Proyek Catatan PK

PENGENALAN PATOLOGI KLINIK Patologi memiliki 3 cabang keilmuan: 1. Patologi Anatomi 2. Patologi Forensik 3.
Patologi Klinik Patologi Klinik (Clinical Pathology = Laboratory Medicine) Definisi: Ilmu yang mempelajari perubahan yang terjadi pada cairan tubuh yang disebabkan oleh penyakit (cairan: darah, urine, CSF) Tujuan pemeriksaan laboratorium a. menunjang pemeriksaan fisis Seseorang tidak boleh didiagnosis oleh hasil pemeriksaan laboratorium, tetapi harus diperiksa secara keseluruhan b. menegakkan diagnosis Penggunaan pemeriksaan laboratorium 1. pemeriksaan penyaring atau skrining Dilakukan pada orang yang tidak sakit, tampak sehat, tidak merasa sakit, tidak ada keluhan. Pemeriksaan berupa: a. rule in : untuk menjaring atau mendapatkan pasien contoh; mencari penderita malaria di suatu wilayah tertentu b. rule out : membuang orang yang sakit, pemeriksaan harus mempunyai spesifisitas yang tinggi contoh: pemeriksaan pegawai perusahaan, asuransi c. case finding : mencari orang yang sakit di suatu wilayah d. check up 2. pemeriksaan konfirmasi a. nilai diagnostik contoh: apakah pasien menderita malaria b. definitif kelanjutan dari chek up, dengan pemeriksaan yang lebih akurat 3. pemeriksaan pemantauan ( follow up ) dilakukan secara serial contoh: pasien dengan Anemia, Hb rendah diberi preparat Fe lalu dipantau 2 minggu kemudian 4. pemeriksaan penderita gawat ( emergency) contoh di IRD: BUN, glukosa, BGA, kreatinin Tidak perlu akurat, perlu pemakaian POCT (Point Care of Testing)- mis; strip test glucose
Catatan kuliah Kimia Klinik PPDS I Patologi Klinik Universitas Airlangga-RSUD Dr. Soetomo Surabaya (typed by Ferdy) 1
5. pemeriksaan untuk persiapan operasi meliputi tes dasar/ baseline yang diminta oleh anastesiolog Tes Laboratorium ( parameter laboratorium ) Setiap tes/parameter terdiri dari beberapa metode contoh : tes penentuan kadar Hb 1. metode sahli 2. metode cyanmethemoglobin Tes penentuan kadar kalium 1. metode flame photometer 2. metode ion sensitive electrode (ISE) 3. metode enzimatik Tiap metode mempunyai sensitifitas dan spesifisitas yang berbeda. Data laboratorium a. kualitatif hasilnya positif atau negatif: tes kehamilan, HbsAg serum pos, darah samar tinja neg b. kuantitatif ada nilai kadarnya: kreatinin serum : 1,9 mg/dl, SGOT: 72 IU/l c. semikuantitatif contoh : glukosa urine : pos 3 (+++), tes Widal, titer O : 1/320 INTERPRETASI HASIL ABNORMAL 1. Berdasar nilai rujukan ( reference value, nilai normal ) contoh : Hb pasien = 10,7 g/dl nilai rujukan 12,5 - 17,5 g/dl interpretasi : kadar Hb rendah ( anemia ) SGPT pasien = 68 IU/l nilai rujukan < 35 IU/l ( UV, 370 C ) interpretasi : meningkat ( sakit liver ? ) Nilai rujukan (reference value, nilai normal ) Cara mendapatkan nilai rujukan : 40 orang yang tampak sehat diperiksa untuk parameter tertentu ( mis. kolesterol ) Dari data yang didapat dihitung nilai rerata ( mean ) dan deviasi standar ( SD ) nilai rujukan adalah : nilai rerata 2 SD contoh : kolesterol dari 40 orang yang diperiksa didapatkan mean = 170 mg/dl SD = nilai rujukan untuk kolesterol : 170 2x 20 130 210 mg/dl
20 mg/dl
Kelemahan menggunakan nilai rujukan: Distribusi orang sehat dan orang sakit umumnya tumpang tindih
Contoh : nilai rujukan untuk kreatinin serum 0,6 1,3 mg/dl Bagaimana dengan nilai 1,2 mg/dl? Normal ? Kalau sebelum sakit nilai kreatinin serum 0,6 mg/dl maka pada saat sakit kreatinin meningkat 2 X ( 1,2 mg/dl ) atau klirens kreatinin ( GFR ) kira-kira 60 ml/mn, fungsi ginjal tinggal 50% Nilai rujukan klirens kreatinin ( GFR ) = 120 ml/mn/1,73 m2 2. berdasar nilai potong ( cut off value ) Nilai cut off didasarkan atas hasil penelitian klinik dari suatu tes laboratorium , metode ttt. terhadap penyakit tertentu. Dari hasil penelitian didapatkan suatu nilai yang optimal antara orang sehat dengan orang yang sakit contoh : Glukosa darah 2 jam pp = 260 mg/dl dapat membedakan secara
nilai cut off untuk Diabetes melitus : 200 mg/dl interpretasi : pasien menderita diabetes melitus Interpretasi perubahan bermakna dalam pemeriksaan serial/pada tes pemantauan: perubahan dianggap bermakna jika selisih hasil pemeriksaan 3 SD ( WHO ) contoh : pasien hiperkolesterolemia sebelum pengobatan, kolesterol serum = 400 mg/dl sesudah pengobatan, kolesterol serum = 380 mg/dl apakah benar kadar kolesterol turun ? impresisi tes kolesterol di laboratorium, SD = 15 mg/dl 3 SD = 45 mg/dl selisih sebelum dan sesudah pengobatan = 20 mg/dl
interpretasi : perbedaan tidak bermakna, artinya tidak ada penurunan
Faktorfaktor lain yang perlu diperhatikan pada interpretasi 1. persiapan pasien ( puasa, obat, dll.) 2. cara pengambilan darah ( duduk,telentang,arteri,vena,kapiler,turniket ) 3. cara penampungan sampel ( anti koagulan, aerob,anaerob,sinar ?) 4. transportasi ( suhu ? ) 5. penyimpanan ( suhu ? ) 6. umur ( anak, dewasa, usia lanjut ) 7. jenis kelamin 8. besar/kecil otot Metode Pemeriksaan laboratorium Keandalan metode pemeriksaan laboratorium Kemampuan tes laboratorium dalam membantu menegakkan diagnosis suatu penyakit secara benar 1. keandalan analitik ( laboratorium ) 2. keandalan diagnostik ( klinik ) Keandalan analitik 1. presisi / impresisi 2. akurasi / inakurasi 3. sensitivitas/detectabilitas 4. spesifisitas analitik
Catatan kuliah Kimia Klinik PPDS I Patologi Klinik Universitas Airlangga-RSUD Dr. Soetomo Surabaya (typed by Ferdy)
Presisi / impresisi Presisi ( precision ) Beda hasil jika pemeriksaan diulang pada bahan yang sama Sifat kualitatif : presisi baik, lebih baik , jelek, lebih jelek Impresisi ( imprecision ) Deviasi standar ( SD ) dari pemeriksaan ulang pada bahan yang sama Sifat kuantitatif : nilai impresisi dinyatakan dalam SD atau CV Akurasi / Inakurasi Akurasi ( accuracy ) : Beda antara hasil pemeriksaan dengan nilai benar ( true value ) Sifat kualitatif : akurasi baik, lebih baik, jelek, lebih jelek Inakurasi ( inaccuracy ) : sifat kuantitatif Rerata penentuan nilai benar x 100% nilai benar Contoh : Hasil pemeriksaan ulang kadar glukosa pada serum yang sudah diketahui kadarnya = 100 mg/dl ( true value ) 112 mg/dl 110 115 112 120 inakurasi Detektabilitas : Kemampuan tes untuk mendeteksi kadar yang terendah Batas deteksi ( detection limit ) = nilai hasil yang paling kecil yang masih dapat dibedakan dengan blanko Sensitivitas Kemampuan untuk mendeteksi perbedaan kadar untuk setiap peningkatan pembacaan Spesifisitas analitik : Kemampuan tes untuk tidak dipengaruhi oleh bahan lain selain bahan yang diperiksa 114 107 111 113 114 atau CV = 3,036 % (112.8 100 / 100) X 100 = 12.8% rerata ( mean ) = 112,8 mg/dl SD CV = 3,425 mg/dl = 3,036 %
impresisi SD = 3,425
B. Keandalan diagnostik 1. sensitivitas diagnostik 2. spesifisitas diagnostik 3. nilai ramal positif 4. nilai ramal negatif 5. efisiensi Contoh : pemeriksaan Glukosa urine untuk diagnosis penyakit Diabetes Melitus Dari 100 penderita dengan diagnosis pasti DM ---- Positif 80 ( TP ) Negatif 20 ( FN ) Dari 100 orang yang pasti bukan DM ------------ Positif 5 orang ( FP ) Negatif 95 orang ( TN ) TP 80 Sensitivitas Diagnostik = ------------ X 100% = ----------- X 100% = 80% TP + FN 80 + 20 TN 95 Spesifisitas Diagnostik = ----------- X 100% = ------------- X 100% = 95% TN + FN 95 + 5 TP 80 Nilai Ramal Positif = ------------ X 100% = ------------ X 100% = 94% TP + FP 80 + 5 TN 95 Nilai Ramal Negatif = ------------ X 100% = ------------ X 100% = 82,6% TN + FN 95 + 20 TP + TN 80 + 95 = --------------------------- 100% = ----------------- X 100% = 87,5% TP + FP + TN + FN 80+5+95+20
Efisiensi
Pemilihan jenis tes Jenis / metode tes yang digunakan di klinik harus memiliki keandalan analitik keandalan diagnostik cukup tinggi
Pengembangan jenis dan metodologi tes laboratorium penelitian di ilmu kedokteran laboratorium / patologi klinik penemuan tes baru yang memiliki keandalan analitik / diagnostik yang lebih tinggi Mutu hasil laboratorium kemampuan laboratorium dalam mempertahankan secara terusmenerus presisi dan akurasi yang baik untuk semua tes yang dihasilkan :
Sumber kesalahan hasil laboratorium Pra analitik permintaan dokter persiapan pasien pengambilan sampel penampungan sampel tertukar antar pasien pengiriman sampel labeling Analitik reagen standar kalibrasi alat rusak tertukar sampel QC ? Pasca Analitik salah ketik salah nama salah hitung salah interpretasi salah kirim
Meminimalkan kesalahan Kesalahan pra analitik dan pasca analitik sulit untuk dilacak ( di deteksi ) Cara meminimalkan kesalahan : sistem barcode transportasi dengan pneumatic tube LIS / HIS ( komputerisasi perbaikan managemen komunikasi antara klinisi dan laboratorium
Kesalahan pada area analitik dapat dilacak ( di deteksi ) dengan sistem QC (pemantapan mutu internal )
Cara meminimalkan kesalahan : sistem barcode otomatisasi mutu SDM
Pemantapan mutu laboratorium klinik 1. kendali mutu internal 2. pemantapan mutu a. internal ( Internal Laboratory Quality Control ) dikelola oleh laboratorium mengendalikan presisi dan akurasi mengeluarkan hasil yang dapat dipercaya b. eksternal ( External Laboratory Assesment ) dikelola dikelola oleh instansi di luar laboratorium (Pemerintah, organisasi profesi, perusahaan swasta) menilai kesamaan (komparabilitas) hasil dari beberapa laboratorium
INTERAKSI SINAR DAN BENDA SINAR Sinar atau cahaya merupakan bagian dari gelombang elektromagnetik. Gelombang elektromagnetik mempunyai panjang gelombang dan frekuensi. Frekuensi adalah jumlah getaran per detik. Frekuensi berbanding terbalik dengan panjang gelombang. Sinar mempunyai panjang gelombang 150-2500 nm. Dalam kehidupan sehari-hari sinar terbagi atas sinar tampak dan sinar tidak tampak. Sinar , R sinar UV u-ni-bi-hi-ku-ji-me NIR infra red 400 nm-800 nm Sinar tampak (visible light) Panjang gelombang 400-800 nm (1nm= 10-9) Berbicara tentang benda berarti berbicara tentang atom. Atom terdiri dari proton dan elektron.
e e
gel TV
gel radio
>2500nm
p
e
Setiap atom mempunyai spesifisitas terhadap panjang gelombang tertentu. Apabila suatu benda dijatuhkan sinar spesifik (sinar dengan panjang gelombang tertentu) maka benda tersebut akan turut beresonansi (resonansi =turut bergetar) oleh karena energi cahaya tersebut diserap, timbul eksitasi pada atom. Eksitasi adalah perpindahan elektron dari lingkaran energi yang rendah ke lingkaran energi yang tinggi. Panjang gelombang pendek menyebabkan eksitasi sampai ke proton (sinar ).
FOTOMETER SEDERHANA
....... ....... 1 2 3 4 5 6
Fotometer sederhana terdiri dari: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Sumber cahaya (excyter lamp) Lensa (lensa cembung) Monokromator Kuvet (cuvet) Detektor Meter (Galvanometer)
Hukum Interaksi Sinar dan Benda Hukum Beer (Beers law) Bila sinar monokromatis dijatuhkan pada suatu larutan maka jumlah sinar yang diserap akan berbanding lurus dengan kadar larutan tersebut. Rumus Beer: C1 = A1 C2 A2 C= kadar A= absorban Kadar bahan= Ab bahan x Kadar standar Ab standar Kadar tes= Ab tes x Kadar standar Ab standar
Hukum Lambert Bila sinar monokromatis dijatuhkan pada suatu larutan, maka bila kadar larutan tersebut meningkat secara linier maka sinar yang diteruskan akan menurun secara logaritmis Rumus: A = log 1/T A= absorban T= transmitan A= 2 - log T (%) The concentration of a substance is directly proportional to the amount of light absorbed or inversely proportional to logarithm of the transmitted light.
10
Keterangan: Berbanding lurus (linier proportion) berarti bila kadar A meningkat 2x maka sinar yang diserap akan meningkat 2x
Meningkat secara linier : 1, 2, 3, 4, 5 dst Meningkat secara logaritmis: 10 102 10 3 104 10 5 dst
Pada udara, air murni cahaya akan diteruskan semuanya, maka T=1 (100%) Pada benda yang tidak tembus cahaya maka T=0 (0%) A=0 pada benda yang tidak dapat menyerap cahaya A= tak terhingga, pada benda yang meneruskan semua cahaya Bila T=10 A= 2 log 10 = 1 Bila T=100 A= 2 log 100=0 Absorban efektif yaitu absorben yang dapat diperiksa, mempunyai nilai = 2 A T 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 0 %
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
PENJELASAN FOTOMETER SEDERHANA 1. Lampu (Exciter lamp/light source) Ada beberapa jenis sumber cahaya: a. Lampu Wolfram (Tungsten) Merupakan sumber cahaya yang paling sering digunakan. Ini merupakan lampu pijar biasa yang ditemukan oleh Thomas Alfa Edison. Lampu pijar ini tidak hangus atau menjadi abu pada saat berpijar oleh karena berada dalam ruang hampa (tanpa oksigen). Saat ini lampu wolfram banyak diisi dengan nitrogen. Keuntungan: Mengeluarkan sinar polikromatik yang sifatnya kontinyu (panjang gelombang terus menerus antara 360-800nm). Bila menginginkan panjang gelombang berapa saja bisa diperoleh dengan lampu ini. Kelemahan: Sulit memisahkan panjang gelombang
11
Membutuhkan energi yang besar agar warnanya putih (100 watt). Bila voltase kurang warna lampu akan menjadi merah. Tidak dapat dipakai apabila membutuhkan panjang gelombang < 100 nm. b. Lampu Halogen Merupakan lampu Tungsten/pijar yang diisi dengan halogen (halogen merupakan kelompok unsur golongan VII: F, Cl, Br, I, At). Tujuan: supaya tetap kuat/ tidak mudah putus. Nominal voltase bisa ditingkatkan tanpa memutus filamen sehingga sinar makin putihmengarah ke sinar UV (320 nm). Bila lampu sudah tua maka warna sinar UV akan berkurang Contoh lampu halogen dalam kehidupan sehari-hari: lampu mobil. c. Lampu Fluorosens Tidak memakai filamen, memakai katode dan anode sehingga terjadi loncatan elektron yang membuat fluoresensi ke dinding tabung. Fotometer yang menggunakan lampu fluorosen memakai HIDROGEN (H3) yang disebut DEUTERIUM. Deuterium merupakan isotop dari hidrogen. (NB: Isotop adalah unsur yang sama dengan nomor atom yang berbedajumlah proton berbeda) Keuntungan: Sifat sinarnya kontinyu Mengandung sinar UV (100nm) Kelemahan: Tidak mempunyai sinar dengan panjang gelombang yang besar (>575 nm) d. Lampu merkuri (Hg) Warna putih keunguan Sifat sinarnya: sinar discrete (putus-putus)
415
575 nm
Keuntungan:lebih mudah mendapatkan sinar dengan panjang gelombang tertentu (sinar monokromatis) Kelemahan: tidak semua panjang gelombang ada e. Jenis lampu lainnya: 1). Lampu Natrium (Sodium); warna kuningpanj.Gelombang 570-585 nm 2). Lampu Barium (Br);warna hijau 3). Lampu Kalium (Potasium); warna keunguan 4). Lampu Stronsium (Sr); warna merah
12
2. Lensa Sifat lensa: Sinar sejajar difokuskan, sinar yang menyebar dibuat sejajar. 3. Monokromator Tujuan: mengeluarkan berkas sinar dengan suatu panjang gelombang (band pass/ band with) Monokromator yang paling kuno adalah spectroscope Monokromator terbuat dari prisma, sifat prisma adalah menguraikan sinar
Me Ji Ku Hi Bi Ni U
Spektroskop dapat juga memakai GRATING (kisi-kisi)
Perbedaan prisma dan kisi-kisi: Prisma: Uraian sinar tidak linier Kisi-kisi: linier (jarak antar panjang gelombang sama) Saat ini spektrofotometer tidak menggunakan prisma, tetapi memakai grating. Untuk menjadikan prisma maupun kisi-kisi menjadi monokromator dapat diatur dengan cara: 1. Prisma diputar 2. Sumber cahaya diputar
Entrance slit
exit slit
Entrance slit: sinar polikromatik masuk Exit slit: sinar monokromatik keluar Untuk mengatur Band Width/Band pass menggunakan EXIT SLIT.
13
Band width adalah berkas sinar dengan range panjang gelombang tertentu. Semakin spesifik semakin kecil lubang, energinya juga semakin kecil. Bila lebar maka panjang gelombang semakin besar. Fotometer yang menggunakan monokromator spektroskop disebut spektrofotometer. FILTER FOTOMETER Bila memakai filter sebagai monokromator Filter yang sederhana adalah kaca berwarna. Apabila gelas merah disinari cahaya putih keluar warna merah tetapi band pass lebar bisa mencapai 100 nm (antara 600-700 nm). Untuk menyempitkan band pass kaca ditumpuk/ dibuat kombinasi. Namun energi menjadi berkurang olehkarena banyak yang diserap, dan timbul panas. Band passnya dapat dicapai hingga 50 nm. Interference Filter Dibuat sedemikian rupa sehingga tidak panas karena yang bisa menembus hanya yang diperlukan saja. Namun masih terdapat kebocoran. Band pass lebih sempit (10 nm) Harga tergantung daya tahan/ keawetannya Untuk pemeriksaan rutin ada 4 filter, sesuai kebutuhan. MULTILAYER Interference Filter Lebih spesifik 9dibuat bertumpuk-tumpuk) Energi yang keluar lebih kecil 4. KUVET (CUVET) Tabung yang ditembus sinar monokromatik. Dahulu cuvet berbentuk bulat.
Tampak samping
Tampak atas
Kuvet bulat mempunyai kerugian: a. Dipantulkan Ini terjadi oleh karena indeks bias, tergantung bahan Bila indeks bias tinggi maka banyak sinar yang dibelokkan. Dari indeks bias tinggi ke rendah maka makin banyak yang dipantulkansinar semakin berkurang (transmitans ) Dibiaskan
14
100%
98%
Bila diisi bahan dengan indeks bias tinggi seperti air, maka yang hilang akan semakin berkurang. Jadi untuk mendapatkan kembali transmitans yang tinggi diberi air. b. Kuvet berputar sendiri Ketebalan kuvet tidak dapat dijamin sama, sehingga sinar yang dibiaskan tidak sama. Oleh karena itu kuvet bulat tidak dipakai lagi, saat ini kuvet yang dipakai berbentuk segi empat. Pada kuvet segi empat sinar datang tegak lurus, sehingga tidak dipantulkan dan tidak dibiaskan (sedikit dibiaskan). Secara teoritis tidak terjadi pengurangan. tampak atas 100% 99%
Kuvet ini sudah diberi tanda pada tempatnya sehingga tidak dapat diputar. Kuvet ini tidak dapat berputar pada tempatnya. Bahan kuvet dibuat sedemikian rupa sehingga mempunyai indeks bias yang rendah. Contohnya pyrex. Saat ini ada bahan yang terbuat dari plastik yang lebih murah namun mudah tergores sehingga dapat mengacaukan sinar. Pada alat otomatis dipakai kuvet disposible. Kuvet dapat dipakai sampai waktu tertentu, misalnya 2 x pakai. Agar kuvet tidak tergores saat dibersihkan maka dibuat kuvet yang bernama flow through cuvet yang mempunyai lubang sehingga tidak perlu diangkat. Kuvet ini hanya perlu diisi air, dipompa, dicuci dan air dibuang. Pencucian dilakukan dengan menggunakan deterjen khusus untuk menghilangkan protein dan lemak. Contoh pencuci yang bagus adalah pencuci kacamata yang menggunakan gelombang suara (ultrasound) sehingga kotoran-kotoran terlepas, tanpa menyebabkan goresan. Alat ini bernama SONICATOR.
Tujuan dibuatnya alat ini adalah supaya pemeriksaan makin akurat. Kuvet mempunyai ukuran atau diameter.
15
Hukum Beer-Lambert: Absorban berbanding lurus dengan diameter (panjang diameter dalam) larutan yang ditembus. Berbanding lurus berarti bila diameter 2x maka absorban 2x 1x 2x
Rumus Beer-Lambert
A= abc
Keterangan: a= absorbtivity (absortifitas), b= diameter bagian dalam kuvet (light path), c= kadar. Absorbtivity: Ditentukan oleh bahan tertentu. Contoh; kreatinin pikrat mempunyai absorbtivity tertentu karena bahan tertentu mempunyai spesifisitas terhadap panjang gelombang tertentu. Light path: Mempunyai standar yaitu 10 mm (1cm). Pada alat otomatis light pathnya dikecilkan. Absorban terletak antara 0 - . Namun untuk mengukur yang paling baik adalah diantara 0,1 - 1,0. Bila cairan tidak dapat diencerkan lagi maka dapat dibantu dengan memperlebar light path. 5. DETEKTOR Alat untuk merubah sinar yang keluar dari kuvet menjadi arus litrik (fotodetektor). Dahulu dipakai fotodetektor dari fotovoltaic, yakni logam tertentu yang merubah sinar menjadi listrik. Kelemahan: tidak linier (jumlah sinar tidak linier dengan arus litrik yang dihasilkan) Saat ini memakai FOTOKONDUKTIF Konduktif=konduktor yaitu bahan yang dapat menghantarkan arus listrik. Untuk itu memerlukan sumber listrik sebagai penghantar. Jenis-jenis fotokonduktif: 1. Photo tube: mempunyai katode-anode 2. Photo multiplayer: lebih baik, sinar yang masuk ditingkatkan daya listriknya. Tidak boleh ada kebocoran sinar (harus tertutup rapathindari sinar yang tidak diharapkan/stray light)
6. METER Merupakan alat ukur, berupa galvanometer.
A T A=0, T= 100% A=, T=0% Agar hasilnya lebih teliti maka jarum diperpanjang, namun kelemahannya lebih berat sehingga jarum dapat jatuh sendiri. Cara mengatasi kelemahan ini adalah dengan menggunakan cermin yang dipantulkan sinar, tanpa memakai jarum. Cara ini dilakukan oleh Goldman Junior. Kelemahan lain memakai jarum adalah adanya kesalahan paralaks dan memakan tempat. Untuk mengatasi ini Goldman membuat bulatan persis di angka. Cara yang paling canggih adalah menggunakan digital.
KURVA SERAPAN Pada Double beam photometer dapat dicari panjang gel MAX dan OPTIMAL A max optimal bilirubin creatinin picrate Hb 400 450 500 550 600 650 700 nm panjang gelombang
Keterangan gambar: Larutan kreatinin dalam HCl + As.pikrat menjadi kreatinin pikrat ---> di scan untuk mendapatkan panjang gelombangnya dengan absorbannya. Caranya dinolkan dulu kemudian discan. Didapatkan panjang gelombang dengan absorban maksimal kreatinin pada 480 nm. Pada panjang gelombang ini absorban Hb dan Bilirubin juga maksimal sehingga akan timbul pengaruh bilirubin dan Hb terhadap absorban kreatinin-pikrat pada panjang gelombang ini, oleh karena itu pada pasien dengan ikterus dan trombosis
intravaskular bisa timbul gangguan absorban kreatinin-pikrat. Oleh karena itu dicari panjang gelombang dimana pengaruh bahan-bahan lain kecil yang disebut dengan panjang gelombang OPTIMAL. Apabila kita tetap memilih memakai panjang gelombang maksimal maka hasil yang keluar adalah serapan resultante (penjumlahan ketiga bahan tadi). Panjang gelombang Lancip landai
Kita harus menghindari yang lancip olehkarena fotometer tidak selamanya terkalibrasi dengan baikbenar-benar keluar panjang gelombang yang diinginkan. Itulah sebabnya pabrik tidak mengeluarkan satu panjang gelombang saja.
INTERFERENCE Interferen ada 2 yaitu chemical dan spectral Chemical interference: bahan yang turut bereaksi, mis: badan keton, glukosa, asam urat, protein turut bereaksi dengan pikrat Spectral interference: bahan yang turut menyerap cahaya, mis: Hb dan bilirubin ikut menyerap. Hal ini dapat diteliti dengan menggunakan kurva serapan
BLANKO Blanko adalah larutan yang mengandung semua bahan kecuali bahan yang ada pada sampel atau standar kecuali bahan yang akan diperiksa. Misalkan bahan yang akan kita periksa adalah kreatinin serum, maka blanko berisi bahan kecuali kreatinin. Tujuan: 1. mengkoreksi secara spektral apakah bahan-bahan tersebut menyerap cahaya. Bacaan sampel Bacaan blanko = Bacaan bahan yang akan diperiksa 2. Menghilangkan pengaruh bahan lain selain bahan yang akan diperiksa Blanko ada 2 yaitu blanko standar (reagen) dan blanko sampel (serum)
18
STANDAR Larutan yang kadarnya sudah diketahui. Standar dapat dibuat, sebagai contoh; standar glukosa dapat dibuat dengan menggunakan labu ukur, diisi dari corong hingga batasnya. Harus diketahui syaratsyaratnya. Misal: glukosa 100 mg/dl Gradasi suatu bahan: a. GR (great): 99,98 %--campurannya sedikit b. PA (pure analitikum): lebih rendah c. Teknik: 95-97%, misalnya glukosa yang dijual di apotek Untuk larutan standar dipakai gradasi GR. Standar : kreatinin + HCl + As.pikrat kreatinin pikrat + NaOH
Sampel : kreatinin pikrat + As.pikrat + NaOH dan bahan-bahan lain dalam serum Langkah-langkah: 1. Fotometer dinyalakan 2. Absorban dinolkan, transmitan 100%, jadi kuvet dikosongkan atau diberi air untuk menghindari pantulan-pantulan 3. Dibaca blanko standar/reagen Isinya: reagen + HCl (tanpa kreatinin)biasanya 0,02 4. Dinolkan lagi 5. Dibaca standarnya Absorben standar = Bacaan standar Bacaan blanko standar Contoh: standar = 0,23 Blanko standar = 0,02 Absorben standar = 0,23 0,02 = 0,21 6. Dinolkan kembali 7. Dibaca absorban blanko sampel 8. Dinolkan kembali 9. Dibaca absorban sampel Standar yang dilarutkan dalam air disebut standar KONVENSIONAL Standar yang dibuat mirip dengan serum sebenarnya disebut KALIBRATOR
19
Kalibrator ini misalnya diisi dengan albumin, kreatinin dengan kadar yang diketahui. Komposisinya hampir sama dengan serum sebenarnya. Kalibrator ini dapat dipakai untuk semua pemeriksaan SAMPEL Blanko serum/sampel Kreatinin bereaksi pada suasana basa terbentuk kreatinin pikrat. Blanko sampel menjadi serum yang berisi tanpa kreatinin pikrat oleh karena tidak diberi NaOH. Jadi isinya hanya kreatinin + as.pikrat (bukan kreatinin pikrat) + NaOH sedikit. Bila pembacaan blanko <0,1 boleh dinolkan (dianggap langsung nol), bila >0,1 harus dibaca. Kepekatan akan menghilangkan liniearitas <0,1 : tidak linier lagi >1: tidak linier Pembacaan yang baik berada diantara 0,1 1 Contoh: kepekaan glukosa adalah 20-300 mg/dl, bila <20 mg/dl atau >300 mg/dl pembacaan tidak linier lagi Linieritas: kemampuan untuk membentuk suatu hubungan yang lurus. Linier berarti antara yang dibaca dengan nilai sesungguhnya sama. Kurva standar harus memenuhi Hukum Beer 1 0,5 0 1 2 contoh: kreatinin hanya linier pada kadar hingga 6 mg/dl, bila lebih tidak lagi memenuhi Hukum Beer 3 4 5 6 7 8 9 10 mg/dl >6 mg/dl memenuhi Hukum Beer maka dilakukan
Agar kreatinin yang PENGENCERAN
Contoh: seum 3 ml diambil 1 ml diencerkan sampai 3 ml (3x). Hasilnya kemudian dikalikan 3. Kreatinin 9 mg/dl serum 1 ml diencerkan hingga 3 ml didapat pembacaan 4 mg/dl. Maka nilai sebenarnya adalah 4 mg/dl x 3 = 12 mg/dl
20
Contoh: alat pemeriksaan kadar glukosa tidak liner Tidak linier
20
300
Bila nilai pada glukometer <20 mg/dl tidak perlu ditentukan nilai sebenarnya, cukup ditulis <20 mg/dl.
KURVA DISTRIBUSI NORMAL Berbentuk bell shape dimana mean=median=mode (berimpit) = mean = nilai rata-rata Md= Median = nilai tengah Mo = Mode = frekuensi yg paling sering muncul
-3SD -2SD -1SD +1SD +2SD +3SD
Mean 1SD = 67% Mean 2SD = 95% Mean 3SD = 99% Umumnya dalam ilmu biologi/ kedokteran mengambil sampel 95% = mean 2SD
Kurva bimodal
Skew to the left
Skew to the right

Kurva Bimodal Menunjukkan terdapat 2 populasi, ada populasi dengan kontrol yang rendah dan yang lebih tinggi. Pada kurva ini biasanya diambil mediannya. Nilai rujukan dipengaruhi oleh: 1. Variasi biologis 2. Variasi analitik Setiap laboratorium sebaiknya membuat nilai rujukan sendiri. Misalnya nilai rujukan kolesterol serum : 100-240 mg/dl. Bila presisinya jelek maka rentangnya lebih lebar = 80 260 mg/dl Bila presisinya lebih baik maka rentangnya lebih sempit = 120 220 mg/dl Bila berbeda akurasi maka nilainya bisa bergeser ke kiri maupun ke kanan misalnya 80 220 mg/dl atau 120 260 mg/dl. Variasi biologis dapat membuat rentang bisa melebar maupun menyempit. Variasi biologis setiap tes berbeda bisa intra individual maupun inter individu. Misalnya kreatinin dipengaruhi oleh massa otot Ingat: nilai rujukan bukan untuk menyatakan seseorang sehat atau tidak tetapi untuk membuat suatu nilai rujukan saja.
OUTLIER Pada suatu penelitian orang-orang yang harus dibuang disebut outlier Contoh: cholesterol pada 100 orang yang diperiksa didapatkan mean= 100, SD =5. Maka nilai Mean 3SD = 85 115. Bila hanya ada 98 orang yang berada dalam rentang ini maka 2 orang tersebut dibuang, lalu dicari kembali mean 3SD dan seterusnya.
KURVA STANDAR Tujuan dibuatnya kurva standar adalah untuk mengetahui hubungan kadar dan pembacaan yang linier. Dalam membuat kurva standar minimal harus mempunyai 5 kadar yang akan diperiksa (bila lebih makin baik). Kadar yang dibuat harus mencakup kadar normal (nilai rujukan). Misalnya kreatinin serum nilai rujukan 0,6-1,3 mg/dl
Standar kreatinin yang dibuat untuk diperiksa adalah: 1 mg/dl 6 mg/dl 2 mg/dl 7 mg/dl 3 mg/dl 8 mg/dl 4 mg/dl 9 mg/dl 5 mg/dl 10 mg/dl Sewaktu ditimbang 1 gram kreatinin pengencernya atau diluentnya HCl 0,1 N. Untuk membuatnya menjadi 10 mg/dl caranya: Kadarnya bila 1 gr kreatinin dilarutkan dalam 1000 ml = 100 mg/dl Untuk membuat larutan 100 mg/dl menjadi 10mg/dl diambil 10 ml larutan kreatinin 100 mg/dl kemudian diencerkan menjadi 100 ml
Kurva standar harus memenuhi Hukum Beer 1 0,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 mg/dl
Dahulu untuk membuat kurva standar menggunakan penggaris khusus yang terbuat dari timah dan dapat dibengkokkan. Bila kurva dari awal sudah tidak terbentuk memenuhi Hukum Beer, maka hal yang dapat dilakukan adalah: 1. Interpolasi ( dibaca kadar dan absorben secara langsung) 2. Log: kurva diluruskan dengan cara dilogaritmiskan (menggunakan skala Logaritmis) dengan cara: a. Semi-log: salah satu di log-kan (kadar di Log-kan) b. Log-Log: keduanya di log kan teknik ini lebih sering dilakukan.
JENIS-JENIS PIPET 1. Pipet manual 2. Pipet otomatik
23
Pipet manual terdiri dari: 1. Volumetric pipet (transferring dan bulb type pipet) 2. Graduated pipet(measuring pipet)
Graduated pipet
Volumetric pipet
Jenis pipet berdasarkan cara mengeluarkan: 1. TD (To Delivere): dihisap kemudian dikeluarkan, ada cairan yang tidak keluar (menempel di dinding) 2. TC (To Contain): seluruh isinya harus keluar (tidak boleh menempel di dinding) Pipet Otomatis Bersifat TC, dapat dipakai bahan silikon (siliconized) sehingga tidak ada bahan yang menempel di tip. Tip tidak boleh dipakai ulang (harus disposibel) sebab bila dipakai ulang atau dicuci silikon bisa hilang dan cairan menempel sehingga hasilnya akan tidak sesuai dengan ukuran sebenarnya Untuk pipet otomatik penghisapannya harus sering dikalibrasi
Pipet Otomatis
Tip
Proses kalibrasi dilakukan oleh pabrik. Cara kalibrasi kedua pipet tersebut berbeda
24
1).Becker 2).Erlenmeyer flask 3).Florence flask 4).Round bottomed flask 5).Conical testing glass 6).Filter tunnel 7).Evaporating dish 8). Watch glass 9).Test tube 10).Kahn atau prepcipitin tube
10
11
12 11).Round bottom centrifuge tube 12).Conical Centrifuge tube 13).Petri dish 14).crystallizing dish 15). Desiccator 16).Stainning trough
13
14
15
16
CARA MENDAPATKAN STANDAR Diambil bahan semurni mungkin/GR (grade) Bila bahan higroskopis/menyerap air, menimbangnya sulit (ada pula yang mengandung bahan kristal, mis: NaCl) Untuk menghilangkan kandungan air tadi dipakai eksikator CaO + H2O Ca(OH)2 Ca(OH)2 + CO2 CaCO3 Sebelum ditimbang dimasukkan dalam eksikator selama 1 malam.
25
DOUBLE BEAM PHOTOMETER
1 ..
Bisa diputar
Bisa diputar Double beam fotometer memakai CHOPER (cermin yang dapat berputar). Tujuan: membagi agar sinar monokromatis mempunyai intensitas yang sama saat keluar. DOUBLE BEAM Tidak perlu dinolkan lagi oleh karena blanko dan sampel sudah dipasang, hasilnya merupakan resultante Tidak ada pengaruh pada perbedaan voltase Diukur absorbennya pada tiap panj.gel (masuk dalam recorder) secara kontinyu (tidak putusputus) Berguna dlam mendapatkan panjang gelombang maksimal dan optimal Hanya dipakai untuk penelitian dalam menemukan/membuat metode baru Bisa memakai spektrofotometer dan filter SINGLE BEAM Bila memeriksa bahan dengan pergantian panjang gelombang harus dinolkan Ada beda waktu antara sewaktu membaca titik nol, bila terjadi perubahan voltase menyebabkan hasil tidak dapat dijamin sama
26
REFLEKTANT PHOTOMETER Reflektan fotometer digunakan untuk memeriksa bahan yang tidak tembus cahaya. Contoh; bila kertas merah kita sinari dengan sinar merah maka semua sinar merah akan dipantulkan.
Ket: Perubahan warna yang bergradasi akan menimbulkan efek terhadap pantulan. Dengan alat ini dapat diperoleh panj.gel optimal dan maksimal. Yang digunakan adalah sinar monokromatis. Bila warna merah minimal maka masih ada yang dipantulkan. Ditentukan mana yang sensitif terhadap perubahan warna. Contoh tes yang menggunakan reflektant fotometer adalah Tes Urine (Urisis), Vitrous. Pada reflektant ini Hukum Beer tidak berlaku.
TURBIDIMETER Alat untuk mengukur kekeruhan yang disebabkan oleh partikel-partikel yang tidak larut. Kekeruhan dapat berupa suspensi maupun emulsi. Serum yang keruh terjadi oleh karena sel-sel darah merah. Plasma yang keruh oleh karena Chylomicron. Emulgator adalah zat yang dapat membuat bahan melayang. Pada plasma emulgator adalah lipoprotein. Pada turbidimeter cahaya yang mengenai partikel tidak diserap tetapi dipantulkan (scatter).
scatter
27
Umumnya menggunakan sinar merah ( > 600 nm). Cara pengukuran sama dengan TRANSMITTANCE namun hukum Beer tidak berlaku. Turbidimeter ini biasa dipakai untuk mikrobiologi, unit kekeruhan Mc Farland untuk menentukan jumlah kuman dengan menggunakan standar BaSO4.
NEPHELOMETRI Mengukur kadar partikel. Pada turbidimeter sinar yang diterima akan menurun apabila kadar meningkat. Pada nefelometri sinar yang diterima akan meningkat apabila kadar meningkat. Biasanya digunakan mengukur partikel Lipoprotein, Ag-Ab kompleks, molekulmolekul besar seperti Ig M.
Laser Nephelometer Sinar koheren dengan intensitas yang tinggi lebih sensitif, meskipun partikelnya besar seperti Ig M dapat ditembus. Sinar scatter yang ditangkap ada yang menggunakan sudut 30 dan 90 derajat. Saat ini menggunakan LED (Light Emiting Diode) mengeluarkan sinar monokromatis lalu diamplifikasi. Laser tidak menggunakan monokromator Umumnya menggunakan sinar merah ( > 600 nm) agar tidak timbul eksitasi sehingga seluruh sinar yang keluar dipantulkan. Laser nephelometer lebih sensitif daripada turbidimeter oleh karena sinar lebih kuat.
FLUOROMETRI Fluorosensi: bila sinar dengan pendek akan disimpan molekul lalu memancarkan sinar dengan lebih panjang.
365 nm
405 nm
28
Hanya beberapa bahan yang bersifat berfluoresensi, misalnya; Fluoresin, Calcein (Fluorosin Thyosianate). Bahan yang akan diperiksa sebaiknya bersifat fluorosensi. Bila bukan bahan yang bersifat fluorosensi bahan tersebut direaksikan dengan bahan yang berfluorosensi. Pada fluorometer ada 2 monokromator yaitu pada sinar datang dan sinar yang difluorosensikan.
305 nm monokromator
405 nm
monokromator
Spektrofluorometer: Memakai spektroskop Pada fluorometri sinar datang dan sinar yang difluorosensikan sudah diketahui. Makin tinggi kadar yang diperiksa maka sinar yang difluorosensikan akan makin tinggi. NB: fosforesensi: sinar yang dikeluarkan bisa sama dengan sinar datang (hanya menyimpan sementara).
FLAME FOTOMETER
EMISION FLAME PHOTOMETER
Keterangan Bahan yang akan didiperiksa : NaCl, KCl Setiap bahan mempunyai sifat yang berbeda. Atom logam mempunyai eksitasi yang berbeda. Pada fotometer serapan bila energi cahaya mengenai suatu bahan akan timbul eksitasi bila cahaya diabsorbsi. Pada logam setelah sinar diserap/diabsorbsi maka akan kembali ke ground state (awal) dengan melepaskan cahaya atau sinar spesifik. Prinsip inilah yang dipakai oleh Flame fotometer. Flame fotometer jarang dipakai namun dijadikan metode referen untuk pemeriksaan Na+ dan K+. Bila atom
logam mengabsorbsi energi, akan memancarkan emisi energi tersebut 10-15% saat kembali ke ground state. Kebutuhan energi untuk bereksitasi pada setiap logam berbeda, misalnya Na, K dan Li bisa dibakar dengan LPG pada suhu 1500oC (propana bisa mencapai 2000oC). Kalsium membutuhkan suhu >3000oC (bisa menggunakan gas acetylen/karbit) Gas bakar yang digunakan adalah metana, butana, propana (LPG: propana + butana) Pompa: mengandung udara sebagai zat pembakar (O2) Monokromator Berfungsi membedakan sinar yang diemisikan masing-masing logam. Monokromator masing-masing logam berbeda. Misalnya monokromator Na, K Makin tinggi kadar maka sinar monokromatis yang digunakan akan meningkat (simpangan meter akan meningkat). Api bisa diatur sehingga warna yang dipilih monokromator bersifat konstan. Lineritas dapat dicapai dengan melakukan pengenceran; kalium 50 x, natrium 200 x. Pada flame fotometer standar sudah dimasukkan sehingga meter langsung menunjukkan kadar.
ATOMIC ABSORPTION SPECTROPHOTOMETER (AAS)
Bila logam diberi energi akan mengemisi 10-15% energi saat kembali ke ground state, 85-90% energi diabsorbsi. Maka alat AAS ini prinsipnya adalah memakai energi yang diabsorbsi tersebut. Sinar monokromatis dari Hollow Cathode Lamp digunakanmengeluarkan sinar seperti yang dikeluarkan oleh logam tersebut. Sinar tersebut akan diserap secara spesifik oleh logam yang dibakar tersebut.
30
Prinsip pemeriksaan: dengan adanya penyerapan maka sinar yang diteruskan berkurang, sinar yang diteruskan inilah yang diukur. Bila kadar meningkat maka sinar yang diteruskan akan menurun. Gas yang digunakan adalah Nitrous dan Acethylen. Pemeriksaan ini sering diminta oleh bagian psikiatri karena secara klinis logam-logam pada plasma dan serum dapat menyebabkan autisme. Hollow katode lamp yang digunakan berbeda untuk tiap logam.
KROMATOGRAFI Definisi: pemisahan zat-zat berdasarkan perbedaan distribusi/migrasi zat-zat tersebut pada 2 fase/medium yaitu fase gerak (mobile/pelarut) dan fase diam (stasioner/gel)(diambil dari kuliah dr.Joko) Krom=warnaberdasarkan warna. Tujuan: memisahkan molekul-molekul dalam suatu campuran. Jenis-jenis kromatografi: 1. Berdasarkan fase gerak-diam a. Gas-cair (gas liquid chr.) b. Gas-padat (Gas solid chr.) c. Cair-cair (liquid-liquid chr.) d. Cair-padat (Liquid solid chr.) 2. Berdasarkan pemisahan a. K Adsorbsi b. K Partisi c. K Penukaran Ion d. K Filtrasi/permeasi e. Elektroforesis f. Immunochromatografi/ICT 3. Teknik Operasional a. K Kolom (Column chr.) b. K Kertas (Paper chr.) c. K lapisan tipis (TLC) d. K gas ( Gas chr.)
31
Kolom kromatografi Saat ini dapat digunakan untuk kuantitasi (menghitung jumlah). Kromatografi yang paling kuno adalah Planar Chromatography, dan yang dikenal paling baik adalah Thin layer Chromatography (TLC). Bahan-bahan TLC: Alumunium, Silica Gel dan Dextran. Banyak digunakan untuk mengetahui asam amino. Solvent yang digunakan biasanya metanol, kloroform. Resolusi: jika resolusi kurang maka akan bertumpuk-tumpuk, tidak terpisah dengan sempurna. Cara kerja kromatografi: Lempeng kaca diolesi silika/dikeringkan Ditetesi bahan-bahan yang akan diperiksa sekaligus standarnya Dimasukkan ke bejana berisi pelarut, akan naik ke atas sesuai kapilaritas, namun belum nampak oleh karena belum berwarna Dikeringkan dengan cara di oven Dimasukkan dalam bejana berisi cat akan mengecat AA, bisa juga dilakukan dengan cara menyemprot.
Banyak dipakai di balai POM untuk mengetahui pemakaian obat bius (mis:morfin).
32
Untuk menentukan kadar dapat dilakukan dengan cara: 1. Eluasi Setelah diberi warna, dikeringkan, kemudian dipotong-potong (digunting) lalu dilarutkan kembali. Volumenya harus diketahui. Lalu dibaca dengan fotometer. 2. Densitometer Prinsip sama dengan reflektanmeter. Jika diberi sinar ada yang diserap/absorban dan reflectan Pada pemeriksaan kuantitatif selalu menggunakan standar sebagi bahan kuantitasi. Resolusi yang tidak baik menyebabkan overlap. Column Chromatography Fase diam dimasukkan dalam suatu tabung. Menunjukkan terjadinya pertukaran ion-ion, bahan-bahan bermuatan. Bahan yang diperiksa dimasukkan beserta pelarutnya (mobile phase). Bahan yang dipisahkan akan turun dengan kecepatan yang berbeda kemudian ditampung dalam tabungtabung kecil yang akan berpindah setiap 30 detik aatu 1 menit. Kuantitasinya menggunakan fotometer. HPLC (High Perfomance Liquid Chromatography) Tidak menggunakan gaya gravitasi, tetapi mengalirkan bahan dengan menggunakan pompa. Kolom kecil 10 cm. Hasil yang diperoleh dalam bentuk grafik chromatography.
ELEKTROFORESIS Tujuan: memisahkan dan mengkuantitasikan. Prinsip: bahan harus bermuatan.
Buffer merupakan cairan dengan pH tertentu (mempertahankan pH) misalnya KHPO4, KH2PO4
33
wick
buffer
Wick mengandung bahan/spotting media seperti agarose gel, selulosa acetat, poliakrilamik. Diatasnya ditaruh bahan yang akan diperiksa (misalnya serum). Bahan bermuatan pada serum adalah protein : albumin, globulin, enzim. Yang paling banyak adalah albumin dan globulin. Muatan protein tergantung pH, muatan (-) pada pH tinggi, muatan (+) pada pH rendah. Protein mempunyai titik isoelektris yaitu pH dimana muatan protein sama (tidak bermuatan). Misalnya albumin pada pH 4-5. Pada titik isoelektris protein mudah mengendap. Makin besar muatan makin cepat jalannya. Aki (Accu) memiliki tegangan (V) dan kuat arus/Ampere (I), untuk mendapatkan resolusi yang baik harus diatur volt dan ampere pada waktu tertentu. Kuantitasi: Hasil diwarnai proses misalnya selulosa asetat kemudian dicelup dalam asam asetat glasial. Selulosa asetat akan larut, komponen protein tinggal (masih transparan) kemudian diperiksa secara densitometer. Pada kertas saring seperti kromatografi dilakukan dengan cara elusi (digunting) kemudian dicelupkan dan diukur dengan fotometer. Bila resolusi tidak bagus maka dapat timbul overlaping. NB: Hemolisat adalah sel darah merah dipisah dari plasma dengan cara disentrifus kemudian dicuci dengan larutan fisiologis (NaCl 0,9 %). Sel darah merah kemudian dilisis dengan air sehingga yang tinggal adalah Hb + membran sel (debris) kemudian disentrifus kembali. Supernatan berupa Hb tinggal diatas (Hb A1,HbA2, HbS, HbH, dsb). Kemudian diwarnai dengan SUDAN BLACK (berwarna hitam).
34
IMUNOELEKTROFORESIS Untuk bahan-bahan protein yang sangat kecil. Dibuat parit yang diisi dengan antibodi pada serum protein lalu diinkubasi. Di dalam gel terjadi immunodifusi (immunodiffusion). Terbentuk Ag-Ab complex yang menyebabkan timbulnya presipitasi. Tampak protein yang lengkap (endapan putih). Parit ditaruh Antibodi
Pemeriksaan ini hanya bersifat kulaitatif. Immunodiffusion Menggunakan agar (molekul besar) Petri dish Ag Ab
Berisi 0,5 cm agar. Ag dan Ab akan betemu membentuk Ag-Ab complex sehingga terbentuk presipitat. Bila agar jernih maka presipitat berwarna putih. Cara lainnya: Dibuat sumur/parit
Diberi muatan (elektroforesis) protein akan berpisah
Parit diisi antibodi terhadap protein serum
Timbul presipitat setelah diinkubasi
NB: cara membuat antibodi yakni serum manusia disuntik ke binatang, terbentuk semua Antibodi serum pada binatang, kemudian darah binatang diambil, plasmanya atau dimurnikan Untuk timbulnya presipitasi perlu waktu 24 jam. Pemeriksaan bersifat kualitatif/ tidak dapat dikuantitasikan.
35
Radial Immunodiffusion Dibuat Antigen dengan kadar berbeda pada agar yang sudah mengandung antibodi. Akan timbul zona presipitasi. Pemeriksaan ini bersifat kuantitatif. Diukur diameter, kemudian dibuat kurva presipitasi sebab kadar sudah diketahui. Ag
COUNTER IMMUNOELECTROPHORESIS (Double Electroimmunodiffusion) Memakai deck glass yang dilapisi agar. Ag Ab
Dilakukan elektroforesis + --
Dalam satu jam akan terbentuk presipitasi, pemeriksaan kualitatif. Dahulu pemeriksaan ini dipakai untuk -fetoprotein (marker hepatoma). Sekarang tidak dipakai lagi karena sudah memakai Serologis cara ELISA, RIA. ELISA = Enzyme Linked Immunosorbant Assay RIA = Radio Immuno Assay ROCKET IMMUNOELECTROPHORESIS (Single Electroimmunodiffusion) Memakai agar yang sudah mengandung antibodi Contoh: Agar diisi antibodi (anti albumin Ab) 1 2 3 4 5 T1 T2 T3 T4 T5
Sumur diisi albumin

36
Keterangan: 5 serum diisi dengan serum yang tidak diketahui kadarnya (T1-T5) 5 sumur diisi standar (sudah diketahui kadarnya) misal 1,2,3,4,5 mg/dl Sambil diinkubasi dilakukan elektroforesis Terbentuk roket Lalu dibuat kurva standarnya
2 3
T1 T2 T3 T4 T5
presipitat
1 2 3 4 5 6 mg/dl
FOCUSING ISOELECTRIC ELECTROPHORESIS Pada masing-masing buffer digunakan pH yang berbeda yang bertujuan memperbaiki RESOLUSI. Biasanya memakai poliakrilamik gel wick
pH 6
buffer pH 8
ELEKTROKIMIA Dasar-dasar: Proton mempunyai massa, elektron tidak mempunyai massa. Asam + Basa akan membentuk garam. Garam di dalam larutan akan terurai. Misalnya CuSO4, NaNO3 CuSO4 Cu2+ + SO4- - logam Cu++ akan mengeluarkan elektron (oksidasi) Kation: mengarah ke elektrode katode
Oksidan: bisa menerima elektron Reduktan: bisa melepas elektron Oksidasi: proses pelepasan elektron Reduksi: proses menerima elektron Contoh: Fehling B: CuSO4 (Frusi)
katode
anode
Cu++
SO4- -
Keterangan : pH = - log [ H ]+ mol/L Metode : Gas hidrogen diimpregnasi/diresapkan dalam suatu alat yang mengandung bahan khusus (misalnya karbon). Dibuat gelas elektroda yang merupakan bahan yang dapat ditembus bahan-bahan tertentu. Misalnya gelas silika yang khusus untuk masing2 ion (Na+, Cl-, H+).Prinsip inilah yang dipakai oleh ISE (Ion Selective Electrode). Yang dihitung adalah aktivitasnya (jumlah yang dilihat dalam larutan). Pemeriksaan pH
pH (glass)
+ reference
larutan yg mau diukur
Diukur beda potensial yang akan menunjukkan pH. Makin tinggi kadar H+ maka simpangan akan semakin panjang. Pemeriksaan pCO2 pCO2 merupakan tekanan parsial CO2 dalam larutan. Didalam plasma berbentuk larutan CO2 (35-45 mmHg=seimbang dengan nafas). Sumber CO2 adalah hasil
38
metabolisme sempurna dari seluruh sel tubuh. Elektrode CO2 merupakan elektrode pH yang diberi bungkus hanya bisa ditembus oleh CO2 lalu diberi HCO3- sehingga akan merubah pH. CO2 + H2O ------------> H2CO3 --CA-----> H+ + CO3-
H2CO3 hanya 1/800 dari CO2 oleh karena adanya enzim CA sehingga bisa diabaikan. NB; CA berada di dalam sel. Reaksi menjadi CO2 + H2O --CA-----> H+ + CO3-
pH (glass)
HCO3-
+ reference
CO2 Semakin tinggi tekanan CO2 berarti semakin tinggi banyak CO2 menembus membran sehingga terbentuk asam. Bila CO2 meningkat reaksi akan bergeser ke kanan (dan sebaliknya). Bila H+ meningkat reaksi akan bergeser ke kiri dan sebaliknya. Kalibrasi pH minimal menggunakan 2 standar yang mengapit pH yang akan ditentukan. Misalnya pH N = 7,35-7,45, diperlukan standar 6, 8 dan 7,48. Hal ini dilakukan karena tidak linier, bila memakai 1 standar kesalahan menjadi besar sekali. Proses kalibrasi manual: Standar 1 (6,8), standar 2 (7,48) Masukkan standar 1 diatur hingga tepat pada angka 6,8 Masukkan standar 2 diatur hingga tepat pada angka 7,48 Masukkan kembali standar 1 dst berulang-ulang sampai angka tetap di 6,8 dan 7,48 Masukkan bahan yang akan diperiksa
Untuk CO2 dan O2 juga dilakukan hal demikian. Pada CO2 gas dalam tangki 30 dan 60 mmHg. Ini pada alat kovensional. Sekarang standar seluruhnya dalam satu ampul (BGA dan pH). Sekarang sudah memakai POCT. Flame fotometer memakai 1 standar oleh karena sudah linier.
39
AUTOANALYZER Merupakan alat analisis secara otomatis. Tujuan: Menghindari kesalahan manusia Meningkatkan presisi
Ada dalam bentuk semi otomatis, full otomatic bahkan robotic. Full aotumatic: mulai dari sentrifugasi lalu dipilah untuk pemeriksaan kimia klinik, hematologi dst. Tipenya discrete dan continous. Discrete: setiap pasien untuk memeriksa semua parameter misalnya SGOT, urea, dsb, lebih lambat Kontinyu: satu parameter pemeriksaan dengan banyak pasien, memakai space sehingga pemeriksaannya lebih cepat. Harus diperhatikan cara pencucian, pengambilan serum, sistem deteksi, cuvet, fotometer. Tipe bikromatik: setiap sampel diperiksa dengan 2 panjang gelombang sehingga lebih spesifik, akurasi semakin baik Pencucian: harus menghindari carry over yaitu sisa bahan yang diperiksa sebelumnya. Pada autoanalizer ada beberapa metode pencucian yaitu: Mengganti air Menyemprotkan udara (terutama yang discrete)
Ada beberapa tipe: Sentrifugal (bahan reagen dibawa dengan cara diputar) Continous (tidak dipakai lagi) Kuvet Bisa langsung menjadi tempat terjadinya reaksi Bisa juga direaksikan ditempat lain, lalu dibawa ke kuvet
Reagen Dipilih langkah yang sederhana (2 langkah saja) Serum + reagen langsung dibaca Pemeriksaan K+, Na+ menggunakan enzim khusus yang dapat diperiksa secara otomatis Pemakaian elektrode Penggunaan air diirit
40
Oleh karena banyaknya syarat air, dipilih yang demineralized water, air tanpa mineral, ion-ion dihilangkan semuanya. Dulu reagen dipakai dari kemasan murni, sekarang sudah tersedia dari pabrik sehingga tidak perlu pengenceran menghindari kesalahan manusia Pemakaian refrigrator sehingga reagen lebih stabil (kondisi terjaga), dan dengan refrigator alat juga stand by (siap) 24 jam
Perhitungan: langsung menggunakan komputer Barcode system: suatu gambar yang mencantumkan register, nama, pemeriksaan, yang dapat dibaca oleh barcode reader. Ini untuk menghindari klerikal error (kesalahan kepaniteraan).
POCT (Point of Care Testing) NB: Kalibrator merupakan bahan yang mengandung bermacam-macam bahan tertentu yang menyerupai serum. Kalibrator digunakan untuk menghindari kesalahan matrix. Matrix adalah bahan dasar yang membentuk (mis:serum dibentuk oleh protein,air dsb). Matrix merupakan bahan yang menyerupai sampel. Matrix mempengaruhi spectral maupun chemical. POCT tidak memerlukan standar. Bahan yang akan diperiksa akan menimbulkan sinyal dengan beda potensial dan besar arus tertentu. POCT memakai electronic calibration : misalnya glukometer tidak memakai standar tetapi memakai kontrol untuk mengetahui alatnya masih baik atau tidak Kontrol bisa menyerupai serum darah, urie yang sudah diketahui kadarnya Kontrol harus sering dilakukan, namun tergantung frekuensi pemakaian. Bila sering dipakai dalam satu hari cukup 1x, bila jarang dipakai setiap mau memakai sebelumnya dikontrol dahulu. Tes yang dilakukan di dekat pasien (diluar laboratorium). Saat ini pemeriksaan bakteri, HIV dsb telah memakai POCT.
Pada laboratorium: Kalibrasi dilakukan tergantung pada stabilitas metode. Bisa 1 x seminggu atau 1x 6 bulan (Vitrous kalibrasi 1 x 6 bulan)
41
Kontrol dilakukan setiap hari yang berasal dari bahan reaksi. Periksa range mean 2SD. Kontrol tidak boleh dipakai sebagai standar, namun bila kontrol dengan range yang sempit boleh digunakan (misanya 100-101). Kontrol yang diperiksa dengan metode definitif boleh digunakan sebagai standar. Di IRD kontrol harus dilakukan tiap 6 jam, bila ragu dengan hasil kontrol dapat diulangi lagi Pertanyaan: 1. Mengapa kontrol harus dilakukan setiap hari? 2. Apa syarat kontrol dapat dipakai sebagai standar? 3. Mengapa standar tidak boleh dipakai sebagai kontrol? Jawaban: 1. Mengecek kerusakan pada alat 2. Mempunyai satu nilai dan berasal dari metode definitif 3. Standar merupakan bahan yang dibuat semirip mungkin dengan kontrol, bukan bahan asli (Ingat pada BGA: tidak lagi memakai bahan asli serum, tetapi sudah dalam bentuk cairan dalam ampul dan sudah memiliki nilai pH, pCO2, dan pO2dahulu memakai bahan murni dalam benjana Tonometer, memakai tabung 30 mmHg dan 60 mmHg sehingga tidak praktis)
42
PEMANTAPAN MUTU LABORATORIUM ( LABORATORY QUALITY ASSURANCE )
Pemantapan mutu intralaboratorium ( internal laboratory quality control ) IQC Pemantapan mutu ekstralaboratorium ( external laboratory quality assessment ) EQA PEMANTAPAN MUTU LABORATORIUM (LABORATORY QUALITY ASSURANCE ) Assurance: jaminan, meliputi area praanalkitik, analitik, pasca analitik. Pra analitik: Mulai dari permintaan dokter (requesting) hingga sampel diterima laboratorium. Menghindari shoot gun perscription sehingga terarah. Disini peran dr.SpPK untuk mengarahkan/membantu klinisi Dibuat SOP (protap) Misal: - pengambilan glukosa pada px dengan Infus D5% harus dihentikan, ditunggu 10 menit dan diambil dari sisi lengan yang lain karena dapat menimbulkan kontaminasi - Pembendungan torniquet menyebabkan hemokonsentrasi sehingga darah lebih pekat: cairan keluar, yang tinggal protein dan substansi terikat protein. Misalnya kalsium, Hb, lemak. Apabila diperiksa hasilnya akan meningkat. Oleh karena itu torniquet harus dilepas saat jarum masuk ke pembuluh darah. - Menghisap darah, spuit tidak boleh vakum sebab p.darah akan kolaps dan arus darah masuk deras sehingga timbul lisis - Tidak boleh mengkorek pembuluh darah sebab akan terjadi pembekuan, mempengaruhi pemeriksaan faktor pembekuan mis: trombosit menurun. Pra analitik paling banyak mengandung sumber kesalahan Transportasi juga harus diperhatikan: misalnya bilirubin bisa teroksidasi matahari, guncangan bisa menyebabkan lisis.
43
Cara menangani kesalahan pra analitik: sistem barcode yakni labelling sticker transportasi dengan pneumatic tube, atau dengan ban berjalan LIS / HIS ( komputerisasi) perbaikan managemen: kepatuhan operator, loyalitas, disiplin dan gaji (adanya SOP pada masing-masing prosedur pemeriksaan) komunikasi antara klinisi dan laboratorium
Pasca Analitik: sulit/tidak dapat diketahui kesalahannya mulai dari hasil keluar dari laboratorium hingga interpretasi ke dokter yang meminta sebelum era komputer daerah pasca analitik meliputi penghitungan optical density (OD)/absorben paling sering kesalahan tertukardapat ditangani dengan barcode system membuat informasi laboratorium: Nilai rujukan, CV klinisi perlu dibantu dalam hal interpretasi misal: SGOT yang meningkat tidak hanya oleh karena kelainan hati tetapi dapat meningkat pada torticolis, myalgia, demam (hingga 200).
Seluruh proses mulai dari pra hingga pasca analitik merupakan tanggung jawab laboratorium. Analitik: Dapat dilacak dengan prosedur internal quality control Quality control meliputi: 1. Penggunaan serum kontrol inti area analitik 2. Metode statistik 3. Kalibrasi alat 4. Pendidikan teknisi lab (training alat-alat baru) Dengan inti area analitik tersebut kesalahan dapat dilacak dengan 2 cara yaitu: 1. Internal: dilakukan oleh manajemen laboratorium sendiri (internal laboratory quality control) 2. External: dilakukan oleh instansi diluar lab. (WHO, Depkes, perusahaan swasta) external laboratory assesment
44
PEMANTAPAN MUTU INTERNAL Tujuan: menjaga supaya hasil tidak berubah-ubahmembatasi dalam range tertentu
103 mg/dl 97 mg/dl 105 mg/dl = 100 mg/dl
Metode 1
SD= 7 mg/dl
SD = SD x 100% = 7/100 x 100% = 7% 117 mg/dl 112 mg/dl 121 mg/dl = 110 mg/dl Metode 2
SD= 4 mg/dl
SD = SD x 100% = 4/110 x 100% = 3,6% Presisi metode 2 lebih baik daripada metode 1 sebab impresisi metode 1 lebih besar daripada metode 2. SERUM KONTROL Bahan yang digunakan sebagai kontrol dengan ciri stabil dan berasal dari bahan asli/murni (bukan buatan). Bisa berupa darah, urine, dsb. Ada nilainya: misalnya glukosa 100-105----> 102,5 mg/dl Presisi Di Indonesia CV<5% dianggap baik. Kia bisa membandingkan presisi metode satu dengan metode lainnya, mis: metode heksokinase buatan Roche dengan pabrik lainnya. Akurasi Beda yang terjadi antara suatu pemeriksaan pada satu sampel dengan nilai sebenarnya. Inakurasi Persentase beda dari nilai rata-rata hasil pemeriksaan yang berulang-ulang pada sampel yang sama dengan nilai sebenarnya. Misalnya: metode 1 = 100, true value= 102, maka inakurasi = 100-102/102 = -1.96%. Metode 2 = 110, true value= 102, maka inakurasi = 110-102/102 = +7,84% Akurasi metode 1 lebih baik daripada metode 2 oleh karena metode 1 mendekati nilai sebenarnya. NB: presisi lebih penting daripada akurasi. ERROR: penyimpangan yang dibawa oleh alat ukur (bukan buatan manusia). Presisi: Random Error---->bisa naik, bisa turun Akurasi: Systematic Error--->semakin tinggi saja, atau semakin turun saja dari nilai sebenarnya.
Presisi jelek Presisi baik, akurasi kurang Presisi baik, akurasi baik
Bila presisi jelek pasti akurasi jelek. Bila presisi baik belum tentu akurasi baik. Oleh karena itu presisi harus lebih dahulu diutamakan. PRESISI DAN IMPRESISI Dilaboratorium ada bermacam-macam presisi dan impresisi a. Within Run (satu seri) Run= kerja. Ulangan dilakukan langsung
b. Between run Setelah selesai run pertama alat dimatikan kemudian selanjutnya pada jam kedua dilakukan run kedua. Kemudian dimatikan lagi dst. Misalnya 100 px, run 1 sebanyak 20 px, run 2 20 px dst hingga run 5.
46
c. Between day Impresisi dan presisi dari hari kehari 10/2/2009
11/2/2009
12/2/2009 Yang mempunyai presisi paling baik adalah WITHIN RUN sebab pada within run tidak banyak terjadi perubahan. Pada beetwen day banyak terjadi perubahanseperti: suhu, kelembaban, voltase, pekerja, reagen dsb. Untuk manajemen yang paling baik dipakai adalah presisi dan impresisi BETWEEN DAY demi pasien dan laboratorium itu sendiri. Alasannya: untuk mencari kesalahan carilah yang paling besar (bias paling banyak). Presisi dan impresisi juga dipengaruhi oleh antar laboratorium. Hasilnya lebih jelek oleh karena: perbedaan metode, pekerja, alat, reagen, standar, waktu dsb. Cara mendapatkan presisi dan impresisi pada suatu metode: 1. Replikat Diulang pada sampel yang sama. Level/kadar dalam satu nilai Rumus
CV = SD x 100% SD=
(x)2 N1
Dst Kelebihan replikat: bisa menghitung CV. Kerugian replikat: hanya satu level
2. Duplikat Setiap sampel diulangi 2 x. Rumus

SD=
d2 2n
I 105 40 300 80 Dst
II 109 38 310 87 Dst
d -4 +2 -10 -7
d2 16 4 100 49
d2
Kelebihan duplikat: memberikan impresisi dari level tertinggi sampai dengan terendah (range luas) Kerugian duplikat: tidak bisa mendapatkan nilai CV oleh karena tidak mempunyai (mean), sebab sampel yang diulangi berbeda. NB: Statistik sederhana Perhitungan statistik memakai sample. Tekniknya bisa cluster, random agar terpencar dengan baik (mewakili). Bila memakai sampel didapatkan sampel dan SD sampel. Bila mengambil beberapa daerah diperoleh beberapa mean dan SD lalu dirata-ratakan agar didapatkan mean populasi dan SE (Standar Error). SE< SD. Berapa batas CV yang diperbolehkan? Di Indonesia <5%, diluar negeri <1%. Pegangan yang dipakai dalam menentukan presisi dan impresisi adalah: 1. Penelitian Impresisi harus sekecil mungkin: konsekuensinya biaya mahal, alat canggih dan tenaga yang handal. Sebab bila impresisi kecil bobot penelitian lebih tinggi. Misal: efek obat SGOT, bila CV 20% sulit membedakan antara yang diberi obat dan tidak diberi obat. 2. Rumus TONKS (TONKS FORMULA) CV max = (range nilai rujukan normal) x 100% range normal Contoh: kolesterol: 120-240 mg/dl, nilai range normal= 120-240= 120 mg/dl = (120 + 240)/2 = 180 mg/dl CV max = (120) x 100 % = 16,7% 180
Contoh lain: Na+ = 135-145, mean = 140, range = 10 CV max = 1,78% CV max rumus Tonk ini tidak dipakai secara langsung karena nilai normal bervariasi sekali (terlalu besar atau terlalu kecil). 3. Kepentingan klinik Di indonesia dipakai CV < 5%. Kegunaan klinik presisi dan impresisi Untuk mengetahui SD tiap-tiap pemeriksaan sehingga diketahui kemaknaan suatu pemeriksaan serial (interpretasi). Misal pemeriksaan Anemia def Fe: Hb=6 mg/dl, lalu diterapi, 2 minggu kemudian diperiksa Hb dst. 6 mg/dl 2 mgg 6,7 mg/dl 2 mgg 6,6 mg/dl
Untuk mengetahui kemaknaan pemeriksaan variasi pemeriksaan harus > 3SD menurut WHO. NB: Variasi biologis harus dimasukkan pada tiap-tiap pemeriksaan untuk melakukan interpretasi. Misalnya Hb= variasi biologis 0,3 gr/dl (2 %), CV Hb= 4% Variasi keseluruhan: CV 2 + CV 2 = variasi keseluruhan + var biologis.
Maka variasi Hb= 42 + 22 = 4,5%
Beda CV dan SD, Cv sudah tidak punya satuan(dalam %), sedangkan SD masih membawa satuannya Impresisi dapat membedakan satu parameter dengan parameter lainnya Beda kalibrator dan standar: - Standar: hanya berisi satu parameter (mis: standar cholesterol, standar glukosa) - Kalibrator: semua larutan standar menjadi satu Proses menyamakan dengan standar disebut kalibrasi Nilai yang ada pada kalibrator bukan dalam bentuk rentang tetapi dalam bentuk satu nilai (mis urea: 20, maka dipaskan pada angka 20)
AKURASI Cara mendapatkan akurasi: 1. Mengikuti external quality control Dilakukan oleh instansi diluar laboratorium: bisa oleh pemerintah, swasta, WHO, organisasi profesi
49
NB: Bahan kontrol: bahan sungguh (serum, urine,CSF) yang sebenarnya/sungguhan yang bersifat stabil (bisa disimpan lama). Bisa stabil karena disimpan dalam bentuk beku kering (freeze dry). Serum kontrol bisa dibuat oleh pabrik maupun dibuat sendiri. Cara membuat sendiri: Dikumpulkan sisa-sisa serum, dikumpulkan dalam tabung erlemenyer pada suhu -20oC hingga banyak ( 1 L) kemudian di toing atau dikeluarkan supaya cair. Tujuan pada suhu tersebut agar tidak rusak oleh bakteri dan suhu panas Serum dibersihkan dari debris dan bakteri (disaring dengan kertas saring) dengan cara dipompa Serum diberi antibiotika kemudian dimasukkan dalam becker glass lalu dibagi dalam botol-botol kecil (5 ml). Ini dinamakan pool sera Bila berasal dari pabrik pada external quality control maka: Dibeli serum dengan NO Batch/Lot yang sama Pengelola mengirim dalam waktu yang bersamaan ke laboratorium2 peserta dan memberi petunjuk jelas cara pemeriksaannya, parameter2nya. Saat di laboratorium: - Tidak boleh ada spesial treatment (harus diperlakukan seperti serum px biasa) - Tidak boleh diulang - Dikirim ke pengelola dengan jadwal yang telah ditetapkan Dihitung mean, SD dari seluruh peserta laboratorium pada masingmasing parameter. Nilainya disebut target/true value Dihitung masing2 lab dari hasil true value tadi
TRUE VALUE Alat ukur mempunyai standar yang disimpan di Paris, misalnya kg dsb. Alat pengukur seperti penggaris dipilih yang terbuat dari besi, bukan kayu maupun plastik sebab bersifat lebih stabil. Nilai dari true value bersifat relatif. Untuk mendapat nilainya perlu dianalisis, analisis mempunyai faktor kesalahan sehingga belum tentu benar. Ada beberapa konsep tentang True Value: A. True value bahan kontrol 1. Definitif value
Suatu nilai yang didapat dengan metode definitif. Metode definitif adalah metode dengan impresisi dan inakurasi nolmetode bebas dari kesalahan. Bila diulang-ulang hasilnya sama. Misalnya definitif value untuk pemeriksaan calcium adalah Isotop Dilution Mass Spectrophotometry 2. Reference value Nilai yang didapat dari metode reference. (ini berbeda dengan konsep nilai rujukan sebelumnya). Metode reference: metode dengan nilai impresisi dan inakurasi mendekati nol Misalnya: metode penentuan glukosa serum adalah hexokinase. Untuk kalsium dengan metode AAS. 3. Concensus value Nilai konsensus yang paling baik berasal dari pemantapan mutu eksternal. Bisa berasal dari bermacam-macam metode maupun satu metode. Konsensus bisa berubah-ubah. Nilai konsensus yang paling rendah berasal dari pabrik penghasil serum kontrol sebab pabrik mendapatkan nilainya dengan external quality control namun jumlah peserta lebih sedikit. B. Recovery Jarang digunakan dalam laboratorium klinik karena memerlukan bahan asli (kadar bahan murni) Banyak digunakan di farmasi untuk mendapatkan kadar obat dalam darah Tujuannya: untuk menguji adanya Interference baik chemical maupun spectral. Contoh: mencari kadar glukosa dalam serum dengan metode A
51
dibagi 2 serum dibuang 1 ml kemudian ditambahkan 1 ml aquadest x mg/dl 100 ml dibuang 100 ml kemudian ditambahkan 1 ml glukosa 1000 mg/dl 1 ml= 10 mg 100 ml Bahan 1 diatas = x mg/dl Bahan 2 diatas = (x+10) mg/dl Lalu masing-masing bahan diperiksa sebanyak 20 x I 1 2 3 4 5 . . 20 1 =80 mg/dl 2= 87 mg/dl II
Recovery = 2 - 1 x100 % = 80-87 x100% = 70% 10 10 10 diperoleh dari nilai mg glukosa bahan 2 (yg ditambahkan) Idealnya nilai recovery adalah 100% Serum penuh dengan bahan pengganggu yang dapat membuat hasil menjadi lebih tinggi atau lebih rendah. Kekeruhan dapat menyebabkan gangguan spectral Bila > 100% hasilnya false high Bila menggunakan blanko serum nilainya lebih rendah, bila menggunakan blanko reagen maka nilainya lebih rendah. Maka idealnya memakai blanko sampel
52
Tidak semua bahan apat dijadikan larutan, oleh karena itu metode recovery tidak digunakan. Misalnya Cholesterol larut dengan lipoprotein (sulit larut dalam air), bilirubin terikat protein.
C. Metode Regresi-Korelasi Korelasi: menghubungkan 2 hal yang mempunyai hubungan. Misalnya tekanan darah dengan stroke, ureum dan kreatinin. Keduanya mempunyai sebab yang sama. Korelasi bisa jelek dan baik I II
Metode reference
Metode kita
idealnya Menunjukkan akurasi Menunjukkan presisi
II I scatter gram misalnya r =+ 0,7
II Pada hal yang tidak berhubungan dapat diuji apakah signifikan atau tidak. Bila tidak signifikan berarti suatu kebetulan. P< 0,05: 5 salah dari 100 P<0,01: 1 salah dari 100 Dalam menghubungkan metode 1 dan 2 (data 1 dan 2) dapat dihubungkan dengan garis menggunakan rumus. Idealnya garis berasal dari titik nol dan membentuk sudut 450
53
y=x
450 II I Y= ax + b a= slope, idealnya nilainya =1 (tan = q/p) b= intercept (perpotongan garis x dan y): idealnya 0 q p II Tujuan: membandingkan antara metode kita dengan metode reference Misalnya: Glukosa dengan metode enzimatik GOD dengan metode heksokinase. Untuk menilai metode GOD dihubungkan dengan metode heksokinase. Setiap sampel diperiksa dengan kedua metode ini menggunakan range kadar yang luas. Kemudian datanya diplot. Bila masih dalam bentuk scatter gram dimasukkan kedalam rumus Uji korelasi regresi bisa dilakukan di lab sendiri maupu di lab lain. Memerlukan pembanding (reference) Harus diperoleh hasil yang bervariasi luas, tidak boleh mengumpul. Misalnya glukosa 40---800 mg/dl Y=x berarti metode kita sama dengan metode reference a dan b masing-masing mempunyai standar deviasi Bila kita membuat garis regresi pasti ada standar deviasi disebut Sxy atau Syx. Nilai Sxy 2SD berarti 95% masuk dalam rentang nilai. Sa= standar deviasi slope, Sb= standar deviasi intercept Konstan error: slope sama, hasil selalu diatas atau dibawahnya (sebab nilai intercept 0), tidak memotong titik nol Proportional error : slope >1, tidak melewati titik nol, nilai Y bisa lebih tinggi atau lebih rendah. Konstan error lebih mudah mengkoreksinya Standar deviation above regression line dapat menunjukkan presisi (makin besar jaraknya, presisi makin jelek) Garis regresi menilai akurasi Misalnya: Sa= 0,2, a=1,2, maka nilai slope 95%CI a 2Sa= 1,2 0,2 = 0,8 1,2 Misalnya Sb = 0,4, b= 0,3 maka nilai intercept 95% CI b 2Sb = -0,2-1 Nilai slope (a) tidak signifikan bila melewati 1 Nilai intercept (b) tidak signifikan bila melewati 0
54
Sxy tidak terlalu penting oleh karena menunjukkan gabungan presisi metode reference dan metode kita Kondisi metode kita harus tidak berbeda signifikan dengan metode reference. Jumlah px yang diperiksa minimal 30 Korelasi mempunyai nilai p. Bila nilai p tidak signifikan maka tidak ada korelasi meskipun nilai a dan b tidak signifikan. Nilai p signifikan <0,05 NB: Uncorelated data = pasien berbeda diperiksa Corelated data = pasien langsung diperiksa 2 x I konstan error (mis: y = x + 2) Idealnya y=x proporsional error (mis: 1,6 x+1,7) 450 II Konstan error: bisa dibuat faktor koreksi Proporsional error: sulit dibuat faktor koreksi
55
PEMANTAPAN MUTU LABORATORIUM (LABORATORY QUALITY ASSURANCE )

Merupakan Pemantapan mutu intralaboratorium dan pemantapan mutu ekstralaboratorium ditambah: semua prosedur pemantauan, serta pendidikan dan latihan tentang persiapan pasien, pengambilan bahan, transportasi, analisis spesimen, dan pelaporan hasilnya. Pemantapan mutu intralaboratorium (internal laboratory quality control IQC) dilaksanakan oleh staf laboratorium di dalam laboratorium memantau terus menerus kinerja dan hasil laboratorium menjamin hasil laboratorium yang layak untuk dikeluarkan mengendalikan dan memantapkan presisi dan akurasi
Prosesnya: 1. persiapan pelaksanaan 2. pelaksanaan 3. melacak penyimpangan 4. cara mengatasi penyimpangan
Persiapan pelaksanaan : 1. menyediakan serum kontrol (unassayed) yang sama atau satu Batch ( satu Lot ) untuk jangka waktu satu tahun 300 + 20 + 50 = 370 botol 2. mengambil sampel 20 botol secara acak ( random ) dari kumpulan 370 botol 3. kertas grafik, untuk pembuatan kartu kontrol ( control chart ) Pelaksanaan : 1. menganalisis 20 serum kontrol ( unassayed ), untuk dikontrol, satu botol setiap hari parameter yang akan
2. menghitung rerata (mean) dan deviasi standar (SD) untuk masing-masing parameter 3. membuat kartu kontrol ( Levey Jenning ) untuk semua parameter yang dikontrol
56
Kartu kontrol
parameter satuan metode alat reagen rerata SD
Kartu kontrol
Laboratorium Patologi Klinik RSU.Dr.Soetomo Surabaya
Bulan :
mean + 2SD =
mean + 3SD =
mean - 2SD = mean - 3SD =
8
11
13
15
17
19
21
23
25 27
29
31
Serum kontrol - berasal dari binatang ( sapi,babi ): lebih aman dari infeksi virus hepatitis, HIV beberapa konstituen berbeda dengan manusia (protein tertentu----> hormon, isoenzim ) - berasal dari manusia: konstituen sesuai dengan penentuan rutin tidak aman dari dari infeksi virus Bentuk Serum control - serum cair : lebih murah bebas dari kesalahan rekonstitusi kurang stabil untuk daerah tropis - serum beku kering ( lyophylized sera ): lebih stabil ada risiko terjadiya kesalahan rekonstitusi harus ada petunjuk jelas tentang cara rekonstitusi dan penanganan serum hepatiis,HIV
57
Jenis serum kontrol yang tersedia di pasar : 1. serum kontrol yang belum dianalisis ( unassayed sera ) 2. serum kontrol yang sudah dianalisis ( assayed sera ) - mempunyai nilai kadar untuk bahan-bahan yang larut di dalamnya - kadar bahan dinyatakan dalam rentang ( range ) : mean 2SD - kadar hasil analisis beberapa laboratorium - merupakan nilai konsensus - tidak digunakan untuk program pemantapan intralaboratorium - digunakan untuk menilai akurasi
CARA REKONSTITUSI SERUM BEKU KERING ( LYOPHILIZED SERA ) 1. gunakan pipet yang terkalibrasi 2. gunakan aquades kualitas tinggi 3. jaga jangan sampai ada bubuk yang terbuang (pada saat membuka vial) 4. campurkan baik-baik, jangan sampai timbul buih 5. tunggu minimal 30 menit sebelum dianalisis (atau menurut petunjuk dari pabrik ) Cara pemeriksaan serum kontrol 1. serum kontrol ditempatkan ditengah deretan serum pasien: tidak ditempatkan paling depan tidak ditempatkan paling belakang 2. serum kontrol diperlakukan seperti serum pasien : tidak diistimewakan / tidak diperlakukan khusus 3. menggunakan serum kontrol yang baru direkonstitusi bukan yang telah disimpan di freezer / lemari es
" THIRD PARTY CONTROL " Bahan kontrol (serum kontrol) yang tidak diproduksi oleh perusahaan / pabrik reagen, reagen kit, dan alat laboratorium
58
KEUNTUNGAN MENGGUNAKAN " THIRD CONTROL SERA " 1. memberikan penilaian yang benar tentang mutu reagen, standar, alat 2. tidak terpengaruh oleh macam reagen, standar, kit, atau alat 3. tidak dirancang untuk optimalisasi metode atau alat tertentu 4. seperti menangani serum pasien
Cara penilaian 1. membandingkan hasil peserta dengan hasil laboratorium rujukan( reference laboratory ) - sulit mencari laboratorium dengan kategori rujukan - jika jumlah laboratorium rujukan sedikit, kesalahan dari satu laboratorium sangat berpengaruhi pada hasil 2. membandingkan hasil peserta dengan nilai rata-rata seluruh laboratorium peserta ( nilai konsensus ) - kesalahan lab. peserta tidak terlalu berpengaruh - nilai konsensus tidak dapat menggambarkan hasil optimal dari sebagian kecil peserta
contoh : hasil pemeriksaan 20 serum kontrol untuk GLUKOSA 1 Agustus 2006 : 103 mg/dl 2 Agustus 2006 : 97 mg/dl 3 Agustus 2006 : 99 mg/dl 4 Agustus 2006 : 105 mg/dl 5 Agustus 2006 : 100 mg/dl 6 Agustus 2006 : -16 Agustus 2006 : 17 Agustus 2006 : 18 Agustus 2006 : 19 Agustus 2006 : 20 Agustus 2006 : 21 Agustus 2006 : 90 mg/dl -105 mg/dl 106 mg/dl ---
7 Agustus 2006 : 103 mg/dl 8 Agustus 2006 : 96 mg/dl
22 Agustus 2006 : 106 mg/dl 23 Agustus 2006 : 24 Agustus 2006 : 25 Agustus 2006 : 26 Agustus 2006 : 94 mg/dl 91 mg/dl 99 mg/dl 93 mg/dl
59
9 Agustus 2006 : 104 mg/dl 10 Agustus 2006 : 100 mg/dl 12 Agustus 2006 : 93 mg/dl
13 Agustus 2006 :
--
14 Agustus 2006 : 105 mg/dl 15 Agustus 2006 : 103 mg/dl Perhitungan statistik hasil pemeriksaan 20 serum kontrol untuk GLUKOSA nilai rerata ( mean ) = 99,6 mg/dl 5,2 mg/dl
deviasi standar ( SD ) =
masukkan angka diatas ke dalam grafik kartu kontrol Levey-Jennings control chart) Kartu kontrol Levey Jening
parameter satuan metode alat reagen rerata SD
glukosa
mg/dl
hexokinase
Hitachi 902
Roche
99,6
5,2
120 Kartu kontrol

115
110 105
Agustus 2006
100 95
mean + 2SD = 109,6 mean + 3SD = 114,9 mean - 2SD = 88,8 mean - 3SD = 83,6
90
85 80
18
11
13
15
17
19
21
23
25 27
29
31
contoh : hasil pemeriksan serum kontrol untuk glukosa Sept. 2006 1 September 2006 : 93 mg/dl 2 September 2006 : 102 mg/dl 3 September 2006 : -4 September 2006 : 106 mg/dl 5 September 2006 : 90 mg/dl 6 September 2006 : 95 mg/dl 7 September 2006 : 100 mg/dl 8 September 2006 : 109 mg/dl 9 September 2006 : 91 mg/dl 10 September 2006 : --
60
parameter
satuan
metode
alat
reagen
rerata
SD
glukosa
mg/dl
hexokinase
Hitachi 902
Roche
99,6
5,2
120
Kartu kontrol
115
110
0
105 100
0 0
0 0 0 0
September 2006
mean + 2SD = 109,6 mean + 3SD = 114,9 mean - 2SD = 88,8 mean - 3SD = 83,6
95 90 85 80
20
11
13
15
17
19
21
23
25 27
29
31
melacak penyimpangan :
terkendali presisi jelek
mean
21
perubahan akurasi
mean
22
61
trend , perubahan akurasi
mean
23
Cara mengatasi penyimpangan : analisis serum kontrol baru bersama 2-3 serum pasien, jika hasil kembali ke area mean 2SD, kemungkinan serum kontrol rusak, salah rekonstitusi, probabilitas ( 5% ), atau memang ada kesalahan analisis
jika hasil tetap di luar mean 2SD
ada gangguan alat,
kerusakan reagen atau larutan standar. Perbaiki alat, ganti reagen atau standar. Ulangi analisis serum kontrol sampai hasil masuk di area mean 2SD Levey - Jenning 1. jika hasil serum kontrol di dalam area mean 2SD, terkendali, hasil pemeriksaan serum pasien boleh dkeluarkan 2. jika hasil serum kontrol berada di area antara mean 2SD dan mean 3SD, periksa alat, reagen atau standar; hasil pemeriksaan pasien masih boleh dikeluarkan 3. jika hasil serum kontrol diluar area mean 3SD, hasil pemeriksaan serum pasien tidak boleh dikeluarkan; gangguan pada alat, reagen atau standar perbaiki alat, ganti reagen / standar ulangi pemeriksaan serum kontrol sampai hasilnya kembali ke area mean 2SD Wesgard - multirule 1. menggunakan lebih dari kontrol dalam setiap deret pemeriksaan dengan kadar sama / berbeda 2. melakukan satu atau dua kali analisis untuk setiap kontrol
62
3. melakukan lima aturan (rules) untuk menyatakan hasil pemeriksaan diterima atau ditolak Aturan kontrol atau control rule
dapat
suatu kriteria penetapan apakah hasil pemeriksaan laboratorium, terkendali atau keluar kendali Simbol aturan kontrol : A L A = L = contoh : jumlah serum kontrol atau singkatan statistik batas kendali ( control limits )
13s menggunakan satu serum kontrol menunjukkan bahwa hasil pemeriksaan serum kontrol melampaui mean 3SD keluar kendali
Logic - diagram
Control data
No
12s
Yes No No
In control Report results

No No No
13s
Yes Yes
22s
Yes
R4s
Yes
41s
Yes
101s
Out-of-control, reject analytical run

28
contoh dari aturan konrol 12s
+3s +2s +1s mean -1s -2s -3s

0
10
29
63
contoh aturan kontrol 13s
+3s +2s +1s mean -1s -2s -3s O
10
30
+3s +2s +1s mean -1s -2s -3s O O O
10
31
contoh aturan kontrol R4s
+3s +2s +1s mean -1s -2s -3s O O O
10
32
64
+3s +2s +1s mean -1s -2s -3s O O O
o o
o o
10
33
contoh aturan kontrol 10 x

+3s +2s +1s mean -1s -2s -3s
o o o o o
o o o
10
34
Pemantapan mutu ekstralaboratorium (external laboratory quality assessment - EQA ) - dilakukan oleh instansi di luar laboratorium - menilai hasil-hasil yang dikeluarkan oleh laboratorium peserta, yang bertujuan menegakkan komparabilitas atau kesamaan antar laboratorium peserta - bersifat retrospektif - dalam jangka panjang memantapkan akurasi Dikelola : 1. Pemerintah dari suatu negara 2. Organisasi kesehatan dunia ( WHO ) 3. Organisasi profesi 3. Perusahaan swasta
65
Biaya : 1. ditanggung oleh peserta ( biaya keikutsertaan ) 2. ditanggung oleh pengelola ( pemerintah, perusahaan ) Keikutsertaan : 1. sukarela ( voluntary ) ada program pendidikan dan latihan bagi yang hasilnya kurang baik 2. wajib ( compulsory ) biasanya dengan sangsi bagi laboratorium yang hasilnya kurang baik Pelaksanaan : cara yang populer adalah cara SURVEI : laboratorium peserta laboratorium peserta laboratorium peserta laboratorium peserta spesimen/kontrol serum laboratorium peserta laboratorium peserta laboratorium peserta Kelemahan cara survei : 1. Bahan kontrol yang dibagikan mungkin berbeda secara biologis serum yang biasa digunakan, hal ini akan mempengaruhi presisi 2. Ada risiko kerusakan serum pada saat pengiriman 3. Kemungkinan penanganan yang berbeda dengan cara yang rutin ( ditangani secara khusus ----> idealnya penanganan harus sama dengan penanganan serum pasien ) 4. Saling konsultasi antar laboratorium tentang hasil pemeriksaan 5. Adanya keraguan tentang kebenaran nilai konsensus atau nilai dari laboratorium rujukan sebagai pembanding dengan laboratorium peserta dengan
Frekuensi pelaksanaan PME tergantung : - kesiapan pengelola dalam penyediaan kontrol dan pengirimannya - kecepatan evaluasi hasil
- makin sering makin baik - berkisar antara 2 sampai 12 X /tahun
Variant Index Scoring ( VIS ) - cara memberi nilai atau angka pada laboratorium peserta - pertama kali diperkenalkan pada UK EQAS 1972 - dasar penilaian adalah membandingkan nilai peserta dengan nilai konsensus, kemudian selisihnya dibandingkan dengan CCV ( Chosen Coeficient of Variation ----> CV dari PME di negara Inggeris pada 1971 ) CARA MENGHITUNG Variant Index (VI) hasil peserta = x
nilai konsensus = xm x - xm % Variasi = ----------- X 100% xm % Variasi Varian Index = -------------- X 100 CCV (CCV Chosen Coeficient of Variation)
Tabel CCV ( Chosen Coefisient of Variation )
Parameter
Natrium Kalium Klorida Urea Glukosa Kalsium Fosfor Besi Asam urat Kreatinin Bilirubin Protein total Albumin Alkali fosfatase Kolesterol
Coeficient of variation % ( CV )
1,6 2,9 2,2 5,7 7,7 4,0 7,8 15,0 7,7 8,9 19,2 3,9 7,5 19,6 7,6
47
67
VARIAN INDEX SCORE Menggunakan VI untuk memberi angka pada peserta Bila VI < 50 maka VIS = 0 ( paling dekat nilai konsensus, angka paling bagus ) Bila VI > 400 maka angka tetap 400 ( angka maksimal ) (ada angka maksimal untuk menghidari masuknya nilai-nilai disebabkan oleh kesalahan penulisan dll. ) ekstrem yang
NILAI-NILAI LAIN DALAM SISTEM VIS - Mean Variant Index Score ( MVIS ) Rata-rata VIS untuk semua parameter pd. satu lab. - Mean Runing Index Score ( MRVIS ) Rata-rata 10 VIS terakhir untuk satu parameter pa. satu lab. - Overall Mean Runing Index Score ( OMRVIS ) Rata-rata 40 VIS terakhir untuk seluruh parameter pd. satu lab.
68

Proyek Catatan PK

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Proyek Catatan PK

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

PENGENALAN PATOLOGI KLINIK Patologi memiliki 3 cabang keilmuan: 1. Patologi Anatomi 2. Patologi Forensik 3.

interpretasi : perbedaan tidak bermakna, artinya tidak ada penurunan

Cara meminimalkan kesalahan : sistem barcode otomatisasi mutu SDM

Spektroskop dapat juga memakai GRATING (kisi-kisi)

6. METER Merupakan alat ukur, berupa galvanometer.

Agar kreatinin yang PENGENCERAN

Contoh: alat pemeriksaan kadar glukosa tidak liner Tidak linier

-3SD -2SD -1SD +1SD +2SD +3SD

Skew to the left

Skew to the right

Kurva standar harus memenuhi Hukum Beer 1 0,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 mg/dl

JENIS-JENIS PIPET 1. Pipet manual 2. Pipet otomatik

DOUBLE BEAM PHOTOMETER

ATOMIC ABSORPTION SPECTROPHOTOMETER (AAS)

ELEKTROFORESIS Tujuan: memisahkan dan mengkuantitasikan. Prinsip: bahan harus bermuatan.

Diberi muatan (elektroforesis) protein akan berpisah

Parit diisi antibodi terhadap protein serum

Timbul presipitat setelah diinkubasi

Sumur diisi albumin

larutan yg mau diukur

PEMANTAPAN MUTU LABORATORIUM ( LABORATORY QUALITY ASSURANCE )

103 mg/dl 97 mg/dl 105 mg/dl = 100 mg/dl

c. Between day Impresisi dan presisi dari hari kehari 10/2/2009

2. Duplikat Setiap sampel diulangi 2 x. Rumus

I 105 40 300 80 Dst

II 109 38 310 87 Dst

idealnya Menunjukkan akurasi Menunjukkan presisi

II I scatter gram misalnya r =+ 0,7

PEMANTAPAN MUTU LABORATORIUM (LABORATORY QUALITY ASSURANCE )

Prosesnya: 1. persiapan pelaksanaan 2. pelaksanaan 3. melacak penyimpangan 4. cara mengatasi penyimpangan

7 Agustus 2006 : 103 mg/dl 8 Agustus 2006 : 96 mg/dl

120 Kartu kontrol

jika hasil tetap di luar mean 2SD

ada gangguan alat,

In control Report results

Out-of-control, reject analytical run

contoh dari aturan konrol 12s

+3s +2s +1s mean -1s -2s -3s

contoh aturan kontrol 13s

+3s +2s +1s mean -1s -2s -3s O

contoh aturan kontrol 22s

+3s +2s +1s mean -1s -2s -3s O O O

contoh aturan kontrol R4s

+3s +2s +1s mean -1s -2s -3s O O O

contoh aturan kontrol 41s

+3s +2s +1s mean -1s -2s -3s O O O

contoh aturan kontrol 10 x

- makin sering makin baik - berkisar antara 2 sampai 12 X /tahun

You might also like