticuerpos contra protenas nucleares, solubles en solucin salina o buffer fosfato. Forma nucleolar.- Antgeno contiene RNA y posiblemente protena asociada.

PRUEBA INMUNOFLUORESCENTE INDIRECTA PARA ANTICUERPOS ANTINUCLEARES

Dos antgenos han sido extrados de fracciones solubles de ncleos celulares. El antgeno Sm fue el primero que se describi y se comprob que participaba en reacciones de precipitacin en gran porcentaje de sueros LES. Los componentes nucleares especficos ms usados en las prctica son DNA nativo, DNA desnaturalizado, protena desoxirribonucleica soluble, antgeno Sm y antgenos nucleares extractables (ENA). El antgeno ENA consiste en RNA y protena y en algunos casos se ha llamado ribonucleoprotena nuclear (RNP).

ANTGENOS NUCLEARES ESPECFICOS

Ambos antgenos son insolubles en soluciones de sulfato de amonio de saturacin mayor al 35%. Ambos son solubles en etanol 0-20%, parcialmente a 20-50% e insolubles a ms de 50% de etanol. La congelacin y descongelacin repetida de los antgenos no altera su capacidad de precipitacin. El antgeno Sm es ms estable a mayores temperaturas durante ms tiempo y mantiene su actividad despus de su exposicin a 56C durante 60 minutos, y ENA es inestable. Ambos antgenos son resistentes a la Dnasa. La actividad de ENA se destruye con RNasa y tripsina.

ANTGENOS NUCLEARES ESPECFICOS

Los glbulos se tratan cido tnico y se recubren de antgeno al igual que para la deteccin de anticuerpos de tiroglobulinas.

HEMAGLUTINACIN DE CELULAS TANADAS PARA ANTGENOS ESPECFICOS

MATERIALES Y MTODOS

Se usan glbulos rojos de oveja GRO. Dos PBS de pH 7.2 y 6.4. Reactivos: PBS pH 7.2, solucin de Stock A y B PBS Ph 6.4, solucin de Stock A y B.

HEMAGLUTINACIN DE CELULAS TANADAS PARA ANTGENOS ESPECFICOS