UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA

MANUAL DE TECNICAS BASICAS PARA EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

MODULO: APARATO DIGESTIVO CICLO ll DE LA CARRERA DE MEDICINA

DIAGNOSTICO DE AMIBIASIS

Prctica No. 16 OBJETIVOS 1.- El alumno conocer la importancia del estudio de amibiasis como uno de los principales problemas de salud en Mxico. 2.- El alumno conocer la importancia del mtodo directo para la identificacin de amibiasis. 3.- El alumno conocer los reservorios de Entamoeba hystoltica. 4.- El alumno conocer el ciclo vital de Entamoeba hystoltica. 5.- El alumno ser capaz de utilizar el mtodo directo para la identificacin de Entamoeba hystoltica. 6.- El alumno conocer la aplicacin del mtodo directo en el diagnstico en la prctica de campo. 7.- El alumno ser capaz de identificar los trofozotos de Entamoeba hystoltica en preparaciones con lugol parasitolgico y solucin salina. 8.- El alumno ser capaz de identificar quistes de Entamoeba hystoltica en preparaciones con lugol parasitolgico y solucin salina. 9.- El alumno conocer los medios de cultivo y sus indicaciones. 10.- El alumno ser capaz de diferenciar morfolgicamente a otras especies de Entamoeba hystoltica

2 Introduccin Notas histricas y geogrficas.- Entamoeba hystoltica fue descubierta por Locsh (1875) en las heces de un enfermo de disentera en San Petersburgo (hoy Lenningrado) Rusia, aunque Losch al hacer la autopsia de ese paciente, hall los trofozotos de la ameba en las lceras del colon y con las heces sanguinolentas inocul per rectum a un perro y le produjo disentera, no lleg a sospechar la relacin de causa a efecto entre la ameba y la colitis aguda. Posteriormente las investigaciones de Kartulis (1886) en el Cairo; de Hlava (1887) en Praga y de

Councilman y Lafleur (1891) en Baltimore, suministraron las pruebas clnicas y anatomopatolgicas de que Entamoeba hystoltica es el agente causal de un tipo de disentera y de absceso heptico. En 1893 Quincke y Roos descubrieron los quistes y Schaudinn en 1903 dio a la especie el nombre de Entamoeba hystoltica y la diferenci de la ameba comn del colon ( Entamoeba coli). Diez aos despus, Walker y Sellards en las Filipinas, obtuvieron pruebas de personas voluntarias de que Entamoeba hystoltica es la causa de la colitis amebiana y que Entamoeba coli es un comensal inocuo del intestino grueso. Entamoeba hystoltica se ha encontrado en todas las poblaciones del mundo en las que ha sido buscada. Es ms frecuente en los trpicos y zonas subtropicales que en los climas fros, pero en las poblaciones carentes de higiene de las zonas templadas y subrticas la frecuencia de sta parasitosis es tan elevada como en los trpicos. Reservorios animales La infeccin natural por Entamoeba hystoltica se observa en monos, perros y posiblemente en cerdos, pero la importancia de stos animales como fuente de contagio para el hombre es mnima, comparada con la del mismo humano. Morfologa biologa y ciclo vital Entamoeba hystoltica pasa por las siguientes fases en su ciclo vital: Trofozoto.- Los trofozotos vivos tienen dimensiones variables que fluctan entre 10 y 60 micras de dimetro, segn el grado de actividad y otras condiciones. Las amebas presentes en las heces disentricas recin evacuadas son por lo general relativamente grandes y las presentes en las heces pastosas de portadores asintomticos no son mayores que los trofozotos de Endolimax nana.

3 La locomocin del trofozoto activo es bastante notable, tal como se ve en los microorganismos obtenidos de heces disentricas, diarreicas o en amebas cultivadas. En medio de cultivo transparente se ve, a veces cmo las amebas ascienden por las paredes del tubo. Los movimientos se deben a la formacin de prolongaciones pseudopdicas digitiformes largas o redondeadas y anchas del ectoplasma, en cuyo interior influye el endoplasma. Aunque la direccin de los movimientos cambia con rapidez en respuesta a las variaciones del microclima, en un momento dado un pseudpodo progresa en

una direccin y casi de manera instantnea se retrae, mientras se forman otros y cambia el sentido de desplazamiento. El movimiento puede ser continuo e intermitente, tal vez parezca errtico y rara vez se mantiene en lnea recta. El protoplasma de Entamoeba hystoltica se diferencia en un ectoplasma externo claro y un endoplasma central finamente granulado en el que se observan a veces vacuolas digestivas; En el trofozoto vivo ocasionalmente cabe observar el ncleo por delante del centro de la masa protoplasmtica. En microorganismos fijados con la tcnica de Schaudinn y teidos con hematoxilina frrica, puede estudiarse mejor su estructura. El ncleo es esfrico y su dimetro es aproximadamente la quinta parte del de la ameba completa; contiene un pequeo cariosoma central claramente visible rodeado de un halo incoloro y fijo a la superficie interna de la membrana nuclear por un gran nmero de fibrillas radiadas acromticas.

4 Tapiza a sta membrana una masa de cromatina que con frecuencia se distribuye en pequeos grnulos redondeados y a veces forma placas de mayor tamao. La membrana en s es delgada y el nucleoplasma es ms viscoso que el endoplasma. En las heces disentricas, las vacuolas digestivas, suelen contener hemates en proceso de digestin, aunque no constituyen un elemento esencial de stas amebas. El citoplasma contiene lisosomas de superficie, partculas de glucgeno, ribosomas cristaliformes de partculas dispuestas en forma helicoidal en pilas o en bastones. Enquistamiento

En condiciones naturales no se produce enquistamiento en los tejidos. En la luz del colon y en condiciones an no conocidas, el trofozoto amebiano elimina alimentos no digeridos y se condensa en una masa esfrica que constituye el prequiste. Produce luego una cubierta resistente y relativamente delgada y queda formado el quiste inmaduro. En ste estadio se forma un solo ncleo similar al del trofozoto y el prequiste. El dimetro de los quistes oscila entre 10 y 20 micras con una media de 12 o 13 micras. Los quistes de Entamoeba hystoltica suelen ser esfricos, aunque, tambin pueden ser subesfricos u ovoides. Los quistes maduran por dos divisiones mitticas consecutivas del ncleo, que dan lugar a 4 ncleos, cada uno de los cuales es una rplica del ncleo original, al iniciarse el enquistamiento. Durante ese proceso de maduracin se consume el glucgeno y los cromatoidales se hacen menos visibles o desaparecen. En raras ocasiones se encuentran hasta ocho ncleos en los quistes maduros. El quiste es sumamente resistente a las condiciones del medio y a los jugos del tubo digestivo. Pueden sobrevivir en las heces por lo menos 8 das a temperaturas que oscilan entre 20 y 40 C y durante 40 das a los 2 y 6 C, resistiendo incluso temperaturas de congelacin. Soportan las concentraciones de cloro en el agua purificada, pero pueden ser destruidos por los procedimientos de filtracin y por el mtodo de electrlisis, as como la ebullicin, yodo y cido actico. A veces se observa el ncleo y con mayor frecuencia los cromatoidales en los quistes sin teir. En las preparaciones frescas teidas con yodo, el glucgeno se colorea de amarillo oscuro y cuando no se sobretien las preparaciones, pueden verse fcilmente los ncleos, en los que el cariosoma y cromatina perifrica aparecen como puntos brillantes de luz amarilla que contrasta con el amarillo pardo ms oscuro del nucleoplasma. 5 En las preparaciones teidas con hematoxilina frrica, el ncleo y los cromatoidales se tien de azul intenso, mientras que las vacuolas de glucgeno no se colorean. Los trofozotos no se enquistan en las heces una vez evacuadas, en materias fecales semiformadas es posible encontrar prequistes uninucleados binucleados o tetranucleados, mientras que en las heces formadas lo normal es encontrar quistes maduros, es decir con 4 ncleos. Los quistes con uno, dos y cuatro ncleos constituyen la forma infectante para el siguiente husped.

Entamoeba hystoltica puede diferenciarse de Entamoeba coli por algunas caractersticas morfologas particulares. El trofozoto de Entamoeba coli es de menor tamao, oscila entre las 10 y 50 micras, aunque no es muy significante en la diferenciacin, los trofozotos se observan, por lo general, como una masa ovoidea con pseudpodos muy cortos y relativamente anchos, el ectoplasma tiene aspecto viscoso y no es posible diferencias del endoplasma. Los quistes de Entamoeba coli son muy pequeos, miden entre 3 y 10 micras y es muy frecuente que contengan hasta 16 ncleos esta caracterstica es la de mayor importancia para su diferenciacin con Entamoeba hystolica. Entamoeba Hartmanni.- Tambin es patgena para el hombre y es capaz de producir cuadros intestinales similares a los de Entamoeba hystoltica, se le conoce como la raza pequea de Entamoeba hystoltica. Se le identifica por el tamao de los trofozotos maduros que miden entre 4 y 12 micras. Los quistes tambin son muy pequeos entre 5 y 10 micras y poseen uno o dos ncleo. Desenquistamiento El desenquistamiento se ha observado in vitro en condiciones que se aproximan a la ameba del tubo digestivo.

6 Una vez que el quiste llega a la boca y es deglutido, pasa por el estmago y penetra en el intestino delgado, sin experimentar cambios morfolgicos aparentes mientras se encuentra en lugares en donde la reaccin del medio es cida pero tan pronto como el medio en que se encuentra es neutro o ligeramente alcalino, adquiere una gran actividad, que combinada posiblemente con el efecto de los jugos digestivos, debilita la pared del quiste y permite que la ameba multinucleada (metaquiste) emerja del quiste.

De forma casi inmediata, el citoplasma se divide en tantas partes como ncleos tiene, de tal manera que cada ncleo pasa a ser el centro de un pequeo trofozoto metaqustico. As del proceso de desenquistamiento derivan cuatro pequeas ambulas. Colonizacin Los trofozotos metaqusticos de Entamoeba hystoltica no colonizan el intestino delgado, sino que son transportados con el contenido fecal hacia el ciego, donde pueden llegar a establecerse si su nmero es suficiente para que uno o varios de ellos entren en contacto con la mucosa o se alojen en las criptas glandulares. Una vez que las pequeas amebas comienzan a alimentarse y crecer se transforman en trofozotos normales y se completa el ciclo del desarrollo. Patologa Entamoeba hystoltica es nica entre las amibas parsitas del hombre por su poder invasor de los tejidos, de donde se desprende lo adecuado del nombre de la especie, variedad hystoltica. Una vez que los pequeos trofozotos metaqusticos se han desarrollado a partir del metaquiste, su crecimiento y reproduccin comienzan probablemente en el ciego, donde los datos clnicos, patolgicos y experimentales con que se cuenta hasta el momento, indican que las amebas tienen la primera oportunidad de colonizacin. Factores de patogenicidad.- La colonizacin depende de varios factores, entre los que figura el nmero de trofozotos activos inicialmente, si son muchos, la posibilidad de que alguno de ellos entre en contacto con la mucosa o se aloje en las criptas glandulares durante un periodo de tiempo lo bastante largo para alimentarse y evolucionar hasta convertirse en trofozoto de tamao normal y multiplicarse, es relativamente grande.

7 Los anatomopatlogos han encontrado en ocasiones lceras amebianas en el colon de personas que durante su vida no haban presentado sntomas claros de colitis. Un nmero apreciable de casos de hepatitis amebiana y abscesos hepticos se desarrollan en sujetos que carecen de historia previa de colitis amebiana. Algunas cepas de sta ameba que tienen ndice de patogenicidad bajo, en particular las que permanecen largo tiempo en una comunidad (es decir cepas homlogas), viven superficialmente en las criptas glandulares del intestino grueso

erosionando la superficie de la mucosa. En condiciones favorables para el husped se establece un equilibrio y el sujeto portador no presenta ninguna manifestacin patolgica caracterstica. De 23 voluntarios humanos infectados que se sometieron a observacin durante un periodo de 9 a 14 meses, siete se curaron espontneamente tras haber estado eliminando quistes por las heces de forma regular durante un periodo de tres semanas a dos meses (Beaver y cols.). Cuando se desarrolla un bajo umbral de resistencia como consecuencia de distintas alteraciones, es posible la invasin real de los tejidos, con la consiguiente aparicin de sintomatologa clnica. Epidemiologa La amebiasis es ms frecuente en regiones tropicales, climas clidos y templados, pero ms an en reas pobres y mal saneadas. En el mbito mundial, est catalogada como la tercera parasitosis causante de muerte. "Alrededor del 10 a 20 % de la poblacin mundial se considera infectada y el 10 % de sta sufre la enfermedad, con una letalidad que oscila entre el 0.1 y 0.25 %." En Mxico, la Amibiasis intestinal ocup la tercera causa de morbilidad general desde 1995 hasta 1999 con un promedio de 1,525,003 casos nuevos por cada ao. En el ao 2000, la amibiasis pas a ocupar la cuarta causa de morbilidad general con 1,348,718 casos. En el presente siglo XXl, en el ao 2001, esta parasitosis ocup la quinta causa de morbilidad general con 1,250,186 casos nuevos. En los aos 2002 y 2003 la amibiasis ocup la quinta causa de morbilidad general , en el ao 2002 se presentaron 1,151,507. En el 2003, se presentaron 1,013, 535 casos nuevos. Aunque la tendencia indica una disminucin de casos por ao, la amibiasis intestinal sigue siendo un gran problema de salud.

8 Diagnstico Entamoeba hystoltica El diagnstico de amebiasis intestinal es sugerido por el cuadro clnico y epidemiolgico y se confirma mediante la demostracin de la E. histolytica en las heces o los tejidos. Las infecciones por Entamoeba histolytica que pueden ser asintomticas o causar malestar abdominal leve, que se alterna con perodos de estreimiento, puede producir tambin cuadros clnicos severos como: diarrea sanguinolenta mucoide o disentera aguda fulminante con fiebres y escalofros que producen la

muerte. La colitis fulminante se presenta principalmente en lactantes con desnutricin avanzada y el cuadro clnico es el anterior pero con datos de peritonitis por perforaciones y las ocasionadas por el estado toxiinfeccioso. La apendicitis amibiana no se puede diferenciar de otros tipos de apendicitis por medios clnicos. El ameboma es raro en nios y se presenta con mayor frecuencia en adultos jvenes, est caracterizado por diarrea mucosanguinolenta y se palpa un tumor abdominal. Diagnstico por el mtodo directo (observacin de heces fecales recientes). El mtodo directo es el mas antiguo, probablemente ANTON VAN LEEWENHOEK, a mediados del siglo XVII, fue de los primeros en utilizarlo, al observar y encontrar en sus propias heces fecales trofozotos de Giardia lamblia. El mtodo tiene entre sus caractersticas, sencillez, rapidez, bajo costo y poco material. Con este mtodo se examinan de inmediato las preparaciones en fresco de heces lquidas y semiformadas recientes, en busca de trofozotos mviles y quistes. Utilidad.- Ha sido el mtodo indicado como excelente para bsqueda de trfozotos, en la prctica ha demostrado su eficacia, cuando se utiliza lugol para la bsqueda e identificacin de quistes, huevos y larvas. Limitaciones.- La muestra es tan pequea que es poco representativa. Cultivos.- Los cultivos de Entamoeba hystoltica podran estar indicados en los casos en que no fueran identificadas a satisfaccin las formas parasitarias. Sin embargo, para que los cultivos resulten positivos, la muestra debe contener grandes cantidades de trofozotos. Los medios de cultivo usados con mayor frecuencia son el de Cleveland-Collier y el difsico de Dobell, en anaerobiosis. 9 Material mtodo para la prctica de laboratorio. Material - Portaobjetos de 25 x 95 mm. - Cubreobjetos de 22 x 22 mm. - Pipeta Pasteur con bulbo. - Mechero de Bunsen. - Aplicadores de madera, palillos o abatelenguas. - Muestra de materia fecal recin evacuada o cultivo de E. Hystoltica. - Microscopio compuesto.

Mtodo 1.- En un portaobjetos, se colocan separadamente una gota de solucin salina y otra de lugol. 2.- Con el aplicador de madera, se toma una muestra de 1 a 4 miligramos de heces y se mezcla con la solucin salina, haciendo una suspensin homognea. 3.- Con el mismo aplicador, se retiran las fibras y otros fragmentos gruesos. 4.- Se coloca el cubreobjetos sobre el portaobjetos con la preparacin.. 5.- Se efecta la misma operacin en la gota de lugol. 6.- Se tienen listas las preparaciones para observar al microscopio. Trofozotos.- Las amebas suelen mostrarse con mas facilidad en los copos sanguinolentos de moco de las heces miden entre 10 y 60 micras de dimetro, adoptan varias formas que pueden ser alargadas, ovoides en que se pueden observar los pseudpodos ondulantes o digitiformes. con la tincin de lugol toman un color amarillo pardo a caf claro. Quistes.- El dimetro de los quistes oscilan entre 10 y 20 micras. Los quistes de Entamoeba hystoltica suelen ser esfricos, aunque, tambin pueden ser subesfricos u ovoides En las preparaciones frescas teidas con yodo, el glucgeno de los quistes se colorea de amarillo oscuro y cuando no se sobretien las preparaciones, pueden verse fcilmente los ncleos, de uno a cuatro, en los que el cariosoma y cromatina perifrica aparecen como puntos brillantes de luz amarilla que contrasta con el amarillo pardo ms oscuro del nucleoplasma. Forma de reportar.- La preparacin con solucin salina sirve para identificar y reportar el hallazgo de trofozotos. La preparacin con lugol sirve para reportar el hallazgo de quistes huevos y larvas. Precauciones.- La materia fecal es potencialmente infectante, por lo tanto, se tendrn los cuidados necesarios para su manejo. 10 En los pacientes sintomticos, la proctoscopa permite a menudo mostrar lesiones en la mucosa. Hay que efectuar siempre una aspiracin de las lesiones y un examen del material obtenido en busca de trofozotos. El diagnstico de amebiasis extraintestinal es ms difcil. En general el examen de las heces es negativo y rara vez puede demostrarse la presencia de trofozotos en material purulento. En algunos casos con sospecha clnica de absceso heptico amebiano el nico mtodo de diagnstico que tiene alguna utilidad es la administracin de prueba con amebicidas. Las pruebas serolgicas ofrecen resultados positivos en casi todos los enfermos con absceso heptico amebiano, y en mas del 80% de los que tienen disentera amebiana aguda. Las pruebas con mayor grado de sensibilidad que se

dispone son la hemoaglutinacin indirecta y la de inmunoabsorcin de tipo enzimtico (ELISA). Tratamiento Amebiasis Aguda Metronidazol 30 a 50 mgs. por kilo por da en 3 tomas durante 7 a 10 das. Tinidazol 50 a 75 mgs. por kilo por da 1sola toma por da x 2 das. Diyodohidroxiquenoleina 30-40 mgs. por kilo por da (1800 mgs.) 3 veces al da durante 10 das Absceso heptico amibiano Emetina Clorhidrato 1 mg. por kilo por da sin rebasar 60 mgs. 1 inyeccin x 5 das. Metronidazol 30-50 mgs. por kilo por da en 3 tomas x 5-10 das. A pesar de la importancia de la enfermedad como problema de salud pblica, se cuenta con un nmero relativamente reducido de medicamentos para el tratamiento de la disentera y el absceso heptico amibianos. La mayora de ellos con un margen teraputico estrecho y con diversos efectos secundarios en el hombre. Adems, han aparecido informes de resistencia de E. histolytica a algunos de los frmacos antiamibianos ms usuales en la prctica mdica.

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CUESTIONARTIO 1.- Mencione la utilidad del diagnstico de amibiasis por el mtodo directo. 2.- Describa el ciclo biolgico de Entamoeba hystoltica. 3.- Describa la tcnica del mtodo directo para el diagnstico de amibiasis.

4.- Describa la morfologa del trofozoto de Entamoeba hystoltica con la tincin de lugol. 5.- Describa las caractersticas de los quistes maduros de Entamoeba hystoltica. EXAMENES COPROPARASITOSCOPICOS. Prctica 17

OBJETIVOS 1.- El alumno conocer la importancia de las enfermedades parasitarias como problema de salud social en Mxico. 2.- El alumno conocer la importancia del diagnstico de laboratorio de las enfermedades parasitarias. 3.- El alumno conocer la clasificacin de los exmenes coproparasitoscpicos. 4.- El alumno ser capaz de aplicar los mtodos mas frecuentes para el diagnstico parasitolgico. 5.- El alumno ser capaz observacin al microscopio. Justificacin En Mxico las enfermedades parasitarias que afectan al aparato digestivo son muy frecuentes debido a las condiciones de pobreza extrema, marginacin social, mal saneamiento, sin control de fauna nociva y domstica, con psimos mtodos de eliminacin de basura con depsitos urbanos y suburbanos, con un gran porcentaje de poblaciones sin agua potable. Las complicaciones como oclusin intestinal por masas de Ascaris, perforacin de la pared intestinal por Entamoeba hystoltica, obstruccin del apndice por Ascariasis o Enterobiasis, prolapso rectal y anemia por Trichuriasis y la migracin a otros tejidos que pueden causar pancreatitis, colecistitis, abscesos hepticos y Sx. De Loeffler que ponen en riesgo la vida de los enfermos. La ascariasis es una parasitosis cosmopolita causada por Ascaris lumbricoides, nemtodo intestinal que produce cuadros clnicos con anorexia, bruxismo, dolor abdominal, diarreas, constipacin, prurito nasal o anal, urticaria, perforacin intestinal con afeccin pulmonar. La ascariasis afecta a lactantes hasta en un 20%, a un 42% de los preescolares y hasta un 41% de los escolares. de identificar las formas parasitarias mediante la

En la repblica Mexicana existen poblaciones en las que hasta el 98% de la poblacin general se encuentra afectada. En el ao 2005 se reportaron 173,414 casos de ascariasis a la Direccin General de Epidemiologa SSA. La amibiasis intestinal es una infeccin causada por Entamoeba hystoltica, protozoo invasor de la mucosa del intestino grueso que produce cuadros clnicos que se caracterizan por un sndrome diarreico con moco y sangre, acompaados de pujo y tenesmo rectal. La disentera con anemia, perforacin intestinal, ameboma, absceso heptico amibiano o amibiasis extraintestinal son complicaciones que ponen en riesgo la vida. La amibiasis intestinal en Mxico afecta al 29% de la poblacin general. La Enterobiasis es una parasitosis exclusiva del hombre, de distribucin mundial y de las ms frecuentes, se estima que afecta a ms de 400 millones de personas a nivel mundial, lo que representa alrededor del 10% de la poblacin total. En Mxico la frecuencia es variable por estados de la Repblica, desde el 25 % hasta el 80% de la poblacin total, en el ao 2005 se reportaron 27,151 casos a la Direccin General de Epidemiologa SSA. El estudio coproparasitoscpico es definitivo para el diagnstico y tratamiento de las parasitosis Exmenes coproparasitoscpicos. Un examen coproparasitoscpico es el estudio de la materia fecal para la bsqueda e identificacin de formas parasitarias. Los mtodos coproparasitoscpicos se pueden dividir en: cualitativos y cuantitativos; Los primeros se usan para saber que formas parasitarias existen y los segundos en que nmero se encuentran. Los mtodos cuantitativos se utilizan sobre todo en helmintiasis, uncinariasis y otras parasitosis. Los mtodos cualitativos siguen diversas rutinas para su elaboracin, en funcin de esto habr unos que exijan mayor manipulacin que otros, como ejemplo de los primeros estn los mtodos de concentracin y en los otros el examen directo es un buen ejemplo. Enseguida se describirn las diversas tcnicas de los exmenes coproparasitoscpicos cualitativos.

EXAMENES COPROPARASITOSCOPICOS CUALITATIVOS (1).- EXAMEN DIRECTO

Antecedentes.- Este mtodo es el mas antiguo, por los datos histricos que se tienen en relacin a los primeros microscopios, probablemente ANTON VAN LEEWENHOEK, a mediados del siglo XVII, fue de los primeros en utilizarlo, al observar y encontrar en sus propias heces fecales trofozotos de Giardia lamblia. El mtodo tiene entre sus caractersticas, la sencillez y rapidez para llevarlo a cabo, adems de la economa que representa ya que es el mtodo que requiere menos material. Utilidad.- Ha sido el mtodo indicado como excelente para bsqueda de trfozotos, en la prctica ha demostrado su eficacia, cuando se utiliza LUGOL para bsqueda e identificacin de quistes, huevos y larvas. Limitaciones.- La muestra es tan pequea que es poco representativa.

15 Material a).-Reactivos Cloruro de sodio, agua destilada, yodo cristaloide, yoduro de potasio. b).-Soluciones 1.- Solucin salina isotnica - Cloruro de sodio....... 8.5 g. - Agua destilada c.b.p. 1000 ml. - Se coloca el cloruro de sodio en un matraz volumtrico y volumen. 2.- Lugol parasitolgico (Solucin madre) - Yodo cristaloide........... 5 g. - Yoduro de potasio.......... 10 g. - Agua destilada............ 100 ml. se completa el

Se disuelve el yoduro de potasio en el agua y enseguida se agrega el yodo, agitando constantemente para que se disuelva la mayor cantidad posible, se guarda en un frasco mbar, procurando que todo el exceso que queda en el fondo tambin se vace en el frasco, esto se hace para que la solucin permanezca con la concentracin deseada, durante mucho tiempo. 3.- Solucin de trabajo - Solucin madre de lugol... 1 volumen. - Agua destilada............... 1 volumen.

Se mezcla la solucin madre con el agua destilada y se guarda la solucin en un frasco gotero mbar. 16

c).-Vidriera - Portaobjetos de 25 x 95 mm. - Cubreobjetos de 22 x 22 mm. - Pipeta Pasteur con bulbo. d).-Aparatos (equipo) - Microscopio compuesto. - Otros: Aplicador de madera, palillos o abatelenguas.

Mtodo 1.- En un portaobjetos, se colocan separadamente una gota de solucin salina y otra de lugol. 2.- Con el aplicador de madera, se toma una muestra de 1 a 4 miligramos de heces y se mezcla con la solucin salina, haciendo una suspensin homognea.

3.- Con el mismo aplicador, se retiran las fibras y otros fragmentos gruesos. 4.- Se coloca el cubreobjetos. 5.- Se efecta la misma operacin en la gota de lugol. 6.- Se tiene lista la preparacin para observar al microscopio. Forma de reportar.- La preparacin con solucin salina sirve para identificar y reportar el hallazgo de trofozotos. La preparacin con lugol sirve para reportar el hallazgo de quistes huevos y larvas. PRECAUCIONES.- La materia fecal es potencialmente infectante, por lo tanto, se tendrn los cuidados necesarios para su manejo.

17 TECNICAS CUALITATIVAS DE FLOTACION (2).- EXAMEN COPROPARASITOSCOPICO (CPS) DE FLOTACION CON SOLUCION DE SACAROSA Utilidad.- Tcnica que se utiliza en casos de emergencia, cuando no se tiene otro tipo de reactivos a la mano. Este procedimiento se puede utilizar en el campo. Limitaciones.- La solucin de sacarosa atrae moscas, provocando las molestias consiguientes. Material a).- Reactivos - Sacarosa (azcar comn). - Agua de la llave (?). b).- Soluciones 1.- Solucin de sacarosa con densidad de 1.180. - Se hace un jarabe de sacarosa y se va diluyendo hasta lograr la densidad deseada. 2.- Lugol parasitolgico (ver mtodo directo). c).- Vidriera

- Frasco de 50 ml. de boca ancha. - Cubreobjetos de 22 x 40 mm. - Portaobjetos de 25 x 75 mm. d).- Aparatos (equipo) - Densmetro graduado de 1.100 a 1.200 - Microscopio compuesto. e).- Otros - Abatelenguas o aplicadores de madera. 18 Mtodo 1.- Se realiza una suspensin de aproximadamente un gramo de materia fecal, en el frasco de boca ancha, con una poca de la solucin de sacarosa, hasta lograr una suspensin homognea. 2.- Se llena, agitando con el abatelenguas, el frasco hasta el tope, con la solucin. 3.- Se coloca el cubreobjeto en la boca del frasco de manera que quede en contacto con la solucin evitando en lo posible la formacin de burbujas; se deja reposar durante 5 minutos. 4.- Se toma el cubreobjetos y se coloca sobre un portaobjetos. 5.- Se examinan todos los campos con el microscopio. Para tincin temporal se puede utilizar lugol parasitolgico. PRECAUCIONES.- Debido a la utilizacin de material fecal, se deben extremar precauciones para no contaminar las zonas de trabajo.

(3).- METODO CUALITATIVO DE WILLIS Como el, anterior es un mtodo cualitativo de concentracin por flotacin simple; en este caso se usa "salmuera".

Antecedentes.- Willis en 1921, describe este mtodo basado en la propiedad que tienen las soluciones de densidad mayor, de hacer flotar objetos menos densos; Posteriormente Otto y cols., en 1941, sustituyeron el cloruro de sodio por sulfato de zinc y disminuyeron la densidad, modificando as este mtodo. La densidad aproximada de la solucin de salmuera es de 1.200, lo que hace que la mayor parte de los huevos de helmintos floten. Utilidad.- Por su sencillez, se puede utilizar en encuestas en el campo; se usa para la bsqueda e identificacin de formas parasitarias como huevos, quistes y larvas. Limitaciones.- Como no se filtra la materia fecal, las preparaciones pueden quedar muy sucias. La densidad tan elevada de la salmuera distorsiona las formas parasitarias y se necesita experiencia para la lectura. 19 Material a).- Reactivos - Cloruro de sodio comercial. Resulta ms prctico y econmico cocina. b).- Soluciones 1.- Solucin de lugol parasitolgico (ver mtodo directo). 2.- Agua de la llave (?). 3.- Solucin saturada de cloruro de sodio. utilizar sal de

En un recipiente de un litro, se vierte agua hasta la mitad y se agrega suficiente cloruro de sodio para que se haga una solucin sobresaturada o sea que quede con exceso de sal sin disolver en el fondo del recipiente. El sobrenadante es el que se deber utilizar. Para acelerar la disolucin, se puede calentar la mezcla y se deja enfriar; el exceso de sal cristalizar. c).- Vidriera - Frascos de vidrio de aproximadamente 50 ml. de boca ancha. - Portaobjetos de 75 x 25 mm. - Cubreobjetos de 22 x 40 mm. d).- Aparatos (equipo) - Microscopio compuesto. - Abatelenguas o aplicadores de madera. Mtodo 1.- Se colocan en el recipiente de vidrio, de 2 a 3 gr. de materia fecal y se aaden unos 5 ml de salmuera, homogeneizando con el abatelenguas.

2.- Se va aadiendo ms salmuera y se sigue agitando con el abatelenguas, hasta que es llene hasta el tope del frasco. 3.- Se coloca un cubreobjetos sobre la boca del recipiente, de tal manera que quede en contacto con la suspensin y se deja reposar de 15 a 30 minutos. 4.- Se toma el cubreobjetos y se coloca en un portaobjetos. ( si se desea se le puede poner a la preparacin una gota de lugol parasitolgico). 5.- Se observa con el microscopio con el objetivo de 10X y 40X. Precauciones.- Tener cuidado, al colocar el cubreobjetos en la boca del recipiente, para que no queden burbujas, esto dificulta la observacin. El carcter infectante de la materia fecal deber tomarse en consideracin para tomar las medidas de seguridad correspondientes.

20 (4) METODO DE FAUST Se trata de un examen coproparasitoscpico cualitativo de concentracin por centrifugacin y flotacin. Antecedentes.- Fue en 1938 cuando Faust y cols. descubrieron su mtodo que hasta la fecha es uno de los ms utilizados. es parecido al que describe Lane en 1924, slo que en ste se utiliza solucin saturada de cloruro de sodio. Como este mtodo es poco eficaz para quistes; Se utiliza ms el mtodo de FAUST que es muy eficaz para estas formas parasitarias. Utilidad.- Hace una buena concentracin de quistes, huevos y larvas; Es la tcnica preferida por la generalidad de los laboratorios. Limitaciones.- Es poco eficaz para huevos pesados como: Ascaris lumbricoides, Taenia sp. y Fasciola heptica. Material a).- Reactivos - Sulfato de zinc (puede utilizarse sulfato de zinc industrial, si se eliminan de la solucin las sales insolubles mediante filtrado previo o con la aplicacin de unas gotas de cido sulfrico). - Agua de la llave. b).- Soluciones

1).- Solucin de sulfato de zinc con densidad de 1.180. - Sulfato de zinc 350 g. - agua de la llave 1000 ml. Se disuelve el sulfato de zinc en el agua hasta la disolucin total de la sal, se le toma la densidad, si se pasa de 1.180, se le agrega agua y se homogeiniza, si le falta, se le agregan pequeas cantidades de la sal, hasta lograr la densidad deseada. 2).- Lugol parasitolgico (ver mtodo directo).

21 c).- Vidriera Recipiente de vidrio de 50 ml aproximadamente. Tubos de ensaye de 13 x 100 mm. Embudos de vidrio de 7.5 cms. de dimetro. Portaobjetos de 75 x 25 mm. Cubreobjetos de 22 x 22 mm.

d).- Equipo - Centrfuga con camisas para tubos de 13 x 100 mm. - Microscopio compuesto. - Densmetro graduado de 1.100 a 1.200 grados Baum\5w\4. c).- Otros - Gasa cortada en cuadros de 15 x 15 cm. - Gradilla. - Aplicadores de madera. - Abatelenguas. - Asa de alambre terminada en crculo de 2 a 3 mm de dimetro, formando ngulo recto con el resto del alambre y montada en un tapn de corcho o caucho. Mtodo 1.- Se hace una suspensin homognea con 1 a 2 g de materia fecal y 10 ml de agua de la llave. 2.- Se pasa a travs de gasa colocada en el embudo y colectando la suspensin directamente en el tubo de ensaye. 3.- Los tubos as preparados, se centrifugan a 2,000 revoluciones por minuto (r.p.m.) durante un minuto. 4.- Se decanta el sobrenadante y se resuspende el sedimento con agua, agitando con un aplicador.

5.- Se centrifuga nuevamente y se vuelve a decantar el sobrenadante. 6.- Se agregan 2 a 3 ml de la solucin de sulfato de zinc a los tubos y se homogeneizan perfectamente, llenando los tubos hasta 0.5 a 1 cm. por abajo de los bordes. 7.- Se centrifuga a 2000 r.p.m. durante un minuto. 8.- Con el asa estril o flameada, se recoge la muestra de la pelcula superficial, que se encuentra en el menisco, durante dos o tres ocasiones sucesivas y se deposita en un porta objetos. 9.- Se agregan dos gotas de lugol parasitolgico y se homogeneiza con el ngulo de un cubreobjetos y se coloca este sobre la preparacin. 10.- Se observa la preparacin al microscopio con objetivos 10X y 40X. 22 Forma de reportar.- Para reportar los hallazgos en las preparaciones, primero se escribe la fase o estadio y enseguida el nombre del parsito, el nombre del gnero con mayscula y el de la especie con minsculas, por ejemplo: quistes de Giardia lamblia; huevos de Ascaris lumbricoides, etc. Precauciones.- Se debe verificar la densidad de la solucin de sulfato de zinc peridicamente o de preferencia prepararla cada tercer da, segn el volumen de trabajo diario, pues fcilmente se pierde la densidad alterndose los resultados. Despus de agregar la solucin de Faust, es necesario tomar inmediatamente la muestra para su lectura, pues si permanecen los tubos mucho tiempo, las formas parasitarias pueden degenerarse o sedimentarse. Dado el carcter infectante de la materia fecal, se deben tomar las precauciones pertinentes.

TECNICAS CUALITATIVAS POR SEDIMENTACION (5) METODO DE RITCHIE El mtodo de Ritchie es un examen CPS cualitativo de concentracin por sedimentacin con centrifugacin. Antecedentes.- Ritchie, en 1948, describi su mtodo muy semejante al de Carles Barthelemy (1917), es una tcnica controvertida, pues se toma como tipo para hacer comparaciones muy frecuentes con otros mtodos, es quiz uno de los mtodos que ms referencias tenga en la literatura cientfica. Utilidad.- Se utiliza para huevos, quistes y larvas, no importan la densidad que tengan, hacen muy buena concentracin de stas formas parasitarias, pues elimina bastantes detritus orgnicos con el ter, el motivo por el cul se utiliza el formol es para mantener la integridad de las formas parasitarias que concentra, por sus caractersticas de fijador. La generalidad de los parasitlogos conoce este mtodo como el de formol-ter.

Limitaciones.- Debido a que se utilizan varios reactivos y tubos cnicos, resulta poco econmico. Las preparaciones quedan muy sucias porque con la sedimentacin, aparte de concentrarse formas parasitarias, se concentran otros materiales. Material a).- Reactivos: - Cloruro de sodio Q.P. - Formaldehdo en solucin Q.P. - ter etlico comercial. 23 b).- Soluciones 1.- Solucin salina isotnica (ver mtodo directo). 2.- Solucin de Formaldehdo al 10 %. Formaldehdo........... 10 ml. Agua destilada c.b.p.... 100 ml. Se colocan los 10 ml de formaldehdo en una probeta o matraz volumtrico de 100 ml y se completa el volumen a 100 ml con agua destilada. c).- Vidriera Embudos de vidrio de 5 cm de dimetro. Vasos de precipitados de vidrio de 50 ml. Pipetas Pasteur con bulbo. Portaobjetos de 25 x 75 mm. Cubreobjetos de 22 x 22 mm. Tubos cnicos para centrfuga de 15 ml.

d).- Aparatos - Centrfuga con camisas para tubos de 13 x 100 mm. - Microscopio compuesto. e).- Otros - Gasa cortada en cuadros de 15 cm de lado. - Aplicadores de madera. - Gradilla.

Mtodo 1.- Con el aplicador de madera, se colocan de 1 a 2 g de materia fecal aproximadamente, en el vaso de precipitados y se aaden 10 ml de solucin salina, homogeneizando con el mismo aplicador.

24 2.- Se pasa la suspensin a travs de la gasa colocada en el embudo y recibiendo el contenido en el tubo cnico. 3.- Se centrifuga durante un minuto a 2,000 r.p.m. 4.- Se decanta el sobrenadante y se resuspende el sedimento con solucin salina, centrifugando, decantando y resuspendiendo las veces que sean necesarias, hasta que el sobrenadante sea claro. 5.- Al ltimo sedimento se le agregan 10 ml de formaldehdo, se mezcla y se deja reposar 10 minutos. 6.- Se aaden 5 ml de ter, se tapan los tubos con tapones de caucho y se agitan enrgicamente durante 30 segundos. 7.- Se centrifuga durante 2 minutos a 1,500 rpm. 8.- Despus de centrifugar, se observan 4 capas: 1a.- De ter. 2a.- Tapn de restos fecales. 3a.- Formaldehdo. 4a.- Sedimento en el fondo del tubo conteniendo los elementos parasitarios. 9.- Se introduce la pipeta Pasteur a travs de las capas 1a., 2a. y 3a., hasta llegar al sedimento, se extrae una gota del mismo y se coloca sobre un portaobjetos. 10- Se le aade una gota del lugol parasitolgico y con uno de los ngulos del cubreobjetos se homogeneiza, colocando este mismo sobre el portaobjetos. 11- Se observa la preparacin en el microscopio con objetivos de 10X y 40X.

PRECAUCIONES.- El rea de trabajo debe estar libre de mecheros encendidos, pues el ter es inflamable. Al mezclar y agitar la suspensin, despus de agregar el ter, el tubo debe de taparse lentamente, para evitar que el contenido salga bruscamente hacia el exterior. Procurar mantener limpia la zona de trabajo para evitar posibles infecciones con la materia fecal.

25 (6) METODO DE SEDIMENTACION EMPLEANDO COPAS Antecedentes.- El procedimiento de decantacin en copas es una tcnica farmacutica conocida desde hace muchos aos en el cul se utiliza un procedimiento fsico para la separacin de las mezclas. Utilidad.- El fundamento de la sedimentacin y decantacin subsiguiente, se ha utilizado como mtodo de diagnstico para aquellas muestras de heces fecales sospechosas de contener huevos de Fasciola Heptica, el mtodo ha demostrado ser bondadoso para otros huevos de helmintos e incluso para quistes de protozoarios. Las ventajas que tiene sobre otros, es que hace una concentracin de volmenes considerablemente grandes de materia fecal. Material a).- Reactivos: - Verde de malaquita. - Detergente. - Agua destilada o agua de la llave. b).- Soluciones: - Solucin de detergente al 5 %. Se pesan 5 g de detergente de cualquier marca y se disuelven en 100 ml de agua de la llave, el detergente que no se alcance a disolver, se sedimenta y decanta, el sobrenadante se deja en el frasco donde se guarda la solucin, pues no interfiere en el proceso. Solucin de verde de malaquita al 1 %. - Verde de malaquita 1 g.

- Agua destilada

100 ml.

Se disuelve el verde de malaquita en los 100 ml de agua y se guarda la solucin en frasco con tapn esmerilado. c).- Vidriera: Copas cnicas de 250 a 500 ml. Pipetas Pasteur. Portaobjetos de 25 x 75 mm. Cubreobjetos de 22 x 40 mm. Embudos de 10 cm de dimetro, de vidrio.

d).- Equipo: - Microscopio compuesto. e).- Otros: - Aplicadores de madera. - Bulbos de caucho. - Gasa cortada en cuadros de 15 cm por lado. Mtodo 1.- En el recipiente donde se llev la muestra al laboratorio, se homogeneiza con agua de la llave y se hace pasar a travs de la gasa previamente en un embudo y recibiendo la suspensin en la copa. 2.- Se colocan 5 ml de colorante y se agita con aplicador. 3.- Se agregan 5 ml de la solucin de detergente y se agita nuevamente. 4.- Se completa el volumen de la copa y se deja reposar durante 15 minutos. 5.- Se decanta el sobrenadante y se agrega ms agua mezclando con el aplicador y se deja reposar 15 minutos. 6.- Se decanta nuevamente el sobrenadante. 7.- Con la pipeta Pasteur con bulbo, se toma del sedimento la muestra que se coloca en un portaobjetos y se pone el cubre objetos. 8.- Se observa con el microscopio, usando objetivos de 10X y cambiando al de 40X, cuando sea necesario. 9.- Se hacen 3 preparaciones de cada sedimento para asegurar la positividad de la muestra. Cuando se tiene suficiente prctica se puede utilizar la lupa del microscopio, sobre todo cuando se buscan huevos de Fasciola heptica. PRECAUCIONES.- Las necesarias cuando se trabaja con material biolgico infectante.

27 (7) " METODO DE CARLES BARTHELEMY " CPS de concentracin por sedimentacin con centrifugacin. Antecedentes.- Justamente con el mtodo de Teleman es una de las tcnicas de sedimentacin ms antiguas, en la actualidad se usa muy poco. Utilidad.- Hace una buena concentracin de quistes huevos y larvas. MATERIAL: a).- Reactivos: Formaldehido Q.P. Cloruro de sodio. cido ctrico cristalizado. Agua destilada. ter etlico.

b).- Soluciones: Solucin salina formolada. (Carles I). Solucin de cloruro de sodio al 0.9... 9 vol. Formaldehdo.......................... 1 vol. Se mezclan ambas soluciones y se guardan en un frasco con tapn esmerilado. La densidad de la solucin debe ser de 1.035. - Solucin ctrica formolada. (Carles II). cido ctrico cristalizado........... 12 g. Formaldehdo............................. 2 ml. Agua destilada.......................... 86 ml. Se disuelve el cido ctrico en el agua y luego se agrega el formaldehdo, se guarda en frasco con tapn esmerilado. Esta solucin deber tener una densidad de 1.046.

28 - Lugol parasitolgico. (ver mtodo directo). c).- Vidriera. Tubos de ensaye de 13 x 100 mm. Portaobjetos de 25 x 75 mm. Cubreobjetos de 22 x 22 mm. Pipeta Pasteur con bulbo.

d).- Equipo: - Microscopio compuesto. - Centrfuga con camisas para tubos de 13 x 100 mm. e).- Otros: Cpsula de porcelana. Tela metlica de malla fina o gasa cortada en cuadros. de 15 cm. de lado. Tapones de caucho. Palillos de dientes o aplicadores de madera.

Mtodo 1.- Suspender 1 a 2 g de materia fecal en 10 ml de " Carles l ", utilizando la cpsula de porcelana para homogeneizar. 2.- Pasar la suspensin a travs de la malla o gasa. 3.- Centrifugar a 1,800 r.p.m. durante 1 minuto. 4.- Decantar y agregar al sedimento " Carles II ", hasta llenar dos tercios del tubo. 5.- Agitar con fuerza y aadir el ter hasta centmetro y medio del borde. 6.- Tapar el tubo con el tapn de caucho y agitar violentamente hasta lograr la homogeneizacin de las sustancias que contiene. 7.- Destapar con cuidado el tubo para evitar la proyeccin de la mezcla y centrifugar durante 30 seg. a 1,800 r.p.m. 8.- Con un palillo de dientes, se rompe el tapn de las heces, grasas y otros restos, agitando ligeramente con el palillo. 9.- Se vuelve a centrifugar durante otros 30 seg. a 1,800 r.p.m. 10- Se rompe nuevamente el tapn superior de restos fecales, desprendindolo de la pared del tubo con cuidado, ayudndose del palillo.

29 11- Se decanta de una sola vez, procurando que quede una pequea cantidad de 2 a 4 gotas lquidas junto al sedimento. 12- Agregar al sedimento una gota de lugol y agitar el tubo ligeramente para homogeneizar. 13- Con la pipeta Pasteur, se toma una gota de la suspensin coloreada del fondo del tubo y se coloca en el portaobjetos, colocando sobre este el cubreobjetos. 14- Se observa en el microscopio con objetivos de 10X y 40X. Precauciones.- Mientras se est trabajando, no deben de existir mecheros encendidos en el laboratorio, porque el ter es inflamable, se debe tener cuidado al destapar los tubos, sobre todo cuando stos hayan sido tapados con caucho, pues se puede proyectar el contenido hacia el exterior. El lugar de trabajo debe ser lavado perfectamente para evitar infecciones.

(8) " METODO DE TELEMANN " Antecedentes.- En 1908 Telemann describe su mtodo el cul es modificado por Rivas en 1928, quien cambi el cido clorhdrico por cido actico. En esta seccin se describir el original. Utilidad.- Se usa para concentracin de huevos, quistes y larvas, sobre todo para aquellas muestras que tienen elevadas concentraciones de grasas neutras y cidos grasos libres. Limitaciones.- No hace buena concentracin de quistes, el ter es muy caro. Material: a).- Reactivos: - ter etlico. - cido clorhdrico concentrado. - Agua destilada. b).- Soluciones Solucin de cido clorhdrico al 15 %. - cido clorhdrico concentrado 40 ml. - Agua destilada.............. 60 ml. c).- Vidriera: - Vaso de precipitado de 50 ml.

- Tubos cnicos de centrfuga de 15 ml. - Pipetas Pasteur. - Portaobjetos de 75 x 25 mm. - Cubreobjetos de 22 x 22 mm. d).- Aparatos: - Microscopio compuesto. - Centrfuga con camisas para tubos de 13 x 100 mm. e).- Otros: - Tapn de caucho. - Gasa o algodn. - Bulbo de goma. - Gradilla. Mtodo 1.- Se coloca un fragmento de heces fecales del tamao de un frijol ( 1 g aproximadamente) en un vaso que contenga 5 a 10 ml de cido clorhdrico al 15 %. 2.- Se homogeneiza con el aplicador. 3.- Se pasa la suspensin por dos capas de gasa previamente humedecida, recibiendo el colado en el tubo de centrfuga cnico de 15 ml. 4.- Se aade ter en cantidades iguales y se coloca un tapn de caucho. 5.- Se agita vigorosamente y se afloja el tapn para disminuir la presin y se destapa. 6.- Se centrifuga a 1,500 r.p.m. durante un minuto. 7.- Se saca de la centrfuga y se observan 4 capas: 1a.- Eter. 2a.- Tapn de restos fecales. 3a.- Capa de cido. 4a.- Sedimento inferior que contiene formas parasitarias. 8.- Se mantiene el tubo horizontal y con un aplicador de madera y con movimientos circulares, se despega el tapn de restos fecales. 9.- Rpidamente, pero con cuidado, se vierten el ter, tapn de restos fecales y la capa de cido, de manera que quede el sedimento en el tubo. 10- Se mantiene el tubo en posicin horizontal, para evitar que los restos de extracto graso y de tapn fecal bajen por las paredes del sedimento. 11- Se introduce un aplicador con hiposo de algodn y se limpian las paredes del tubo. 12- Con el tubo vertical, se toma parte del sedimento con una pipeta Pasteur. 13- Se coloca en un portaobjetos y se pone un cubreobjetos por encima de este. 14- Se examina en el microscopio con objetivo seco dbil 10X y seco fuerte 40X. PRECAUCIONES.- lavar cuidadosamente el rea de trabajo para evitar infecciones. 31 (9) " CPS POR SEDIMENTACION CON AGUA GLICERINADA "

Antecedentes.- Es un mtodo descrito por Faust en 1945, es poco conocido, por haber tenido un xito efmero. Utilidad.- El agua glicerinada disminuye la tensin superficial de mezclas con diferentes soluciones, fenmeno que aqu se utiliza para detectar formas parasitarias y concentrarlas. Limitaciones.- Se lleva mucho tiempo. Material a).- Reactivos: - Glicerina. - Agua de la llave. b).- Soluciones: - Solucin de glicerina. - Glicerina.......... 0.5 ml. - Agua de la llave () 100 ml. Se coloca el agua en un matraz de 125 ml., se pipetean 0.5 ml de glicerina y se vaca en el agua, enjuagando la pipeta en el agua. Se guarda en un frasco con tapn esmerilado. - Solucin isotnica (ver mtodo directo). - Solucin de lugol (ver mtodo directo). c).- Vidriera. - Vasos de precipitado de 250 ml. - Vasos de precipitado o matraz graduado de 250 a 500 ml. - Pipetas Pasteur con bulbo. - Portaobjetos de 25 x 75 mm. - Cubreobjetos de 22 x 22 mm. - Embudo de vidrio de 20 cm de dimetro. d).- Aparatos: - Microscopio compuesto. e).- Otros: - Gasas o algodn. - Abatelenguas. - Bulbo de goma.

Mtodo 1.- Se coloca la muestra de aproximadamente 5 g de materia fecal en un vaso de 250 ml con agua glicerinada hasta la cuarta parte del vaso y se mezcla con un abatelenguas. 2.- Se aade agua glicerinada hasta las tres cuartas partes del vaso. 3.- Se pasa la suspensin por un embudo con dos capas de gasa o de algodn mojados y se recibe en un vaso de precipitados o matraz graduado cnico. 4.- Se deja reposar por una a dos horas y se decanta el sobrenadante. 5.- Se resuspende el sedimento con agua glicerinada hasta casi llenar el matraz, se homogeneiza y se deja reposar de 30 a 45 minutos. 6.- Pasado el tiempo se decanta nuevamente y estos pasos se repiten hasta que el sobrenadante quede limpio. 7.- Se decanta el ltimo lavado y del sedimento se toma con pipeta Pasteur una muestra. 8.- Se coloca en un portaobjetos y si est muy espesa, se puede diluir con solucin salina isotnica. 9.- Se coloca el cubreobjetos y se observa con el microscopio con objetivos de 10X y 40X. Nota.- Las muestras se pueden repetir cuantas veces se desee, tomando de las capas superior, media e inferior del sedimento. Cuando se utilicen matraces de 500 ml para realizar la sedimentacin, se puede duplicar o triplicar la muestra. Precauciones.- Se debe limpiar perfectamente el rea de trabajo para evitar infecciones. (10) EXAMEN CPS DE CONCENTRACION POR SEDIMENTACION DE MUESTRAS PRESERVADAS CON MIF (MIFC) Antecedentes.- Esta tcnica fue descrita por Biaggy cols.,en 1955, es una tcnica semejante a la de formol ter, pero en este caso no se est utilizando el formol porque se va a trabajar con una muestra previamente conservada. Utilidad.- Esta tcnica permite hacer una buena concentracin de huevos, quistes y larvas, personas muy experimentadas en el manejo de esta tcnica han descrito tambin la concentracin de trofozotos, aunque algunos otros investigadores sealan que stos se pueden destruir con el ter a pesar de que hayan sido previamente fijados y conservados con el MIF. Limitaciones.- Alto costo de los reactivos. Material

a).- Reactivos: - ter etlico. - Merthiolate. - Yodo. - Yoduro de potasio. - Formaldehdo. - Glicerina. - Agua destilada. b).- Soluciones: - Solucin de MIF. c).- Vidriera. - Tubos cnicos de centrfuga de 15 ml. - Pipetas Pasteur. - Portaobjetos de 25 x 75 mm. - Cubreobjetos de 22 x 22 mm. d).- Equipo: - Microscopio compuesto. - Centrfuga con camisa para tubos de 15 ml. e).- Otros.- Tapn de caucho. - Aplicadores de madera. - Algodn y gasa cortados en cuadros de 15 cm por lado. - Gradilla. Mtodo 1.- Mezclar la muestra fecal con la solucin de MIF y pasarla a travs de gasa humedecida en MIF a un tubo cnico de centrfuga, si no es suficiente la muestra se aade ms preservador hasta aproximadamente 10 ml y se agita para homogeneizar. 2.- Se agregan 5 ml de ter, se tapa el tubo con el tapn de caucho y se agita con cuidado pero vigorosamente, durante un minuto. 3.- Despus de agitar, se retira el tapn con cuidado y se centrifuga a 1,500 r.p.m. durante un minuto. 4.- Despus de centrifugar, se forman 4 capas: 1a.- Eter. 2a.- Restos fecales. 3a.- Solucin MIF. 4a.- Sedimento con las formas parasitarias. 5.- Se desprende el tapn superficial y se decantan las tres capas superiores, dejando el sedimento.

6.- Con un algodn en un aplicador de madera, se limpian las paredes del tubo. 7.- Con una pipeta Pasteur se toma la muestra de la parte superior del sedimento, se coloca en un portaobjetos y se cubre. 8.- Se examina en el microscopio con objetivos de seco dbil y seco fuerte. " EXAMENES COPROPARASITOSCOPICOS CUANTITATIVOS " Estas tcnicas son utilizadas para hacer una evaluacin de la intensidad de ciertos helmintos como: Ascaris lumbricoides, uncinariasis, estrongiloidosis. (11) " EXAMEN CUANTITATIVO DE SCOTT " Antecedentes.- Esta tcnica fue ideada y desarrollada por Scott, para cuantificar los huevos de uncinarias, es un mtodo bastante antiguo, fue publicado en 1923, dadas las caractersticas del mtodo, es uno de los ms exitosos en encuestas epidemiolgicas no solo en uncinariasis, sino en muchas helmintiasis. Utilidad.- No obstante que fue diseada para infecciones por uncinarias, las bondades de ste mtodo lo han hecho popular y til en todo tipo de helmintiasis que se requiere hacer una evaluacin de la intensidad. Su fundamento es bsicamente aritmtico, los mtodos son muy simples tomando en consideracin las diluciones empleadas. Limitaciones.- Por el hecho de hacer una dilucin de un pequeo volumen de materia fecal en un volumen relativamente grande de una solucin de hidrxido de sodio, las posibilidades de evaluar con xito las helmintiasis moderadas, estn sumamente disminuidas. Se utilizan adems volmenes de material fecal ms pequeos de los que se utilizan en el examen directo. Por el hecho de no utilizar tincin temporal, se dificulta observar los quistes. Material a).- Reactivos: - Hidrxido de sodio Q.P. - Agua destilada. b).- Soluciones: - Solucin 0.1\ N de Hidrxido de sodio. - Hidrxido de sodio 4 g. - Agua destilada c.b.p....... 100 ml. En un matraz volumtrico de un litro, se coloca el hidrxido de sodio, inmediatamente despus de pesado, se agregan unos 100 a 200 ml de agua destilada y se disuelve perfectamente. Se afora el matraz a la marca. Se guarda la

solucin en un frasco con tapn de caucho. no se debe usar frasco con tapn esmerilado. c).- Vidriera: - Probeta graduada de 100 con tapn esmerilado. - Pipeta de 1 a 2 ml graduada en centsimas. - Portaobjetos de 38 x 75 mm. - Cubreobjetos de 22 x 40 mm. - varillas de vidrio de 20 cm de longitud. d).- Equipo: - Microscopio compuesto. Mtodo 1.- En la probeta se ponen 56 ml de la solucin de hidrxido de sodio. 2.- Se aade la materia fecal hasta el nivel de 60 ml, ayudando se para esto con la varilla de vidrio. 3.- Se aaden 15 a 20 perlas de vidrio y se tapa la probeta. 4.- Colocamos uno de los dedos sobre el tapn esmerilado y tomando firmemente la probeta con el resto de la mano, se agita vigorosamente durante un minuto hasta formar una suspensin homognea. 5.- En cuanto cesa la agitacin, los restos fecales y huevos comienzan a irse hacia el fondo; Se toma inmediatamente la pipeta Pasteur y se va introduciendo hasta la parte media de la suspensin. 6.- Se toman 0.075 a 0.15 ml, que se colocan sobre el portaobjetos y se cubre. 7.- Se observa la preparacin al microscopio con objetivos de 10X y 40X. 8.- Se observan absolutamente todos los campos de la preparacin, contando los huevos encontrados. Para esto se sigue siempre una rutina que puede ser de arriba hacia abajo o de un lado para otro. Forma de reportar: El nmero de huevos o larvas contados en todos los campos de la preparacin, se multiplican por los siguientes factores, segn se hayan tomado 0.075 o 0.15 mas de la suspensin y tambin tomando en consideracin la consistencia de la muestra de la materia fecal. HECES Duras Pastosas Lquidas Duras Pastosas Lquidas CENTECIMAS 0.075 0.075 0.075 0.150 0.150 0.150 FACTOR. 50. 100. 200. 100. 200. 400.

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El resultado se expresa en huevos o larvas por mililitro de heces, por ejemplo: Si la materia fecal es pastosa y se encontraron en todos los campos 4 huevos de uncinarias: 4 X 200 = 800 ( 200 es el factor de las heces pastosas con 0.150 centsimas). Precauciones.- Se recomienda dada la dilucin de la muestra, tomar de preferencia 0.150 de la suspensin y verificar que sean exactamente pipeteados, para no alterar el factor de dilucin. Se debe llevar con cuidado la punta de la pipeta hasta el centro y parte media de la suspensin de la probeta ya que esto hace que disminuya el error debido a la sedimentacin rpida de los huevos. Para evitar infecciones y contaminacin en el laboratorio se recomienda limpieza minuciosa de la zona de trabajo.

(12) METODO CPS CUANTITATIVO DE FERREIRA . Es un mtodo de concentracin de una suspensin de materia fecal 1:10, que tiene la caracterstica, adems, de ser cuantitativo. Antecedentes.- Biagy y cols. Describieron en 1959, ste mtodo en Mxico, el cul fue ideado y puesto en prctica por Ferreira y Abreu, basados probablemente en el mtodo de Faust. Utilidad.- Rene las caractersticas de un CPS de concentracin y de un cuantitativo, sirve para recuento de huevos y larvas y hace una muy buena concentracin de quistes. Limitaciones.- El equipo y material que se utiliza no se puede conseguir fcilmente en el comercio. Por otro lado, el uso del factor por el que se multiplica para obtener la cuenta final de huevos o larvas por gramo de heces, no ha sido aclarado en la descripcin de la tcnica. Material a).- Reactivos: - Sulfato de zinc Q.P. se puede usar el industrial, siempre que se eliminen las sales insolubles por filtracin y adicin de una gotas de cido sulfrico. - Formaldehdo.

- Agua de la llave. b).- Soluciones: - Solucin de sulfato de zinc con densidad de 1.92. grados baum. - Sulfato de zinc 400 a 450 g. - Agua de la llave 1000 ml. Se solubiliza el sulfato en el agua, se toma la densidad, si falta para el 1.192 se le agrega sulfato, si se pasa, se le agrega agua, a fin de lograr la densidad. - Solucin de formaldehdo al 10 %. - Formaldehdo 10 ml. - Agua de la llave c.b.p. 100 ml. En una probeta de 100 ml se coloca el formaldehdo y se completa a 100 ml con agua de la llave. - Lugol parasitolgico (ver mtodo directo). c).- Vidriera: - Recipiente de vidrio de boca ancha, de 50 a 100 ml. - Tubos de 25 x 100 mm. - Portaobjetos de 25 x 75 mm. - Cubreobjetos de 22 x 40 mm. - Probetas graduadas de 100 ml. d).- Equipo: - Balanza gramataria. - Centrfuga con camisas para tubos de 25 x 100 mm. - Microscopio compuesto. e).- Otros: - Gradilla para tubos de 25 x 100 mm. - Tela de alambre o gasa cortada en cuadros de 15 cm por lado. - Abatelenguas. - Campana. Mtodo 1.- Se pesa un frasco de boca ancha con un abatelenguas.

2.- Se pone materia fecal ayudndose con el abatelenguas, hasta que sean 4 g (peso del frasco con el abatelenguas ms 4 g de materia fecal). 3.- Se miden 36 ml de solucin de formaldehdo y se vacan en el frasco. 4.- Se homogeneiza la materia fecal con la solucin de formol hasta que quede una suspensin. 5.- Se pasa la mezcla por malla o gasa previamente colocada en un embudo y se recibe la suspensin en un tubo colocado en una gradilla. 6.- Se centrifuga durante un minuto a 2,000 r.p.m.. 7.- Se decanta el sobrenadante, se suspende el sedimento con agua y se vuelve a centrifugar bajo las mismas condiciones anteriores. 8.- Se decanta nuevamente el sobrenadante y se agregan 2 a 3 ml. de la solucin de sulfato de zinc, se mezcla hasta hacer una nueva suspensin. 9.- Se introduce la campana de Ferreira, dando un pequeo giro. 10- Se llena el tubo con ms solucin, procurando que tanto el menisco interno de la campana, como el externo, vayan subiendo paralelamente. 11- Se centrifuga a 2,000 r.p.m. durante un minuto. 12- Se saca el tubo de la centrfuga y con el pulgar y el ndice se comprime fuertemente el trocito de manguera de caucho del extremo anterior de la campana y de un golpe se saca sta del tubo. 13.- Se invierte la campana sobre el portaobjetos y se homogeneiza la suspensin con el ngulo de un cubreobjetos y se coloca sobre el portaobjetos. examina la preparacin con el microscopio a seco dbil y seco fuerte (10X y 40X respectivamente) si es necesario Caractersticas morfolgicas de huevos de algunos parsitos Los huevos de Ascaris lumbricoides miden en promedio 70 micras de largo por 50 de ancho; poseen una membrana externa gruesa, de color caf o dorado con tincin de lugol.

Los huevos de Enterobius vermicularis embrionados, en estado infectante son ovoideos, aplanados ventralmente y convexos su dorso, miden de 50 a 60

micras de longitud por 20 a 30 de dimetro, tienen una envoltura hialina albuminosa gruesa transparente y una cpsula formada por dos capas de quitina.

Los huevos Trichuris trichiura tienen aspecto de barril, de baln de ftbol americano o de bolillo o virote, miden en promedio 52 micras de largo por 22 de ancho, poseen una envoltura gruesa, de tres capas

Los huevos de Taenia solium son esfricos, miden de 31 a 43 micras de dimetro, de color caf, tienen una cpsula gruesa que contiene un embrin desarrollado, u oncsfera, que generalmente contiene 3 pares de ganchos.

CUESTIONARIO 1.- Mencione la clasificacin de los exmenes coproparasitoscpicos. 2.- Describa el mtodo cualitativo de FAUST. 3.- Describa el mtodo cualitativo de RITCHIE. 4.- Describa el mtodo cuantitativo de SCOTT. 5.- Describa el mtodo cuantitativo de FERREIRA. 6.- Describa la tcnica de tincin con lugol para observar al microscopio las formas parasitarias. 7.- Describa las la morfologa de los huevos de Ascaris Lumbricoides. 8.- Describa la morfologa de los huevos de Trichuris trichura. 9.- Describa la morfologa de los huevos de Enterobius vermicularis 10.- Describa ala morfologa de los huevos de Taenia solium.

CULTIVO DE ENTEROBACTERIAS EN MEDIOS SELECTIVOS Prctica 18

OBJETIVOS 1.- El alumno conocer los gneros y especies de la familia de las enterobacterias. 2.- El alumno conocer la importancia de la identificacin de las enterobacterias. 3.- El alumno conocer las caractersticas morfolgicas de los gneros y especies de enterobacterias que con mayor frecuencia producen infecciones intestinales. 4.- El alumno conocer los medios de cultivo selectivos para el aislamiento primario de enterobacterias.

5.- El alumno aplicar la tcnica para el aislamiento primario de enterobacterias. 6.- El alumno aplicar la tcnica de tincin de Gram. 7.- El alumno identificar las caractersticas morfolgicas y de tincin de las enterobacterias. 8.- El alumno conocer las caractersticas colonias de E. Coli en el medio de cultivo agar EMB. 9.- El alumno conocer las caractersticas coloniales de los gneros Proteus y Pseudomona en el medio de cultivo agar Mc Conkey. 10.- El alumno conocer las caractersticas coloniales de los gneros Salmonella y Shigella en el medio de cultivo agar Mc Conkey. Introduccin El tubo digestivo del recin nacido es completamente estril, sin embargo, la ingesta de alimentos lleva consigo la introduccin de flora bacteriana que utiliza estos alimentos para su metabolismo. En el intestino de nios alimentados al seno materno y hasta antes de la ablactacin se encuentran Streptococcus y Lactobacilos (Bifidobacterium), estos microorganismos Gram positivos producen cidos al metabolizar carbohidratos, como glucosa y lactosa principalmente, con lo que colaboran para mantener el pH apropiado del tubo digestivo. La lactancia artificial y la introduccin de sondas e instrumental mdico o quirrgico favorece la colonizacin de flora que permanecer como residente habitual del tubo digestivo. Algunas bacterias que forman parte de la flora normal son bacilos Gram negativos aerobios o anaerobios como los miembros de los gneros Bacteroides (B. Fragilis), Fusobacterium (F. nucleatum); Otros microorganismos son bacilos Gram positivos anaerobios como Clostridium perfringes. La gran mayora de microorganismos residentes habituales del tubo digestivo pertenecen a la familia de enterobacterias e incluyen algunas especies de los gneros Citrobacter, Enterobacter y Klebsiellas no patgenas. En el intestino de los adultos se aslan un gran nmero de microorganismos Gram negativos anaerobios o aerobios facultativos de la familia enterobacteriaceae (enterobactericeas) formada por un grupo heterogneo de bastoncillos Gram negativos en la que se han incluido a mas de 20 gneros y 100 especies, entre la que se encuentran, los gneros Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia y Proteus. Algunas de estas especies forman parte de la flora normal del tubo digestivo y producen

enfermedades de manera incidental, otros sin embargo, son patgenos de manera regular para el hombre ejemplo: Proteus, Salmonellas, Shigellas, etc. La gastroenteritis aguda o diarrea infecciosa de origen bacteriano en Mxico por dcadas ha sido un gran problema de salud y junto con las diarreas de origen viral y parasitarias han ocupado el segundo lugar de morbimortalidad general. En el ao 2003 ocuparon el segundo lugar de morbilidad general con 4,881,368 casos nuevos y 9,585 defunciones en este ao, siendo los lactantes menores el grupo etario mas afectado.

45 Los microorganismos bacterianos que con mayor frecuente se aslan de las heces fecales de enfermos con diarrea aguda pertenecen a los gneros Shigella y Salmonella invasoras de la mucosa intestinal. Entre las bacterias productoras de enterotoxinas se encuentran Escherichia coli, Klebsiellas, Proteus y Pseudomona. Las Enterobactericeas comparten algunas caractersticas morfolgicas y fisicoqumicas base de su clasificacin. Son bacilos Gram negativos, anaerobios o aerobios facultativos, fermentan gran cantidad de carbohidratos, poseen estructuras antignicas complejas, producen toxinas y otros factores de virulencia. La familia de Enterobactericeas se caracteriza adems, desde el punto de vista bioqumico por la capacidad de algunos de sus miembros de reducir nitratos a nitritos, de fermentar glucosa con produccin de cido o gas, o ambos y son negativos a la oxidasa. Para la identificacin preliminar de los gneros de esta gran familia, se recurre a la observacin de las caractersticas morfolgicas de sus colonias en medios selectivos y de su morfologa celular por microscopa con tincin de Gram, para la identificacin definitiva de gnero y especie se recurre a mltiples pruebas bioqumicas, la identificacin de antgenos por serologa y a estudios de homologa del ADN. GENERO SALOMONELLA A la tincin de Gram, las Salmonellas tienen forma de bacilos rectos de 0.7 a 1.5 micras de dimetro por 2 a 5 de largo, son Gram negativos, mviles por tener flagelos pertricos, anaerobios facultativos. Clasificacin Las Salmonellas hasta 1983, se encontraban agrupadas en un solo gnero con 3 especies: Salmonella typhi (1 serotipo)

Salmonella choleraesuis (1 serotipo) Salmonella enteritidis (ms de 1500 serotipos. Posteriormente a este gnero se asign el nombre de Salmonella Arizona (gnero), que incluye a una sola especie con seis subespecies, clasificadas en el estudio de ADN. Sin embargo, los reportes de laboratorio, tipifican a las subespecies en serogrupos e indistintamente, se designan con el nombre del gnero y utilizando el nombre de la especie, adicionando o no el serogrupo, lo que indica que esta clasificacin no fue del todo aceptada.

46 De acuerdo a la adaptacin y preferencia de las Salmonellas, a las especies de animales que le sirven de husped existe la clasificacin ecolgica: GRUPO A: Serotipos adaptados perfectamente al hombre. Salmonella typhi, parathyphi B, hirschfeldi y sendai. No tienen reservorio zoontico, la infeccin de los animales es raro y accidental, el hombre es el nico reservorio, la fuente de infeccin son las heces de personas infectadas. La transmisin de hombre a hombre es decisiva. A causa de su importancia clnica, deben identificarse tres especies, S. Typhi, S.choleraesius y S. Paratyphi A. GRUPO B: Serotipos muy adaptados a huspedes no humanos. Salmonella pollorum, dublin, abortus, ovis, typhisis, gallinarum, abortusequi, y cholerae suis. Infectan a pollos, gallinas, reses, caballos, carneros y cerdos. S. dublin y S. cholerae suis espordicamente causan infeccin en el hombre. GRUPO C: Serotipos no adaptados a huspedes especficos. Ms de 1700 serotipos, comparten: produccin de gastroenteritis de corta duracin, periodo de incubacin corto, raramente invaden la sangre, fuente de infeccin al hombre son las heces de animales, del hombre y de productos alimenticios (huevos, carne, leche y otros productos lcteos de animales infectados. Fuente de infeccin y reservorios Agua contaminada con excremento, leche y otros productos lcteos, contaminacin con excremento, pasteurizacin insuficiente o manipulacin de alimentos inapropiada, mariscos provenientes de aguas contaminadas, huevos desecados o congelados de aves de corral infectadas o contaminadas durante su procesamiento, carnes y sus derivados, animales infectados o contaminados por excremento de roedores o seres humanos, mascotas del hogar, tortugas, perros, gatos, etc Las Salmonellas son capaces de producir enfermedades como:

Gastroenteritis aguda.- Despus de 8 a 48 horas de la ingestin se presentan nauseas, cefalea, vmito, fiebre, diarrea profusa con moco, tenesmo. Los sntomas suelen desaparecer de dos a tres das o pueden complicarse con un estado tifoso. Los hemocultivos son negativos, los coprocultivos generalmente son positivos para las Salmonellas y pueden observarse positivos an, varias semanas despus de la recuperacin clnica.

47 Fiebre Tifoidea.- Las Salmonellas ingeridas llegan al intestino delgado, pasan a los vasos linfticos y a la sangre, se diseminan ocasionando septicemias mortales, se multiplican en el tejido linfoide intestinal y se excretan por las heces fecales. Los sntomas son malestar general, cefalalgia, fiebre de predominio vespertino mayor a 39 C, diaforesis profusa, tenesmo, estreimiento, bradicardia, mialgias y hepatoesplenomegalia. Es frecuente hallar manifestaciones clnicas de faringitis, manchas de color rub en la piel del abdomen y trax conocidas como rosola tifoideica. El ataque al sistema nervioso central con cefalea, vmito, confusin, delirio y convulsiones indican meningoencefalitis de mal pronstico. Patologa Las Salmonellas Invaden el epitelio de la mucosa intestinal multiplicndose en el leon y colon. En la lmina propia del epitelio con microvellosidades se encuentran leucocitos polimorfonucleares, neutrfilos y macrfagos que fagocitan y lisan Salmonellas, sin embargo, algunas de ellas logran invadir algunas clulas del tejido linftico de las placas de Peyer y multiplicarse. GNERO SHIGELLA (bacilo de Shiga) Las Shigellas son bastoncillos Gram negativos delgados en promedio de 2 micras de longitud por 0.5 micras de dimetro, Inmviles, anaerobios facultativos, fermentan glucosa, forman cido a partir de los carbohidratos, rara vez produce gas. Clasificacin La clasificacin de las Shigellas se basa en sus caractersticas bioqumicas y antignicas, los antgenos O somticos de las Shigellas son la base de su tipificacin serolgica, existen mas de 40 serotipos y 4 especies patgenas para el hombre: Shigella dysenteriae, Shigella.flexneri, Shigella.boydii y Shigella.sonnei.

Patologa La dosis infectante es menor a 1000 bacterias. Shigellas invade las clulas epiteliales de la mucosa intestinal, por fagocitosis inducida, las bacterias son llevadas al interior de las clulas en una vacuola fagoctica, por lo que no hay muerte celular ni bacteriana, la multiplicacin bacteriana se lleva a cabo en el citoplasma de la clula epitelial y pasan a las clulas adyacentes. 48 Las Shigellas producen microabscesos en la pared del leon terminal y del colon causando finalmente necrosis de la mucosa, ulceracin superficial, hemorragia y formacin de pseudomembranas sobre el rea ulcerada. La pseudomembrana esta formada de fibrina, leucocitos y deshechos celulares, mucosa necrtica y bacterias. Conforme sede el proceso, las lceras se llenan de tejido de granulacin y se produce en ellas tejido cicatrizal. Toxinas Endotoxina.- Las Shigellas liberan por autolisis un lipopolisacrido txico para las clulas del epitelio de absorcin contribuyendo as a la necrosis de la pared intestinal. Exotoxina de Shigella dysenteriae tipo 1 produce una exotoxina termolbil que afecta tanto al intestino como al sistema nervioso central, es de tipo proteico y produce diarrea actuando de manera similar a la verotoxina termolbil de E. coli. La exotoxina inhibe la absorcin de azcares y aminocidos en el intestino delgado y produce enterocolitis hemorrgica (Disentera bacilar). La neurotoxina puede contribuir a las reacciones del sistema nervioso y a la gravedad extrema y mortal de las infecciones por Shigella dysenteriae.

ESCHERICHIA COLI Las especies de este gnero se caracterizan por ser bacilos Gram negativos de 1 a 2 micras de longitud, por 0.05 micras de ancho, No capsulados, No esporulados, aerobio y anaerobios facultativos y mviles por flagelos pertricos. Escherichia coli agrupa a especies que se subclasifican en serotipos, existen muchas variedades patgenas y cada una de las cuales presenta un mecanismo diferente de produccin de la enfermedad. Las ms especies mas importantes desde el punto de vista clnico son

Escherichia coli enterotoxgena (ECET), que representa una causa importante de diarrea del viajero: Escherichia coli enteropatgena o enteroadherente (ECEP), una causa de diarrea en la infancia, Escherichia coli enteroinvasora (ECEI), que causa disentera bacilar y Escherichia coli enterohemorrgica (ECEH) que produce colitis hemorrgica y se ha asociado en sndrome hemoltico urmico(SHU) en los nios. 49 Escherichia coli enterotoxgena es una causa importante de gastroenteritis bacteriana. La diarrea del viajero afecta a personas que residen en pases industrializados y que visitan regiones tropicales o subtropicales sin condiciones higinicas adecuadas. Escherichia coli enterotoxgena ECET se adquiere por va fecal oral por el consumo de agua no embotellada o de verduras no cocinadas. El inculo debe ser lo suficientemente intenso para resistir su destruccin por el cido del estomago las manifestaciones clnicas principales son consecuencia del abundante escape de lquido a travs del aparato gastrointestinal, secundario a la accin de los dos tipos de enterotoxina sobre la mucosa gastrointestinal. La toxina termolbil activa la adenil ciclasa con el consiguiente incremento en los niveles intracelulares de adenocin monofosfato cclico que inhibe a la bomba de sodio, bloqueando la difusin facilitada de glucosa al interior del epitelio de absorcin con prdida de sodio, potasio, cloro agua y bicarbonato del lquido intracelular, intersticial e intravascular. La toxina termoestable activa a la guanilato ciclasa con la consecuente elevacin de los niveles intracelulares de guanosina monofosfato cclico. Los elevados niveles de monofosfato cclico estimulan la secrecin de cloruro e inhiben la absorcin de cloruro sdico. Escherichia coli enteropatgena o enteroadherente.- Las cepas de ECEP se unen a las clulas de la mucosa intestinal produciendo prdida de las microvellosidades de absorcin. ECEP ocasionalmente es capaz de penetrar en las clulas de absorcin produciendo generalmente diarrea de corta duracin. Escherichia coli enteroinvasora ECEI, invaden las clulas husped y producen una respuesta inflamatoria significativa. Las manifestaciones son ms de una disentera bacteriana con fiebre sanguinolenta en cuyas heces hay leucocitos polimorfonucleares. El tratamiento consiste en reposicin hdrica y electroltica debido a que estos microorganismos suelen ser resistentes a los antibiticos, la utilidad del tratamiento especifico es limitada. Escherichia coli enterohemorrgica ECEH produce verotoxina, toxina que recibe

este nombre por el efecto txico en las clulas vero, lnea de clulas de rin de mono verde africano, esta toxina produce en el hombre un tipo de diarrea grave con enterocolitis hemorrgica, con anemia hemoltica microangioptica, trombocitopenia, sndrome urmico hemorrgico, insuficiencia renal y muerte.

50 PROTEUS Son bacilos Gram negativos de 0.4-0.8 micras de dimetro por 2 a 8 micras de longitud, mviles por flagelos pertricos, forman anillos concntricos a partir del sitio de inoculacin en los medios de cultivo, no fermentan lactosa, producen cido y gas a partir del metabolismo de la glucosa. Clasificacin El gnero Proteus agrupa cuatro especies: Proteus vulgaris, morfolgicamente presenta las caractersticas correspondientes al gnero, algunas cepas son hemolticas en agar sangre, es causa frecuente de diarreas, infecciones nosocomiales, neumona, septicemia y muerte en desnutridos y enfermos inmunocomprometidos. Proteus mirabilis son hemolticas en agar sangre con mayor frecuencia que P. vulgaris, causan infecciones urinarias y clculos renales, generalmente son susceptibles a cefalosporinas, aminoglucsidos y penicilinas Proteus myxofaciens bacteria productora de polisacridos extracelulares a 25oC en caldo Soya tripticasa, es hemoltica en agar sangre. Afecta a desnutridos y enfermos inmunocomprometidos. Proteus pennen: bacteria frecuentemente resistente a cloranfenicol y que se ha aislado ocasionalmente. Estructura antignica El gnero Proteus presenta antgenos somticos, se reconocen 17 para P. Vulgaris, 27 para P mirabilis y otros 5 compartidos por ambas especies, los antgenos flagelares (h) son 19, la reaccin cruzada entre estas bacterias es frecuente por lo que la prueba de antgenos flagelares en la tipificacin es limitada. El antgeno capsular (k) designado como antgeno C ha lo comparten P. vulgaris y P. Mirabilis. Las Ricketsias tienen componentes antignicos idnticos a los del gnero Proteus (antgenos OX-19, OX-2, OX-K), esta relacin se utiliza para el

diagnstico del tifo, enfermedad causada por Ricketsias, en la prueba de WeilFlix.

51 Proteus ha si considerado como una bacteria oportunista a la que se le ha mencionado como factor de patogenicidad a su capacidad de modificar el pH como consecuencia de la hidrlisis de la urea y produccin de amonio. Patologa Un 25 % de las personas son portadores asintomtico. Como oportunista se encuentra en pacientes sometidos a cateterizacin, ciruga, instrumentacin urolgica, heridas y quemaduras. Puede ocurrir una autoinfeccin y septicemia. En los procesos infecciosos esta involucrado en infecciones de vas urinarias, heridas, tracto respiratorio, ojos, odos, gastroenteritis por consumo de alimentos contaminados, puede infectar el cordn umbilical conduciendo a bacteriemia y meningitis.

MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS PARA EL AISLAMIENTO PRIMARIO DE ENTEROBACTERIAS EMB, MC CONKEY SS. EMB Medio de cultivo slido en placas de color caf oscuro a color vino. El colorante Azul de metileno del medio de cultivo inhibe moderadamente el crecimiento de bacterias Gram positivas. Mtodo de siembra por estra cruzada. Frmula en Gramos por Litro de Agua Destilada Peptona (Gelysate B-B-L) 10.0 Sacarosa 5.0 Agar13.5 Eosina Y.. 0.4 Azul de metileno.0.065 Lactosa....... 5.0 Fosfato Dipotsico. 2.0 pH final 7.2 +

Morfologa Las colonias de los gneros Salmonella y Shigella forman colonias de 1 a 2 milmetros de dimetro aproximadamente, convexas de color mbar. Mientras que las colonias de E.coli son planas de color azul obscuro con brillo metlico. Otros microorganismos entricos forman colonias mucoides convexas de color caf. AGAR MAC CONKEY Medio slido en placa de color rojo a naranja. Contiene sales biliares que inhibe el crecimiento de un gran nmero de Gram positivos. Se siembra con tcnica de aislamiento. Frmula en gramos por litro de Agua Destilada Gelysate 17.0 Polypeptone .. 3.0 Lactosa 10.0 Mezcla de Sales Biliares . 1.5 Cloruro de Sodio 5.0 Agar . 13.5 Rojo Neutro . 0.03 Violeta Cristal 0.001 pH final 7.1 * El Agar de Mac Conkey se puede emplear para la investigacin de lo patgenos entricos en heces y otros materiales, recomendndose hacer siembras paralelas en unos de los medios modernos y ms definidos como el Agar con Desoxicolato AGAR SS El Agar para Salmonella y Shigellas es un medio slido de color rojo en placas selectivo para el aislamiento de bacilos entricos patgenos, especialmente los que pertenecen a los gneros Shigella y Salmonella. El medio es en realidad una modificacin del Agar con Desoxicolato y Citrato descrito por Leifson, excepto que la inhibicin de los organismos coniformes y Gram positivos se logra mejor con la mezcla de sales biliares. Se siembra con tcnica de aislamiento. Frmula en Gramos por Litro de Agua Destilada Extracto de carne de res 5.0 Polypeptone.......................... 5.0 Lactosa....................................... 10.0 Mezcla de sales biliares.......... 8.5 Citrato de sodio... 8.5 Tiosulfato de sodio... 8.5 Citrato frrico....... 1.0 Agar..... 13.5 Verde brillante... 0.00033 Rojo neutro 0.025 pH final 7.0 +Incbese durante 18-24 horas

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Usos. El agar para Salmonella y Shigella puede inocularse con heces fecales, torundas rectales, orina u otros materiales que se sospeche contengan bacilos entricos. Se recomienda inocular al mismo tiempo una placa de un medio con sales biliares puras, con menor poder inhibitorio, tal como el Agar con Desoxicolato Selenito F. Las colonias de especies que no fermentan la lactosa son incoloras, en tanto que las de coniformes u otros organismos que s la fermentan son rosadas o rojas.

SIMMONS, AGAR CITRATADO DE El Agar Citratado de Simmons.- Es un medio slido de color verde, en placas o en tubos con pico de flauta, se usa para diferenciar las bacterias entricas Gram negativas, basndose en la utilizacin de citrato. Tcnica de siembra por estra cruzada en placas y por estra superficial en el pico de flauta y picadura en el fondo. Frmula en Gramos por Litro de Agua Destilada Fosfato Monobsico de Amonio ......1.0 Fosfato Dipotsico ......................1.0 Cloruro de Sodio ..............................5.0 Citrato de Sodio ..........................2.0 Sulfato de Magnesio .........................0.2 Agar .........................................15.0 Azul de Bromotimol ........................ 0.03 pH final 6.9 + Slo los organismos que utilizan el citrato como nica fuente de carbono crecen en Agar Citratado de Simmons. La aparicin de un crecimiento visible por el desarrollo de colonias, va acompaado en general de un cambio del color verde del medio cido, al color azul alcalino del indicador azul de Bromocresol.

AGAR SULFITO DE BISMUTO El agar sulfito de bismuto es una modificacin del medio de Wilson y Blair, para el aislamiento Salmonella typhi y otros bacilos entricos ntese la inclusin de glucosa en la frmula. La fermentacin de glucosa produce reduccin del sulfito, con formacin de sulfuro de hierro y colonias negras con brillo metlico El metal pesado bismuto y el verde brillante son inhibidores del desarrollo de todas las bacterias Gram positivas y de la mayora de las Gram negativas, excepto las Salmonellas. Algunas cepas del gnero Shigellas crecen bien. El medio se debe usar el mismo da que se prepara, lo cual limita su empleo general en muchos laboratorios. 54

Frmula en gramos por litro de agua destilada. Extracto de carne........... 5.0 g Glucosa......................... 5.0 g Sulfato ferroso............... 0.3 g Verde brillante............... 0.025 g Agua destilada c.s.p. Peptona....................... 10.0 g Fosfato disdico............ 4.0 g Sulfito de bismuto........... 8.0 g Agar...............................20..0 g. pH final = 7.

La mayora de los coliformes fermentadores de lactosa y las Shigellas son totalmente inhibidos. Las colonias de Salmonella typhi son negras con brillo metlico. La mayora de las cepas de Salmonella enteritidis forman colonias negras y sin brillo. S. gallinarum, S. choleraesuis y S. paratyphi forman colonias verdosas. Material para la prctica. 1 Microscopio 1 Asa bacteriolgica 1 Mechero de Bunsen Portaobjetos Juego de reactivos para tincin de Gram 4 cajas de agar EMB 2 cajas de Agar SS 2 cajas de sulfito de Bismuto 1 caja de agar verde brillante 1 Cepa pura de Salmonella Typhi 1 Cepa pura de Shigella sp 1 Cepa pura de Escherichia coli 1 Cepa pura de Proteus sp Procedimiento 1.- Tomar una asada del medio de cultivo que contiene la cepa pura de Escherichia coli y sembrar con tcnica de aislamiento en una caja de las cajas con Agar EMB. Hacer el mismo procedimiento con las cepas de Salmonella Typhi, Shigella sp y Proteus sp. 2.- Tomar una asada del medio de cultivo que contiene Salmonella Typhi y sembrar con tcnica de aislamiento en una de las cajas que contienen agar SS. Hacer el mismo procedimiento con la cepa de Shigella sp. 55

3.- Tomar una asada del medio de cultivo que contiene Salmonella Typhi y sembrar con tcnica de aislamiento en una de las cajas que contienen agar Sulfito de bismuto. Hacer el mismo procedimiento con la cepa de Shigella sp. 4.- Tomar una asada del medio de cultivo que contiene Salmonella Typhi y sembrar con tcnica de aislamiento en una de las cajas que contienen agar verde brillante. 5.- Incubar a 37 C durante 24 horas y reportar la morfologa colonial. Guardar los medios de cultivo en refrigeracin para pruebas bioqumicas en la siguiente sesin. 6.- Hacer Tinciones de Gram de cada una de las cepas y reportar la morfologa celular.

CUESTIONARIO 1.- Describa las caractersticas morfolgicas coloniales de E. Coli en EMB.

2.- Describa las caractersticas morfolgicas coloniales de Salmonella typhi. en agar SS. 3.- Describa las caractersticas morfolgicas coloniales de Shigellas en agar SS. 4.- Describa las caractersticas morfolgicas coloniales de Salmonella typhi en agar Mc Conkey. 5.- Describa las caractersticas morfolgicas coloniales de Proteus en agar Mc Conkey. IDENTIFICACIN DE ENTEROBACTERIAS POR PRUEBAS BIOQUMICAS Prctica 19

Objetivos 1.- El alumno conocer el fundamento bioqumico de las reacciones positivas en los medios de cultivo slidos TSI, SIM, LIA, MIO, Agar citratado de Simmons. 2.- El alumno conocer el fundamento bioqumico de las reacciones positivas en el medio de cultivo lquido Caldo con urea o en el medio slido Agar con urea de Christensen. 3.- El alumno aplicar las tcnicas de siembra en tubos para los medios de cultivo slidos TSI, SIM, LIA, MIO, Agar citratado de Simmons y agar con urea de Christensen de las colonias aisladas por resiembra, a partir del hemocultivo. 4.- El alumno aplicar la tcnica de siembra en tubos para el medio de cultivo lquido Caldo con urea de las colonias aisladas por resiembra, a partir del hemocultivo. 5.- El alumno interpretar las pruebas positivas y reportar a los gneros y especies bacterianas identificadas como posibles patgenas. Para facilitar la identificacin de estos bacilos entricos patgenos, se dispone de medios de cultivo para pruebas mltiples como, TSI, SIM, MIO, LIA y de otros medios como Agar con urea, etc., que resultan ser diferenciales por algunas reacciones bioqumicas que se producen como resultado del metabolismo bacteriano especfico, no solo de gnero, sino tambin de especie. Las pruebas bioqumicas principales que pueden ser demostrables en estos medios de cultivo son: TSI

Metabolismo o fermentacin de hidratos de carbono como glucosa, sacarosa, lactosa, manitol, etc., La reaccin de fermentacin se evidencia por un cambio de color, de rojo normal del medio de cultivo por la adicin al medio de Rojo de fenol, indicador de pH., al color amarillo que se produce por la acidificacin del medio por accin de los cidos lctico o pirvico. Produccin de sulfuro ferroso se demuestra por el ennegrecimiento del medio de cultivo. En esta reaccin se produce sulfuro ferroso a partir del aminocido cistena o de tiosulfato sdico que contiene el medio de cultivo. En la primera etapa el tiosulfato o la cistena son reducidos con la participacin de las enzimas cistena o tiosulfato disulfhidrasas para formar cido sulfhdrico (H2S) mas amonaco (NH3), en la segunda etapa el cido sulfhdrico (H2S) reacciona con la sal fuerte que contiene el medio de cultivo, citrato de amonio frrico, para formar sulfuro ferroso que produce un precipitado de color negro en el medio. Produccin de Indol, se produce a partir del triptfano que se encuentra en las peptonas del medio de cultivo TSI. El triptfano puede ser oxidado por la accin de enzimas bacterianas, las triptofanasas, que dan origen a tres productos indlicos, Indol, escatol y cido indolactico en reacciones bioqumicas especficas. La desaminacin del triptfano produce Indol que se demuestra adicionando unas cuantas gotas del reactivo de Kovac o de Ehrlich al medio, formndose un anillo de color rojo en la parte superior del medio de cultivo. Movimiento bacteriano conferido por flagelos, cuando el medio SIM es inoculado por puncin cuidadosamente con el asa recta, las cepas mviles crecen lejos del sitio de la inoculacin. La ureasa es una enzima bacteriana capaz de hidrolizar a la urea formando dos molculas de amonaco que finalmente es convertido en carbonato de amonio, estos compuestos derivados de la urea alcalinizan el medio de cultivo que cambia de color de rosa tenue (durazno) a rojo por el indicador de pH rojo de fenol. Medios de cultivo para pruebas bioqumicas TSI Agar con tres azcares y hierro.- TSI es un medio de cultivo slido en tubos inclinados con pico de flauta, el medio es de color rojo por el indicador de pH rojo de fenol, contiene lactosa en la superficie, sacarosa y glucosa en el fondo del tubo. El agar con tres azucares y hierro lo ide Hajna para diferenciar los bacilos entricos Gram negativos por su habilidad para atacar la glucosa, lactosa y sacarosa y liberar sulfuros. Frmula en Gramos por Litro de Agua Destilada

Polypeptone. Cloruro de Sodio Lactosa. Sacarosa.. Glucosa Sulfato de Amonio Ferroso .. Tiosulfato de Sodio Rojo de Fenol. Agar. Preparacin

20.0 5.0 10.0 10.0 1.0 0.2 0.2 0.025 13.0

pH final 7.3 +

Se suspenden los 59.4 gramos del polvo en un litro de agua destilada. Mzclese bien y calintese agitando de vez en cuando. Hirvase durante 1 2 minutos para disolver. Distribyase en tubos de ensayo, llenndolos hasta su tercera parte. Esterilcese a no ms de 118C durante 15 a 17 minutos. Los tubos se deben enfriar en posicin inclinada, de tal manera que produzcan fondos profundos con pico de flauta. Tcnica de siembra. El Agar TSI inclinado se debe inocular a partir de las colonias seleccionadas como EMB, Agar Mc Conkey o de otras fuentes apropiadas. EL cultivo se debe estriar en la porcin inclinada y picar hasta un centmetro antes del fondo. Los cultivos se leen despus de 18 a 48 horas de incubacin a 37 C. Metabolismo de Carbohidratos.- Fundamento.- El metabolismo bacteriano de alguno o de los tres carbohidratos da como resultado la produccin de cido pirvico y cido lctico (fermentacin cida), por lo que medio de cultivo se acidifica, esta acidez se evidencia por un cambio de color del medio de rojo o rosa intenso al color amarillo por la accin del indicador rojo de fenol. Si el medio se conserva alcalino no hay cambio de color, conservndose el medio de cultivo de color rojo. Escherichia coli fermenta los tres azcares por lo que todo el medio de cultivo, tanto el pico de flauta como el fondo, cambiarn al color amarillo. El gnero Salmonella fermenta glucosa pero no lactosa, por lo que el pico de flauta permanece rojo, pero el fondo ser de color amarillo. Produccin de Sulfuro ferroso en TSI Fundamento.- Algunas bacterias son capaces de degradar aminocidos azufrados como cistena y metionina, o de utilizar tiosulfato como sustrato, liberando el azufre de estos compuestos para formar cido sulfhdrico H2S en forma gaseosa gracias a la accin de enzimas bacterianas como la cistena

disulfhidrasa y tiosulfato reductasa, este medio contiene Sulfato de Amonio Ferroso y Tiosulfato de sodio, este ltimo es el primer sustrato que utiliza la enzima tiosulfato reductasa bacteriana para formar cido sulfhdrico incoloro el cual reacciona posteriormente con el Sulfato de Amonio Ferroso para formar sulfuro ferroso que forma un precipitado negro en el medio. Las especies del gnero Proteus y Salmonella producen sulfuro ferroso que se evidencia por un precipitado de color negro en el medio. E. Coli y Shigellas son negativas. SIM Azufre Indol y movimiento.- Medio de cultivo slido en tubos de color ligeramente mbar transparente. Se emplea para la determinacin de la produccin de sulfuro ferroso, formacin de Indol y movimiento de enterobacterias. Frmula en gramos por litro de agua destilada. Trypticase............................20.0 grs. Sulfato de hierro y amonio... 0.2 grs. Agar...................................... 3.5 grs. Preparacin Se suspenden los 30 gramos del material seco en un litro de agua destilada, mzclese bien y cuando se obtenga la suspensin uniforme, calintese agitando de cuando en cuando y hirvase durante un minuto o hasta su disolucin. Distribyase en tubos de ensayo, llenndolos hasta su tercera parte. Esterilcese a 121C a 15 libras de presin durante 15 minutos. Tcnica de siembra El Agar SIM se debe inocular por picadura en el centro hasta la mitad o un centmetro antes del fondo. Las muestras se toma de las colonias seleccionadas como EMB, Agar Mc Conkey Sulfuro ferroso.- Fundamento.- Algunas bacterias son capaces de degradar aminocidos azufrados como cistena y metionina, o de utilizar tiosulfato como sustrato, liberando el azufre de estos compuestos para formar cido sulfhdrico H2S en forma gaseosa gracias a la accin de enzimas bacterianas como la cistena disulfhidrasa y tiosulfato reductasa. Este medio contiene Sulfato de Amonio Ferroso y Tiosulfato de sodio, este ltimo es el primer sustrato que utiliza la enzima tiosulfato reductasa bacteriana para formar cido sulfhdrico incoloro el cual reacciona posteriormente con el Sulfato de Amonio Frrico que contiene el medio de cultivo para formar sulfuro ferroso que forma un precipitado negro en el medio. Las especies del gnero Proteus y Salmonella producen sulfuro ferroso Thiotone (peptonas)............ 6.1 grs. Tiosulfato de sodio............... 0.2 grs. pH final 7.3 +

que se evidencia por el color negro del medio. Escherichia coli y Shigellas no producen H2S por lo que el medio conserva su color original. Indol. Fundamento.- El alto contenido de trypticase (triptfano) en el medio SIM, lo hace ideal para la produccin de indol. El triptfano puede ser desaminado o descarboxilado por la accin de la enzima triptofanasa que producen algunas bacterias utilizando como coenzima al fosfato de piridoxina (vitamina B6) dando origen a tres metabolitos indlicos por reacciones especficas de la enzima (indol, escatol y cido indolactico) liberando una molcula de amoniaco. La desaminacin del triptfano produce Indol. La inmediata aparicin de un anillo de color rojo cuando se agregan cinco gotas del reactivo de Kovac (Alcohol amlico o butlico + Dimetilaminobenzaldehdo + HCL concentrado) al medio de cultivo incubado durante 24 horas indica la presencia de Indol y se considera una prueba positiva. Escherichia coli es capaz de producir Indol por lo que al agregar 5 gotas del reactivo de Kovac, se forma un anillo rojo en la superficie del medio SIM. 63 Movimiento positivo en el medio SIM.- Gracias a sus flagelos pertricos los gneros Salmonella, Proteus, Escherichia coli se desplazan alejndose de la picadura dando un aspecto de remolino o turbidez alrededor de la picadura. Los gneros Klebsiella y Shigella no tienen movimiento.

LIA.- Agar lisina con hierro Medio slido en tubos con pico de flauta de color rosa. Determina si los miembros de la familia Enterobcteriaceae descarboxilan o desaminan la lisina. Ayuda en la identificacin de especies de Salmonella la mayora de la cuales son H2S positivas y lisina positivas. Frmula Agar ...................................15.0 g Extracto de levadura.............3.0 g L-lisina.................................. 1.0 g Tiosulfato de sodio anhidro... 0.4 g Agua destilada.................... 1000 ml Peptona de gelatina.........5.0 g Glucosa............................1.0 g Citrato frrico-amnico.... 0.5g Prpura de bromocresol.. 2.0 mg pH final: 6,7 + 0,2

Fraccionar en cantidades de 4 ml. (tubos para la prueba 13 X 100 mm). Agar inclinado extremo inferior profundo, ( anaerobio) con pico de flauta corto.

Tcnica de siembra Con el asa bacteriolgica recta, estriar el pico de flauta y punzar el fondo del medio dos veces. Dejar las tapas del medio de cultivo ligeramente flojas. Incubar durante 18 a 24 hrs., a 35 C. Descarboxilacin de la lisina.- Fundamento. La descarboxilacin es el proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas especficas atacan a los aminocidos en su carboxilo terminal (COOH) para formar una amina o una diamina y dixido de carbono. aminocido amina dixido de carbono 64 Existen numerosas enzimas descarboxilasas utilizadas para la identificacin bacteriana, las tres mas importantes son lisina, ornitina y arginina descarboxilasas. Estas descarboxilasas son enzimas adaptativas o inducidas y solo se activan cuando un microorganismo es cultivado en un ambiente cido en presencia de un sustrato especifico. Los productos de la descarboxilacin de estos aminocidos cambian el pH a limites alcalinos. La descarboxilacin que producen estas enzimas, esta restringida a los aminocidos que poseen por lo menos un grupo qumicamente activo distinto de una amina como (NH2) y a los aminocidos que tienen un grupo carboxilo (COOH). Este tipo de descarboxilacin ocurre en anaerobiosis, es decir, cuando en la gliclisis se obtienen lactato y piruvato como productos finales que acidifican el medio de cultivo y activan a las enzimas descarboxilasas. La descarboxilacin es irreversible no oxidativa y por lo general requiere una coenzima comn, fosfato de piridoxal, que refuerza mas la actividad de las descarboxilasas. El aminocido Llisina es descarboxilado para formar cadaverina, una diamina y dixido de carbono, por la accin de la enzima especifica lisina descarboxilasa.

El aminocido L- ornitina es descarboxilado por la enzima ornitina descarboxilasa para formar la diamina putresina y dixido de carbono. Todos los integrantes de la familia Enterobacteriaceae causan una fermentacin inicial de la glucosa con produccin de cidos que originan un cambio en el indicador de pH del prpura al amarillo en el curso de las primeras 10 a 12 hrs. de incubacin. En respuesta a la acidez, los microorganismos que producen lisina descarboxilasa forman una amina, cadaverina, que alcaliniza al medio de cultivo, manifestndose por un nuevo viraje del indicador de pH prpura de bromocresol, a la alcalinidad (color prpura). 65 Interpretacin de la descarboxilacin de la lisina Positivo (+): El pico de flauta se observa de color prpura (alcalino) y el extremo inferior prpura (alcalino), puede haber produccin de cido sulfhdrico (H2S) o sin l. Negativo (-) pico de flauta prpura y el extremo inferior amarillo (cido) que indica solo la fermentacin de la glucosa sin descarboxilacin de la lisina. La reaccin de descarboxilacin en el extremo inferior (prpura), puede enmascararse por el color negro del sulfuro ferroso a partir del H2S que producen algunas bacterias. La produccin de H2S se produce en un medio alcalino (prpura). Produccin de sulfuro ferroso.- Algunas bacterias son capaces de degradar aminocidos azufrados como cistena y metionina, o de utilizar tiosulfato como sustrato, liberando el azufre de estos compuestos para formar cido sulfhdrico H2S en forma gaseosa gracias a la accin de enzimas bacterianas como la cistena disulfhidrasa y tiosulfato reductasa, este medio contiene Sulfato de Amonio Ferroso y Tiosulfato de sodio, este ltimo es el primer sustrato que utiliza la enzima tiosulfato reductasa bacteriana para formar cido sulfhdrico incoloro el cual reacciona posteriormente con el Sulfato de Amonio Ferroso para formar sulfuro ferroso que forma un precipitado negro en el medio

MIO (Motility-Indole-Ornitine o Motilidad-Indol-Ornitina).- Esta prueba bioqumica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la produccin de Indol y a la descarboxilacin de la ornitina.

Frmula en gramos por litro: Dextrosa................................................1.0 grs. Extracto de levadura.............................3.0 grs. Peptona...............................................10.0 grs. Triptena..............................................10.0 grs. Clorhidrato de Ornitina..........................5.0 grs. Agar.......................................................2.0 grs. Prpura de bromocresol.........................0.02 grs. pH final: 6.5 0.2 Los tubos se siembran por puncin con asa recta hasta un centmetro antes del fondo. Incubar por 24 horas a 37 C. Movilidad. La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o un crecimiento que se difunde desde la lnea de inoculacin, mientras en las no mviles crece a lo largo de la lnea de siembra. Indol.- Fundamento.- El triptfano que contiene el medio MIO puede ser desaminado o descarboxilado por la accin de la enzima triptofanasa que producen algunas bacterias, utilizando como coenzima al fosfato de piridoxina (vitamina B6) dando origen a tres metabolitos indlicos (indol, metilindol y cido indolactico) y liberando una molcula de amoniaco. La desaminacin del triptfano produce Indol. La inmediata aparicin de un anillo de color rojo cuando se agregan cinco gotas del reactivo de Kovac (Alcohol amlico o butlico + Dimetilaminobenzaldehdo + HCL concentrado) al medio de cultivo incubado durante 24 horas indica la presencia de Indol. La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad bacteriana. Descarboxilacin de la ornitina.- Fundamento. La descarboxilacin es el proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas especficas atacan a los aminocidos en su carboxilo terminal (COOH) para formar una amina o una diamina y dixido de carbono. aminocido amina dixido de carbono

Existen numerosas enzimas descarboxilasas utilizadas para la identificacin bacteriana, las tres mas importantes son lisina, ornitina y arginina descarboxilasas. Estas descarboxilasas son enzimas adaptativas o inducidas y solo se activan cuando un microorganismo es cultivado en un ambiente cido en presencia de un sustrato especifico, ornitina. Los productos de la descarboxilacin de estos aminocidos cambian el pH a limites alcalinos. La descarboxilacin que producen estas enzimas, esta restringida a los aminocidos que poseen por lo menos un grupo qumicamente

activo distinto de una amina como (NH2) y a los aminocidos que tienen un grupo carboxilo (COOH). El aminocido L- ornitina es descarboxilado por la enzima ornitina descarboxilasa para formar la diamina putresina y dixido de carbono. 67 Todos los integrantes de la familia Enterobacteriaceae causan una fermentacin inicial de la glucosa con produccin de cidos que originan un cambio en el indicador de pH del prpura al amarillo en el curso de las primeras 10 a 12 hrs. de incubacin. En respuesta a la acidez, los microorganismos que producen ornitina descarboxilasa forman una amina, putresina, que alcaliniza al medio de cultivo, manifestndose por un nuevo viraje del indicador de pH prpura de bromocresol, a la alcalinidad (color prpura). Este tipo de descarboxilacin ocurre en anaerobiosis, es decir, cuando en la gliclisis se obtienen lactato y piruvato como productos finales que acidifican el medio de cultivo y activan a las enzimas descarboxilasas. La reaccin positiva de la ornitina est dada por un color prpura del medio debido a la fermentacin de la glucosa que reduce el pH proporcionando condiciones ptimas para la decarboxilacin de la ornitina de la frmula. Si ocurre la decarboxilacin de la ornitina el pH sube y el color del medio se vuelve prpura gracias al indicador prpura de bromocresol. Los cultivos negativos a ornitina producen un tubo amarillo que puede ser prpura en la parte superior.

SIMMONS, AGAR CITRATADO DE El Agar Citratado de Simmons.- Medio slido de color verde en placas o en tubos inclinados, se usa para diferenciar las bacterias entricas Gram negativas, basndose en la utilizacin de citrato. Frmula en Gramos por Litro de Agua Destilada Fosfato Monobsico de Amonio ................................................. 1.0 Fosfato Dipotsico ......................................................................... 1.0 Cloruro de Sodio ............................................................................ 5.0 Citrato de Sodio ............................................................................. 2.0 Sulfato de Magnesio ...................................................................... 0.2 Agar ........................................................................................ 15.0 Azul de Bromotimol ................................................................... 0.03 Preparacin Suspender los 24.2 gramos de polvo en un litro de agua destilada. Djese

remojar durante 5 a 10 minutos. Mezclar bien y calentar suavemente agitando de vez en cuando hasta que el medio hierva durante 1 o 2 minutos.

68 Distribuyese en tubos y esterilcese en autoclave a 121C. (15 libras de presin) durante 15 minutos. Se deja enfriar en posicin inclinada, aunque tambin se puede emplear como medio en placas. Tcnica de siembra Se pueden hacer cultivos en placa con tcnica de aislamiento o si se prefiere el medio inclinado, se inocula estriando la superficie y picando el fondo. Fundamento.- Solo los organismos que utilizan el citrato como nica fuente de carbono crecen en el Agar Citratado de Simmons. El citrato es obtenido del citrato de sodio que contiene el medio para ser incorporado directamente al ciclo de los cidos tricarboxlicos (Krebs) para su metabolismo y produccin de energa. Esta reaccin es catalizada por la citrato desmolasa o citratasa enzimas bacterianas que requieren de un medio alcalino y de cationes divalentes como magnesio para su activacin. Algunas enterobacterias son capaces de degradar las sales de amonio (fosfato monobsico de amonio) del medio para formar amonaco (NH3) para ser utilizado como fuente nitrogenada para su metabolismo. El nitrgeno liberado en forma de amonaco es convertido en hidrxido de amonio (NH4OH) mas fosfato orgnico, estos dos productos proporcionan las condiciones ptimas para la activacin de la citratasa que obtiene al citrato y lo incorpora al ciclo de Krebs. La aparicin de un crecimiento bacteriano visible indica la utilizacin del citrato como fuente de carbono. De manera indirecta se comprueba por un cambio de color del medio de cultivo, del color verde normal, al color azul que indica la alcalinizacin del medio por el del indicador de pH, azul de bromotimol. Los gneros Salmonella y Proteus generalmente sin citrato positivas, en cambio Klebsiella, Shigellas y E. coli son negativas.

AGAR CON UREA DE CHRISTENSEN El Agar con urea de Christensen es un medio de cultivo slido en tubos con pico de flauta que se utiliza para detectar la actividad de la ureasa, enzima bacteriana que hidroliza a la urea convirtindola en dos molculas de amonaco que

finalmente forman carbonato de amonio.

Estos productos alcalinizan el medio de cultivo haciendo que cambie de color, de rosa tenue a rojo por la accin del indicador Rojo de fenol. Frmula en gramos por litro de agua destilada. Peptona............................. 1.0 gr. Fosfato monopotsico....... 2.0 grs. Urea....................................20.0 grs. ---------- pH final 6.8 + ----------Preparacin Se pesan 3.87 grs. Para cada 100 ml de agua destilada y se disuelve sin calentar. Se distribuye en tubos estriles de 13 X 100 mm, en fracciones de 2 ml. Esterilizar en autoclave de 115 a 121 C a 15 libras de presin por 15 minutos. Djense enfriar los tubos a 50 C y colocar en forma inclinada. Tcnica de siembra Se debe estriar superficialmente con un inculo grande, el fondo sirve como control del color, por lo que no debe puncionarse. El Agar con urea de Christian elimina la necesidad de que los microorganismos utilicen el amonaco como nica fuente de nitrgeno para su metabolismo, la glucosa que contiene el medio permite el crecimiento de un buen nmero de gneros que adems podrn evidenciar la produccin de ureasa alcalinizando el medio de cultivo haciendo que cambie del color normal al rojo por el indicador Rojo de fenol. La mayor parte de las especies del gnero Proteus dan una reaccin fuertemente positiva (de 4 cruces) a las 24 hrs., de incubacin. Otros gneros de bacterias paraclicas dan una pequea reaccin positiva desde las 6 primeras horas de incubacin que se intensifica hasta 4 cruces hasta despus de tres das. Otros gneros menos positivos a la ureasa dan una reaccin leve despus de 6 das. CUESTIONARIO 1.- Mencione el fundamento de las pruebas bioqumicas en el medio deTSI. 2.- Mencione el fundamento de las pruebas bioqumicas en el medio de SIM. Cloruro de sodio................ 5.0 grs. Glucosa .............................. 1.0 grs. Rojo de fenol.........................0.012 grs.

3.- Mencione el fundamento de las pruebas bioqumicas en el medio de LIA. 4.- Mencione el fundamento de las pruebas bioqumicas en el medio de Citrato de Simmons. 5.- Mencione el fundamento de las pruebas bioqumicas en el medio de agar con urea de Christensen. COPROCULTIVO Prctica 20

OBJETIVOS 1.- El alumno conocer la importancia del coprocultivo para la identificacin de enterobacterias. 2.- El alumno conocer la tcnica de la toma de la muestra para el coprocultivo. 3.- El alumno conocer la tcnica de siembra en los medios de cultivo tetrationato y caldo Selenito.

Etiologa de la diarrea infecciosa La gastroenteritis o diarrea infecciosa aguda, es un sndrome cuya etiologa puede ser viral, bacteriana o parasitaria que afecta al estmago e intestinos y se manifiesta por evacuaciones diarreicas, clicos intestinales, nusea, vmito, fiebre y deshidratacin. El desequilibrio hidroelectroltico es la complicacin principal que pone en riesgo la vida. Afecta principalmente a nios menores de 5 aos. Rotavirus, Parvovirus y Norwalk virus.- La gastoenteritis aguda es causada principalmente por virus. El agente etiolgico que individualmente es la causa mas frecuente de diarrea en nios menores de 5 aos es el Rotavirus. Otros tipos como Adenovirus, Astrovirus, Enterovirus, Coronavirus y Calicivirus, tambin pueden producir gastroenteritis. Los microorganismos bacterianos que con mayor frecuente se aslan de las heces fecales de enfermos con diarrea aguda pertenecen a los gneros Shigella y Salmonella invasoras de la mucosa intestinal. Entre las bacterias productoras de enterotoxinas se encuentran Escherichia coli, Klebsiellas, Proteus y Pseudomona. El coprocultivo es el estudio de la materia fecal para la bsqueda e identificacin de organismos bacterianos causantes de fiebres de origen intestinal,

diarreas agudas o crnicas.

72Las muestras de heces, los raspados rectales y la obtencin de bilis y material extrado por drenaje duodenal cultivadas en medios enriquecidos y selectivos ponen de manifiesto a los agentes bacterianos causantes de diarrea infecciosa aguda. Inicialmente debe realizarse un examen macroscpico de las heces, la consistencia, el color, la presencia de moco, pus o sangre pueden ser sugestivas para la eleccin de los medios de cultivo y permiten adems la toma de una muestra representativa para el cultivo. El aislamiento primario debe incluir medios de cultivo enriquecidos tanto para enterobacterias como para bacterias Gram positivas. Caldo base con tetrationato y caldo Selenito F, Mc Conkey y EMB para enterobacterias, Agar sangre para bacterias Gram positivas CALDO BASE CON TETRATIONATO El caldo base con tetrationato y solucin yodo yodurado es un medio enriquecido y selectivo para el aislamiento del gnero Salmonella. Las sales del medio y el yodo inhiben el crecimiento de Gram positivas y un gran nmero de Gram negativas Frmula en gramos por litro de agua destilada. Polypeptone....................5.0 Carbonato de calcio.......10.0 Sales biliares.................. 1.0 Tiosulfato de sodio.........30.0 Solucin yodo yodurado. Yodo............................... 6.0 g. Agua................................20 ml.

Yoduro de potasio........... 5.9 g

Con un hisopo estril se recolectan uno a dos gramos de heces fecales y que se mezclan en 10 mililitros del caldo con tetrationato, dejando en hisopo en el interior del medio de cultivo. La mezcla se incuba durante 24 horas a 37 C., posteriormente se siembra en placas con medios selectivos.

73 SELENITO F.- El caldo de Selenito F en tubos es de color blanco, se emplea para aislar Salmonellas, Shigellas y Pasteurellas. Frmula en gramos por litro de agua destilada. Polypeptone.............................5.0 g. Lactosa.................................. 4.0 g. Fosfato de sodio....................10.0 g. Selenito cido de sodio.......... 4.0 g. Agrguese uno a dos gramos de heces fecales, en tubos con 10 mililitros del caldo y agite con asa bacteriolgica o bien tome la muestra con un hisopo estril y colquela dentro del medio de cultivo. La mezcla se incuba durante 24 horas a 37 C. El crecimiento de bacilos tficos o paratficos es mas rpido que otros coliformes por lo que no debe de incubarse por mas tiempo. Aunque el medio Selenito F se ide ante todo como medio enriquecido y selectivo para los miembros del gnero Salmonella, en el se pueden aislar los bacilos disentricos como Shigella sonei.

CUESTIONARIO 1.- Mencione a los principales gneros bacterianos causantes de diarrea infecciosa aguda. 2.- Diga cuales son los medios de cultivo selectivos usados en el coprocultivo. 3.- Mencione la tcnica de siembra en el medio lquido con tetrationato.