Composición Fenólica en Variedades Tintas de V.vinífera.

Universitat Rovira i Virgili
FACULTAT DENOLOGIA
D e p a r t a m e n t de Bioqumica i Biotecnologia
C O M P O S I C I FEN L I C A EN V A R I E T A TS N EG R E S DE V I T I S V I N IFER A . I N FLU N C I A D E D IFEREN T S FA C T O R S
Josep Valls Fonayet

TESI DOCTORAL, 2004
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI DEPARTAMENT DE BIOQUMICA I BIOTECNOLOGIA FACULTAT D ENOLOGIA
COMPOSICI FENLICA EN VARIETATS NEGRES DE VITIS VINIFERA. ESTUDI DE LA INFLUNCIA

DE DIFERENTS FACTORS
Memria presentada per Josep Valls Fonayet Per optar al grau de Doctor en Bioqumica
Tarragona, 2004
Als meus pares, i a la memria de la meva via
UNIVERSITAT
La sotasignant, Montse Biologia Vegetal, adscrita al Universitat Rovira i Virgili, FA CONSTAR
Dept. Bioqumica i Biotecnologia FACULTAT dENOLOGIA DE TARRAGONA Nadal Roquet-Jalmar, Professora Titular de lrea Av Ramn y Cajal, 70 43005- Tarragona de Bioqumica i Biotecnologia de Departament Tel. 977 250355 E-mail: mnrj@astor.urv.es
de la
Que el present treball, amb ttol Composici fenlica en varietats negres de Vitis vinifera. Estudi de la influncia de diferents factors, que presenta en Josep Valls Fonayet, per optar al grau de Doctor en Bioqumica per la Universitat Rovira i Virgili, ha estat realitzat sota les meves direccions, i que tots els resultats obtinguts sn fruit dels experiments duts a terme per lesmentat doctorand. I perqu sen prengui coneixement i tingui els efectes que correspongui, signa aquesta certificaci.
Dra. Montse Nadal Roquet-Jalmar Tarragona, 20 de gener de 2004
AGRAMENTS
Here comes the sun. Aix sembla que sacaba. Per fi. Als membres de lrea de Biologia Vegetal, grup minoritzat, per que quan ens hi posem.... Desitjo agrair a la Montse la confiana que ha dipositat en mi des del primer dia fins al darrer, i que mhagi recolzat en tot moment en les meves iniciatives i defensat
amb vehemncia quan ha fet falta. A la sister Miriam, que va ser la pionera, li agraeixo que hagi acceptat ser membre del tribunal, tota lajuda que mha prestat en la discussi de resultats quan jo no hi veia clar i, sobretot, lamistat que mha demostrat tan sovint durant tots aquests anys. A la Sumpta, li agraeixo la seva efervescncia, i tots els estius que mha ajudat a conquerir els congeladors de la Facultat. A Marta, que viniste a dar un empujn y porque durante un tiempo fuimos los amos. A la Francesca, perqu sempre mha tingut en consideraci. I a tants daltres que han vingut a col.laborar durant tots aquests estius. A tots els membres del Departament de Bioqumica i Biotecnologia de la URV, i especialment al Dr Nicolas Rozs, per preocupar-se desinteressadament del meu dem i involucrar-shi. Pel mateix motiu, al Dr. Gerard Pujadas. A la Dra Montse Poblet li agraeixo la seva accessibilitat i els seus nims. Al Dr Fernando Zamora, tot i que no sigui de Reus, per lenfoc i les correccions del bloc 2. Al Dr Joami Canals, pels mapes de la finca, que em va prestar amb tanta celeritat, i pel tracte del dia a dia. A la Dra Isa Baiges , per tota lajuda amb els temes de Biologia Molecular i de laboratori (i pels kuchen). A la Mireia i la Cristina, per tanta tinta tunta. I al Santiago Moreno, perqu li demanem de tot i ell sempre respon.
A tot el personal de la Facultat dEnologia. A lElena, per tantes nits sortint tard; al Joan, sempre atent amb el fax i el menjador, i a laltre Joan, que no me noblido. A la Tere i la Maria, por su trato afable todos estos aos. A la gent de la Biblioteca, especialment a la Inma, que aquests darrers mesos sha hagut de regirar tots els armaris, grcies per la pacincia i leficincia; i a la Xose, que sempre mha aconseguit el que necessitava; i a tots els altres, que han hagut de jugarse el fsic per arribar a segons quins articles. I a la Marisol, el Rafael, el Jordi i lngel, per tractar tan b el noi aquell que est en hores intempestives a Enologia. Al Pepe Escalona i al Dr Hiplito Medrano, per les atencions prestades en la meva breu estana a Mallorca. Y a la Dra Puri Fernndez, Rubn Saenz y, muy especialmente, a Ernesto Garrido, por toda la ayuda y atencin con el HPLC-MS en La Rioja.
I a la cara B, com no, als doctorands, per tot el vostre suport, sobretot en aquest final boig. Comencem per la vella gurdia s, nois, tots tenim una edat. De nou a la Miriam. Al Pep Llaurad, un Peppouet de cincia i de camaraderia, sempre disposat a donar un cop de m i preocupar-se de servidor; al Ramon (hooombre), per la pacincia que t quan un es posa morda; a la Judit, que ofereix la seva amistat maralenca; a la Cristina, que o mafanyo o ja haur acabat de fer les Amriques; a la Marta, que al principi s la que em va integrar al cotarro, i a la Blanca, oink Las tres ngeles. A la Maite, que em va assessorar per tirar endavant el captol 3, per tot el seu prosme, i per tantes i tantes coses ms. Limpi la poyata, pero hay okupas. Como las balas A Chus, porque es el modelo a seguir de rigor cientfico, de buena compaera y de esponja. A la Gemma, per totes les coses bones que t, que sn moltes (per que no inclouen la tria cinematogrfica, sens dubte). Al Ton, pel pacte i per saber sobreviure en un mn de taurons...A ngel, aunque las menos, por las conversaciones, la ayuda con la redaccin, y por saber cundo uno necesita nimos. A Rosana, por todo el apoyo que me ha ido brindando con B en esta etapa final, y por sus
aportaciones con la PCR cuantitativa. A la Nria, per tot LO bon rotllo que desprn, encara que qui em cau realment b s.. A Carmen, sirena cubana que fue en busca del artculo perdido. A la Roser, per oferir-me ajuda bibliogrfica, bons aliments i els massatges!! A la Mireia, que sap que la vida s aigua. I als de la Facultat gran... I a tots els antics. I a tots els nous (Eli, Vctor, Marian, Yunuen, Javier, Loubna, Salvador) ni se us ocurreixi llenar-me les mostres!!!!! Als companys dAnaltica, especialment a la Pili, que amb tota dedicaci mha fet piruetejar en lanlisi de components principals. A la Montse Mestres, que deu estar al caure. Al Marc, que ja ha caigut. I a la resta de noies (b, i tamb algun noi) que shan deixat caure per all. Igualment, als meus amics dels altres lmits. Al Txiki, que se vino una vez a traerme el mtodo de la vainillina, y desde entonces ha ido acudiendo puntualmente, gracias por contarme tantas cosas y contar conmigo, y suerte en esta nueva etapa. A lEva, per tots aquells anys dinant junts, i perqu, malgrat la internacionalitzaci, sempre sap quan s 19, i al Fernando, encara que treballa massa. A la Mnica i el Francesc, perqu sempre sofereixen i perqu ens entenem i riem la mar de b. Igual que la Coia, que a ms va tenir la consideraci de no fer-se professora (uuffff). Si fa no fa com lAlexis, el puigpelat ms trempat que conec. A la Nria i el Xavier, i lOriol, la Maria Pilar i lAnna, una gran famlia en qu sempre em trobo ben acollit. A Inma y Santi, que ya llevan un timepo doctoreando. I a la Coia i lElena, que ja les veig massa poc. A veure si quedem, que no s noms culpa meva. A Carmen, Isabel, Inma, Joan , und so weiter. I al Mari, que per culpa daquesta tesi fa temps que tinc abandonat. Al Francesc, tot i que es treur el carnet abans que jo. A la Nria, que tanta companyia em fa i tant mha ajudat en aquests anys sota el mateix sostre, i que mha aportat suport informtic i logstic. Moltes grcies. I sobretot, als meus pares, que sn els qui ms han patit per aquesta tesi, grcies per tanta profusi destima, per permetrem fer-ho a la meva manera, i per tot,tot i tot. Noms perqu la tingueu en les vostres mans, ja ha valgut la pena. I b, si mhe oblidat dalgdisculpeu, per tranquils vs a saber, potser aquesta tampoc s encara la definitiva. ;-)
NDEX
Justificaci i objectius 1
BLOC I : COMPOSICI FENLICA EN RAM Introducci general

1. Els compostos fenlics 2. Bioqumica de maduraci del ram Referncies bibliogrfiques Disseny de camp
7 9
11 17 29 35
Captol 1: Composici antocinica en les pells

1.1. Introducci
1.1.1. Estructura qumica 1.1.2. Perfil dantocians en Vitis 1.1.3. Evoluci dels antocians al llarg de la maduraci
39
41
42 43 46
1.2. Objectius 1.3. Metodologia 1.4. Resultats i discussi

1.4.1. Perfil antocinic de diferents varietats en el moment de la collita 1.4.2. Antocians en data de verema i relaci amb la mida de la baia 1.4.3. Antocians individuals en data de collita segons lanyada 1.4.4. Evoluci dels antocians durant la maduraci 1.4.5. Variacions dels antocians individuals al llarg de la maduraci 1.4.6. Efecte del reg en el contingut i natura dels antocians dull de llebre i cabernet 1.4.6.1. Irrigaci i anyada 1.4.6.2. Irrigaci i varietat 1.4.6.3. Efectes de la irrigaci sobre els antocians individuals
48 49 54
54 60 63 66 74 77 77 86 91
1.5. Conclusions 1.6. Referncies bibliogrfiques
93 94
Captol 2: Catequines i proantocianidines en pinyols

2.1. Introducci
2.1.1. Estructura qumica 2.1.2. Localitzaci i evoluci durant la maduraci 2.1.3. Propietats que confereixen als vins
101
103
103 105 107
2.2. Objectius 2.3. Materials i mtodes

2.3.1. Reacci amb aldehids 2.3.1.1. Assaigs colorimtrics: vainillina i DMACH 2.3.1.2. Anlisi de catequines mitjanant cromatografia en capa fina 2.3.2. Anlisi de catequines per HPLC 2.3.3. Estimaci del grau de polimeritzaci mitj per determinaci dels productes de trencament
108 109
110 110 111 113
115
2.4. Resultats i discussi

2.4.1. Anlisi del contingut en catequines dels pinyols de les diferents varietats 2.4.2. Procianidines oligmeres per HPLC 2.4.2.1. Comparaci situacions reg i no reg 2.4.3. Determinaci dels graus de polimeritzaci
118
118 121 132 135
141 142
BLOC II: COMPOSICI FENLICA EN VI Captol 3: Extracci dels antocians al llarg de la maceraci
3.1. Introducci
3.1.1. Difusi dels compostos fenlic al most 3.1.2. Procs de maceraci en negres
147 151
153
154 156
3.2. Objectius 3.3. Materials i mtodes 3.4. Resultats i discussi

3.4.1. Discussi general
3.4.1.1. Evoluci de lextracci 3.4.1.2. Capacitat extractiva segons les varietats 3.4.1.3. Extractabilitat segons la natura qumica
159 160 160

166
166 167 169
171 172
Captol 4: Efecte de la composici fenlica i la seva evoluci sobre el color del vi

4.1. Introducci
4.1.1. Efecte del pH 4.1.2. Efecte del sulfurs 4.1.3. Fenmens de copigmentaci 4.1.4. Reaccions de condensaci 4.1.4.1. Condensaci directa entre antocians i flavanols 4.1.4.2. Condensacions mitjanades per acetaldehid 4.1.5. Condensacions mitjanades per cid pirvic o cids fenols: Formaci de vitisines o piranoantocians
175
177
177 178 178 181 182 184 186
4.2. Objectius 4.3. Materials i mtodes 4.4. Resultats i discussi

4.4.1. Reaccions de condensaci mitjanades per acetaldehid en solucions model 4.4.1.b. Determinaci de les constants de velocitat 4.4.2. Reaccions de condensaci mitjanades per acetaldehid en vins monovarietals 4.4.3. Fenmens de copigmentaci en solucions model
188 189 192

192 195 199 202
206 207
BLOC III: SNTESI DANTOCIANS EN CULTIUS IN VITRO

Introducci general Materials i mtodes Referncies bibliogrfiques
211
213 218 220
Captol 5: Influncia de diferents factors en la sntesi dantocians en cultius in vitro 221

5.1. Introducci 5.2. Objectius 5.3. Materials i mtodes 5.4. Resultats i discussi
I. Factors que influeixen en la sntesi dantocians totals 5.4.1 Efecte de lestrs osmtic 5.4.2. Efectes de lestrs nitrogenat 5.4.3. Efecte del pH 5.4.4. Efecte de lincul 5.4.5. Efecte de la font de carboni II. Determinaci dels antocians individuals
223 226 226 227

227 227 232 236 242 245 252
5.4.6. Efectes dels estressos 5.4.6.b.Reaccions de biotransformaci per produir antocians acilats 5.4.7. Efecte de fitohormones
252 255 258
264 265
Captol 6. Activitat de la fenilalanina amonio liasa in vitro

6.1. Introducci
6.1.1. PAL 6.1.2. Expressi gnica
271
273
273 277
6.2. Objectius 6.3. Materials i mtodes

6.3.1. Extracci del RNA total 6.3.2. Extracci de DNA 6.3.3. Retrotranscripci 6.3.4. Realitzaci de la PCR 6.3.5. Realitzaci de la PCR quantitativa del DNA
280 281
281 282 283 283 285
6.4. Resultats i discussi

6.4.1. Disseny de prmers 6.4.2. Determinaci de lexpressi gnica
286
286 290
296 297
CONCLUSIONS
301
Justificaci i objectius
El ram representa la collita fruitera ms important a nivell mundial, amb aproximadament 60 milions de tones produdes anualment1. Un 80% daquesta collita es destina a lelaboraci del vi, un 13% s venut com a ram de taula, i la resta es destina a la producci de sucs i altres productes. La majoria de vinyes sn conreades a Europa, i a Itlia, Frana i Espanya shi cultiven aproximadament un 40% dels 7,5 milions dhectrees de vinya. A Catalunya, la vinya ocupa al voltant dun 75% de la superfcie agrcola, amb una producci de vi als darrers anys daproximadament 3 milions dhectlitres, que representen ms del 9% del total de lEstat Espanyol. Actualment, la tendncia del mercat sorienta cap al consum de vins negres, amb molt de color, estructura i grau. A causa de limpacte econmic daquest producte, es fa necessari un millor coneixement dels factors que determinen el que es coneixen com a parmetres de qualitat dun vi, entre els quals t un pes relatiu preponderant el color; aix com dels factors que incideixen sobre aquests parmetres. Al grup de recerca en Biologia Vegetal del Departament de Bioqumica i Biotecnologia de la URV shavien efectuat extensos estudis previs sobre ladaptabilitat de
1
FAO Statistical Data, 1990-2002
varietats al clima del Priorat,2 i sobre les repercussions de lalimentaci hdrica en la qualitat del ram3. En aquests shavia fet palesa la influncia que tenia el dficit hdric sobre la sntesi de compostos fenlics, i especialment, sobre els antocians totals. En el present treball, es proposa aprofundir en aquests aspectes estudiats, incidint en el contingut i acumulaci de compostos fenlics en diferents varietats per una banda, i estudiant-ne la biosntesi a nivell cellular per laltra. Per efectuar aquest estudi, es va considerar necessari treballar en 2 vessants. A) A nivell de camp, es van escollir diferents varietats negres que es cultiven en els camps experimentals de la Facultat dEnologia en el terme de Constant. Lobjectiu en aquest estudi fou la determinaci dels antocians individuals en el ram de varietats negres en diferents anyades, per comprovar la incidncia dels elements climtics en la seva acumulaci. Aquest estudi es va fer posteriorment extensiu a altres compostos fenlics, concretament les proantocianidines dels pinyols, que tamb tenen un efecte important en la qualitat final dels vins. Apart, es van triar dues varietats negres per realitzar un assaig amb la variable irrigaci, establint els tractaments de ceps regats i no irrigats, per tal de relacionar les diferncies entre els tractaments a nivell de contingut en antocians totals observades en altres treballs 3 amb aquelles que es presentessin a nivell individual. Daquest primer objectiu sen derivaren uns altres, que contemplaven com es tradua el contingut en antocians del ram en el vi elaborat desprs de la vinificaci. Aix, es va decidir estudiar lextractibilitat dels antocians en el perode de maceraci, previ o simultani a la fermentaci alcohlica, i la reactivitat en el vi dels antocians procedents del ram. B) En segon lloc, es van establir uns cultius in vitro de Vitis vinifera per tal de poder efectuar lestudi dels factors que influeixen en la biosntesi dantocians, com lestrs osmtic i lestrs nitrogenat. A ms, aprofitant que sn un mitj ideal per a efectuar estudis bioqumics i moleculars, es va decidir dabordar lestudi dexpressi gnica de les vies que determinen la biosntesi dels compostos fenlics. En concret, es va decidir estudiar un enzim, la fenilalanina amonio liasa (PAL), que resulta clau en aquestes vies, ja que determina el predomini del metabolisme primari o del secundari.
Nadal, M. (1993).Estudi dels factors ecolgics i de les condicions de maduraci del Cabernet Sauvignon per obtenir vins de qualitat al Priorat; Tesi doctoral, Dep. Bioqumica i Biotecnologia, Universitat Rovira i Virgili (URV) 3 Lampreave, M. (2002). Fisiologia de labsorci en lecosistema vitcola sl-planta-atmosfera i repercussions en la qualitat del ram. Tesi doctoral, Dep Bioqumica i Biotecnologia, Universitat Rovira i Virgili (URV)
Per qu lestudi de la composici fenlica? Els compostos fenlics presenten un inters enolgic, per assolir vins de qualitat; i un inters nutricional, pel seu possible efecte teraputic. Els polifenols del vi constitueixen un dels principals factors de qualitat en vins negres. Malgrat que el vi ha estat un aliment present des de temps immemorials en la dieta de la cultura mediterrnia, en les darreres dcades ha esdevingut un producte industrial de gran projecci, la qual cosa ha comportat una tendncia a lelaboraci de vins de qualitat, per als quals resulta essencial el seu contingut fenlic, que aporta color i cos al vi. Aix justifica linters que t lestudi daquests compostos en lmbit de la Viticultura i de lEnologia. Per altra banda, nombrosos estudis epidemiolgics han establert la correlaci negativa entre el consum moderat del vi i el risc dincidncia de malalties crdio-vasculars. Molts daquests estudis atribueixen als compostos fenlics aquests efectes positius.
Per qu lestudi dels antocians? Els antocians sn les molcules responsables del color de les pells de les baies i, per tant, la base del color dels vins negres. El color s un dels principals parmetres de qualitat daquests tipus de vins, cosa que justifica linters que t lanlisi cromtica dels vins. Per aix esdev primordial conixer el contingut daquestes molcules responsables del color. Per qu lestudi de les proantocianidines? Les proantocianidines tamb incideixen en la qualitat del vi, al qual aporten la tanicitat. Per, a ms, mitjanant les seves reaccions amb els antocians, juguen un paper decisiu en lestabilitzaci del color del vi, que resulta especialment important en els vins de criana.
Per qu treballar amb diferents varietats? La composici fenlica del ram est influda per diversos factors. El ms determinant dells s la varietat, ja que marca fenotpicament la composici fenlica del fruit. No obstant aix, aquesta potencialitat no resulta absoluta, sin que hi ha altres factors que hi incideixen. A la finca experimental es treballa amb diferents varietats negres per vinificaci. Es va considerar dinters caracteritzar la composici fenlica daquestes varietats per assignar-ne les particularitats i poder aix conixer desprs la seva incidncia a nivell de qualitat dels vins.
3
Per qu en diferents anyades? En el nostre grup ja shavia posat de manifest que lanyada influa significativament en el contingut de compostos fenlics totals. Quedava per veure quin era el seu efecte de manera ms concreta, s a dir, a nivell de les molcules individuals. Per aix el treball sabord en diferents campanyes, per tal de poder assignar desprs tamb la influncia de les caracterstiques climtiques de lany sobre els continguts en polifenols. Per qu en condicions dirrigaci? La irrigaci, des que ha estat permesa per la legislaci en el nostre pas, ha representat una millora de la qualitat global del ram, encara que pugui comportar una disminuci dels compostos fenlics. Per tot aix resulta interessant analitzar els efectes que pot tenir lestrs hdric i la situaci dirrigaci sobre la seva biosntesi. Per qu lestudi en les vinificacions? Els compostos fenlics presents en el ram sn extrets en diferent mesura al llarg del procs maceratiu, en funci de la seva estructura qumica i de la seva localitzaci en el ram. La matria colorant del vi dependr, doncs, del grau dextracci que shagi assolit durant aquest procs. Per altra banda, el vi s una matriu complexa en qu la matria colorant experimenta una srie dinteraccions i de transformacions que modifiquen les seves propietats cromtiques i que tamb cal conixer per entendre el color del vi. Per qu treballs in vitro? El problema dels treballs amb plantes en el camp s que estan sotmeses a una periodificaci depenent del seu cicle vital. A ms, a causa de la dificultat de controlar totes les variables implicades, els possibles tractaments i efectes resulten molt ms difcils de dur a terme i dinterpretar. Per aix es va decidir diniciar en la nostra lnia de recerca el treball amb cultius in vitro, que permeten una disponibilitat contnua de material de partida i que poden ser sotmesos rpidament a lacci controlada dagents exgens per tal davaluar-ne la influncia.
Per qu lestudi de lexpressi gnica de la fenilalanina amonio liasa (PAL)? Les tcniques de Biologia Molecular han suposat un gran aven cientfic en lmbit de la Bioqumica, ja que permeten de manera rpida conixer quines vies poden estar funcionant en unes condicions determinades. La PAL s un enzim clau en el metabolisme dels compostos fenlics, ja que catalitza la formaci dels seus precursors. Per tant, es pens que era una bona eina de partida per establir coneixements a nivell molecular de la regulaci daquestes vies.
Introducci
1. Els compostos fenlics

Els compostos fenlics sn metablits secundaris fonamentals en la Bioqumica vegetal, on tenen funcions diverses: des de la coloraci de flors i fruits fins a la impregnaci de lignina de les parets pecto-cel.lulsiques 4. En Viticultura, la seva importncia s capital no noms a causa del seu paper en la coloraci dels fruits, sin tamb perqu confereixen al vi gran part de les seves propietats organolptiques especfiques. En les varietats negres, sn substncies de gran importncia per la seva influncia en el color (antocians), en l'estructura i en la capacitat d'envelliment dels vins. En varietats blanques el contingut de fenols totals s menor i no s'hi sintetitzen els antocians, i el color s degut a la presncia de carotens, xantofiles i flavonols com la quercitina. 1.1 Estructura principals tipus Des dun punt de vista qumic, els compostos fenlics consten dun anell benznic substitut amb un o diversos grups hidroxil5. Una classificaci dels compostos fenlics segons la seva estructura qumica es recull a la taula 1:
* COMPOSTOS NO FLAVONOIDES - cids fenlics
R HO R' COOH
R COOH
* COMPOSTOS FLAVONOIDES
OH HO O
OH
OH
OH
cids benzoics, cids cinnmics - Estilbens

R1 R2 R3 HO
- Flavonols - Antocians - Flavanols - Flavanones
resveratrol
Taula 1. Compostos fenlics en Vitis

4 5
Champagnol, F. (1984). Les composs phnoliques; a Elements de physiologie de la vigne et de viticulture generale. Ed. Dhan Souquet, JM; Cheynier, V; Sarni-Manchado, P; Moutounet, M. (1996). Les composs phnoliques du raisin. J. Int. Sci. Vigne et Vin, Hors srie , 99-107
11
Composici fenlica en ram
1.1.1.
COMPOSTOS NO FLAVONOIDES
* cids fenlics Els cids fenlics (benzoics i cinnmics; Figura 1) es troben al ram en forma dester dun sucre o dun cid orgnic (principalment, tartric).
R1 HO R2
Figura 1. Estructura general dels cids fenlics cids benzoics cids cinnmics
R1 COOH HO R2 C C COOH H H
Els cids benzoics sn constituents de les lignines, i encara que el contingut en cids benzoics lliures en el ram s baix, poden aparixer al vi procedents de les barriques de roure, sovint com a productes doxidaci dels corresponents aldehids. Lcid gl.lic apareix tamb esterificant els flavan-3-ols i les proantocianidines. Els cids cinnmics sn constitutivament ms importants, i a ms poden formar esters amb els residus glicosdics de les molcules dantocians. Els principals cids benzoics i cinnmics es recullen a la Figura 2.
HO HO HO MeO HO MeO COOH CO OH HO COOH
MeO HO
cid ferlic
C C COOH H H HO HO C C COOH H H
cid gl.lic
cid p-hidroxibenzoic
MeO HO COOH
HO
C C COOH H H
cid cumric
cid cafeic
cid sirngic
cid vainllic
Figura 2. Estructura qumica dels principals cids fenlics del ram
Entre els esters de l'cid hidroxicinnmic, el ms abundant en Vitis vinifera s el tartrat de cafeoil i en menors quantitats es distribueixen el cumaroil i feruoil.
12
Introducci
Els cids fenlics participen en els fenmens doxidaci que resulten en lempardiment de les fulles. Malgrat que no semblen tenir un efecte sobre el gust, estan implicats en laparici de fenols voltils, cosa que implica modificacions en laroma.
* Estilbens
HO
OH HO
Figura 3. Estructura qumica del resveratrol
Els estilbens sn una altra famlia de compostos fenlics, caracteritzats estructuralment per la uni de 2 anells aromtics mitjanant una cadena carbonada amb insaturaci. La presncia daquests compostos fenlics com el resveratrol (Figura 3) en forma trans en les pells del ram tamb s destacable,
malgrat que no superi els 20 g/g pes fresc6. La presncia daquest estilb permet explicar la resistncia de certes baies a atacs fngics. Malgrat que organolpticament no atribueixen propietats als vins, recentment ha anat creixent linters per aquests compostos, ja que sels atribueixen bona part dels efectes cardioprotectors dels vins negres7.
1.1.2. COMPOSTOS FLAVONOIDES El terme flavonoides engloba una gran famlia de compostos que consten dun esquelet de 2 anells benznics units per una cadena de 3 toms de carboni ciclada en un heterocicle oxigenat (cicle pirnic en el cas dels flavonols; cicle pirnic en el cas dels antocianidols i els flavanols). Aquesta estructura bsica (C6-C3-C6) correspon a la molcula de fluoroglucinol (figura 4)5 .
6
OH HO O
OH OH Figura 4. Estructura del fluoroglucinol
Jeandet, P; Bessis, R; Gautheron, B. (1991). The production of resveratrol (3,5,4-trihydroxystilbene) by grape berries in different development stages. Am J Enol Vitic. 42: 41-46 7 Lamuela-Raventos, R;M; Waterhouse, AL. (1999). Resveratrol and piceid in wine. Oxidants and antioxidants, pt A, 299, 184-190
13
* Antocians Lestructura i propietats dels antocians seran discutits ms mpliament en el captol 1 de la present tesi. * Proantocianidines i tanins Lestructura i propietats dels flavan-3-ols i els seus oligmers i polmers, els tanins, sn lobjecte del captol 2 de la present tesi. * Flavonols
R1 OH HO O
R2 OH
OH
OH OH HO O HO O OH HO O
OH OH
OH OH OH O OH O OH OH O OH
kaempferol
quercetina
miricetina
Figura 5. Estructura general i principals flavonols
Els flavonols es caracteritzen per la presncia dun carbonil en posici 4. Els flavonols (Figura 5) es troben en les pells generalment glicosilats amb glucosa, ramnosa i cid glucurnic. El predominant en V. vinifera s el kamferol Sn les molcules responsables del color de les pells de les varietats blanques i, en conseqncia, de part de la coloraci groguenca dels vins blancs, per tamb es troben a les pells de les varietats negres 8.
R1 OH HO O
*Flavanonols i flavones Els flavanonols tenen una estructura similar als flavonols, amb prdua del doble enlla de lanell (figura 6). Han estat identificats a les pells de les varietats blanques. Sn lastilbina (3-ramnsid del deihidroquercetol) i lengelatina (3-ramnsid del dihidrokaempferol), i representarien el 5% del total dels compostos fenlics totals de les pells daquestes varietats9.
O-Ramnosil OH O Figura 6. Estructura qumica dels flavanonols
8 9
Ribreau-Gayon, P. (1964). Les composs phnoliques du raisin et du vin II. Les flavonosides et les anthocyanosides. Ann Physiol Veg 6, 211-242 Cheynier, V; Moutounet, M; Sarni-Manchado, P. (2003). Los compuestos fenlicos. A Enologa: Fundamentos cientficos y tecnolgicos. Coord. Claude Fanzi, EMV Ediciones.
14
Introducci
1.2.
Localitzaci dels compostos fenlics
Segons la localitzaci, sn les cllules de la pell les que acumulen ms compostos fenlics, gaireb la major part en la primera capa de la hipodermis. Aqu s on es localitzen els antocians, encara que sen poden trobar tamb a la polpa en el cas de les varietats tintoreres (ex. Vitis vinifera varietat Alicante Bouchet o Garnatxa Tintorera, o Vitis vinifera Gamay Fraux). A nivell subcel.lular, els antocians es troben en vacols, on es poden trobar fins i tot en orgnuls especialitzats (antocianoplasts) 10. Els estilbens i els flavonols es troben nicament a la pell de les baies9 . Els cids fenlics es troben en forma dester tartric a les vacuoles de les cl.lules de la polpa i de la pell5 . Els flavanols i els tanins sn abundants en els pinyols, i en menor grau, a les pells, on subcel.lularment es localitzen en vacols, lligats a la membrana vacuolar o lligats a la paret cellular 10 . En les llavors predominen els tanins monmers, que al llarg de la maduraci es van polimeritzant.
1.3. Propietats dels compostos fenlics * Propietats espectrals: Els cids fenlics no tenen color en lespectre visible, per poden patir processos doxidaci que condueixen a lembruniment del most i del vi11. A ms, poden participar indirectament en el color vermell pels fenmens de copigmentaci, que comentarem ms endavant. Els flavonoides, i principalment els antocians, absorbeixen la llum i aix els dna un paper preponderant en la coloraci de baies, fulles i vi. El color est influt pel pH, ja que varia la ressonncia electrnica de la molcula. En medi fortament cid, donen un color vermell-violaci, per en medi lleugerament cid, no hi ha absorci en el visible. En medi bsic, en canvi, donen una coloraci blava- verda12.
10 11
Joutei, KA; Glories, Y. (1995). Tanins et anthocyanes: localisation dans la baie de raisin et mode dextraction. Rev Franaise dOenologie , 153, 28-31 Singleton, V. (1987).Oxygen with phenols and related reactions in musts, wines and model systems: observations and practical implications. Am J Enol Vitic, 38, 69-76 12 Glories, Y. (1984). La couleur des vins rouges. 1re partie. Les equilibres des anthocyanes et des tannins. Conn. Vigne Vin, 18, 195-217
15
* Propietats oxidoreductores: Les funcions fenol soxiden fcilment a quinona. Entre els compostos fenlics ms fcilment oxidables es troben tres cid fenols (protocatquic, gllic i cafic), dos flavonols (quercetol, mircetol), tres antocianidols (cianidol, delfinidol, petunidol) i els flavanols que formen els tanins4 . Loxidaci controlada participa en la maduraci del vi, per una oxidaci massa rpida o massa completa compromet la qualitat del producte: visualment, per lembruniment i la turbulncia, i gustativament i olfactiva, per laparici de gusts i olors indesitjables. * Propietats gustatives: Sn sobretot atribubles als tanins, segons la seva naturalesa i el seu grau de polimeritzaci, que proporcionen un equilibri ptim que evoluciona en el temps entre diferents formes amb diferents graus de condensaci. El conjunt de compostos fenlics participa en aquest equilibri 13. * Propietats higiniques - acci bactericida dcids fenlics i tamb de flavonoides en general - acci antiviral, resultant de la combinaci de tanins i protenes - acci contra laterosclerosi, deguda a les proantocianidines, que reforcen la paret arterial, acceleren leliminaci de colesterol i soposen a la producci dhistamina 14.
13 14
Glories, Y. (1999). Substances responsibles for astrigency, bitterness and wine colour. J Internat Sci Vigne Vin, 33, 107-110 Burns, J; Gardner, PT; ONeil, J; Crawford, S; Morecroft, I; McPhail, D; Lyster, C; Matthews, D; Mac Lean, MR; Lean, MEJ; Duthie, G; Crozier, A. (2000). Relationship among antioxidant activity, vasodilation capacity, and phenolic content of red wines. J Agric Food Chem, 48 : 220-230
16
Introducci
2. Bioqumica de maduraci del ram

En el cicle biolgic de Vitis vinifera es poden distingir dues etapes fisiolgicament ben diferenciades, una primera en qu destaquen els processos de creixement i desenvolupament dels rgans vegetatius i una segona on sn predominants els processos d'acumulaci de mid en l'agostejament i de sucres en la maduraci del ram 15.
Interrupci del creixement del floema
Floema
Xil.lema
Engostament
Mida de la baia
Periode herbaci
Verol
Periodes en qu sacumulen els compostos Glucosa Fructosa Antocians Compostos aromtics
Tartrat
Tanins
Hidroxicinnamats
Metoxipirazines
Malat
Divisi cel.lular del pericarp
Quatllat
Floraci
Dies a partir de la floraci FORMACI DE LA BAIA

16
MADURACI DE LA BAIA
Figura 7. Etapes en la maduraci del ram (extret de Kennedy ). El diagrama mostra la mida relativa i el color de les baies en intervals de 10 dies a partir de la floraci, i passant per les principals etapes de desenvolupament. Es mostra tamb la periodificaci dacumulaci de components, els nivells de Brix del most, i la realci del flux del xilema i el floema cap a la baia.
El desenvolupament de les baies comprn tres fases amb dos perodes de creixement sigmoidal (figura 7): el creixement del gra verd; el verol o latncia, on sinicia la sntesi de polifenols amb el conseqent canvi de color de la pell de les baies, i la darrera
15
Nadal, M.. (2000). captol Fisiologia de la maduraci i factors que incideixen en la formaci dels principals components del ram en de la verema i el vi, CFEA, Centre de Formaci i Estudis Agrorurals Mas Sed, DARP, Reus, Tarragona
Parmetres qualitatius
17
fase, la maduraci del ram, on les baies incrementen el seu volum degut principalment a laigua i sucres que sacumulen en les seves cllules 16. El primer perode de creixement del gra verd dura des de la floraci fins a uns 60 dies desprs. En aquest perode, es forma la baia i els embrions de les llavors. En les primeres setmanes t lloc una rpida divisi cellular , i es sintetitzen cids mlic i tartric de forma majoritria, fins al verolament , en el qual assoleixen els valors mxims. La sntesi de tartric com a metablit secundari a la baia derivaria de l'cid galacturnic. L'cid mlic, en canvi, s un important intermediari del cicle dels cids tricarboxlics (TCA) i es sintetitza via gliclisi i cicle TCA o b per fixaci de CO 2 pel fosfoenolpiruvat (PEP)17. Tamb sacumulen els cids hidroxicinnmics i els tanins de les llavors i les pells18,19. Per altra banda, tamb hi ha una acumulaci de compostos que tenen importncia en la qualitat del vi, com sn minerals, aminocids20 i precursors de laroma com les metoxipirazines, que aporten caracters vegetals a certs vins21. Durant el verolament, els canvis fsics comporten una adquisici en lepidermis del fruit de ceres en la pruna, una disminuci de la transpiraci, la ruptura dels vasos del xillema i un flux ms important del potassi respecte daltres ions 22. Desprs del verol, els vasos funcionals sn els del floema, vehicle de transport de la sacarosa cap a la baia. A partir de les fulles adultes s'importen els sucres, per a ms a ms, el mid dels parnquimes corticals reserva es metabolitza per suplir les elevades necessitats fisiolgiques que esdevenen en el verol 23: la finalitzaci del procs de formaci de la llavor, la sntesi de polifenols i la migraci dels sucres a la baia. El creixement s'atura en aquests moments i la translocaci dels sucres es dirigeix cap al ram. El comenament de la segona fase de creixement o fase de maduraci del ram es caracteritza per la coloraci i la prdua de duresa de la baia. El volum de la baia acabar per
16 17 18
Kennedy, J. (2002). Understanding grape berry development. Practical winery & vineyard, jul/aug 2002, 14-23 Ruffner, HP. (1982). Metabolism of tartaric and malic acids in Vitis: a review, Vitis 21, 247-259 Kennedy, J.A., Hayasaka, Y., Vidal, S., Waters, E.J., Jones, G.P. (2001) Composition of Grape Skin Proanthocyanidins at Different Stages of Berry Development. Journal of Agricultural & Food Chemistry 49: 5348-5355. 19 Kennedy, J.A., Troup, G.J., Pilbrow, J.R., Hutton, D.R., Hewitt, D., Hunter, C.A., Ristic, R., Iland, P.G., Jones, G.P. (2000) Development of seed polyphenols in berries from Vitis vinifera L. cv. Shiraz. Australian Jour. of Grape & Wine Research 6: 244-254 20 Stines, A.P., Grubb, J., Gockowiak, H., Henschke, P.A., Hj, P.B., van Heeswijck, R. (2000) Proline and arginine accumulation in developing berries of Vitis vinifera L. in Australian vineyards: influence of vine cultivar, berry maturity and tissue type, Australian Jour. of Grape & Wine Research 6:150-158 21 Hashizume, K; Samuta, T. (1999). Grape maturity and light exposure affect berry methoxypyrazine concentration quality; Am J Enol Vitic 50: 194-198 22 Creasy G-.L,., Price S. f., Lombard P. B. (1993). Evidence for xylem discontinuity in Pinot noir and merlot grapes: Dye uptake during berry maturation. Am J Enol Vitic, 44, 187-192. 23 Kliewer W. M. y Antcliff, A. J. (1970) Influence of defoliation, leaf darkening, and cluster shading on the growth and composition of Sultana grapes. Am, J, Enol, Vitic , 21, 21-26
18
Introducci
haver-se duplicat, de manera que molts dels soluts presents a linici veuen reduda la seva concentraci malgrat que no siguin metabolitzats 24. Altres compostos, com el mlic, veuen reduda la seva concentraci no noms per lefecte de diluci. Lcid mlic disminueix de forma rpida durant la maduraci, ja que s'utilitza com a substracte en la respiraci o es descarboxila via oxalacetat (OAA) a PEP en la gluconeognesi . En canvi, lcid tartric roman ms estable25. Aix tamb els ocorre als tanins de les llavors. La seva reducci sembla deguda a processos doxidaci.26 En les pells, els tanins disminueixen o romanen constants, i sn modificats de manera que augmenta la seva mida. Per el principal procs que t lloc en la segona fase de creixement s que comencen a acumular-se sucres (principalment glucosa i fructosa) provinents de la hidrlisi de la sacarosa obtinguda en la biosntesi. La sacarosa en la baia es desdobla en glucosa i fructosa, que arriben a trobar-se en parts iguals a la verema encara que en la primera etapa predomini la glucosa27. Lacumulaci de sucres en la baia est en relaci directa amb la funci superfcie foliar/pes del fruit. El transport d'assimilats t lloc majoritariment des de les fulles del mateix costat del ram i s'estima en 10cm 2/g la superfcie foliar que es requereix per a la maduraci del ram 28. Per altra banda, en aquesta etapa tamb es comencen a acumular metablits secundaris que determinen la qualitat del vi. Els ms obvis sn els antocians en les pells dels rams de les varietats negres, per tamb sacumulen la major de components responsables de laroma, ja sigui directament o via precursors que no arriben a ser voltils fins que el vi ha envellit.. Dentre ells, els ms estudiats sn els terpens, que tenen una elevada presncia en les varietats aromtiques, sobretot els moscatells. S'hi troben els monoterpens voltils i les formes combinades, diglucsids, les quals sota lacci de les glucosidases alliberen el terp aromtic. Malgrat que els compostos aromtics augmenten al llarg de la maduraci, de les baies ms madures sobtenen vins menys aromtics, a causa de la seva conversi a formes no voltils. En moscatell, a l'inici de la maduraci la concentraci de geraniol s molt elevada i progressivament disminueix el terp lliure i apareix el diglucsid. A mida que avana la maduraci, s el linalol el terp que arriba a concentracions ms elevades29. Altres substncies com els fenols voltils (vainillina, metil
24 25 26
Coombe, BG. (1992). Research on development and ripening of the grape berry. Am J Enol Vitic 43, 101-110 Winkler, AJ; Cook, JA; Kliewer, WM; Lider, LA. (1974). General Viticulture. Univ of California Press, Berkeley Kennedy, J.A., Matthews, M.A., Waterhouse, A.L. (2000) Changes in grape seed polyphenols during fruit ripening. Phytochemistry 55: 77-85 27 Kliewer, WM. (1967). The glucose-fructose ratio of Vitis vinifera grapes. Am J Enol Vitic . 18, 33-41 28 Smart, R. E. (1982).Vine manipulation to improve grape wine quality , in Grape Wine Centennial Symposium of 1980, 362.375, U of California, Davis 29 Wilson, B; Straus, CR; Williams, PJ. (1986). The distribution of free and glycosidically-bound monoterpenes among skin, juice and pulp fractions of some white grape varieties; Am. J. Enol. Vitic , 37, 107-114
19
vanillat, zingerone) i alcohols fenlics (feniletanol) tamb es glicosilen durant la maduraci i s'han determinat en sauvignon blanc i chardonnay 30. Altres aromes produts en la fermentaci, alcohols superiors i esters, poden dependre del contingut en sucres i precursors en el ram.
Saber quan els diversos components sacumulen en la baia s important per entendre com les prctiques culturals poden modificar les caracterstiques del vi. La clau roman a determinar el moment ptim de maduresa per veremar el ram.
2.1. Evoluci dels compostos fenlics No s fins arribar al verol que la producci de fenols augmenta significativament, ja que durant el desenvolupament de la baia verda la seva sntesi t lloc en molt poca quantitat. La clau en la sntesi dels fenols es troba en el pas de la fenilalanina a l'cid cinnmic regulada per la fenilalanina-amonioliasa. A partir de l'cid es generen per una banda diversos no-flavonoides i per l'altra s'incorpora a un precursor procedent de la via del malonil-CoA que donar lloc al primer antoci, la cianidina-3-glucsid, de la qual deriven els altres antocians. L'elevada correlaci de les concentracions dels sucres amb les d'antocians ens suggereix la seva implicaci en el procs, tant perqu a partir dels sucres es formar el substrat de la sntesi com per a la possible incidncia de l'augment de potencial osmtic que ninduiria la sntesi 31. Dues o tres setmanes abans de la verema s'assoleix el mxim contingut de fenols, declinant lleugerament el seu nivell en funci de les condicions climtiques que tenen lloc en acostar-se a la verema. Les catequines i els esters de l'cid hidroxicinnmic disminueixen en la segona fase de la maduraci degut al creixement de la baia. Aix tamb els ocorre als tanins de les llavors, en una disminuci que sembla atribuble a processos doxidaci26 , i que contribueix a suavitzar l'astringncia global. En varietats blanques, on sn menors les concentracions, les catequines no tendeixen a la polimeritzaci. Entre els factors que influeixen en la sntesi i que determinen el contingut final de fenols a la verema cal esmentar les caracterstiques gentiques, la translocaci i acumulaci dels sucres a les baies, la disponibilitat daigua i la temperatura. 2.2 Factors que influeixen en la maduraci del ram
30
Strauss, CR; Wilson,B; Anderson,R; Williams, PJ. (1987) Development of precursors of C13 nor-isoprenoids flavorants in Riesling grapes. Am.J.Enol.Vitic 38, 23-27 (1987)
20
Introducci
Qualsevol factor que influeixi en el creixement de la planta incideix de manera directa o indirecta en la capacitat del cep de nodrir i madurar el seu fruit. Conseqentment, la major part de les prctiques vitcoles sencaminen a regular aquests factors per tal daconseguir un mxim rendiment, consistent amb la qualitat i la productivitat posterior del cep. La qualitat del ram depn de la varietat i de la interacci que estableix el cep amb el medi que lenvolta. Els factors edafoclimtics condicionen ladaptaci de les varietats a un ecosistema determinat. Lecosistema constitut pel clima-sl i la interacci daquest amb la planta juguen un paper fonamental en ladaptaci i en el desenvolupament de les varietats vinferes, aix com en el perode de maduraci de les baies, incidint directament en la composici del ram i en conseqncia en la qualitat del vi final 32. El contingut en compostos fenlics depn en primera instncia de la varietat; aix, per exemple, mentre que cabernet sauvignon i merlot tenen un potencial fenlic alt, en la garnatxa i el pinot les concentracions sn baixes. Les condicions climtiques tamb influeixen decisivament en els processos fisiolgics, en estimular el creixement primari o secundari i, per tant, conduir a un increment de la producci o a lactivaci de la sntesi de fenols, respectivament. Per altra banda, els ceps han dassolir un nivell destrs hdric determinat desprs del verolament, imprescindible per aconseguir un contingut ptim de compostos fenlics en la baia.
2.2.1. FACTORS CLIMTICS La temperatura i la pluviometria sn els parmetres climtics habitualment considerats per establir classificacions bioclimtiques i agrupar les varietats vinferes segons ladaptaci a una zona climtica determinada33.
31
Do,CB; Cormier, ,F. (1991).Accumulation of peonidin-3-glucoide enhanced by osmotic stress in grape (Vitis vinifera L.) cell suspension. Plant Cell Organ Cult. 24, 49-54 32 Rankine, B; Fornachon, J; Boehm, E; Cellier, K. (1971). Influence of grape variety, climate and soil on grape composition and quality of table wines; Vitis, vol 10, 33-50
21
2.2.1.1. Temperatura La temperatura t efectes en la fisiologia de les plantes, el creixement i el desenvolupament, ja que incideix en el procs fotosinttic. A ms, la temperatura activa els enzims i contribueix a la permeabilitat de membrana. En climes clids, durant la maduraci disminueix la sntesi dcid mlic i es consumeix rpidament en resposta a les altes temperatures que activen els enzims responsables de la seva metabolitzaci, de manera que les altes temperatures provoquen que els cids disminueixin de forma ms acusada i la prdua dacidesa es fa evident34. Lincrement de temperatures facilita l'acumulaci de sucres, excepte quan s'arriba a 32-35oC, per la seva repercussi en la disminuci de la fotosntesi35. En la sobremaduraci augmenten els sucres per deshidrataci. La temperatura tamb t un efecte molt important en la sntesi dels antocians. En general, en augmentar la temperatura incrementa la sntesi d'antocians, excepte quan s'excedeixen els 35oC 36. En moltes varietats s'estimula aquesta sntesi mitjanant les variacions de temperatures entre dia clid/nit fresca. Els aminocids incrementen amb la temperatura, sobretot prolina i arginina. En el potassi tamb s'observa un augment. Malgrat hom considera que les zones on les temperatures sn ms fredes t lloc una sntesi ms elevada d'aromes (com per exemple en pinot noir) cal esmentar que en aquestes condicions i en altres varietats com cabernet sauvignon, es desenvolupen aromes vegetals no desitjables 37.
2.2.1.2.Pluviometria La pluviometria s un parmetre climtic que juga un paper essencial en el desenvolupament de la vinya, ja que la disponibilitat daigua condiciona el creixement i desenvolupament de la planta, incidint en la sntesi i acumulaci de substncies a les baies durant el perode de maduraci del ram38. En aquest perode, lexistncia dun estrs hdric es tradueix en qualitat.
33 34 35
Winkler, A. (1984). Viticultura. Ed. Continental, Mxico. Chirivella, C., Haba, M., Prez, A. (1992) Evolucin de los cidos orgnicos durante el perodo de maduracin de la uva. Vitivinicultura, 7-8: 52-55.
Chaves, M., Rodrigues, M. (1987). Photosynthesis and water relations of grapevines growing in Portugal -response to environmental factors. Eds J. D. Tenhunen, F. M. Catarino, O. L. Lange and W. C. Oechel. Spring-Berlag, Berlin, 379-390. 36 Kliewer, WM. (1977). Influence of temperature, solar radiation and nitrogen on coloration and composition of Emperor grapes. Am J Enol Vitic , 28, 96-103 37 Heyman, H; Noble, AC. (1987) Descriptive analysis of Pinot noir wines from Carneros, Napa and Sonoma. Am. J. Enol. Vitic . (38), 41-44 38 Hidalgo, L.. (1980).La viticulture dans les pays semi-arides. Bulletin OIV, vol 598, 945-971
22
Introducci
La importncia de les precipitacions radica en el seu repartiment al llarg del cicle vegetatiu de la vinya. A les zones vitcoles mediterrnies sn caracterstiques les pluges de primavera i tardor, per la qual cosa en funci de la capacitat de retenci daigua en el sl i la seva profunditat, el dficit hdric estival variar39. La vinya s una planta considerada adaptada a la sequera, i per tant les precipitacions dhivern sn aprofitades per la planta per al seu desenvolupament i creixement, mentre que a lestiu lelement regulador que condicionar la fisiologia del cep ser la capacitat de retenci de laigua del sl i el nivell de la capa fretica 40.
2.2.1.3. Consideracions sobre lanyada Els registres dels elements climtics varien lleugerament dun any a laltre. Segons el moment fisiolgic en qu es trobi la planta, lefecte de la variaci pot tenir una influncia decisiva en la qualitat de lanyada. En la nostra zona climtica, les precipitacions al llarg del cicle presenten fora oscillacions segons lanyada i els seus efectes seran molt ms importants que la temperatura. Algunes anyades registren una pluviometria anual elevada, per un ter o gaireb la meitat de les precipitacions es donen a la tardor41, perode en qu el seu efecte resulta ms moderat. s si les precipitacions i la humitat sn abundants durant el perode final de maduraci quan poden comprometre la qualitat perqu comporten una disminuci de concentraci dels components de la baia i dels compostos fenlics en particular, a ms del risc dafavorir el desenvolupament de la botritis. La freqncia de precipitacions en vinyes situades prop de la costa va en detriment de la qualitat del ram, ja que provoca una disminuci en les concentracions de sucres i compostos fenlics42. La distribuci de temperatures durant el perode vegetatiu s ms homognia. Temperatures continuades que assoleixen els 40C van en detriment de la sntesi de fenols, doncs inhibeixen lactuaci de la fenilalanina amonio liasa (PAL)43. Aquesta situaci
39
Fregoni, M. (1977). Irrigation des vignobles. Problmes de physiologie, de biochemie, de gntique, dagronomie, de technologie et dconomie, Bulletin OIV, vol 551, 1-19 40 Nadal, M. (1993).Estudi dels factors ecolgics i de les condicions de maduraci del Cabernet Sauvignon per obtenir vins de qualitat al Priorat; Tesi doctoral, Dep. Bioqumica i Biotecnologia, Universitat Rovira i Virgili (URV)
41 42
Nadal, M. (2002). Els vins del Priorat, Ed. Cossetnia, Valls, Tarragona.
Nadal M.; Lampreave, M; Valls, J. (2000). Estrategias de riego en el cultivo de la vid y repercusiones en la calidad del mosto y vino. Viticultura y Enologia profesional, n extarordinario 2000, Nutri-fitos, pp 37-45
43
Roubelakis, K.; Kliewer, M. (1986). Effects of exogenous factors on phenylalanine ammonia-lyase activity and accumulation of anthocyans and total phenolics in grape berries. Am. J. Enol. Vitic ., 37, 4: 275-281.
23
saccentua en les varietats de baix potencial fenlic, en les quals dificulta el complet verolament de les baies.
2.2.1.4. Radiaci De l'energia que arriba a la superfcie terrestre, noms una petita part del visible s la utilitzada per les clorofilles i pigments en la fotosntesi. S'ha apuntat el paper del fitocrom tamb en la sntesi d'antocians. Les proporcions del fitocrom fisiolgicament actiu que arriben a canpies amb microclima adient sn de 60% en front el 20% en condicions dombrejament. S'ha de precisar que no depn el color del ram tan sols de l'exposici a la llum, sin tamb de la interacci amb altres factors dels quals depn el metabolisme secundari. Els efectes de la llum sn ms importants en les varietats de contingut mitj o baix en polifenols 44. Els rams ben exposats presenten una acidesa total ms elevada que els que es troben a l'ombra. Cal remarcar el que succeeix en les regions meridionals, on es suma a l'efecte de la llum el de la temperatura per la intensitat de radiaci ms alta i en conseqncia, els rams en qu toca el sol, presenten menors continguts en cid mlic a causa de lactivaci de lenzim mlic 45 En canvi, el contingut en sucres s menor en les baies ombrejades, efecte que pot ser causat per l'augment del seu volum, que implica una diluci dels seus components. En relaci a les aromes, les baies exposades mostren menors nivells d'aromes herbacis en sauvignon blanc, mentre que el contingut de norisoprenoides en altres varietats en resulta augmentat.
2.2.3. FACTORS EDFICS La fertilitat del sl i la seva capacitat d'emmagatzemar aigua determinen el creixement, el vigor de la planta i en conseqncia afecten indirectament a la maduraci del ram i a la relaci vegetaci/collita.
44
Morrison, JC; Noble, AC. (1990).The effects of leaf and cluster shading on the composition of Cabernet Sauvignon grapes and on fruit and wine sensory properties; Am J Enol Vitic . 41, 193-200 (1990) 45 Smart, R. and Robinson, M. (1991). Sunlight into wine. Ministry of Agric and F, New Zealand
24
Introducci
En particular, juguen un paper determinant en labsorci dels elements per part de la planta la textura i estructura del sl, la profunditat, la composici qumica, i el pH25 . La disponibilitat de l'aigua en el sl s el factor ms important vers la qualitat. La maduraci s'inicia en el verol en condicions en qu s'atura el creixement, i llavors el metabolisme secundari predomina al primari. La manca d'aigua lligada a les altes temperatures s imprescindible perqu es produeixi l'estrs hdric que desencadena tot el procs del verol. En cas contrari, els vins obtinguts disminueixen la seva concentraci, fet que s notablement ms acusat en el cas d'antocians.
2.2.4. FACTORS CULTURALS Les prctiques culturals afecten directament el creixement del cep i el desenvolupament del ram, i per tant indirectament tamb afecten la seva maduraci i l'acumulaci dels components de qualitat a la baia. L'increment de la collita comporta un esgotament dels ceps i no permet de madurar b tot el ram alhora que disminueix el potencial productiu pels anys vinents. S'ha d'aconseguir l'equilibri entre producci i qualitat i analitzar els factors que incideixen en la qualitat. El sistema de conducci, la poda, els tractaments, la fertilitzaci i la irrigaci determinen el vigor i el desenvolupament de la canpia, apropiats per obtenir un ram de maduraci ptima en el moment de la verema 46 Les collites excessives comporten un retard en la maduraci, augment de l'acidesa, menor acumulaci de sucres i de sntesi d'antocians i alhora menor concentraci en aromes. No sempre els baixos rendiments d'una vinya sn indicadors dun augment de qualitat si no estan equilibrats la superfcie foliar exposada i els rams a madurar. Un excs de vegetaci pot conduir a un augment del sombrejament en la canpia i a l'augment de la mida de les baies, disminuint la qualitat del ram47. El vigor de les vinyes es presenta com un factor negatiu pel desequilibri que suposa en el microclima de la planta; per aquest motiu en vinyes poc vigoroses s'aconsegueix una millor relaci vegetaci/ram que permet una maduraci lenta, arribant daquesta manera als mxims continguts de sucres, polifenols, i nivell d'acidesa propis de la varietat.
46 47
Argilier, J.P., (1989) "Interdpendance des facteurs de la qualit", Chambre Agric. Herault, Montpellier Schneider, A; Mannini, F; Gerbi, V; Zeppa, G. (1990).Effect of vine vigour of Vitis vinifera cv Nebbiolo clones on wine acidity and quality. A Proceedings of the 5th International Symposium of Grape Breeding, 525-531
25
2.2.4.1. Fertilitzaci La quantitat total de nutrients en el sl a disposici dels ceps prov majoritriament de la roca mare i de les aportacions realitzades en ladob de preplantaci. Ladob de manteniment representa unes aportacions addicionals suplementries mnimes de matria orgnica o adob qumic, i es realitza en funci de les caracterstiques del sl. El nitrogen estimula el desenvolupament vegetatiu i en les vinyes que gaudeixen de canpies ms denses, de manera que el ram acumula menys sucres i color. La fertilitzaci amb nitrats comporta una tendncia a la basicitat del pH a la cllula, que es compensa amb la sntesi de mlic 48. El potassi t un paper essencialment osmoregulador, determinant lestat de turgncia cellular i controlant leconomia de laigua a la planta a nivell estomtic. Per alts nivells de potassi causen un increment en la sntesi dcids mlic i tartrtic. Els dos cids (mlic i tartric) estan implicats en el manteniment de l'equilibri osmtic cellular, acumulant-se en el vacol per evitar una acidificaci del citoplasma. A causa al transport del potassi dins la cllula, per aconseguir lequilibri osmtic i la regulaci del pH cellular, s'estimula la sntesi d'cids. Tanmateix, el potassi causa un increment del pH, ja que forma sals amb els cids49.
2.2.4.2 Irrigaci Lobjectiu que es pretn amb el reg s satisfer les necessitats hdriques dels cultius quan aquestes no poden ser cobertes mitjanant lacci combinada de les pluges i les reserves del sl, per tal daconseguir maximitzar el rendiment, tant en quantitat com en qualitat, de la collita. 50 ,51 La vinya s una planta que es considera tradicionalment de sec, ja que precisa de relativament poques quantitats daigua per al seu cultiu, a causa de la seva gran capacitat dadaptaci, tant pel seu potent sistema reticular com per la resistncia protectiva consistent a reduir les prdues daigua per transpiraci 40,52. Naturalment, una abundant disponibilitat daigua afavoreix la producci, per tamb presenta una acci directa en la
48 49
Jackson, RS. (2000). Grapevine structure and function. A Wine Science: Principles, Practice, Perception 2nd Ed, Academic Press Iland, PG; Coombe, BG. (1988). Malate, tartrate, potassium, and sodium in flesh and skin of Shiraz grapes during ripening: Concentration and compartmentation. Am J Enol Vitic. 39, 71-76 50 Martn de Santa Olalla Maas,F; Juan Valero, J.A. (1992). Agronoma del riego; Ediciones Mundi-Prensa. 51 Urbano Terrn, P. (2002). Fitotecnia. Ingeniera de la Produccin Vegetal. Ediciones Mundi-Prensa 52 Lampreave, M. (2002). Fisiologia de labsorci en lecosistema vitcola sl-planta-atmosfera i repercussions en la qualitat del ram, Tesi doctoral
26
Introducci
qualitat. 53 La irrigaci de la vinya incideix en la seva fisiologia, que a la vegada pot afectar directament o indirecta el rendiment i la composici del ram, dos aspectes que tamb influencien la qualitat del most i del vi.54 Els efectes del reg en la vinya han estat objecte de nombrosos estudis en els darrers anys, estudis que aporten resultats molt diversos i a vegades contradictoris. En general, es pot establir que el reg proporciona uns majors rendiments 55,56,57,58,59,60,61. Quant als parmetres de composici del ram, el reg provoca un augment del pes de les baies 62, un increment dels slids solubles (Brix)63, i un increment de lacidesa total58. Tanmateix, sovint els resultats no aporten diferncies significatives60, 64, i fins i tot poden donar valors contraris57. Un dels aspectes ms estudiats respecte la influncia del reg en la qualitat del ram s el seu efecte sobre els compostos fenlics, ja que aquests sn un dels parmetres fonamentals que determinen la qualitat del ram. Novament es troben resultats diversos. En general, les concentracions dantocians i compostos fenlics en les baies decreix quan augmenta laplicaci daigua en la vinya, a causa principalment dun increment en el pes de la baia60 , mentre que les situacions de dficit daigua condueixen a una major concentraci de compostos fenlics65,66. No obstant aix, no sempre sarriba a aquestes conclusions 67. A ms, alguns autors observen lincrement dalguns compostos fenlics i la disminuci duns altres 68; la qual cosa sembla confirmar dos tipus de resposta del ram davant del dficit daigua: per una banda, un efecte indirecte i sempre positiu de concentraci dels compostos
53 54
Hidalgo, L. (1993). Tratado de viticultura general, Ediciones Mundi-Prensa. Esteban, M.A.; Villanueva, M.J.; Lissarrague, J.R. (2002). Relationships between different berry components in Tempranillo (Vitis vinifera L) grapes from irrigated and non-irrigated vines during ripening; J Sci Food Agric 82:1136-1146 55 Nadal,M; Arola, L. (1995). Effects of limited irrigation on the composition of must and wine of Cabernet Sauvignon under semi-arid conditions. Vitis, 34(3) 151-154 56 Maltabar, L. M.;Skobel'tsyn, Yu. A; Chausov, V. M. (1996). Different methods of irrigation and their influence on the crop of table grape Moldova, Vinograd i Vino (2) 2-5 57 Oliveira, M. (1995). Effect of soil water availability on the production of the variety Touriga Francesa in the demarcated region of Douro (Cima-Corgo); Ciencia e Tecnica Vitivinicola;12 (2) 59-71 58 Dettori S. (1993). Influence of irrigation on growth and ripening of the berries of grapevine variety Nuragus; Vignevini,20 (5) 77-81 59 Matthews, MA; Anderson, MM. (1989). Reproductive development in grape, Vitis vinifera L.:responses to seasonal water deficits; Am J Enol and Vitic ; 40, 52-60 60 Ginestar, C.;Eastham, J.;Gray, S.;Iland, P. (1998). Use of sap-flow sensors to schedule vineyard irrigation. I. Effects of post-veraison water deficits on water relations, vine growth, and yield of Shiraz grapevines; Am J Enol and Vitic ; 49 (4) 413-420 61 Mihalache L;Stan M Scripcariu C;Mustata P;Vasiloiu M;Tomoiu A;Miscu P;Tudorache A;Onciu C. (1989). The influence of irrigation upon the vine plantations, cultivated with wine grape varieties, under conditions of drought in the years 1986 and 1987; Anal Inst Cerc Pent Vitic si Vinif Valea Calug; 12, 165-180 62 Ojeda,H; Andary, C.; Kraeva, E.; Carbonneau, A.; Deloire, A. (2002). Influence of pre- and postveraison water deficit on synthesis and concentration of skin phenolic compounds during berry growth of Vitis vinifera cv. Shiraz; Am. J. Enol. And Vitic ., 53 (4) 261-267 63 Sipiora, M.J., Gutirrez Granda, M.J. (1998). Effects of pre-veraison irrigation cutoff and skin contact time on the composition, color, and phenolic content of young Cabernet Sauvignon wines in Spain; Am. J. Enol and Vitic ., 49(2)152-162 64 Osorio U., A.;Rodriguez V., A.;Alfaro P., R.. (1998). Efecto de dos regmenes de humedad del suelo en postcosecha sobre comportamiento de vid cv. Sultanina; Agricultura Tecnica; 58 (2) 123-132; 65 Matthews, M. A.; Anderson, M. M. (1988). Fruit ripening in *Vitis vinifera* L.: Responses to seasonal water deficits; Am J Enol and Vitic ;39 (4) 313-320 66 Freeman BM. (1983). Effects of irrigation and pruning of Shiraz grapevines on subsequent red wine pigments; Am J Enol and Vitic ; 34, 23-26 67 Esteban, M. A.; Villanueva, M. J.; Lissarrague, J. R. (2001). Effect of irrigation on changes in the anthocyanin composition of the skin of cv. Tempranillo (Vitis vinifera L.) grape berries during ripening; J Sci Food Agric ; 81 (4) 409-420 68 Kennedy, J. A.; Matthews, M. A.; Waterhouse, A. L. (2002). Effect of maturity and vine water status on grape skin and wine flavonoids; Am J Enol and Vitic;53 (4) 268-274
27
fenlics a causa de la reducci de la mida de la baia; i per altra, un efecte que ser positiu o negatiu segons el cas, i que dependr del tipus de compost, del perode daplicaci i de la severitat del dficit daigua62 . A ms, la irrigaci tamb sembla provocar una major extractabilitat dels antocians durant els inicis de la fermentaci, que condueix a un major color en el vi63 . La irrigaci tamb incideix en altres compostos del ram com sn els sucres, els aminocids, els cids grassos o el alcohols69. Sembla ser, doncs, que la resposta a la irrigaci dependr de diversos factor, entre els quals cal esmentar la varietat, lestadi de maduresa de pell i polpa en el moment de la collita, la disponibilitat de laigua en el sl, el mesoclima, les precipitacions i temperatura, la salinitat del sl70, la poda71, o el sistema de reg 52,72,73.
2.2.4.3. Sistema de conducci El sistema de conducci t una clara incidncia en el microclima del cep, ja que determina lalada i la disposici de la cobertura vegetal i, en conseqncia, de laprofitament de la llum per a la fotosntesi.40
69
Boubals D; Meriaux S; Rollin H; Panine M; Potier J-M; Lessut J; Guiraud J-L. (1984).Results of an experiment with localised and flood irrigation on seven varieties in the south of France. Bulletin de l'O.I.V.;57, 597-605 70 Walker, R. R.; Blackmore, D. H.;Clingeleffer, P. R.;Iacono, F. (1997). Effect of salinity and Ramsey rootstock on ion concentrations and carbon dioxide assimilation in leaves of drip-irrigated, field-grown grapevines ( Vitis vinifera L. cv. Sultana). Aust J of Grape and Wine Research; 3 (2) 66-74 71 Bravdo B; Naor A. (1995). Effect of water regime on productivity and quality of fruit and wine. Acta Horticulturae (427) 15-26 72 Sanderson G; Fitzgerald D. (1996). The effects of rootstock and irrigation on Sultana berry maturity; Australian Grapegrower & Winemaker, (390a) 119-120 73 Araujo F; Williams LE; Matthews MA. (1995). A comparative study of young 'Thompson Seedless' grapevines, Vitis vinifera L., under drip and furrow irrigation. II. Growth, water use efficiency and nitrogen partitioning. Scientia Horticulturae, 60 (3-4) 251-265
28
Introducci
REFERNCIES BIBLIOGRFIQUES
1.
Champagnol, F. (1984). Les composs phnoliques; a Elements de physiologie de la vigne et de viticulture generale. Ed. Dhan
2.
Souquet, JM; Cheynier, V; Sarni-Manchado, P; Moutounet, M. (1996). Les composs phnoliques du raisin. J. Int. Sci. Vigne et Vin, Hors srie, 99-107
3.
Jeandet, P; Bessis, R; Gautheron, B. (1991). The production of resveratrol (3,5,4trihydroxystilbene) by grape berries in different development stages. Am J Enol Vitic. 42: 41-46
4.
Lamuela-Raventos, R;M; Waterhouse, AL. (1999). Resveratrol and piceid in wine. Oxidants and antioxidants, pt A, 299, 184-190
5.
Ribreau-Gayon, P. (1964). Les composs phnoliques du raisin et du vin II. Les flavonosides et les anthocyanosides. Ann Physiol Veg 6, 211-242
6.
Cheynier, V; Moutounet, M; Sarni-Manchado, P. (2003). Los compuestos fenlicos. A Enologa: Fundamentos cientficos y tecnolgicos. Coord. Claude Fanzi, EMV Ediciones.
7.
Joutei, KA; Glories, Y. (1995). Tanins et anthocyanes: localisation dans la baie de raisin et mode dextraction. Rev Franaise dOenologie, 153, 28-31
8.
Singleton, V. (1987).Oxygen with phenols and related reactions in musts, wines and model systems: observations and practical implications. Am J Enol Vitic, 38, 69-76
9.
Glories, Y. (1984). La couleur des vins rouges. 1re partie Les equilibres des anthocyanes et des tannins. Conn. Vigne Vin, 18, 195-217
10.
Glories, Y. (1999). Substances responsibles for astrigency, bitterness and wine colour. J Internat Sci Vigne Vin, 33, 107-110
11.
Burns, J; Gardner, PT; ONeil, J; Crawford, S; Morecroft, I; McPhail, D; Lyster, C; Matthews, D; Mac Lean, MR; Lean, MEJ; Duthie, G; Crozier, A. (2000). Relationship among antioxidant activity, vasodilation capacity, and phenolic content of red wines. J Agric Food Chem, 48 : 220-230
12.
Nadal, M (2000). captol Fisiologia de la maduraci i factors que incideixen en la .. formaci dels principals components del ram en Parmetres qualitatius de la verema i el vi, CFEA, Centre de Formaci i Estudis Agrorurals Mas Sed, DARP, Reus, Tarragona
13.
Kennedy, J. (2002). Understanding grape berry development. Practical winery & vineyard, jul/aug 2002, 14-23
14.
Ruffner, HP . (1982). Metabolism of tartaric and malic acids in Vitis: a review, Vitis 21, 247-259
15.
Kennedy, J.A., Hayasaka, Y., Vidal, S., Waters, E.J., Jones, G.P. (2001) Composition of Grape Skin Proanthocyanidins at Different Stages of Berry Development. Journal of Agricultural & Food Chemistry 49: 5348-5355.
29
16.
Kennedy, J.A., Troup, G.J., Pilbrow, J.R., Hutton, D.R., Hewitt, D., Hunter, C.A., Ristic, R., Iland, P.G., Jones, G.P. (2000) Development of seed polyphenols in berries from Vitis vinifera L. cv. Shiraz. Australian Jour. of Grape & Wine Research 6: 244-254
17.
Stines, A.P., Grubb, J., Gockowiak, H., Henschke, P.A., Hj, P.B., van Heeswijck, R. (2000) Proline and arginine accumulation in developing berries of Vitis vinifera L. in Australian vineyards: influence of vine cultivar, berry maturity and tissue type, Australian Jour. of Grape & Wine Research 6:150-158
18.
Hashizume, K; Samuta, T. (1999). Grape maturity and light exposure affect berry methoxypyrazine concentration quality; Am J Enol Vitic 50: 194-198
19.
Creasy G-.L,., Price S. f., Lombard P. B. (1993). Evidence for xylem discontinuity in Pinot noir and merlot grapes: Dye uptake during berry maturation. Am J Enol Vitic, 44, 187192.
20.
Kliewer W. M. y Antcliff, A. J. (1970) Influence of defoliation, leaf darkening, and cluster shading on the growth and composition of Sultana grapes. Am J Enol Vitic, 21, 21-26
21.
Coombe, BG. (1992). Research on development and ripening of the grape berry. Am J Enol Vitic 43, 101-110
22.
Winkler, AJ; Cook, JA; Kliewer, WM; Lider, LA. (1974). General Viticulture. Univ of California Press, Berkeley
23.
Kennedy, J.A., Matthews, M.A., Waterhouse, A.L. (2000) Changes in grape seed polyphenols during fruit ripening. Phytochemistry 55: 77-85
24.
Kliewer, WM. (1967). The glucose-fructose ratio of Vitis vinifera grapes. Am J Enol Vitic. 18, 33-41
25.
Smart, R. E. (1982).Vine manipulation to improve grape wine quality , in Grape Wine Centennial Symposium of 1980, 362.375, U of California, Davis
26.
Wilson, B; Straus, CR; Williams, PJ. (1986). The distribution of free and glycosidicallybound monoterpenes among skin, juice and pulp fractions of some white grape varieties; Am. J. Enol. Vitic, 37, 107-114
27.
Strauss, CR; Wilson,B; Anderson,R; Williams, PJ. (1987) Development of precursors of C13 nor-isoprenoids flavorants in Riesling grapes. Am.J.Enol.Vitic 38, 23-27 (1987)
28.
Do,CB; Cormier, ,F (1991)Accumulation of peonidin-3-glucoside enhanced by osmotic stress in grape (Vitis vinifera L.) cell suspension. Plant Cell Organ Cult. 24, 49-54
29.
Rankine, B; Fornachon, J; Boehm, E; Cellier, K. (1971). Influence of grape variety, climate and soil on grape composition and quality of table wines; Vitis, vol 10, 33-50
30. 31.
Winkler, A. (1984). Viticultura. Ed. Continental, Mxico.
Chirivella, C., Haba, M., Prez, A. (1992) Evolucin de los cidos orgnicos durante el perodo de maduracin de la uva. Vitivinicultura, 7-8: 52-55.
30
Introducci
32.
Chaves, M., Rodrigues, M (1987). Photosynthesis and water relations of grapevines . growing in Portugal -response to environmental factors. Eds J. D. Tenhunen, F. M. Catarino, O. L. Lange and W. C. Oechel. Spring-Berlag, Berlin, 379-390.
33.
Kliewer, WM. (1977). Influence of temperature, solar radiation and nitrogen on coloration and composition of Emperor grapes. Am J Enol Vitic, 28, 96-103
34.
Heyman, H; Noble, AC. (1987) Descriptive analysis of Pinot noir wines from Carneros, Napa and Sonoma. Am. J. Enol. Vitic. (38), 41-44
35.
Hidalgo, L.. (1980).La viticulture dans les pays semi-arides. Bulletin OIV, vol 598, 945-
971
36.
Fregoni, M. (1977). Irrigation des vignobles. Problmes de physiologie, de biochemie, de gntique, dagronomie, de technologie et dconomie, Bulletin OIV, vol 551, 1-19
37.
Nadal, M. (1993).Estudi dels factors ecolgics i de les condicions de maduraci del Cabernet Sauvignon per obtenir vins de qualitat al Priorat; Tesi doctoral, Dep. Bioqumica i Biotecnologia, Universitat Rovira i Virgili (URV)
38. 39.
Nadal, M. (2002). Els vins del Priorat, Ed. Cossetnia, Valls, Tarragona.
Nadal M.; Lampreave, M; Valls, J. (2000). Estrategias de riego en el cultivo de la vid y repercusiones en la calidad del mosto y vino. Viticultura y Enologia profesional, n extarordinario 2000, Nutri-fitos, pp 37-45
40.
Roubelakis, K.; Kliewer, M (1986). Effects of exogenous factors on phenylalanine . ammonia-lyase activity and accumulation of anthocyans and total phenolics in grape berries. Am. J. Enol. Vitic., 37, 4: 275-281.
41.
Morrison, JC; Noble, AC. (1990). The effects of leaf and cluster shading on the composition of Cabernet Sauvignon grapes and on fruit and wine sensory properties; Am J Enol Vitic. 41, 193-200
42.
Smart, R. and Robinson, M. (1991). Sunlight into wine. Ministry of Agric and F, New Zealand
43.
Argilier, J.P., (1989) "Interdpendance des facteurs de la qualit", Chambre Agric. Herault, Montpellier
44.
Schneider, A; Mannini, F; Gerbi, V; Zeppa, G (1990). Effect of vine vigour of Vitis . vinifera cv Nebbiolo clones on wine acidity and quality. A Proceedings of the 5th International Symposium of Grape Breeding, 525-531 (1990)
45.
Jackson, RS. (2000). Grapevine structure and function. A Wine Science: Principles, Practice, Perception 2nd Ed, Academic Press
46.
Iland, PG; Coombe, BG. (1988). Malate, tartrate, potassium, and sodium in flesh and skin of Shiraz grapes during ripening: Concentration and compartmentation. Am J Enol Vitic. 39, 71-76
47.
Martn de Santa Olalla Maas,F; Juan Valero, J.A. (1992). Agronoma del riego; Ediciones Mundi-Prensa.
31
48.
Urbano Terrn, P. (2002). Fitotecnia. Ingeniera de la Produccin Vegetal. Ediciones Mundi-Prensa

49.
Lampreave, M. (2002). Fisiologia de labsorci en lecosistema vitcola sl-plantaatmosfera i repercussions en la qualitat del ram, Tesi doctoral
50. 51.
Hidalgo, L. (1993). Tratado de viticultura general, Ediciones Mundi-Prensa.
Esteban, M.A.; Villanueva, M.J.; Lissarrague, J.R. (2002). Relationships between different berry components in Tempranillo ( Vitis vinifera L) grapes from irrigated and nonirrigated vines during ripening; J Sci Food Agric 82:1136-1146
52.
Nadal,M; Arola, L. (1995). Effects of limited irrigation on the composition of must and wine of Cabernet Sauvignon under semi-arid conditions. Vitis, 34(3) 151-154
53.
Maltabar, L. M.;Skobel'tsyn, Yu. A; Chausov, V. M. (1996). Different methods of irrigation and their influence on the crop of table grape Moldova, Vinograd i Vino (2) 2-5
54.
Oliveira, M. (1995). Effect of soil water availability on the production of the variety Touriga Francesa in the demarcated region of Douro (Cima-Corgo); Ciencia e Tecnica Vitivinicola;12 (2) 59-71
55.
Dettori S. (1993). Influence of irrigation on growth and ripening of the berries of grapevine variety Nuragus; Vignevini,20 (5) 77-81
56.
Matthews, MA; Anderson, MM. (1989). Reproductive development in grape, Vitis vinifera L.:responses to seasonal water deficits; Am J Enol and Vitic; 40, 52-60
57.
Ginestar, C.;Eastham, J.;Gray, S.;Iland, P. (1998). Use of sap-flow sensors to schedule vineyard irrigation. I. Effects of post-veraison water deficits on water relations, vine growth, and yield of Shiraz grapevines; Am J Enol and Vitic; 49 (4) 413-420
58.
Mihalache L;Stan M Scripcariu C;Mustata P;Vasiloiu M;Tomoiu A;Miscu P;Tudorache A;Onciu C (1989). The influence of irrigation upon the vine plantations, . cultivated with wine grape varieties, under conditions of drought in the years 1986 and 1987; Anal Inst Cerc Pent Vitic si Vinif Valea Calug; 12, 165-180
59.
Ojeda,H; Andary, C.; Kraeva, E.; Carbonneau, A.; Deloire, A. (2002). Influence of pre- and postveraison water deficit on synthesis and concentration of skin phenolic compounds during berry growth of Vitis vinifera cv. Shiraz; Am. J. Enol. And Vitic., 53 (4) 261-267
60.
Sipiora, M.J., Gutirrez Granda, M.J. (1998). Effects of pre-veraison irrigation cutoff and skin contact time on the composition, color, and phenolic content of young Cabernet Sauvignon wines in Spain; Am. J. Enol and Vitic., 49(2)152-162
61.
Osorio U., A.;Rodriguez V., A.;Alfaro P., R.. (1998). Efecto de dos regmenes de humedad del suelo en postcosecha sobre comportamiento de vid cv. Sultanina; Agricultura Tecnica; 58 (2) 123-132;
62.
Matthews, M. A.; Anderson, M. M. (1988). Fruit ripening in *Vitis vinifera* L.: Responses to seasonal water deficits; Am J Enol and Vitic;39 (4) 313-320
63.
Freeman BM. (1983). Effects of irrigation and pruning of Shiraz grapevines on subsequent red wine pigments; Am J Enol and Vitic; 34, 23-26
32
Introducci
64.
Esteban, M. A.; Villanueva, M. J.; Lissarrague, J. R. (2001). Effect of irrigation on changes in the anthocyanin composition of the skin of cv. Tempranillo (Vitis vinifera L.) grape berries during ripening; J Sci Food Agric; 81 (4) 409-420
65.
Kennedy, J. A.; Matthews, M. A.; Waterhouse, A. L. (2002). Effect of maturity and vine water status on grape skin and wine flavonoids; Am J Enol and Vitic;53 (4) 268-274
66.
Boubals D; Meriaux S; Rollin H; Panine M; Potier J-M; Lessut J; Guiraud J-L. (1984).Results of an experiment with localised and flood irrigation on seven varieties in the south of France. Bulletin de l'O.I.V.;57, 597-605
67.
Walker, R. R.; Blackmore, D. H.;Clingeleffer, P. R.;Iacono, F. (1997). Effect of salinity and Ramsey rootstock on ion concentrations and carbon dioxide assimilation in leaves of dripirrigated, field-grown grapevines (Vitis vinifera L. cv. Sultana). Aust J of Grape and Wine Research; 3 (2) 66-74
68.
Bravdo B; Naor A. (1995). Effect of water regime on productivity and quality of fruit and wine. Acta Horticulturae (427) 15-26
69.
Sanderson G; Fitzgerald D. (1996). The effects of rootstock and irrigation on Sultana berry maturity; Australian Grapegrower & Winemaker, (390a) 119-120
70.
Araujo F; Williams LE; Matthews MA. (1995). A comparative study of young 'Thompson Seedless' grapevines, Vitis vinifera L., under drip and furrow irrigation. II. Growth, water use efficiency and nitrogen partitioning. Scientia Horticulturae, 60 (3-4) 251-265
33
Disseny de camp
El present estudi es va realitzar als terrenys Mas dels Frares, installacions de qu disposa la Facultat dEnologia en el terme municipal de Constant (Tarragona) (figura 7)74.
Maquinria
Moscatell gra petit
Ull de llebre
Merlot
4. Monastrell
45 varietats autctones catalanes
6. Carinyena 5. Garnatxa negra
1. Assaig reg Cabernet sauvignon
Ull de llebre
CAMP 1
Chardonnay Macabeu
CAMP 2
2. Assaig reg Ull de llebre Cabernet sauvignon
8. Merlot
7. Syrah
Cabernet sauvignon 3. Pinot noir
Figura 7. Mapa de la finca Mas dels Frares. En numeraci i negreta, varietats estudiades en la present tesi. Adaptat de Canals (1997)
Es van estudiar 8 varietats negres: Cabernet Sauvignon, Carinyena, Garnatxa, Merlot, Monastrell, Pinot noir, Syrah i Ull de llebre. El portaempelt com a totes les varietats s el Richter-110 i el marc de plantaci s de 2,80 m entre fileres i de 1,2 m entre plantes. El sistema de conducci s vertical simple, constitut per 3 nivells de fils, el dels braos a 60 cm dalada i dos ms tipus telgraf que determinen una distncia de 70 cm dalada de vegetaci. La poda s royat, deixant 3 o 4 caps per bra. El sl s de textura franc argilosa amb una capacitat de retenci hdrica mitjana. El percentatge de matria orgnica es troba als voltants de 1,2 i consta duna calcria activa del 10%.
74
Canals, JM. (1997). Aplicaci de tcniques de Cromatografia Lquida de Protenes (FPLC) a lestudi de vins blancs; Tesi Doctoral. Dept. Bioqumica i Biotecnologia, URV
37
Es proced a la determinaci i avaluaci de la composici fenlica de les 8 varietats durant diferents campanyes, principalment la 2000 i la 2002. Per a aix, es van fer determinacions de compostos fenlics totals, dantocians per HPLC, i de proantocianidines en les pells; aix com de proantocianidines en pinyols per a la campanya 2002. Les determinacions dantocians es van fer per a les campanyes 1998, 1999, 2000 i 2002. En el cas de Cabernet sauvignon i Ull de llebre, tamb es van fer els estudis de la influncia del reg en el contingut de compostos fenlics. El disseny de la plantaci s del tipus split-plot amb una distribuci a latzar en blocs de 4 repeticions per al Cabernet, i de 3 repeticions en el cas de lUll de llebre. Per cada repetici, en la parcella de Cabernet es va treballar amb 18 ceps per tractament de reg (6 ceps/filera) i en la dUll de llebre, amb 24 ceps/tractament (12 ceps/filera). En estudis previs efectuats en el nostre grup de recerca75 es va realitzar un clcul acurat de les necessitats hdriques del cultiu per determinar la dosi daigua a aplicar amb el reg, de manera que es van escollir les segents dosis: cabernet sauvignon: 0% ETc, i 80% ETc ull de llebre: 0 % ETc i 80% Etc
B1-NR B1-35 B1-R B1-60
B2-R B2-NR B2-60 B2-35
B3-35 B3-60 B3-R B3-NR
B4-60 B4-35 B4-NR
a) b)
B3-R B3-35 B3-R*
B2-35* B1-NR B2-R* B1-R B2R B1-35
B4-R
B3-35* B2-NR B1-35

Figura 8. Distribuci al camp dels blocs de repeticions per a) Cabernet sauvignon; b) Ull de llebre. Els nombres indiquen els % ETc aplicats en la parcel.la destudi. Es marquen en rosa els blocs utilitzats en el present treball. R= Reg (80% ETc); NR= No Reg (0% Etc).
B3-NR B2-35
B1-R*
La freqncia dirrigaci fou setmanal, i sajustava linici de la mateixa a finals de juny, tenint en consideraci per fixar aquesta data el valor de lETP i el nivell de precipitacions de lpoca. De la mateixa manera es va establir la data dinterrupci del reg, que es situ de manera general a partir de 2 setmanes del verolament.
75
Lampreave, M. (2002). Fisiologia de labsorci en lecosistema vitcola sl-planta-atmosfera i repercussions en la qualitat del ram, Tesi doctoral
38
Captol 1. Composici antocinica en les pells
1.1. INTRODUCCI
Els antocians (del grec anthos, flor, i kyanos, blau) sn colorants vegetals universals i les molcules responsables dels colors de tonalitat cian de ptals i fruits76. A part, tamb poden trobar-se en arrels, tiges i fulles. A nivell cel.lular, els antocians sn molcules hidrosolubles que es localitzen normalment en soluci dins de vacuoles, on a vegades sacumulen en unes vescules esfriques, anomenades antocianoplasts o inclusions vacuolars antociniques (AVI); tot i que a vegades aquestes estructures es poden localitzar tamb al citoplasma. 77 Els antocians de les flors i dels fruits jugarien un paper essencial com atraients visuals dels animals per a la pol.linitzaci i dispersi dels fruits; per s ms difcil explicarne la funci en altres rgans de la planta. El fet que es promogui la seva sntesi en presncia del.licitors i de radiacions UV fa creure que poden tenir una funci en la resposta a les infeccions microbianes, i tamb sespecula que poden actuar com a sensors o filtres de la llum 78. En el cas del ram, els antocians sn les molcules responsables del color vermell blavs de les pells dels rams negres i, conseqentment, participen en el color dels vins que se nobtenen. Daqu prov lenorme inters enolgic que comporta el seu estudi. En el ram, es localitzen a les pells i tamb a les 3 o 4 primeres capes cellulars de lhipodermis; i tamb es troben en el si de la polpa en les varietats tintoreres (com per exemple en les varietats Alicante Bouschet o Gamay Fraux)79.
76 77
Strack,D; Wray, V. (1994). The anthocyanins, a The flavonoids: Advances in research since 1986 Chapman & Hall Markham, KR; Gould, KS; Winefield, CS; Mitchell, KA; Bloor, SJ; Boase, MR. (2000). Anthocyanic vacuolar inclusions their nature and significance in flower colouration. Phytochemistry 55: 327-336 78 Chalker-Scott; L. (1999). Environmental significance of anthocyanins in plant stress responses. Photochemistry and Photobiology. 70(1): 1-9 79 Souquet, JM; Cheynier, V; Sarni-Manchado, P; Moutounet, M. (1996). Les composs phnoliques du raisin. J. Int. Sci. Vigne et Vin, Hors srie , 99-107
41
1.1.1 Estructura qumica

R1 OH B HO A O-Glc OH O
+
R2
Els antocians (figura 1.1.1) pertanyen a la classe qumica dels flavonoides, amb el sistema danells A (benzoil) i B (hidroxicinnamoil) caracterstic daquesta famlia de compostos. Sn hetersids: glicsids i acilglicsids de la molcula dantocianidina o antocianidol, que a la vegada deriva de lestructura del cati flavilium (2-fenilbenzopirili).
Figura 1.1.1. Estructura qumica dels antocians
Hi ha ms de 300 estructures antociniques descrites en la natura 76. Aquesta gran variabilitat ve determinada per 3 factors: 1) Segons els nivells dhidroxilaci dels substituents en posici 3 i 5 de lanell B, obtenim els 6 antocianidols ms comuns, dels quals en el gnere Vitis sen detecten 5 (figura 1.1.2).
OH OH HO O+ OH OH OH H HO O+ OH OMe OH H HO O+ OH OH OH OH OH
Cianidina
OMe OH HO O+ OH OH OH
Peonidina
OMe OH HO O+ OH OH
Delfinidina
OMe
Malvidina
Petunidina
figura 1.1.2. Estructura dels 5 principals antocianidols en Vitis
No sha detectat la presncia de laltra antocianidina comuna, la pelargonidina, en Vitis. En altres plantes shan detectat estructures ms inusuals, caracteritzades per la variaci (per desoxigenaci, hidroxilaci o metilaci) en els substituents de lanell A, de manera que shan arribat a identificar fins a 17 estructures dantocianidines en el regne vegetal76. Aquests antocianidols sn els que aporten les caracterstiques cromfores de lantoci, caracterstiques que a la vegada poden estar modulades pels substituents que presenti la molcula.
42
2) Lantocianidol (aglic) es combina amb un sucre per donar lhetersid, que s prpiament la molcula dantoci. Els antocians poden existir com a 3-monsids, 3-disids, o 3-trisids, aix com a 3,5-diglicsids i, ms rarament, 3,7-diglicsids, associats amb els sucres glucosa, galactosa, ramnosa, arabinosa i xilosa. En Vitis, el sucre s la glucosa, per pot variar la substituci segons lespcie. En Vitis vinifera existeixen noms els derivats 3glucsids; per en altres espcies presenten els derivats 3,5-diglucsids76 . 3) Aix mateix, el sucre pot estar acilat, s a dir, esterificat amb un cid (figura 1.1.3). Normalment aquest cid s lcid actic o algun cid-fenol com el cumric, el cafeic, o el ferlic. Recentment tamb shan trobat antocians acilats amb cids dicarboxlics com el malnic, el succnic, el mlic o loxlic.76
OMe OH HO O
+
OMe OH O CH2 O OH OH HO OH COCH3 O HO O

+
OMe O
OMe H2C O
O CO
OH
OH HO
OH OH
Malvidin-acetil-glucsid figura 1.1.3. Estructura qumica dels antocians acilats
Malvidin-p-cumaroil-glucsid
Les estructures poden esdevenir ms complexes, per la combinaci de diferents sucres amb diferents agents acilants; aix com per lassociaci de diverses molcules dantocians amb metalls per formar complexos, anomenats metal.loantocians. Lestructura qumica determina lestabilitat i reactivitat daquestes molcules. Aix, la peonidina i malvidina sn els ms estables i els acilats sn menys oxidables. Lestructura dels antocians presents en Vitis s de les ms senzilles dintre del regne vegetal, per malgrat aix la distribuci de cada molcula difereix entre espcies i varietats.
1.1.2. Perfil dantocians en Vitis La composici dantocians de la pell del ram sembla ser especfica de varietat80,81,82, la qual cosa ha fet que diversos autors hagin establert estadsticament la classificaci
80 81
Climent D; Pardo T. (1993). Study of the phenolic composition of Bobal, Grenache and Tempranillo grapes; Riv di Vitic e di Enol, 46 (3) 35-44 Ortega Meder, M. D.; Rivas Gonzalo, J. C.; Vicente, J. L.; Santos Buelga, C. (1994). Diferenciacin de variedades de uvas tintas por su composicin antocinica. Revista Espaola de Ciencia y Tecnologia de Alimentos, 34 (4) 409-426
43
jerrquica de les varietats dacord amb el seu perfil antocinic 83,84,85,86 i fa que es proposi aquesta caracterstica fenotpica com a fingerprint per a testar les varietats utilitzades en lelaboraci dun vi 87,88,89,90,91,92. Daquesta manera, aplicant anlisis estadstiques multivariants93,94 (components principals i anlisi de clusters) saborda la identificaci de les varietats, i shan arribat a redefinir varietats en algunes zones amb casos dhomonmia (s a dir, en casos en qu es donava el mateix nom a diferents varietats), o en casos de diferents noms en diferents zones per a una mateixa varietat95, 96,97. De totes maneres, sovint aquesta identificaci no queda prou establerta98 i s necessria lanlisi daltres factors fenotpics com les protenes dels pinyols, els isoenzims de la baia, la morfologia de llavors i fulles, etc. 99,100. Actualment, la determinaci del perfil antocinic sutilitza per testar noves metodologies didentificaci varietal fonamentades en lanlisi per Biologia Molecular de microsatl.lits101,102. En els diversos estudis que es troben a la Bibliografia referents a la caracteritzaci varietal a partir de la composici antocinica, es constatava que en les varietats de Vitis
82
Arozarena, I.; Casp, A.; Marn, R.; Navarro, M. (2000). Differentiation of some Spanish wines according to variety and region based on their anthocyanin composition. European Food Research and Technology, 212 (1) 108-112 83 Eder R;Wendelin S;Barna J. (1994). Klassifizierung von Rotweinsorten mittels Anthocyananalyse. 1. Mitteilung: Anwendung multivariater statistischer Methoden zur Differenzierung von Traubenproben. Mitteilungen Klosterneuburg, Rebe und Wein, Obstbau und Fruechteverwertung;44: 201-212 84 Scienza A;Piergiovanni L;Visai C;Conca E;Romano F. (1986). Il profilo antocianico delle uve quale mezzo tassonomico per il riconoscimento dei vitigni rossi. Vignevini, 13: 75-81 85 Roggero JP;Larice JL;Rocheville-Divorne C;Archier P;Coen S. (1988). Composition anthocyanique des cepages. I. Essai de classification par analyse en composantes principales et par analyse factorielle discriminante. Revue Francaise d'Oenologie, Cahier Scientifique, 28 (112): 41-48 86 Gonzlez-Neves, G.;Gmez-Cordovs, C.;Barreiro, L. (2001). Anthocyanic composition of Tannat, Cabernet Sauvignon and Merlot young red wines from Uruguay. Journal of Wine Research;12 (2) 125-133 87 Holbach, B.;Marx, R.;Ackermann, M. (1997). Determination of anthocyanins composition of red wine by HPLC. Lebensmittelchemie . 51 (4) 78-80 88 Gonzalez-San Jose ML; Santa-Maria G; Diez C. (1990). Anthocyanins as parameters for differentiating wines by grape variety, wine-growing region, and wine-making methods. Journal of Food Composition and Analysis;3: 54-66 89 Hesford, F.;Schneider, K. (1997). Anthocyanins, the natural red coloring matter of the wine. Schw. Zeit. fr Obst- und Weinbau;133 (22): 559-561 90 Katalinic, V.;Males, P. (1997). Compositional changes in grape polyphenols throughout maturation. Journal of Wine Research 8 (3): 169-177 91 Kallithraka, S.;Arvanitoyannis, I. S.;Kefalas, P.;El-Zajouli, A.;Soufleros, E.;Psarra, E. (2001). Instrumental and sensory analysis of Greek wines; implementation of principal component analysis (PCA) for classification according to geographical origin. Food Chemistry ;73 (4): 501-514 92 Garca-Beneytez, E; Revilla, E; Cabello, F. (2002). Anthocyanin pattern of several red grape cultivars and wines made from them. European Food Research and Technology, 215 (1):32-37 93 Scienza A;Failla O;Anzani R;Mattivi F;Villa PL;Gianazza E;Tedesco G;Benetti U. (1990). Possible similarities between the Lambrusco with cleft leaves and some cultivated and wild grapevines grown in southern Trentino, North Italy. Vignevini, 17 (9): 25-36 94 Otteneder, H.;Holbach, B.;Marx, R.;Zimmer, M.. (2002). Identification of grape cultivars in red wine by means of their anthocyanin spectra. Mitteilungen Klosterneuburg, Rebe und Wein, Obstbau und Frchteverwertung, 52 (5-6): 187-194 95 Calo A;Di Stefano R;Costacurta A;Calo G. (1991). Characterization of Cabernet franc and Carmenere, Vitis sp., and explanations on their cultivation in Italy. Rivista di Viticoltura e di Enologia. 44 (3) 3-25 96 Valenti, L.;Mastromauro, F.;Brancadoro, L.;Bogoni, M.;Mattivi, F. (1997). The description and evaluation of grapevine land races in Oltrepo Pavese, northern Italy. Journal of Wine Research, 8 (2) 87-102 97 Crespan, M.;Cal, A.;Costacurta, A.;Milani, N.;Giust, M.;Carraro, R.;Di Stefano, R. (2002). Ciliegiolo and Aglianicone: The only varieties with a direct relationship to Sangiovese. Rivista di Vitic e di Enologia, 255 (2-3): 3-14 98 Burns, J.;Mullen, W.;Landrault, N.;Teissedre, P. L.;Lean, M. E. J.;Crozier, A.. (2002). Variations in the profile and content of anthocyanins in wines made from Cabernet Sauvignon and hybrid grapes. Journal of Agricultural and Food Chemistry , 50 (14) 4096-4102; 99 Scienza A;Mattivi F;Villa P;Gianazza E;Tedesco G;Failla O. (1994). Genetic relationships between Teroldego and some wine grape genotypes of different geographic origin. Bolletino dell'Instituto Agrario;Supplemento al 2 (3) 23-32 100 Del Caro A;Franco MA;Sferlazzo G;Mattivi F;Versini G;Monetti A;Castia T. (1994). Characterization of anthocyanic profiles of Vitis vinifera grown in Sardinia. Vignevini, 21 (11) 63-69 101 Rossoni, M.;Fasoli, V.;Labra, M.;Spinardi, A.;Failla, O.;Scienza, A.;Sala, F. (2001). Exploration of elite grapevine germplasm of Oltrep pavese (northern Italy) using genetic, chemotaxonomic and morphological markers. Advances in Horticultural Science, 15 (1-4):72-78 102 Costantini, L.;Malossini, U.;Roncador, I.;Mattivi, F.;Grando, M. S. (2001). Cultivar identity control of Moscato rosa grapevines undergoing clonal selection. Advances in Horticultural Science, 15 (1-4): 56-60
44
vinifera noms es trobaven els derivats monoglucsids103. En canvi, en les espcies americanes, en particular Vitis riparia, Vitis rupestris i Vitis labrusca, aix com en els hbrids procedents dels seus respectius creuaments amb Vitis vinifera, es troben tamb els derivats diglucsids104. Aquesta distinci analtica va permetre descobrir la presncia de vins procedents de rams de varietats hbrides en vins comercialitzats amb denominaci dorigen105. Tanmateix, el desenvolupament de tcniques ms sensibles i acurades didentificaci i quantificaci han posat de manifest que es poden trobar antocians diglucosilats en Vitis vinifera, tot i que en molt baixos nivells 106. En Vitis vinifera lantoci majoritari s la malvidina; mentre que en Vitis aestivalis, Vitis coriacea i Vitis lincencumii s la cianidina. 107, i en altres espcies com Schiava o Groppello, pot arribar a ser la peonidina 84. En algunes varietats japoneses fins i tot es troba absncia dalgun daquests antocians majoritaris; com pot ser absncia de malvidina en les varietats Campbell Early i Ishihara, o de cianidina en les varietats Kokuho i Takao108. En tots els casos, els derivats majoritaris sn els glucsids no acilats. Segons la varietat canvien els nivells dels derivats acetilats o p-cumarilats, que sn els principals derivats acilats dels antocianidin-3-monoglucsids presents a Vitis vinifera. A ms, en menors proporcions, tamb es troben en algunes varietats antocians en qu lagent acilant s lcid cafeic o lcid fumric 109. Algunes varietats (com el Pinot Noir o el Noble) no presenten derivats acilats 110, o en presenten en molt baixes quantitats, com el Sangiovese111; mentre que en altres varietats com Syrah o Cabernet sauvignon els nivells dacilaci sn fora majors.
103 104 105
Golodriga Pla; Doubovienko NP. (1978). Anthocyanins and genotype in the vine Genet. Amelior. Vigne. IIe Symp. Intern., Bordeaux.INRA, 413-416 Flamini, R.;Tomasi, D.. (2000). The anthocyanin content in berries of the hybrid grape cultivars Clinton and Isabella; Vitis, 39 (2) 79-81 Blouin, J; Guimberteau, G. (2002). Maduracin y madurez de la uva; Ed Mundi-Prensa 106 Baldi, A; Romani, A; Mulinacci, N; Vincieri, FF; Casetta, B. (1995). HPLC/MS application to anthocyanins of Vitis vinifera L.. J Agric Food Chem 43 (8):2104-2109 107 Ribreau-Gayon,P. (1964). Les composs phenoliques du raisin et du vin. Ann,. Phhysiol. Vg INRA 108 Shiraishi Sh;Watanabe Y;Okubo H;Uemoto Sh. (1986). Anthocyanin pigments of black-purple grapes related to variety Kyoho (Vitis vinifera L. * V. labrusca L.. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science, 55 123-129 109 Yokotsuka K; Nishino N; Singleton VL. (1988). Unusual Koshu grape skin anthocyanins; American Journal of Enology and Viticulture ; 39: 288-292 110 Goldy RG;Ballinger WE;Maness EP. (1986). Fruit anthocyanin content of some Euvitis * Vitis rotundifolia hybrids. J Am Soc for Hort Sci; 111: 955-960 111 Baldi A; Romani A; Mulinacci N; Vincieri FF. (1993). Polyphenolic compounds in Tuscan varieties of Vitis vinifera L.. J Int Sci Vigne et du Vin;27 201215
45
La composici antocinica duna varietat pot tenir importncia en el procs delaboraci dels vins negres, ja que sha descrit que en el cupatge amb vins, les varietats que presenten majors nivells de derivats acilats en milloren el color112. Encara que alguns estudis no sostenen aquesta tesi 113,114,115, sembla que nombrosos factors poden alterar aquesta composici antocinica, com sn el sl116, el clima, lanyada 117,118, el terroir119; o les prctiques vitcoles com el sistema de conducci120, la fertilitzaci 121 o el reg122. Les variacions vindrien generalment donades en el sentit que aquests factors poden afectar lestadi de maduraci de les baies123. Aix, en condicions de maduraci equivalents, el perfil antocinic es mant fora com per varietats cultivades en diferents zones 120, 124, i fins i tot en el cas de secat natural de les baies 125. A ms, tamb sembla que els canvis en resposta al clima poden ser especfics de varietat 117. De totes maneres, s comunament acceptat que els nivells dantocians totals dependran ms dels factors climtics i de maduraci del ram que no pas de la varietat 126, 127.
1.1.3 Evoluci dels antocians al llarg de la maduraci Els diferents percentatges d'antocians i dels derivats acilats tenen una incidncia en l'estabilitat del vi i poden variar durant la maduraci i segons les varietats.
112
Bucelli P; Faviere V; Giannetti F; Gigliotti A. (1991). Analytical features and evaluation of the aptitude of Colorino grapes for improving the quality of Chianti wine.Vignevini, 18 (3): 57-62 113 Roson JP;Moutounet M. (1992). Quantits danthocyanes et de tanins des raisins de quelques cepages du sud-ouest en 1988 et 1989. Revue Franaise d'Oenologie , 32 (135): 17-27 114 Bucelli P;Faviere V;Giannetti F;Gigliotti A. (1995). Evaluation of phenolic components of some black grape varieties grown in Tuscany . Rivista di Viticoltura e di Enologia, 48 (1): 39-50 115 Aguilo F;Diez C. (1995). Anthocyanins and watering in Vitis vinifera L. (in: Brouillard, R.; Jay, M.; Scalbert, A. (Eds.): Polyphenols 94. 17th International Conference on Polyphenols, Palma de Mallorca, Spain, May 23-27, 1994); Colloques de l'INRA (69) 231-232, 1995 116 Yokotsuka, K.; Nagao, A.; Nakazawa, K.; Sato, M. (1999). Changes in anthocyanins in berry skins of Merlot and Cabernet Sauvignon grapes grown in two soils modified with limestone or oyster shell versus a native soil over two years. American Journal of Enology and Viticulture , 50 (1) 1-12 117 Di Stefano, R.; Moriondo, G.; Borsa, D.; Gentilini, N.; Foti, S.. (1994). Influenza di fattori climatici e colturali sul profilo antocanico varietale; Annali dell'Istituto Sperimentale per l'Enologia Asti, 25 (1) 31-46 118 Arozarena, I.; Ayestarn, B.; Cantalejo, M. J.; Navarro, M.; Vera, M.; Abril, I.; Casp, A. (2002). Anthocyanin composition of Tempranillo, Garnacha and Cabernet Sauvignon grapes from high- and low-quality vineyards over two years. European Food Research and Technology , 214(4)303-309 119 Vivas de Gaujelac, N; Nonier, MF; Guerra, C; Vivas, N. (2001). Anthocyanins in grape skins during maturation of Vitis vinifera L. Cv. Cabernet sauvignon and merlot noir from different Bordeaux terroirs; J Int Sci Vigne Vin, 35 (3) 149-156 120 Castia T;Franco MA;Mattivi F;Muggiolu G;Sferlazzo G;Versini G. (1992). Characterization of grapes cultivated in Sardinia: Chemometric methods applied to the anthocyanic fraction. Sciences des Aliments,12: 239-255 121 Keller, M; Hrazdina, G. (1998). Interaction of nitrogen availability during bloom and light intensity during veraison. II. Effects on anthocyanin and phenolic development during grape ripening. Am J Enol Vitic , 49 (3): 341-349 122 Sipiora, MJ; Gutirrez Granda, MJ. (1998). Effects of pre-veraison irrigation cutoff and skin contact time on the composition, color, and phenolic content of young Cabernet Sauvignon wines in Spain. Am J Enol Vitic , 49 (2): 152-162 123 Moriondo G;Gentilini N. (1992). Phenolic composition of some grape varieties grown in Valle d'Aosta. Riv Vitic e di Enol, 45 (3) 59-68 124 Bucelli, P.;Giannetti, F.;Dodi, S.;Scalabrelli, G. (1997). Preliminary results of anthocyanin and polyphenol studies with black grapes of Lunigiana, Italy. Annali dell'Istituto Sperimentale per l'Enologia Asti, 27 (1996-97) 221-234 125 Borsa, D.;Di Stefano, R. (2000). Polyphenol changes in colored grapes during drying. Rivista di Viticoltura e di Enologia, 53 (4) 25-35 126 Cacho J; Fernandez P; Ferreira V; Castells JE.(1992). Evolution of five anthocyanidin-3-glucosides in the skin of the Tempranillo, Moristel, and Garnacha grape varieties and influence of climatological variables. American Journal of Enology and Viticulture ; 43 244-248 127 Mateus, N.;Machado, J. M.;De Freitas, V.. (2002). Development changes of anthocyanins in * Vitis vinifera* grapes grown in the Douro Valley and concentration in respective wines. Journal of the Science of Food and Agriculture , 82 (14) 1689-1695
46
El contingut total dantocians al llarg de la maduraci va incrementant 128 , per es poden trobar estancaments o fins i tot mnims poc abans de la maduresa129,130. Levoluci dels antocians ha estat descrita en ocasions mitjanant un model polinomial131, en qu es recull aquest mnim abans de la maduraci, que sembla causat per un declivi i posterior increment dels derivats p-cumarilats i dels derivats acetilats i cafeoilats de la malvidina. Alguns autors proposen la sntesi dantocians com a ndex de maduraci de fruits132, aspecte que resulta particularment interessant a lhora de definir el moment de la verema. Aix, sha descrit una maduresa de la pell, i un moment ptim de maduraci en qu els continguts de sucre romandrien estables, just abans que comencin a decrixer els nivells dantocians 133. A partir de levoluci dels nivells dantocians al llarg del verolament i la maduraci, tamb sintenta establir la correspondncia dactivitats en la via enzimtica. Aix, els nivells alts de delfidina i cianidina indiquen unes altes activitats flavonoid hidroxilasa134, que sn els enzims que regulen el pas dels esquelets flavonoids cap a la sntesi dantocians, que es distribueix en 2 branques. Tamb resulta clau el paper de lenzim calcona sintasa, ja que competeix amb lestilben sintasa, responsable de la sntesi de resveratrol135.
Fenilalanina
PAL C4H, 4CL CHS
Naringenina calcona
CHI
Naringenina flavanona
F3'H F3H F3'5'H F3'5'H Pentahidroxiflavanona
Dihidrokaempferol Eriodicitol
F3H
F3'H
Dihidroquercetina
DFR
Dihidromiricetina
DFR
Leucocianidina
LDOX
Leucodelfinidina
LDOX
Cianidina
UFGT
OH OH
El model proposat per Roggero et al contempla dues vies de sntesi dels antocians en Vitis vinifera, una que deriva en la cianidina, i una altra que ho fa en la delfinidina. Posteriorment, aquests antocians poden donar lloc als altres antocians per metilaci dels grups hidroxil de lanell. Aix, de la cianidina es genera, per acci de metiltransferases, la peonidina;
136
Delfinidina
UFGT
OH OH
+
Lanaridis, P.; Tzourou-Bena, I.(1997).ChangesOof anthocyanin contents during berry ripening of five greek red wine cultivars. Journal International des H O HO O OH H Sciences de la Vigne et du Vin, 31 (4) 205-212 OGl uc 129 Jordao, OGl uc M.; Ricardo da Silva, delfinidina-3-glucsid O H (1998). Evolution of anthocyanins during grape maturation of two varieties (*Vitis vinifera* L.), A. J. M.; Laureano, O. OH MT Castelao Frances and Touriga Francesa.Vitis, 37 (2) 93-94 cianidina-3-glucsid MT MT 130 Gonzalez-San Jose ML; Diez C. (1992). Compuestos fenlicos en el hollejo de uva tinta durante la maduracin. Agrochimica; 36 63-70 131 OM e OM e Gonzalez-SanJose ML; Barron LJR; Diez C. (1990). Evolution of OH OM e anthocyanins during maturation of Tempranillo grape variety, Vitis vinifera, using OH OH polynomial regression models. Journal of the ScienceHof Food and Agriculture , 51 Fig 1.1.4. Vies biosinttiques dels antocians. 337-343 O O 132 H O F3H = flavanoid-3 hidroxilasa; F35H=flavanoid-3,5-hidroxilasa HO Chalmers, DJ; Faragher, JD;ORaff; JW. (1973).OH O OM e Changes in anthocyanin synthesis as an index of maturity in red apple varieties; J. Hort Sci, 48: 387-392 H 133 MT=metiltransferases Barcelo, J. Glu c (1997). Management of berry ripening from enological point of view. Effects on Syrah Cotes du Rhone quality wines. Progres Agricole et M. O Gluc OGl uc O OH Viticole , 114 (12) 281-286 OH OH 134 malvidina-3-glucsid Lamikanra O. Development of anthocyanin pigments in muscadine grapes.HortScience, 23 597-599 petunidina-3-glucsid peonidina-3-glucsid 135 Jeandet P; Sbaghi M; Bessis R; Meunier P. (1995). The potential relationship of stilbene, resveratrol, synthesis to anthocyanin content in grape berry skins. Vitis,34 (2) 91-94 136 Roggero, JP; Coen, S; Ragonnet, B. (1986). High performance liquid chromatography survey on changes in pigment content in ripening grapes of Syrah. An approach to anthocyanin metabolism. Am J Enol Vitic , 37, 77-83
+ + + +
128
47
mentre que a partir de la delfinidina es generarien la petunidina i la malvidina 137, com es recull en la figura 1.1.4 No obstant aix, el contingut de malvidina monoglucsid pot decrixer i el de delfinidina monoglucsid augmentar al llarg de la maduraci, la qual cosa aporta dubtes al model biosinttic dorigen dels antocians monoglucsid presentat per Roggero et al 117. En concret, observacions en la varietat Nerello Mascalese, en qu canviant les condicions dentorn i culturals, hi ha canvis en els continguts de cianidina i malvidina, i fins i tot pot acabar sent la cianidina el pigment principal, discrepen daquest model biosinttic117 . Tamb hi ha hagut nombrosos estudis centrats en el paper de la UFGT (UDPGflavonoid-glicosil transferasa), que s un enzim que es localitza noms a les pells 138 i que s el responsable de la glucosilaci de les antocianidines, i que est per tant estrictament relacionat amb la sntesi dantocians. El gen corresponent es troba tamb present en les varietats blanques, per no sexpressa. Aix fa que aquestes varietats, en qu s hi sn presents les proantocianidines, no presentin antocians 139; i que es formuli la hiptesi que el canvi fenotpic de varietats blanques a varietats negres fos resultat duna mutaci en el gen regulador que controla lexpressi daquest gen UFGT140. 1.2. OBJECTIUS Els nostres objectius consistiren a: 1. Abordar la diferenciaci de les varietats negres cultivades en la finca Mas dels Frares a partir de lanlisi de la seva composici antocinica, tot establint-ne la mateixa. 2. Estudiar els efectes de lanyada sobre el contingut dantocians totals i sobre els antocians individuals, tot posant de manifest la influncia climtica sobre la mateixa. 3. Estudiar les variacions en la composici antocinica al llarg del procs de maduraci del ram, per tal de relacionar-les amb els models de biosntesi. 4. Estudiar lefecte de la variable irrigaci sobre la composici antocinica en les varietats ull de llebre i Cabernet sauvignon.
137
Fernndez-Lpez, JA; Almela, L; Muoz, JA; Hidalgo, V; Carreo, J. (1998). Dependence between colour and individual anthocyanin content in ripening grapes. Food Research International, vol 31 (9), 667-672 138 Boss PK; Davies C; Robinson SP. (1996). Expression of anthocyanin biosynthesis pathway genes in red and white grapes. Plant Mol Biol, 32 (3) 565-569 139 Boss PK; Davies C; Robinson SP. (1996). Anthocyanin composition and anthocyanin pathway gene expression in grapevine sports differing in berry skin colour.Australian Journal of Grape and Wine Research; 2 (3) 163-170 140 Kobayashi, S.; Ishimaru, M.; Ding, C. K.; Yakushiji, H.; Goto, N. (2001). Comparison of UDP-glucose:flavonoid 3-*O*-glucosyltransferase (UFGT) gene sequences between white grapes (*Vitis vinifera*) and their sports with red skin. Plant Science, 160 (3) 543-550
48
1.3. METODOLOGIA
1.3.1). Extracci dels compostos fenlics: 0.5 g de mostra congelada i pulveritzada en nitrogen lquid sextreuen a lultrasons, controlant-ne la temperatura, 3 vegades amb un volum de 25 ml detanol absolut (Panreac, SA) acidulat amb un 1% dcid frmic (Panreac, SA). Lextracci no s possible amb metanol i cid clorhdric, metodologia que a vegades sutilitza en lextracci dantocians totals, ja que en aquestes condicions est descrit que es produeix hidrlisi dels derivats acetilats 141. Lextracte sevapora fins a sequedat (aprox 20 minuts) en rotavapor a una temperatura inferior a 40 C. El residu sec es redisol en una soluci de metanol (Panreac, SA) 50% acidulat amb 1% dcid frmic, i senrasa a un volum de 10 ml. Es guarda fins a lanlisi dels antocians per HPLC en alquotes a -20C. 1.3.2) Determinaci espectofotomtrica dantocians totals: sefectua mitjanant la mesura de la lectura dabsorbncia a 535 nm. Pels clculs, sutilitza el valor dabsorbncia que dna una soluci patr de malvidina-3-glucsid (Extrasynthese) 0,175 mg/ml.
1.3.3) Anlisi dantocians individuals Histricament, lanlisi dantocians de les pells del ram sha abordat amb diferents metodologies. Els primers estudis mitjanant cromatografia en capa fina (TLC) permetien la detecci i la separaci pels seus valors de Rf de derivats mono- i diglucsids, i fins i tot separar els 3-glucsids entre s i diferenciar-los respecte els corresponents derivats acilats 142,143. El principal problema de la Cromatografia en Capa Fina s que permet la separaci i identificaci dalguns antocians, per en fa difcil la quantificaci, tot i que es poden recollir valors dabsorci que permeten per una banda fer una estimaci i per l'altra establir les longituds dona dabsorci dels compostos144.
141
Anderson, DW; Gueffroy, DE; Webb, AD; Kepner, RE. (1970). Identification of acetic acid as an acylating agent of anthocyanin pigments in grapes; Phytochemistry , vol 9 (7): 1579-83 142 Shiraishi S; Watanabe Y. (1988). Anthocyanin pigments in the blue-black tetraploid grape cultivars 'Black Olympia', 'Pione' and 'Izunishiki', Vitis vinifera L. * V. labrusca L. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science; 57 (1) 17-21 143 Shiraishi SI; Watanabe Y. (1993). Anthocyanin pigments in the grape skins of several red Vitis vinifera cultivars bred in Japan. Journal of the Faculty of Agriculture Kyushu University ; 36 (1-2) 63-67 144 Lay H; Draeger U. (1991). Profiles of the pigments from different red wines. Wein-Wissenschaft, 46: 48-57
49
Les metodologies fonamentades en lanlisi per HPLC dels antocians han suposat un gran aven en el seu estudi, ja que en permeten una separaci ms eficient. La columna acostuma a ser de fase reversa, i sutilitza un sistema de bombes en qu la fase mbil va augmentant de polaritat, emprant-se com a solvent metanol o acetonitril, segons els casos; i amb un acidificador, que pot ser el frmic o lcid perclric145.
En el nostre cas, lequip utilitzat s un sistema modular (Agilent) amb 4 bombes i equipat amb un detector de longitud dona mltiple. La separaci sefectua en un columna Waters Spherisorb ODS2 (4.6 x 250 mm) amb control de temperatura a 40C. Els solvents emprats sn una soluci A (cid frmic: aigua, en relaci 10:90) i una soluci B (metanol: aigua : cid frmic, en relaci 45:45:10). Les condicions de gradient sn: 0 minuts: 20%B, flux 1.5 ml/min; 15 minuts: 40%B, flux 1.5 ml/min; 25 minuts: 80%B, flux 2 ml/min; 30 minuts: 80%B, flux 2 ml/min; 33 minuts: 20%B, flux 1.5 ml/min. Dintre del procediment experimental, el primer aspecte que exposarem en la present tesi s la identificaci dels compostos antocinics mitjanant el mtode cromatogrfic proposat. La separaci cromatogrfica dels antocians s un aspecte freqentment abordat per la bibliografia, i lassignaci cromatogrfica dels pics sefectua a partir dels temps de retenci. Aix, un cromatograma tpic donaria el perfil que es representa en el
No acilats
acetilats p-cumarilats
cromatograma 1.3.1. Separaci cromatogrfica dels antocians de les pells del ram. 1: Dp-3-glu; 2: Cy-3-glu; 3: Pt3-glu; 4: Pn-3-glu; 5: Mv-3-glu; 6: Dp-ac-glu; 7: Cy-ac-glu; 8: Pt-ac-glu; 9: Pn-ac-glu; 10: Mv-ac-glu; 11: Dp-pc-glu; 12: Mv-cf-glu; 13: Cy-pc-glu; 14: Pt-pc-glu; 15: Pn-pc-glu; 16: Mv-pc-glu. Dp=delfinidina; Cy=cianidina; Pt=petunidina; Pn=peonidina; Mv=malvidina; glu= glucsid; ac = acetil; pc=p-cumaril
cromatograma 1.3.1.
145
Revilla, E.; Garca-Beneytez, E.; Cabello, F.; Martn-Ortega, G.; Ryan, J. M. (2001). Value of high-performance liquid chromatographic analysis of anthocyanins in the differentiation of red grape cultivars and red wines made from them. Journal of Chromatography A, 915 (1-2) 53-60
50
Com es pot observar, primer elueixen els antocians lliures, i posteriorment apareixen successivament els derivats acetilats i els p-cumarilats. Tanmateix, sovint elueixen pics simultniament als derivats acilats que dificulten lassignaci correcta dels compostos, de manera que es va emprar una tcnica didentificaci per assegurar-ne la correcci. 1.3.4) Sistema HPLC-MS Per a assignar correctament els pics als compostos, es va proposar la utilitzaci de lacoblament HPLC-MS. En un primer moment, es va pensar a utilitzar-lo amb la interfase de particle beam, que shavia mostrat efectiva a lhora didentificar dmers de catequina en altres treballs dintre del Departament146. En aquesta metodologia, la molcula es fracciona donant diferents fragments, i la hiptesi de partida fou que els trencaments es produirien preferentment per les regions ms lbils, Figura 1.3.1. Llocs de trencament corresponents als enllaos esters. Daquesta manera, hipottics de la molcula dantoci es podrien obtenir per una part lantocianidina, duna altra el sucre, i finalment lagent acilant (figura 1.3.1). No obstant aix, el trencament de la molcula en el nebulitzador no proporcion en cap cas un fragment visible que correspongus a la mida de lanell fenlic, i noms sapreciaven en algunes ocasions els pics corresponents al sucre.
OM e OH HO O
+
OM e
OH
OH
O C H2OH
Aix provoc que es decids a canviar de tcnica. La metodologia emprada fou la de HPLC-ESI-MS. En aquest cas, la interfase delectrospray provoca una ionitzaci suau de la molcula, de manera que produeix els ions [M]+ en alta abundncia. Un aspecte limitant daquesta tcnica s que serveix per assignar la massa molecular, per no dna fragments que desprs puguin servir per a reconstruir i interpretar lestructura de la molcula. De totes maneres, considerant que es disposava dun coneixement previ fora acurat de les molcules que podien trobar-se, saccept que era una tcnica totalment vl.lida per abordar el problema. Un altre conflicte era la limitaci del flux dentrada al detector, que es va haver de reduir a 1 ml/minut. Aix, encara que no afectava la resoluci dels antocians per la columna, s que provocava un retard dels temps de retenci, que desprs havien de tornar a ser reassignats per les condicions cromatogrfiques de treball rutinari.
146
Bernardino Garca. (2000). Treball de 12 crdits. URV.
51
Per poder recollir els ions en el detector de masses i que aquests donin un senyal prou quantitatiu, es va partir d unes concentracions elevades dels compostos, de manera que es van efectuar extraccions dels antocians per les diferents varietats del ram i desprs es van concentrar en el rotavapor fins arribar a uns nivells dantocians, determinats pel mtode espectrofotomtric, de 10 mg/ml. Aix era sobretot necessari per als antocians acilats, ja que shavia observat que els seus nivells en les pells eren sempre inferiors als dels antocians lliures. En la utilitzaci daquesta tcnica sobtenien millors resultats si sefectuava una restricci de les masses a detectar. Aix doncs, es van considerar noms les masses moleculars dels antocians descrits a Vitis. En la Taula 1.3.1 es recullen els compostos que prviament shavien pogut identificar emprant aquesta metodologia:
[M]+ 449 463 465 479 493 compost Cy-3-glu Pn-3-glu Dp-3-glu Pt-3-glu Mv-3-glu [M]+ 491 505 507 521 535 compost Cy-ac-glu Pn-ac-glu Dp-ac-glu Pt-ac-glu Mv-ac-glu [M]+ 595 609 611 625 639 compost Cy-pc-glu Pn-pc-glu Dp-pc-glu Pt-pc-glu Mv-pc-glu [M]+ 547 655 561 517 625 compost Pt-piruvilglucsid Mv-cf-glu Mv-piruvilglucsid Vitisina B Pn-cf-glu
Taula 1.3.1. Masses moleculars dels diferents antocians detectats per HPLC-MS
Com que de fet els dubtes provenien dels antocians en les regions acilades, i per tal de no saturar el detector, el 80000 70000 que es va fer a la prctica va 60000 ser injectar les mostres al 50000 HPLC sense acoblar-hi el 40000 30000 masses fins al moment en qu 20000 havien sortit els 5 pics 10000 corresponents als antocians 0 20 30 40 50 60 lliures. ab491 ab505 ab507 ab521 ab535 ab595 ab609 ab611 ab625 ab627 ab639 ab655 En el cromatograma Cromatograma 1.3. 2. Eluci cromatogrfica dels pics. En la llegenda sindica 1.3.2 es recull lordre deluci la massa molecular del i M+ pels pics que donaven senyal per a una mostra de merlot.
52
A partir dels resultats obtinguts, es va poder establir la seqncia dantocians que caracteritzava cadascuna de les varietats estudiades. Lordre deluci dels antocians, un cop adaptat al mtode de HPLC sense acoblament al espectrmetre de masses, era el segent:
tR (min) 3.7 4.6 5.5 6.1 8.7 compost Dp-3-glu Cy-3-glu Pt-3-glu Pn-3-glu Mv-3-glu tR (min) 10.5 12.6 14.0 15.6 13.2 compost Dp-ac-glu Cy-ac-glu Pt-ac-glu Pn-ac-glu Mv-ac-glu tR (min) 16.9 17.1 18.0 19.4 21.3 21.7 compost Dp-pc-glu Mv-cf-glu Cy-pc-glu Pt-pc-glu Pn-pc-glu Mv-pc-glu
Taula 1.3.2. Temps de retenci dels diferents antocians detectats per HPLC-MS
Un cop establerts els temps de retenci dels principals antocians presents, es proced a lanlisi dels antocians per a cada varietat en les diferents campanyes.
3.5) Anlisi estadstica Els valors presentats corresponen a mitjanes de triplicats. Per tal dobtenir-ne les mitjanes i desviacions i determinar-ne les diferncies significatives per tractament i per data de mostreig es va aplicar lanlisi de la variana i el test de Fisher, utilitzant un nivell de probabilitat p0.05 mitjanant el programari Statview. El software utilitzat en lanlisi multivariant s el Pirouette 2.6 (Infometrix, Inc. (Woodinville, WA).
53
4. RESULTATS I DISCUSSI 1) Perfil antocinic de diferents varietats en el moment de la collita Lanlisi de la composici antocinica de les diferents varietats es va efectuar a partir de les mostres de la collita i les de dates prximes, ja que, com es comentar posteriorment en aquest captol, el perfil resulta modificat al llarg de levoluci. Per fer lanlisi de grups, es va treballar amb els resultats de 5 anys per a Cabernet sauvignon i ull de llebre; i els de tres campanyes per a la resta de varietats. La grfica 1.4.1.1 recull les agrupacions que resulten de lanlisi de components principals:
Cab99-collita99 Cab99-15/9/99 Cab99-8/9/99 CS99 R-2/9/99 CS99 NR-2/9/99 CS02 nr 3/9/02
Cabernet sauvignon
10 Factor2
CS02 r CS02 nr 13/9/02 3/9/02 CS02 r 27/9/02 sy023/9/02 nr 27/9/02 CS02
CS00 NR-12/9/00 CS98 NR-12/9/98 CS00 R-12/9/00 CS98 R-12/9/98 CS00 NR-26/9/00 CS98 NR-26/9/98 CS00 R-26/9/00 CS98 R-26/9/98 CS02 r 13/9/02
mt02 13/9/02
Pinot noir
pn02 13/8/02 pn00collita 0 0 pn01 collita01 gx00 4/9/00 mon02 3/9/02 gx00 coll /00 mon01 collita 01
PN02 9/8/02
mt02 3/9/02
Merlot
mt00 4/9/00
mt99 -8/9/99 13/9/02 sy02 sy004/9/00
Garnatxa
gx02 gx02 3/9/02 13/9/02 mt01 collita0 1
mt00 collita0 0
gx99-15/9/99 car023/9/02 car023/9/02
sy023/9/02 gx99-collit99
Syrah
sy00 coll 0 0
-10
mon00 collita 0 0 mon00 4/9/00 ull 99r-15/9/99
Monastrell
Car00 4/9/00 ull 01collita 01 ull 99nr-15/9/99 car0220/9/02 car0213/9/02 Ull98R 14/9/98 Ull98nr 14/9/98 00R 16/9/00 00nr 16/9/00 ull 02r 3/9/02 car 00collita 00
Ull de llebre
Carinyena
ull 02nr 3/9/02 Car99 15/9/99 car01collita01 Car 99collit99
-20
-20
0 Factor1
20
Grfica 1.4.1.1. Agrupaci de les varietats estudiades segons els seus scores en lanlisi discriminant
Tenint en compte el pes que t cada variable estudiada en els factors, hom pot observar que Cabernet sauvignon es diferencia clarament de la resta de varietats vinferes pel factor 2. En aquest factor hi participen majoritriament, pel que es pot deduir de la representaci dels loadings (Grfica 1.4.1.2), que recull la participaci de cada variable en el factor, les variables acetilaci (participaci positiva) i p-cumarilaci (participaci negativa). Per tant, Cabernet sauvignon subica en una zona que correspon a uns alts nivells
54
dacetilaci, i baixos de p-cumarilaci; mentre que en ull de llebre i carinyena succeeix el contrari. 0.6 ac- glucsid Pinot noir, Merlot i Syrah es Mv-ac-glu diferencien pel factor 1. En aquest cas, els loadings provenen de la proporci 0.2 Mv dacilaci (tant amb actic com amb pcumric). Syrah seria la varietat a qui 3- glucsid correspondrien els majors valors -0.2 dacetilaci, encara que els seus valors sn Mv-pc-glu pc-glucsid molt dispersos, seguida de Merlot. En -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 garnatxa i monastrell hi ha un menor nivell Factor1 dacilaci, per no diferirien gaire, encara Grfica 1.4.1.2. Grfica dels loadings de lanlisi que a Monastrell li correspondria una de components principals. major proporci de derivats p-cumarilats, ja que els seus scores corresponen a valors ms negatius del factor 1. Finalment, en el cas de Pinot noir correspondrien els valors ms elevats de 3-glucsids. De la grfica dels loadings hom pot apreciar que les variables que aporten ms informaci en els components principals (explicant-ne un 85% de la varincia) sn el
S Pn Mv-3-gluPn -3-glu
Pn-ac-glu Dp-ac-glu TOTAL C y-ac-Pt-ac- lu glu g C y-pc cS C y-3- glu-glu - lu y C Pn- p glu g M -cafeoil v Dp-3- S Dp Dp- gluglu p cPt-3- luPt-pc -glu g S Pt
Factor2
sumatori dacetilaci ( ac-glucsid), el sumatori de p-cumarilaci ( pc-glucsid), i el sumatori de no acilaci ( 3-glucsid). Dintre de les acilacions, tamb intervenen preponderantment els nivells en Malvidina acilada (Mv-ac-glu i Mv-pc-glu), cosa que concorda amb el fet que s la malvidina lantoci majoritari en totes les varietats (i, per tant, hi ha una dependncia clara entre el contingut de malvidina acilada i el contingut total dacilaci). En canvi, el percentage de varincia que expliquen els antocianidin-3monoglucsid individuals s fora baix i, per tant, no semblen ser el principal factor de diferenciaci entre varietats. En resum, la quantitat dantocians acetilats i p-cumarilats serien el principal criteri que permetria la separaci de les varietats, dacord amb lanlisi de components principals. Per illustrar ms clarament aquestes diferents perfils, presentem a continuaci un cromatograma de separaci per a cada varietat, acompanyat dun grfic sectorial de la proporci de cada antoci. Per simplificar la visualitzaci, noms shan desglossat els antocians individuals no acilats, ja que sn els majoritaris.
55
1) Carinyena.
pcumarilats
carinyena
no acilats
delfinidina cianidina petunidina peonidina malvidina
acetilats
2) Garnatxa
pcumarilats
garnatxa delfinidina cianidina petunidina peonidina
3) Merlot
no acilats acetilats
malvidina
3) Monastrell
pcumarilats
monastrell delfinidina cianidina petunidina peonidina malvidina
4) Syrah
pcumarilats
syrah delfinidina cianidina petunidina peonidina
no acilats
malvidina
acetilats
5) Pinot noir
pinot noir delfinidina cianidina petunidina peonidina
no acilats
malvidina
56

ull de llebre
6) Ull de llebre
pcumarilats
no acilats
acetilats
7) Merlot
merlot
pcumarilats
8) Cabernet sauvignon
pcumarilats
cabernet sauvignon
delfinidina cianidina petunidina peonidina
malvidina
Grfica 1.4.1.3. Cromatograma i composici sectorial dels antocians no acilats, acetilats i p-cumarilats, aix com dels 5 antocianidin-3-monoglucsids, per cada una de les varietats estudiades.
El perfil antocinic de les varietats estudiades es caracteritza per la presncia de 16 compostos principals, excepte en el cas del Pinot noir, que no presenta derivats acetilats, aspecte ja descrit en la bibliografia81 . Les altres varietats s presenten acilaci, i aquesta difereix entre les varietats. Cabernet sauvignon es caracteritza per tenir major nivell dacetilaci, a diferncia de les altres varietats, en qu predominen els derivats p-cumarilats. En el cas de Cabernet sauvignon, la bibliografia recull discrepncies en els valors. La proporci que hem trobat en aquest estudi (65% no acilats, 25% acetilats, 10% pcumarilats) s comparable a la que troben Garca-Beneytez et al.92 (60:30:10) en les regions de Navarra i Arag i als de Nez et al 147 tamb a Navarra, per sallunyen dels que troben Castia et al.120 (72:15:13) a Sardenya. Aix suggereix que hi ha un efecte de la regi sobre la composici antocinica.
147
Nez, V; Monagas, M; Gmez-Cordovs, MC; Bartolom, B. (2004). Vitis vinifera L.cv. Graciano grapes characterized by its anthocyanin profile . Postharvest Biol and Techn, 31: 69-79
57
Les altres varietats presenten diferents percentatges en acetilaci i p-cumarilaci. Podem establir els segents grups: a) Varietats amb alta p-cumarilaci i baixa acetilaci: Ull de llebre, Carinyena b) Varietats amb alta cumarilaci i alta acetilaci: Syrah, Merlot c) Varietats amb baixa p-cumarilaci i baixa acetilaci: Garnatxa, Monastrell d) Varietats amb baixa p-cumarilaci i alta acetilaci: Cabernet e) Varietats sense acilaci: Pinot noir Per tant, sembla que la proporci relativa entre els antocians acilats i els no acilats s el principal criteri que diferencia les varietats estudiades, i coincideix amb el criteri ms utilitzat 88, 81, 148 per emprar els antocians com a marcadors varietals. Aquestes relacions indicarien les activitats acetil i p-cumaroil transferasa del ram, que serien per tant dependents de la varietat. Alguns autors proposen tamb lanlisi de les relacions entre els antocians individuals, ja que aquestes respondrien a les activitats enzimtiques implicades en la biosntesi. Aix, Roggero et al.85 utilitzen la relaci entre malvidina-3-glucsid / peonidina3-glucsid, mentre que Ortega Meneder et al.81 calculen la relaci entre malvidin-3glucsid/delfinidina-3-glucsid. Baldi et al.111 investiguen la relaci de la suma de malvidina, petunidina i delfinidina respecte els de peonidina. Aquests parmetres estarien relacionats amb les activitats enzimtiques flavanoid-3-hidroxilasa (que transforma la cianidina en delfinidina) i o-dihidroxifenil-o-metiltransferasa (responsable de la metilaci que t lloc en posicions 3 i 5, que permet la transformaci de cianidina en peonidina, de delfinidina a petunidina, i de petunidina a malvidina). En el cas dels treballs de Nez et al147 ., aquestes relacions permeten diferenciar les varietats Graciano, Ull de llebre i Cabernet sauvignon. De la grfica dels loadings 1.4.1.2, podem observar que els nivells de les 5 antocianidines-monoglucsid no juguen un paper important en la participaci dels dos components principals que separen les varietats. Es va ampliar lanlisi estadstica considerant les relacions entre aquests compostos, tal com proposa la bibliografia147 ; de manera que es va analitzar el poder discriminant que tenien les relacions Cy/Mv; Dp/Mv, Pn/Mv, i Pt/Mv.
148
Hmamouchi,M; Es-safi, N; Pellecuer, J; Essassi, EM. (1995). Anthocyanic composition of grape skins of grape skins of four red grape varieties grown in Morocco; Bulletin de lOIV. 777-778, 907-919
58
gx99-15/9/99 gx99-collit99
PN02 9/8/02 pn00 collita 00 pn01 collita01
mt01 collita 01 pn02 13/8/02 gx02 13/9/02
sy00 coll 00 sy02 3/9/02 sy02 3/9/02
gx02 3/9/02 gx00 4/9/00 gx00 coll/00
Pinot noir
Syrah
CS02
Garnatxa
-20 Factor 2
sy02 Cab99-15/9/99 13/9/02 sy00 4/9/00 Car99 15/9/99 Cab99-collita99 CS99 R-2/9/9999collit99 NR-2/9/99 Car car02 3/9/02 car02 13/9/02 CS00 NR-12/9/00 Cab99-8/9/99 13/9/02 CS98 R-26/9/98 CS00 NR-26/9/98 CS98 01 4/9/00 01 Car00 mt02 CS98 NR-26/9/00 CS00 R-26/9/00 ullcar02 00 99nr-15/9/99 13/9/024/9/00 ull00collita20/9/02 collita mt00 ull NR-12/9/98 mt99 -8/9/99nr mt00 collita 00car 98nr 14/9/98 CS02CS02 r 3/9/02 CS00 R-12/9/98 CS9899r-15/9/99 Ull 00nr 16/9/00 R-12/9/00 CS02 nr 3/9/02 mon0202r 3/9/02 Ull 98R 14/9/98 ull 00R 16/9/00 3/9/02 CS02 r 27/9/02 mt02 3/9/02 ull 02nr 3/9/02 mon01 collita 01 nr 27/9/02
mon00 collita 00
gx01 collita 01
Pn/Mv
Pt/Mv
Dp/ Mv
0.0
mon00 4/9/00
-40
-0.4
-60
CS02 r 13/9/02 -80 car 01collita01 -60 -20 Factor1 20
Factor2 -0.8
Cy/Mv
-0.5 Factor1 0.0 0.5
Grfica 1.4.1.4. Grfica dels scores i dels loadings de les varietats en la collita considerant com a variables les relacions Cy/Mv, Dp/Mv, Pt/Mv i Pn/Mv.
En el nostre cas (grfica 1.4.1.4) , ls daquestes variable no provoca una discriminaci dels 8 grups, encara que s sembla classificar les varietats garnatxa, pinot noir i Syrah separades de la resta. De la grfica de loadings podem extreure que en aquestes 3 varietats hi ha una relaci PnG/MvG major que en les altres varietats.
En conclusi, podem establir que la utilitzaci de mtodes quimiomtrics aplicats a lestudi de la fracci antocinica permeten classificar les 8 varietats amb un baix percentatge de discrepncies, malgrat que hi ha varietats que presenten certa dispersi dels valors a causa de lefecte de lanyada. Mancarien, doncs, estudis complementaris que permetessin establir de manera determinant aquestes classificacions.
59
120
100
80
60
40
20
2) Antocians en data de verema i relaci amb la mida de la baia A continuaci es discuteix la diferent resposta varietal en el contingut dels antocians. Shan comentat les dades de lany 2000, un any destiu sec representatiu de la zona, i el 2002, que sha considerat molt atpic en les regions vitcoles meridionals, ja que es va caracteritzar per un estiu molt temperat, en qu es van enregistrar unes temperatures anormalment baixes per lpoca. Igualment, hi va haver una manca dinsolaci de P (mm) 2000 P (mm) 2002 Tm (C) 2000 Tm (C) 2002 forma continuada durant juny, juliol i agost, amb Grfica 1.4.2.1. Diagrames climtics dels pluges consistents al llarg de tot el cicle i tamb al anys 2000 i 2002 final del perode de maduraci (Grfica 1.4.2.1).
60
Precipitacions
Temp mitjanes
P anual 2000: 371mm P anual 2002: 558mm
50
40
30
20
10
En la grfica 1.4.2.2. es recullen les dades de producci, pes de 100 baies, grau alcohlic probable i concentraci dantocians per gram de baia.
contingut d'antocians
300
pes 100 baies
Antocians (mg/ kg baia)
1600
Pes 100 baies (g)

e
2000
200
1200
800
100
400
M er lo t M on as tre ll
na G ar na tx a
ye na G ar na tx a
er lo t M on as tre ll
no
no
br
ne
br
ra
lle
ra
er
lle
ye
Pi
Pi
Sy
in
ab
in
Sy
de
ar
ar
de
ll
Antocians, 2000
Antocians, 2002
pes 100 baies, 2000
pes 100 baies, 2002
producci
8.0 15 14 13 12
Grau alcohlic probable
Producci (kg/cep)
GAP
6.0
11 10 9 8
4.0 7 6 5 2.0 4 3 2 1 0.0 0
ll
M er lo t M on as tre ll
na
M on as tre ll
na
C br C ab er ne t
no
G ar na tx a
ne
G ar na tx a
ra
ye
er
lle
ra
no
br
lo
Sy
er
in
de
ab
in
Sy
ar
ll
ar
producci, 2000
producci, 2002
GAP, 2000
GAP, 2002
Grfica 1.4.2.2. Contingut dantocians i pesos de baia per les diferents varietats en les veremes dels anys 2000 i 2002
60
ll
de
lle
ye
Pi
Pi
ab
er
ne
Segons el contingut final en la verema i ladaptaci al mesoclima de Tarragona de les varietats estudiades, es poden distingir tres grups atenent la concentraci dantocians: Grup 1: Cabernet sauvignon, Merlot i pinot, de contingut antocinic alt: varietats de baia petita que poden arribar als 1500-2000 g antocians/ g baia. Mantenen la mida de la baia petita en les condicions de conreu i el clima de Tarragona , proporcionant valors elevats i semblants als trobats per altres autors 95,126,128, 157. Cabernet i Merlot mostren un nivell ms elevats dantocians en anys secs, per Pinot presenta els nivells ms elevats lany 2002 (ms plujs), en el qual sobserva una mida de la baia molt petita -menys de la meitat de volum que el que presenta lany 2000-, cosa que significa un increment de la productivitat dantocians per baia. Grup 2: Syrah i ull de llebre, de contingut antocinic mitj, que es troben al voltant de 1500 g antocians/ g baia; la primera en baies petites mitjanes, la segona, de mida de baies mitjanes grans. Presenten una resposta diferent a les altres varietats quant a la mida de la baia. Lany ms plujs, malgrat augmentar la mida de la baia, contrriament al que seria desperar, safavoreix la sntesi dantocians. Grup 3: Garnatxa, carinyena i monastrell, de baix contingut antocinic, amb nivells que rarament superen els 1000 g antocians/ g baia. A aix contribueix tant una baixa sntesi com el fet que siguin varietats de baies grans. A ms, Garnatxa qualla molt b i la carinyena s molt frtil. Malgrat que es va realitzar un aclariment dels rams de prop dun 50%, no se naconsegueix millorar el grau ni el color. El mateix val a dir pel monastrell. En general, les situacions destrs hdric causades per la sequera en lany 2000 provoquen augments significatius en la quantitat dantocians finals. La manca de disponibilitat daigua promou la maduraci i la sntesi de compostos fenlics149,150,151. Tanmateix, per les varietats pinot noir, ull de llebre i Syrah, safavoreix la sntesi dantocians lany 2002, dabundant nuvolositat, major i ms freqent precipitaci anual i temperatures sensiblement menors que en altres anys, que indiquen un menor estrs del que s habitual
149 150
Matthews, MA; Anderson, MM. (1988). Fruit ripening in Vitis vinifera L: responses to seasonal water deficits. Am J Enol Vitic 39, 313-320 Jackson, DI; Lombard, PB. (1993). Environmental and management practices affecting grape composition and wine quality a review. Am J Enol Vitic, vol 44, n4, 409-429 151 Peterlunger, E; Sivilotti, P; Bonetto, C; Paladin, M. (2002). Water stress induces changes in polyphenol concentration in Merlot grapes and wines. Riv Vitic. Enol. N1: 51-66
61
durant els estius en la nostra zona destudi. (grfica 1.4.2.1). Podrem inferir de la situaci climtica del 2000 que les condicions de sequera apuntarien a un detriment de la sntesi per les esmentades varietats. Altres consideracions a fer sn que Pinot es verema molt aviat i per tant, no est afectat per les precipitacions, per s en canvi per les baixes temperatures durant el verolament, que podrien ser la causa de la mida de baia petita que comporta un augment de 800 g/baia en el 2000 a 1500 g/baia dantocians en el 2002. Pinot noir s una varietat de cicle molt curt que es desenvolupa de forma adient en els mesoclimes de la Champagne, caracterstiques que sn difcils de trobar en la viticultura meridional mediterrnia. Garnatxa, carinyena i monastrell sn varietats de cicle llarg que en el sl frtil i el mesoclima de Tarragona no tenen possibilitat darribar al seu ptim de maduraci fisiolgica. Monastrell gaireb sempre es podreix, ra per la qual es va optar el 2002 per destinar-la a produir vi per cava i veremar-la un mes abans de lhabitual.
Sembla clar, doncs, que hi ha un fort efecte de lanyada i la climatologia en el contingut dantocians final. Cacho et al 126 tamb remarquen aquest fort efecte, que implica diferents nivells finals dantocians en verema, registrant-se entre un 50% i 100% de diferncies en comparar dos anys en les varietats garnatxa, ull de llebre i monastrell. Sorprenentment, per a l ull de llebre cultivat a Somontano sobtenen concentracions menors dantocians en lanyada de ms sequera, amb unes baies de volum molt menor. En el present estudi a Tarragona, sobserven uns resultats en el mateix sentit en ull de llebre. Molt ms acusada - ms del 100% dantocians totals lany menys sec- s la diferncia que es produeix per la garnatxa a Calatayud 126, per al contrari que en ull de llebre, el pes de la baia disminueix lleugerament lany ms plujs. A Tarragona, tamb disminueix lleugerament el pes de la baia de garnatxa en any plujs, per el contingut dantocians disminueix drsticament, comportament que sobserva en la majoria de les varietats estudiades. Esteban et al157, en ull de llebre plantat a Madrid observen resultats evidents duna major sntesi dantocians lanyada de ms sequera amb una mida de baies notablement menor en comparar-ho amb lany ms plujs, a linrevs de lobservat a Tarragona. Lany ms plujs implica en la majoria de les varietats una disminuci del grau alcohlic probable (grfica 1.4.2.2), per tanmateix les produccions per cep sn variables
62
segons les varietats i anys i no segueixen un patr com. Diversos estudis senyalen una correlaci entre el contingut en sucres i el contingut en antocians152,153, i s observable en els nostres estudis, a excepci del cas de garnatxa i Syrah, a causa duna disminuci brusca final dantocians producte de les precipitacions en el 2002 i en el 2000, respectivament. A la vista daquests resultats, cal considerar lefecte de lecosistema, la unitat de terrer bsic (sl + clima), que implica per una banda un comportament de les varietats diferent en funci de la zona vitcola (diferents contingut dantocians en una mateixa varietat i diferent dinmica de sntesi), i per laltra, que la concentraci final dantocians es pot modificar acusadament dun any a altre per a una mateixa varietat119 .
3) Antocians inidividuals en data de collita segons lanyada Lobservaci que lanyada canvia el contingut total dantocians es completa en les segents taules, en qu es recullen els canvis en el moment de la verema dels antocians individuals:
152
GonzalezSanJose, ML; Diez, C. (1992). Relationship between anthocyanins and sugars during the ripening of grape berries. Food Chemistry , 43(3): 193197 153 Hrazdina, G; Parsons, GF; Mattick, LR. (1986). Physiological and biochemical events during development and maturation of grape berries" Am J Enol Vitic 35 (4): 220-227
63
Taules 1.4.2.1. Composici antocinica segons la varietat en el moment de verema. Es recull la composici percentual de les antocianidin-3-glucsid respecte del total de no acilats; i dels antocians no acilats, acetilats i p-cumarilats en relaci als antocians totals.s indica diferncies significatives.
64
Com es pot observar, hi ha una variabilitat de la composici antocinica segons lanyada. Aix concorda tamb amb la informaci que oferia lanlisi de components principals, en qu es podia observar que les diferents mostres de collita abarcaven una zona mplia de la representaci dels scores, tot i que aix no impedia la capacitat de dita anlisi de separar les varietats. En la majoria de casos, lany sec (2000) ha promogut un increment dels nivells relatius dacilaci, que es manifesten en cada varietat segons quin sigui lagent acilant majoritari. Les niques excepcions a aquest fet sn la garnatxa, en qu no hi ha diferncies significatives, i lull de llebre, que com ja hem comentat, en anys secs est especialment mal adaptat. Aquestes observacions es corresponen amb les de Freeman i Kliewer154 i les de Matthews et al.155 o les dEscalona156 en el sentit que les situacions rigoroses de manca daigua promouen lacilaci dels antocians. Quant a les 5 antocianidines, per a les quals tamb est descrit un canvi en lacumulaci segons la disponibilitat hdrica, els resultats no sn tan determinants. En general, en un any sec hi ha major proporci de malvidina, tot i que en Garnatxa i monastrell sobserva el contrari. Aquest increment de la malvidina suposa una disminuci dels altres antocians. Conv recordar que la major acumulaci de malvidina correspondria a un ple funcionament de la via biosinttica, ja que aquest antoci ns el producte final. En els treballs de Ryan et al.160 tamb es comenta la disminuci dels continguts en delfinidina i petunidina, que associen a les condicions climtiques de lany, en el sentit que en anys relativament frescos sn superiors que en anys cl.lids. En els nostres resultats, es compleix aquesta afirmaci a excepci de les varietats carinyena, Cabernet sauvignon i Merlot; per en no ser els nics antocians que veuen disminuda la seva concentraci, mancarien efectuar ms estudis per assegurar que en aquesta regi es compleixi aquest comportament.
154
Freeman, BM; Kliewr, WM. (1983). Effect of irrigation, crop level and potassium fertilization on Carignan vines. II. Grape and wine quality; Am J Enol Vitic 34: 197-207 155 Matthews MA; Anderson, M. (1989). Reproductive development in grape (Vitis vinifera L.): responses to seasonal water deficits. Am J Enol Vitic . 40: 52-60 156 Escalona, JM. (2003). Respuestas de la vid frente al dficit hdrico: efectos sobre la fotosntesis y la transpiracin en hoja y en planta entera y su repercusin en la calidad del fruto; Tesi Doctoral; Dep Biologia UIB
65
4) Evoluci dels antocians durant la maduraci En les segents grfiques presentarem levoluci en el contingut dantocians per a les 8 varietats negres estudiades durant dos anys destudi, el 2000 i el 2002; el primer correspon a un any sec mentre que el segon s un any plujs. Aquesta evoluci es representa en un grfic lineal que recull el contingut en antocians totals (eix secundari), i per cada punt danlisi saporta un grfic de barres (eix principal) on es mostren els percentatges dantocians no acilats (els 3-monoglucsids) i els antocians acetilats i p-cumarilats. En leix dabscises es representa el dia a partir del primer mostreig, que correspon al moment del verolament. Aix, per cada punt tenim recollit tant el contingut total com la composici. Posteriorment discutirem amb ms detall la composici, ampliant lestudi als diferents antocians individuals. 3.1. Carinyena.
Carinyena, 2002 Carinyena, 2000
antocians (g/g baia)
percentatge
100
1200
percentatge
100
1200
90 1000 80
90 1000 80
70 800 60
70 800 60
50
600
50
600
40 400 30
40 400 30
20 200 10
20 200 10
10
20
30
40
50
60
70
10
20
30
40
50
60
70
dia
no acilats acetilats p-cumarilats total no acilats
dia
acetilats p-cumarilats total
Grfica 1.4.4.1. Evoluci en la varietat Carinyena dels antocians totals i desglossament en els percentatges dantocians no acilats, acetilats i p-cumarilats al llarg de les campanyes 2000 i 2002
En carinyena, la data del primer mostreig correspon al 24 i 20 de juliol per a lany 2000 i 2002, respectivament; i la de verema, al 20 de setembre i 14 de setembre. Quant a concentraci dantocians en baia, arriba a uns valors al voltant dels 1000 g/g baia. Cal tenir en compte que aquesta varietat presenta un volum de baia gran, cosa que significa que els nivells per pell (sobre els 10 mg/ g pes fresc de pell en data de verema) resulten relativament ms elevats que per altres varietats amb menor volum de baia. Com es pot apreciar, lany 2000 assoleix al cap de poc el seu mxim dantocians, mentre que en el 2002 t un comportament ms errtic.
66
3.2. Garnatxa
Garnatxa, 2000 Garnatxa, 2002
percentatge
percentatge
100
1000
100
1000
90
900
90
900
80
800
80
800
70
700
70
700
60
600
60
600
50
500
50
500
40
400
40
400
30
300
30
300
20
200
20
200
10
100
10
100
10
20
30
dia
40
50
60
10
20
30
40
50
60
dia
p-cumarilats total no acilats acetilats p-cumarilats total
no acilats
acetilats
Grfica 1.4.4.2. Evoluci en la varietat Garnatxa dels antocians totals i desglossament en els percentatges dantocians no acilats, acetilats i p-cumarilats al llarg de les campanyes 2000 i 2002
La Garnatxa s una varietat de gra gran que presenta poca concentraci dantocians, malgrat que lany 2000 va assolir uns nivells de 1000 g/g baia. En pells, s la varietat que presenta uns valors ms baixos (6000 g/g pell en el 2000, i noms 2500 g/g pell en el 2002). En el 2002, el primer mostreig es va fer quan ja estava avanat el verolament, el 31 de juliol, motiu pel qual sescura leix dabscisses en la grfica. El 2000, el primer mostreig es va efectuar el 20 de juliol, i no fou fins al moment de la collita que shavia assolit el mxim en antocians. En canvi, en el 2002 hi va haver una davallada producte de les precipitacions dels mesos destiu, que van diluir el contingut.
3.3. Merlot
Merlot, 2000 Merlot, 2002
percentatge
90
1800
percentatge
100
2000
100
2000
90
1800
80
1600
80
1600
70
1400
70
1400
60
1200
60
1200
50
1000
50
1000
40
800
40
800
30
600
30
600
20
400
20
400
10
200
10
200
10
20
dia
acetilats
30
40
50
60
10
20
dia
acetilats
30
40
50
60
no acilats
p-cumarilats
total
no acilats
p-cumarilats
total
Grfica 1.4.4.3. Evoluci en la varietat Merlot dels antocians totals i desglossament en els percentatges dantocians no acilats, acetilats i p-cumarilats al llarg de les campanyes 2000 i 2002
67
Merlot s una varietat de gra petit que dna uns valors elevats dantocians per baia. En aquest cas, tamb les concentracions mximes es van assolir la campanya2000 (al voltant de 2000 g/ g baia. s, doncs, una varietat rica en contingut antocinic i, de fet, dentre totes les estudiades, s la que dna majors rendiments per pell (15 mg/g pes fresc). Com en el cas de la Garnatxa, el primer mostreig va resultar relativament tard, el 31 de juliol, en comparaci amb el primer mostreig del 2000, que sefectu el 20 de juliol.
4. Monastrell
Monastrell, 2000 Monastrell, 2002
percentatge
percentatge
100
1200
100
1200
90 1000 80
9 0 1000 8 0
70 800 60
7 0 800 6 0
50
600
5 0
600
40 400 30
4 0 400 3 0
20 200 10
2 0 200 1 0
10
20
30
dia
40
50
60
70
10
20
30
dia
40
50
60
70
no acilats
acetilats
p-cumarilats
total
no acilats
acetilats
p-cumarilats
total
Grfica 1.4.4.4. Evoluci en la varietat Monastrell dels antocians totals i desglossament en els percentatges dantocians no acilats, acetilats i p-cumarilats al llarg de les campanyes 2000 i 2002
Monastrell s una varietat de gra gran, de manera que els valors al voltant de 1000
g/g
baia signifiquen uns valors daproximadament 7000 g/g pell. En lany 2002, el seu contingut va augmentant gradualment i presenta un punt dinflexi 15 dies abans de la seva verema. De fet, aquest any 2002 es va avanar la verema daquesta varietat per destinar-la a lelaboraci de blanc de noirs, per la qual cosa encara no havia assolit el seu mxim contingut antocinic.
68
5. Syrah
Syrah, 2000 Syrah, 2002
percentatge
percentatge
100 1400 90
100 1400 90
80
1200
80
1200
70 1000 60 800 50
70 1000 60 800 50
40
600
40
600
30 400 20 200 10
30 400 20 200 10
0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
60.0
0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
60.0
dia
no acilats acetilats p-cumarilats total no acilats
dia
acetilats p-cumarilats total
Grfica 1.4.4.5. Evoluci en la varietat Syrah dels antocians totals i desglossament en els percentatges dantocians no acilats, acetilats i p-cumarilats al llarg de les campanyes 2000 i 2002
Syrah s, amb Merlot, la varietat que majors quantitats dantocians acumula en la pell (sobre els 13000 g/g pell), que en ser de gra petit, es manifesten en uns valors de sobre 1300 g/g baia. En aquesta varietat, el contingut dantocians augmenta molt rpidament en el primer mes (el primer mostreig correspon al 20- 24 de juliol), i desprs sestabilitza i fins i tot pot patir lleugeres oscillacions segons la pluviometria.
6) Pinot noir
Pinot noir, 2000 Pinot noir, 2002
percentatge
1400 90
percentatge
100
100 1400 90
80
1200
80
1200
70 1000 60 800 50
70 1000 60 800 50
40
600
40
600
30 400 20 200 10
30 400 20 200 10
10
20
30
10
20
30
dia
no acilats total no acilats
dia
total
Grfica 1.4.4.6. Evoluci en la varietat Pinot noir dels antocians totals i desglossament en els percentatges dantocians no acilats, acetilats i p-cumarilats al llarg de les campanyes 2000 i 2002
69
Pinot noir s una varietat que es caracteritza per aportar poc color i no presentar acilaci. Els valors anormalment alts de la campanya 2002 satriburien bsicament a un baix pes de les baies en lpoca de collita. Aquesta varietat es destina a la producci de vins escumosos, i per aquest motiu es verema precoment, motiu pel qual la seva grfica devoluci resulta tan curta.
7. Ull de llebre
ull de llebre, 2000 Ull de llebre, 2002
percentatge
1400 90
percentatge
100
100 1400 90
80
1200
80
1200
70 1000 60 800 50
70 1000 60 800 50
40
600
40
600
30 400 20 200 10
30 400 20 200 10
10
20
30
dia
40
50
60
70
10
20
30
40
50
60
70
dia
p-cumarilats total no acilats acetilats p-cumarilats total
no acilats
acetilats
Grfica 1.4.4.7. Evoluci en la varietat Ull de llebre dels antocians totals i desglossament en els percentatges dantocians no acilats, acetilats i p-cumarilats al llarg de les campanyes 2000 i 2002
En ull de llebre, la primera mostra del 2000 es va agafar amb molta anticipaci (12 de juliol, en comparaci al 24 de juliol del 2002, quan es realitz el primer mostreig per a la campanya 2002), quan hi havia una molt petita proporci de baies verolades. Per aquest motiu, al llarg del primer mes no hi ha prcticament increment dantocians, ja que per aquesta varietat transcorre molt de temps fins que totes les baies estan verolades. Els nivells dantocians en les pells sn fora elevats (13 mg/g pes fresc de pell), per en ser de baia gran, els continguts globals per baia la classificarien com una varietat de contingut antocinic mitj, per sota de les de Syrah, Merlot o Cabernet sauvignon.
70
8. Cabernet sauvignon
Cabernet sauvignon, 2000 Cabernet sauvignon, 2002
percentatge
percentatge
100
100
90 2000 80
90 2000 80
70 1500 60
70 1500
60
50 1000
50 1000
40
40
30
30 500
20
20
500
10
10
10
20
30
40
50
60
70
dia
no acilats acetilats p-cumarilats total
10
20
30
40
50
60
70
dia
no acilats acetilats p-cumarilats total
Grfica 1.4.4.8. Evoluci en la varietat Cabernet sauvignon dels antocians totals i desglossament en els percentatges dantocians no acilats, acetilats i p-cumarilats al llarg de les campanyes 2000 i 2002
Cabernet s la darrera varietat que es verema, a finals de setembre (dies 26 i 27 pels anys 2000 i 2002, respectivament). Com en altres varietats dalta concentraci (Merlot, Syrah), lincrement en el contingut dantocians s rpid en el primer mes, per desprs estabilitzar-se i sofrir lleugeres oscillacions i disminucions segons lanyada.
Discussi general La dinmica dacumulaci dels antocians durant la maduraci segueix en les 2 anyades un comportament en el qual es poden establir algunes similituds: 1- Desprs del verolament t lloc una breu etapa daugment lent dels antocians totals, seguida dun increment exponencial durant el primer mes, al final del qual shan sintetitzat prcticament el 75% del total dantocians que es presenten en la verema. Lincrement es dna a diferent velocitat segons les varietats: a) en Merlot, Syrah, cabernet i pinot, augmenta rpidament el contingut dantocians totals un cop comencen a tintar els rams. A causa daquesta elevada velocitat de sntesi, sassoleix el 75% del contingut final en noms dues setmanes desprs del verolament. b) en ull de llebre, carinyena, garnatxa i monastrell, la sntesi es produeix de forma ms pausada i es perllonga durant un mes.
71
Aquesta velocitat est molt relacionada amb el temps que triga la varietat a assolir el 100% de baies verolades. En Merlot, Cabernet i Syrah aquest procs resulta ms rpid, i aix fa que tamb augmenti ms rpidament el contingut en antocians, ja que aquests estan noms presents en les baies verolades. 2- A meitat del perode de maduraci salenteix la sntesi i sestabilitza el nivell dantocians acumulats. 3- El comportament de la corba en letapa ms propera a la verema s diferent segons les varietats i segons lanyada: Lany 2000: a) en monastrell i garnatxa, dues setmanes abans de la verema segueix augmentant lentament la concentraci dantocians. b) en carinyena, Merlot, i Cabernet, prcticament sestabilitzen les concentracions cap al final de la maduraci c) en ull de llebre, Syrah i pinot sobserva certa disminuci del contingut dantocians totals, de manera que el mxim nivell dantocians shavia aconseguit una setmana i mitja abans de la verema.
Lany 2002: En aquest any senregistren abundants precipitacions en primavera i tamb de ms de 60 mm durant els mesos dagost i setembre, que afecten el ram en la darrera fase de maduraci, la ms propera a la verema, tant en les varietats ms primerenques (ull de llebre, Syrah), com en les dpoca mitjana de maduraci (Merlot, garnatxa) o en les ms tardanes (carinyena, Cabernet sauvignon). Ara b, podem establir diferncies en la resposta segons la varietat: a) en carinyena i Syrah, es dna una davallada de la concentraci dantocians de la qual es recuperen en data de verema b) en monastrell, Merlot, Cabernet sauvignon, i ull de llebre disminueix lleugerament la concentraci final. c) en garnatxa, representa una disminuci final molt notable. d) en pinot, en canvi, provoca un increment considerable.
72
La resposta de la varietat ull de llebre en el 2000 s la mateixa que lobservada per Cacho et al.126 : una setmana abans de la verema es concentren els nivells mxims dantocians en els dos anys destudi, malgrat la diferncia de clima evident entre les dues anyades. En canvi, en la varietat garnatxa sobt un comportament dincrement continu en un any en qu hi hagu pluges abundants abans de la verema, mentre que sestanca en cas que les pluges primaverals eren ms febles. I per monastrell, es pot donar o no una saturaci poc abans de la verema malgrat que les condicions climtiques siguin similars. Contrriament, en els resultats presentats per Gonzalez San Jos et al.88, durant la maduraci es produeix una acumulaci continuada dels antocians lliures fins a la verema. El mateix augment progressiu fins el final de la maduraci t lloc en el ull de llebre en dues anyades diferents i consecutives segons els estudis d Esteban et al157. Jordao et al. tamb obtenen aquest comportament sense disminuci en els nivells dels antocians en la varietat Touriga Francesa a Portugal129.
De totes aquestes observacions es desprn que el patr dacumulaci dantocians totals difereix amb el cultiu i amb lanyada, entre altres factors agroecolgics. Segons aquestos, sobtindr una evoluci en 3 fases (increment lent, rpid augment, i estabilitzaci), descrita per la majoria dautors; per tamb es pot donar una situaci dincrement constant abans darribar a la verema. Tenint en compte que el contingut dantocians desprs de la verema disminueix, associat a la sobremaduraci de les baies129 , indicaria que en aquelles varietats que encara presenten una corba dincrement en els nivells dantocians en el moment de veremar estan en el punt de maduresa tecnolgica, per no encara en el de maduresa fenlica o, ms concretament, en el dantocinica. Per tant, podem inferir que lefecte de lanyada incidiria principalment en la maduraci fenlica del ram.
157
Esteban, M. A.; Villanueva, M. J.; Lissarrague, J. R. (2001). Effect of irrigation on changes in the anthocyanin composition of the skin of cv. Tempranillo (Vitis vinifera L.) grape berries during ripening. J Sci Food Agric ; 81 (4) 409-420
73
5) Variacions dels antocians individuals al llarg de la maduraci Dels apartats 1.4.1 i 1.4.2 sembla observar-se una correspondncia entre el percentatge dacilaci que presenta la varietat i el seu contingut antocinic. Aix, varietats com Cabernet sauvignon, Syrah o Merlot, que tenen una elevada participaci destructures antociniques acilades, tamb tenen uns nivells alts dantocians. En canvi, varietats com garnatxa o monastrell, amb molt poc grau dacilaci, tenen un contingut en antocians fora ms baix. Per Pinot noir tamb es compleix aquesta sentncia, excepte en lanmalment elevat valor dantocians registrat lany 2002. Mancarien ms estudis per tal darribar a establir si hi ha realment una connexi a nivell molecular que justifiqui aquest fenomen, i discernir si es tracta duna casualitat, dun efecte promotor dels antocians acilats de les vies de sntesi dantocians - ja sigui per desaparici de producte o per activaci enzimtica- o dun efecte dincrement de les activitats aciltranferases concomitant a la sntesi dantocians. Per altra banda, en les diferents varietats hi ha un canvi dels percentatges dantocians acilats al llarg de la maduraci. En la segent taula es representen aquestes variacions:
Dp-3-glu Carinyena 20/7 Carinyena 31/7 Carinyena 23/8 Carinyena collita 19.00.8 10.20.7 12.51.5 11.10.2 Dp-3-glu Merlot 20/7 Merlot 9/8 Merlot 23/8 Merlot collita 23.00.4 14.90.4 13.41.8 10.91.2 Dp-3-glu Syrah 20/7 Syrah 9/8 Syrah 23/8 Syrah collita 15.51.0 6.00.8 4.10.4 2.40.6 Dp-3-glu Pinot 24/7 Pinot 31/7 Pinot 9/8 5.90.6 4.80.5 4.40.5 Cy-3-glu 8.30.2 2.10.2 1.20.2 1.50.1 Cy-3-glu 16.20.7 3.70.5 3.81.0 2.80.2 Cy-3-glu 3.70.3 0.80.2 0.80.2 0.50.4 Cy-3-glu 1.70.1 1.3 .3 1.40.2 Pt-3-glu 13.71.1 9.20.7 11.31.1 10.40.3 Pt-3-glu 12.90.1 11.50.2 10.91.0 9.80.8 Pt-3-glu 13.90.4 7.70.8 5.70.5 4.00.8 Pt-3-glu 8.20.7 7.10.5 6.80.6 Pn-3-glu 10.90.1 3.60.9 2.70.4 2.80.1 Pn-3-glu 12.20.7 6.40.4 8.11.7 7.20.5 Pn-3-glu 8.91.4 3.80.7 3.50.7 4.41.5 Pn-3-glu 12.20.7 12.12.4 14.00.8 Mv-3-glu 33.30.8 42.21.8 40.30.5 41.51.3 Mv-3-glu 19.01.0 35.61.1 35.22.5 38.81.0 Mv-3-glu 37.32.4 37.81.7 35.21.2 28.24.4 Mv-3-glu 71.90.7 74.73.5 73.41.9 TOTAL 3-glucsid 85.2 0.9 67.3 2.0 68.0 3.4 67.4 1.8 TOTAL 3-glucsid 83.3 0.7 72.0 0.2 71.5 3.0 69.6 2.1 TOTAL 3-glucsid 79.3 2.0 56.1 4.2 49.3 2.8 39.5 7.5 TOTAL 3-glucsid 100 100 100 TOTAL ac-glu 3.3 0.1 3.1 0.7 2.6 0.3 2.8 0.3 TOTAL ac-glu 10.9 0.1 13.4 0.2 14.4 0.8 14.4 0.3 TOTAL ac-glu 8.2 0.4 13.1 0.6 12.7 0.3 17.2 1.3 TOTAL ac-glu 0 0 0 TOTAL pc-glu 11.5 1.0 29.6 1.4 29.4 .3.1 29.8 1.6 TOTAL pc-glu 5.8 0.5 14.5 0.5 14.1 2.3 16.0 1.8 TOTAL pc-glu 12.5 2.2 30.8 4.4 38.0 2.6 43.3 6.6 TOTAL pc-glu 0 0 0
74
Dp-3-glu Monastrell 20/7 Monastrell 31/7 Monastrell 18/8 Monastrell collita 19.00.7 16.91.2 14.20.8 9.50.6 Dp-3-glu Garnatxa 20/7 Garnatxa 31/7 Garnatxa 18/8 Garnatxa collita 7.10.1 4.80.6 3.60.3 4.90.6 Dp-3-glu Ull 12/7 Ull 28/7 Ull 18/8 Ull 14/9 7.61.7 15.62.7 13.90.7 13.32.0 Dp-3-glu Cabernet 21/7 Cabernet 27/8 Cabernet 30/8 Cabernet 26/9 17.41.1 15.71.6 10.20.3 10.60.6
Cy-3-glu 13.21.1 11.96.9 3.21.3 7.41.7 Cy-3-glu 6.10.3 2.30.5 1.40.1 4.50.4 Cy-3-glu 10.32.9 3.10.7 1.80.1 2.00.4 Cy-3-glu 13.51.9 3.91.0 1.30.1 1.00.3
Pt-3-glu 15.51.1 16.21.2 13.90.9 12.60.3 Pt-3-glu 7.30.1 6.10.3 4.60.3 5.90.5 Pt-3-glu 11.11.8 12.71.5 12.00.4 11.81.5 Pt-3-glu 9.70.7 9.70.5 7.40.2 7.40.5
Pn-3-glu 10.70.7 6.20.7 4.91.3 9.81.9 Pn-3-glu 29.21.4 15.51.8 12.20.2 22.24.1 Pn-3-glu 17.83.0 4.10.7 3.80.1 3.80.2 Pn-3-glu 14.11.6 5.70.8 3.90.2 3.40.5
Mv-3-glu 32.21.6 35.88.6 41.41.1 43.53.4 Mv-3-glu 41.51.5 56.92.4 58.50.4 52.43.5 Mv-3-glu 43.34.3 43.02.4 40.50.7 41.70.5 Mv-3-glu 20.62.6 34.72.9 37.70.7 43.01.1
TOTAL 3-glucsid 90.6 0.8 87.0 1.1 77.6 3.8 82.8 1.5 TOTAL 3-glucsid 91.2 1.2 85.6 1.5 80.3 0.8 89.9 0.9 TOTAL 3-glucsid 90.1 3.7 78.4 3.1 71.9 1.6 72.7 3.7 TOTAL 3-glucsid 75.3 1.0 69.7 1.3 60.4 0.6 65.4 1.6
TOTAL ac-glu 3.1 0.3 2.5 0.6 3.6 0.2 2.9 0.2 TOTAL ac-glu 2.0 0.1 1.6 0.5 2.7 0.1 0.5 0.4 TOTAL ac-glu 1.5 0.2 3.6 0.5 3.4 0.2 3.0 0.2 TOTAL ac-glu 19.7 0.4 22.8 3.1 27.8 0.6 26.1 1.4
TOTAL pc-glu 6.3 0.6 10.5 0.5 18.9 3.6 14.3 1.6 TOTAL pc-glu 6.8 0.1 12.8 1.1 17.0 0.8 9.7 0.3 TOTAL pc-glu 8.3 3.5 18.0 3.4 24.7 1.5 24.3 3.5 TOTAL pc-glu 5.0 0.7 7.5 2.5 11.8 0.2 8.5 0.4
Taula 1.1.5.1. Comparaci dels percentatges en els diferents antocians al llarg de la maduraci
Com es pot apreciar, en totes les varietats hi ha un canvi en la composici en avanar la maduraci. En totes elles hi ha un increment en el nivell dels antocians acilats (Total acglu, Total pc-glu) entre el dia del verol i el dia de la verema. Especialment marcat s aquest efecte en el cas de Syrah, en qu es passa duna proporci de 80% dantocians sense acilar (Total 3-glu) a noms un 40%. Altres autors, com Piergiovanni et al.158 tamb indiquen aquest increment dels nivells dantocians acilats des del verolament fins a la verema. Noms en levoluci de la varietat Castelao Francesa descrita per Jordao et al129 a Portugal saprecia una disminuci dels nivells dantocians acilats al llarg de la maduraci. Lincrement generalitzat de la formaci dantocians acilats al llarg de la maduraci confirma que la reacci dacilaci t lloc de manera posterior a les reaccions de formaci dels antocians, i que lesterificaci sobre la glucosa t lloc quan aquesta ja est unida a lantoci .
158
Piergiovanni,L; Volonteiro, G. (1983). Studio della frazione antocinaica delle uva. Tecnol Aliment-Imbottigliamento, 6: 22-28
75
Un altre argument a favor de la posterioritat de la reacci dacilaci prov de la constataci de la similitud en la distribuci relativa de les 5 antocianidines tant entre els antocians monoglucsids no acilats com entre els antocians acilats. El fet que en algunes varietats (monastrell, garnatxa, i Cabernet) hi hagi una disminuci de lacilaci en els darrers dies sembla corroborar aquesta hiptesi, ja que podria indicar que continua la sntesi dantocians malgrat no es diposi dagent acilant. Aquest ampli declivi dels antocians acilats abans de la maduresa fisiolgica el troben tamb altres autors com Gonzlez-SanJos et al88 i, en menor extensi, Fernndez-Lpez et al.159 . Lacilaci pot ser important per al color del vi, com ampliarem en un posterior captol, ja que els antocians acilats determinen una major estabilitat i intensitat del color. Quant a les antocianidines individuals, tamb sobserva que en totes les varietats hi ha un increment de malvidina en totes les fases de maduraci, mentre que la resta disminueixen, especialment la delfinidina i la peonidina. Lincrement en el contingut de malvidina est dacord amb lobservat per altres autors com Roggero et al.136 en Syrah, o Ryan et al.160, en Ull de llebre i Cabernet sauvignon, o Fernndez-Lpez et al.159 en Monastrell; i concorda amb el model biosinttic dels antocians, en qu la malvidina resulta el darrer producte que es forma, a partir de les metilacions i hidroxilacions dels altres antocians. La disminuci de cianidina i delfinidina al llarg de la maduraci concorda amb el seu lloc en la biosntesi, ja que sn precursores de la resta dantocians. Aix justifica que al principi tinguin uns nivells alts i desprs vagin desapareixent perqu es van transformant. La disminuci de peonidina i cianidina suposa una progressiva disminuci de lactivitat de la seva branca de sntesi en comparaci a la que genera els altres 3 antocians. Budin161 indica que el primer antoci que es detecta s la petunidina, per Kampis et al.162 localitzen en el seu lloc malvidina i delfinidina; i Piergiovanni et al.158 i GonzlezSanJos et al.88 els detecten tots ja des de linici. Els notres resultats coincideixen amb els daquests darrers autors, per cal considerar que el verol s un procs global, de manera que en el mostreig coincideixen baies verdes, baies verolant i baies ja totalment colorejades per tal daconseguir una mostra representativa, per individualment en les baies pot tenir lloc la sntesi ordenadament, seguint models com els proposats per Roggero 85 o daltres.
159
Fernndez-Lpez, JA; Hidalgo, V; Almela, L; Lpez Roca, JM. (1992). Quantitative changes in anthocyanin pigments of Vitis vinifera cv Monastrell during maturation. J Sci Food Agric , 58, 153-155 160 Ryan, JM; Revilla, E. (2003). Anthocyanin composition of cabernet sauvignon and tempranillo grapes at different stages of ripening, J Agric Food Chem. 51, 3372-3378 161 Budin, R. (1984). Accumulation of anthocyanins, sugars and organic acids in grapes of the Blue Franconia and Saint Laurence varieties during ripening. Kvansy Prum, 30: 55-58 162 Kampis, A; Kerny, Z; Hoschke, A; Hajdu, F. (1986). Evolution des pigments anthocyanins pendant la maturation des cpages rouges. Bull Liaison Groupe 13,
76
6) Efecte del reg en el contingut i natura dels antocians dull de llebre i Cabernet
6.1) Irrigaci i anyada Per poder discutir els comportaments de les varietats ull de llebre i Cabernet al llarg dels anys i en funci del reg i el no reg, s necessari ubicar els resultats en el context de les caracterstiques climtiques de la zona. Farem primer una anlisi global a partir del diagrama de precipitacions i temperatures mitjanes registrats durant els 4 anys destudi (1998, 1999, 2000 i 2002), per desprs fer lanlisi separada per cada any. El diagrama ombrotrmic 120 30 (grfica 1.4.6.1) mostra diferncies 100 25 entre els anys quant a 80 20 precipitacions, per la temperatura 60 15 mitjana es mant constant 40 10 prcticament tots els anys, a causa 20 5 de lefecte termoregulador que 0 0 G F M A M J J A S O N D exerceix la proximitat del mar. En P (mm) 1998 P (mm) 1999 P (mm) 2000 P (mm) 2002 lanlisi de les pluges, sn Tm (C) 1998 Tm (C) 1999 Tm (C) 2000 Tm (C) 2002 especialment importants aquelles Grfica 1.4. 6.1. Diagrama de precipitacions i de temperatures mitjanes per a les campanyes objecte destudi que es registren els mesos entre juny i la verema, ja que en aquests moments s quan poden afectar ms levoluci del ram i, per tant, la qualitat.
Tm (C)
* El 1998 tingu un estiu sec, especialment els mesos de juny i juliol, encara que els darrers dies dagost i setembre van produir-se abundants precipitacions. En canvi, les precipitacions de primavera van ser discretes per suficients per al correcte desenvolupament de la planta. Les humitats relatives tamb van ser baixes. * El 1999 tingu escasses pluges durant lestiu, i a ms estigueren repartides al llarg del perode, excepte al mes de setembre en qu, de manera similar al 98, ocorregueren abundants precipitacions. La constncia en les precipitacions estiuenques va estar associada a unes humitats relatives superiors que en lany anterior. * Lany 2000 caigueren pluges abundants durant el mes de juny, que van compensar lescassa precipitaci dels mesos anteriors, abans de la brotada. En canvi, els mesos de juliol
precipitacions (mm)
77
i agost van ser els ms secs dels considerats, i van ser els de ms rigor de temperatures. Al setembre, en canvi, es van registrar novament precipitacions considerables. * Lany 2002 fou el ms plujs, amb abundants pluges tant els mesos dagost i setembre, com durant la primavera i, de fet, al llarg de tot el cicle. Tamb cal remarcar que les temperatures mitjanes foren considerablement menors que en els altres anys i que en aquests mesos hi hagu fora nuvolisitat. Comentarem seguidament les situacions particulars de lany: 1) Campanya 1998
100 Pluviometria (mm) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 G F M A M J J A S O N D 0 10 5 15 25 20 30 Temperatura (C)
P (mm) 1998
Tm (C) 1998
B
percentatge
100 90 80 70 60 600 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 dia 40 50 60 70 0 200 400 800 1000
percentatge
Ull reg 98
ull no reg 98 100 90 80 70 60 600 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 dia 40 50 60 70 0 200 400 800 1000
no acilats
percentatge percentatge
100 100 90 90 80 80 70 70 60 60 50 50 40 40 30 30 20 20 10 10 0 0 0 0
acetilats
cs reg cs no reg 98
p-cumarilats
total
percentatge
1200
no acilats
percentatge
100 100 90 80 70 60 50 40 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 0 10 20
acetilats
cs no reg r e g c s 98
p-cumarilats
total
1000
antocians (g/g baia) antocians (g/g baia)
1000 1000 800 800
900 1000 800
700 800 600 500 400 400 300 200 100 dia 40 30 dia 0 40 50 50 60 60 70 70 0 200
600 600
600
400 30 200 200 0 70 0 70 20 10 10 10 20 20 30 30 dia 40 dia 40 0 50 50 60 60
10
20
30
no acilats no acilats
acetilats acetilats
p-cumarilats p-cumarilats
total total
no acilats no acilats
acetilats acetilats p-cumarilats p-cumarilats total total
78
Pes 100 baies (g) Ull, reg Ull, no reg CS, Reg CS, No Reg 300 307 155 157
Producci (kg/cep) 5.0 4.4 4.2 4.0
GAP 11.0 11.2 12.2 11.9
Antocians (mg/kg baia) 698 802 1014 948
Grfics i taules 1.4.6.2. Es representa (A) el diagrama ombrotrmic, (B) levoluci en antocians totals i en els percentatges dacilaci per les varietats Ull de llebre i Cabernet sauvignon, en condicions dirrigaci i de no irrigaci, per la campanya 98. La taula (C) mostra els valors en el moment de la collita dels parmetres pes de 100 baies, la producci, el grau alcohlic probable i el contingut dantocians (en mg/kg baia)
El 1998, desprs dun desenvolupament vegetatiu normal, lestiu, com ja hem comentat, fou molt sec, per amb unes precipitacions de 35 mm els darrers dies dagost. Els antocians van augmentant lentament, per aquestes precipitacions 3 dies abans de veremar van afectar ull de llebre, com demostra la davallada de la concentraci total dantocians en el punt final del mostreig, corresponent al moment de la verema (fig B). De fet, la mxima concentraci sassoleix dues setmanes abans de veremar, i desprs disminueix notablement. Aquest efecte es produeix tant en el tractament de reg com en el de no reg, encara que fou ms acusat en les vinyes no irrigades. Malgrat aquesta major diluci final, aquestes vinyes irrigades van tenir un contingut antocinic lleugerament inferior al del tractament de no reg (taula C). Aquest menor contingut significa una menor sntesi global, ja que la mida de la baia no difereix entre tractaments. En Cabernet, en veremar-se ms tard, al 16 de setembre, les tardanes pluges dagost en el 1998 no afectaren la dinmica de la maduraci com en ull de llebre, ja que les baies encara estan a gaireb un mes del final de la maduraci fisiolgica (figura B). Els antocians van augmentant progressivament i tant les concentracions finals com el volum de la baia sn similars entre les situacions de reg i no reg (taula C). El grau alcohlic probable, que sovint es correlaciona amb el nivell dels antocians, no presenta diferncies significatives entre ambds tractaments per a cada varietat, com tampoc ho fan els antocians. No obstant aix, sembla apreciar-se una tendncia a una major producci en el tractament de reg, especialment en el cas dull de llebre.
79
2) Campanya 1999
100 Pluviometria (mm) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 G F M A M J J A S O N D
30 Temperatura (C) 25 20 15 10 5 0
P (mm) 1999
Tm (C) 1999
B
percentatge percentatge
Ull reg 99 100 90 80 70 60 50 600 40 30 20 200 10 0 0 10 20 30 dia 40 50 60 70 0 0 0 10 20 30 dia 40 50 60 70 0 400 800 1200 Ull no reg 99 100
90 80 70 60 50
1200
1000
1000
800
600 40 30 20 200 10 400
no acilats percentatge
acetilats
cs reg 99
p-cumarilats
total percentatge
no acilats
acetilats
cs no reg 99
p-cumarilats
total
100
100 90 80 70 60 50
90 80
1200
1200
1000 70 60 50 600 40 30 20 200 10 0 0 10 20 30 dia 40 50 60 70 0 400 800
1000
800
600 40 30 20 200 10 0 0 10 20 30 dia 40 50 60 70 0 400
no acilats
acetilats
p-cumarilats
total
no acilats
acetilats
p-cumarilats
total
80
Producci (kg/cep) 7.2 7.4 5.3 5.3
GAP 10.3b 9.8a 11.8a 12.2b
Lany 1999 presenta un pluviometria anual semblant al 98, per la repartici de les pluges t lloc al llarg del cicle i la humitat relativa s tamb ms elevada que en el 1998. Lany 1999 lull de llebre presenta un contingut final dantocians ms elevat en reg per un volum de baies similar. En aquest any, no sobserva una disminuci final del contingut, sin que aquest encara est augmentant en el moment de la verema. En Cabernet, lany 99 registra uns nivells dantocians ms elevats en la situaci de no reg. La varietat rep una copiosa pluja el setembre que sembla perjudicar el tractament de reg front el de no reg, ja que en sumar-se laigua de reg amb la de la pluja sarriba a un mxim abans de la verema que desprs canvia per disminuir cap al final. La concentraci dantocians a la collita respecte lany anterior s ms gran i les baies sn quelcom ms petites en no reg que en reg, contrriament al que succea en ull de llebre. Els graus alcohlics probables en ull de llebre disminueixen respecte els de lany anterior, per aix no es tradueix en una disminuci en el contingut dantocians. En Cabernet es mant un grau similar durant les anyades estudiades, malgrat que les produccions sn ms elevades en el 1999. Aquest any, sobserven diferncies en el grau alcohlic probable a favor del no reg. No obstant aix, les produccions per cep no difereixen entre els dos tractaments.
81
3) Campanya 2000
30 Temperatura (C) 25 20 15 10 5 0
P (mm) 2000
Tm (C) 2000
B
Ull reg 2000 Ull no reg 2000 1200
percentatge
100.00 90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00
percentatge
100.00 90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00
1200
1000
1000
800
800
600
600
400 30.00 20.00 10.00 0.00 0.00 10.00 20.00 30.00 dia 40.00 50.00 60.00 0 70.00 200 30.00 20.00 10.00 0.00 0.00 10.00 20.00 30.00 dia 40.00 50.00 60.00
400
200
0 70.00
100.00
acetilats
CS reg 2000
p-cumarilats
total percentatge
100.00
no acilats
acetilats
CS no reg 2000
p-cumarilats
total
2200 90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 800 30.00 600 20.00 10.00 0.00 0.00 10.00 20.00 30.00 dia 40.00 50.00 60.00 400 200 0 70.00 2000 1800 1600 1400 1200 1000
2200 90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 800 30.00 600 20.00 10.00 0.00 0.00 10.00 20.00 30.00 dia 40.00 50.00 60.00 400 200 0 70.00 2000 1800 1600 1400 1200 1000
no acilats
acetilats
p-cumarilats
total
no acilats
acetilats
p-cumarilats
total
82
Pes 100 baies (g) Ull, reg Ull, no reg CS, Reg CS, No Reg 213 b 182 a 123 117
Producci (kg/cep) 7.4 b 6.0 a 3.5 3.7
GAP 10.5 10.3 13.2 13.5
Antocians (mg/kg baia) 990 a 1208 b 1484 a 1932 b
Lestiu del 2000 tamb va ser sec, i amb unes humitats relatives molt baixes. Aquesta sequedat es manifesta en uns volums de baia que sn els menors dentre tots els anys destudi. En Cabernet, hi ha una disminuci final del contingut en antocians atribuble a les pluges de setembre, efecte que s novament ms pronunciat en la situaci de reg, en qu es suma lefecte de lirrigaci al de les precipitacions. Aquesta situaci s equivalent a la que es va produir lany anterior, i de fet sembla que hi ha una relaci entre el valor de les precipitacions i la disminuci dantocians, ja que aquestes prdues sn ms elevades en el 2000, en qu les pluges de setembre foren de 100 mm, que en les del 1999, en qu les precipitacions registrades eren de 60 mm. De totes maneres, aquest efecte no impedeix que sassoleixin les concentracions ms elevades dantocians en aquest any sec. Quant a lefecte de lirrigaci, sn notablement superiors els valors en la situaci de no reg que en la de reg, malgrat que els volums de baia sn similars. En ull de llebre la verema tingu lloc abans daquestes precipitacions, motiu pel qual no hi ha lefecte de disminuci de concentracions comentat, sin que el contingut en antocians totals augmenta fins a la verema. En Ull de llebre tamb saconsegueixen uns valors ms alts dantocians, especialment si el comparem amb lany anterior, el 99. Com en Cabernet, s la situaci de no reg la que presenta superiors nivells dantocians, cosa que va lligada a un menor volum de baia.
83
4) Campanya 2002
30 Temperatura (C) 25 20 15 10 5 0
P (mm) 2002
Tm (C) 2002
Ull reg 2002
Ull no reg 2002
B
1600 1400 1200 1000 800 600
percentatge
100.00 1600 90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 600 30.00 20.00 10.00 0.00 0.00 10.00 20.00 30.00 dia 40.00 50.00 60.00 400 200 0 70.00 1400 1200 1000 800
percentatge
100.00 90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 0.00 10.00 20.00 30.00 dia 40.00 50.00 60.00 400 200 0 70.00
acetilats
p-cumarilats
total percentatge
no acilats
acetilats
p-cumarilats
total
CS reg 2002 100.00 90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 200 10.00 0.00 0.00 10.00 20.00 30.00 dia 40.00 50.00 60.00 0 70.00 10.00 0.00 0.00 10.00 20.00 400 800 1200 100.00 90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00
CS no reg 2002
1200
1000
1000
800
600
600
400
200
30.00 dia 40.00
50.00
60.00
0 70.00
no acilats
acetilats
p-cumarilats
total
no acilats
acetilats
p-cumarilats
total
84
Producci (kg/cep) 6.8 6.1 4.2 3.9
GAP 11.6 12.6 12.1 12.4
En oposici als altres anys, el 2002 va ser un any especialment plujs, i en aquest cas sobserva una resposta varietal diferent: lUll de llebre s capa de sintetitzar uns nivells ms elevats dantocians en aquest any. Contrriament, en cabernet la sntesi resulta menor. En Cabernet, sobtenen unes concentracions notablement ms elevades en situaci de no reg, igual que en lUll de llebre.
Les pluges determinen un increment dels pesos de les baies respecte la situaci de lany 2000, per sense assolir-se els valors de lany 98, en qu va ploure desprs duna abundant sequera.
85
6.2) Irrigaci i varietat A continuaci comparem les situacions entre els anys per a cada varietat:
a) Ull de llebre Com es desprn de les grfiques dacumulaci dantocians al llarg de la maduraci, la dinmica en Ull de llebre es caracteritza per un increment continu dels antocians fins a la data de verema. Noms en lany 1998 sobserva un valor mxim abans daquesta data, que correspon a un efecte de diluci causat per unes precipitacions poc abans de la verema. Seguidament comentarem els valors finals (data de collita) de producci, pes de baia, grau alcohlic probable i antocians (Grfica 1.4.6.6 ).
Producci Ull de llebre 8 7 7.2 6 5 4 3 2 1 0 98 99 Producci Reg Grau Alcohlic Probable (GAP) 00 Producci No Reg 02 100 50 0 98 99 Pes 100 baies Reg 00 Pes 100 baies No Reg 02 5 4.4 6 7.4 Pes 100 baies (g) Producci (kg) 7.35 6.8 6.1 350 300 250 200 150 300 307 251 258 213 182 208 Pes 100 baies Ull de llebre
235
GAP Ull de llebre 14 12 10 8 6 4 2 0 98 99 GAP Reg 00 GAP No Reg 02 11 11.17 11.57 12.07 10.3 9.8 10.47 10.33 Antocians (mg/ kg baia) 1800 1600
Antocians Ull de llebre
1680
1400 1200 1000 800 600

700 790 1125 1215 1067 1210 1300
980
400 200 0 98 99 00 mg antocians / kg baiaNo Reg 02 valor mxim mg antocians/ kg baiaReg
Grfics 1.4.6.6. Es representa, per a la varietat Ull de llebre, els valors de producci, de pes de 100 baies, de grau alcohlic probable i de contingut dantocians en mg/kg de baia,en les condicions de reg i no reg. En el cas dels antocians, es representa en groc el valor mxim que sassolia abans de la verema en la situaci de no reg.
* Excepte en la campanya99, els valors dantocians en la situaci de no reg han estat sempre superiors als de les condicions irrigades. Aquest fenomen no sembla atribuble a lefecte diluci, ja que els pesos de les baies sn similars en ambds tractaments i, de fet,
86
excepte en la campanya2000, lleugerament inferiors en el cas de la situaci de reg. Per tant, la menor concentraci dantocians per un pes de baia similar sembla indicar que la situaci dirrigaci inhibeix la sntesi dels antocians a nivell de baia. Malgrat aix, en un any plujs com el 2002 s quan Ull de llebre sintetitza ms antocians. Cal tenir en compte que en aquest any han tingut lloc pluges repartides durant tot el cicle vegetatiu. Que en un any inusual destiu menys rigors i primavera amb majors aportacions hdriques es pugui veure afavorit el desenvolupament i la fisiologia de la planta, ens indicaria que aquesta varietat presenta una mala adpataci a les caracterstiques mesoclimtiques seques habituals de la regi. Els valors ms baixos dantocians corresponen a lanyada 1998, encara que sn atribubles, com ja sha indicat, a lacci diluent de les pluges abans de la verema. * Per cada anyada, es pot establir una correlaci del contingut antocinic amb la producci, ja que en tots els casos, el tractament (reg o no reg) que ha generat menys kg de collita resulta ser el que produeix major contingut antocinic, fins i tot per la campanya99, en qu les vinyes no irrigades van produir ms que les regades. De totes maneres, la magnitud daquesta relaci depn absolutament de lanyada, ja que produccions similars per en diferents anys, com les registrades el 99 i el 2000, donen un contingut dantocians en baia diferents. Aix pot venir donat per la gran variabilitat de les produccions aconseguides en aquests anys destudi, que oscillen entre els 4.5 i els 7.5 kg/cep. * No es pot establir correlaci, en canvi, entre la concentraci dantocians i el pes de les baies. Noms en el 2000 sobserva en la situaci de no reg uns menors volums de baia i uns majors nivells dantocians. En canvi, en el 2002 el menor volum de les baies de lUll de llebre es correspon amb uns nivells dantocians ms baixos, especialment en els tractaments de no reg. En els anys 98 i 99 no sobserven diferncies significatives en el pes, per s divergeixen els valors dantocians. Per tant, en Ull de llebre la mida de la baia no determina el contingut dels antocians. * Quant al grau alcohlic probable, s a dir, el contingut en sucres de la baia, sembla correlacionar-se amb el nivell dantocians, independentment de la variable irrigaci, a excepci de lany 2000. En els anys 1999 i 2002, a ms, aquesta relaci mant una proporcionalitat, per no succeeix el mateix en els anys destius secs com el 98 i 2000: en aquestes condicions els graus relativament elevats no proporcionen les quantitats dantocians esperables, sin uns valors ms baixos.
87
Si observem els resultats sobre la composici del ram pel que fa al grau alcohlic probable i la relaci amb la producci per cep, podem constatar la menor acumulaci de sucres en Ull de llebre en produccions elevades, situaci que es dna en el 1999 i en el 2000. No es troben diferncies significatives si es comparen les tesis de reg i no reg en cap dels dos anys.
b) Cabernet Sauvignon Un fet a ressaltar en Cabernet sauvignon s la dinmica dacumulaci dels antocians durant la maduraci, ja que tant en situaci de reg com de no reg i independentment de lanyada, sassoleixen els nivells mxims dantocians entre 10 i 20 dies abans de la verema. En Cabernet, contrriament al que succeeix amb Ull de llebre, les concentracions ms altes (quasi el doble) dantocians per pes de baia satenyen en any sec (2000). A ms, sn notablement ms elevades en no reg que en reg, cosa que tamb ocorre el 1999. En canvi, en un any plujs com el 2002 la concentraci en antocians disminueix ostensiblement i les diferncies entre regats i no regats sn febles (grfic 1.4.6.7).
Producci cabernet sauvignon 6 Pes 100 baies (g) Producci (kg) 5 4 4.17 3 2 1 0 98 99 Producci Reg Grau Alcohlic Probable (GAP) 00 Producci No Reg 02 4 3.48 4.2 3.74 3.9 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 98 99 Pes 100 baies Reg 00 Pes 100 baies No Reg 02 155 157 147 141 123 117 137 131 5.28 Pes 100 baies cabernet sauvignon
5.26
GAP cabernet sauvignon 14 13.5 13 12.5 12.6 12 11.5 11 10.5 98 99 GAP Reg 00 GAP No Reg 02 0 12.37 12.2 11.9 11.8 500 12.2 13.45 13.18 Antocians (mg/ kg baia) 2500
Antocians cabernet sauvignon
2000
1950
2250
1500
1480 1200
1820
1000
1000 950 900 1100
1190
1060 1150 980
98 antocians/ kg baiaReg mg 99 mg antocians / kg baiaNo Reg
valor mxim (reg) 00 valor mxim (no reg)
02
Grfics 1.4.6.7. Es representa, per a la varietat Cabernet sauvignon, els valors de producci, de pes de 100 baies, de grau alcohlic probable i de contingut dantocians en mg/kg de baia,en les condicions de reg i no reg. En el cas dels antocians, es representen tamb els valor mxims que sassolien abans de la verema en els anys 2000 i 2002.
88
* Lany ms sec (2000) tamb resulta ser el menys productiu, i es formen unes baies de mida menor. En les altres anyades, de produccions ms elevades, augmenta el pes de baia. * La concentraci dantocians tamb es relaciona amb el pes de les baies, de manera que en tots els anys, sobtenen majors quantitats dantocians en aquelles condicions en qu hi ha un menor pes de baia, situaci que es correspon generalment a les condicions de no irrigaci, excepte en lany 1998. De totes maneres, en el pes de baies es tracta de diferncies no significatives, de manera que haurem de parlar de tendncies. s destacable que, quant a anyades, en Cabernet sauvignon es mant molt ms constant el pes de les baies que el que succeeix en Ull de llebre. * Els valors dantocians es correlacionen prou b amb els de grau alcohlic, a excepci de la campanya 2002, en qu resulta major el GAP en el cas del reg. El grau alcohlic probable de lany sec (2000) resulta ms elevat que el daltres anys, i la seva correlaci amb el contingut dantocians es manifesta de forma clara per a aquesta campanya. En els anys 99 i 2000 els valors ms elevats de GAP tenen lloc en les vinyes no irrigades. Per contra, en el 1998 i en el 2002 es registra un nivell ms elevat de sucres en la situaci de reg. Per tant, no es pot establir una influncia clara del reg sobre aquesta variable. En canvi, es pot establir un lligam entre els valors de producci i els de grau alcohlic respecte les anyades, ja que en el 99 lelevada producci origina baies amb menor contingut de sucres, mentre que en el 2002 la relaci s inversa (baixa producci, elevat grau alcohlic), i en el 2001 es situen els valors mitjans. La relaci, per, no es compleix si es comparen les situacions de reg i no reg , o si es considera lany 1998, en qu sobtenen uns continguts en sucres baixos.
Discussi general En la nostra zona, lefecte de lanyada sobre la producci, el pes de les baies, el contingut en sucres i el contingut antocinic de la baia s molt ms acusat que lefecte dels tractaments de reg i no reg, que noms originen diferncies febles. Sembla que el reg o les pluges afecten de forma diferent a les dues varietats. Existeix una forta interacci amb el clima, sobretot amb la pluviometria. Hom pot concloure que les diferncies anuals que es donen en la zona dinfluncia mediterrnia per la variabilitat del
89
moment en qu es registren les pluges condicionen notablement la composici, producci i nivell dantocians en la verema. - Els anys ms plujosos, temperats, amb pluges que sovintegen al llarg del cicle afavoreixen la sntesi dantocians en Ull de llebre, com succeeix lany 2002. En els altres anys, per, sobserva un comportament errtic que dificulta la comparaci de resultats. Per sembla evident que Ull de llebre s una varietat mal adaptada a la zona, ja que no assoleix el potencial fisiolgic propi. Aix ho posa de manifest el baix grau alcohlic obtingut, que en altres zones arriba a ser de 13, aix com el baix contingut en antocians. - Els anys ms secs afavoreixen la sntesi dantocians en Cabernet sauvignon. Es pot establir una tendncia a correlaci entre la mida de la baia i el contingut en antocians. Per altra banda, les variacions de mida de baia i produccions sn menors sota lefecte danyada que en lUll de llebre. Els resultats obtinguts en el cas de Cabernet sauvignon sn consistents amb els que troben daltres autors163,164,165 segons els quals el dficits hdrics incrementen la sntesi dantocians. La disminuci de la mida de la baia, que en Cabernet es relaciona amb un augment dantocians, sembla no guardar relaci en la varietat Ull de llebre, doncs laugment dantocians en 2002 respecte del 2000 en situaci tant en el tractament de reg com en el de no reg no va acompanyat duna disminuci del volum de la baia166. Contrriament als nostres resultats, el nivell final ms elevat dantocians en Ull de llebre registrats per Esteban et al 157 correspon a la tesi de no reg front la de reg durant les dues anyades estudiades. Si es considera lefecte de lanyada (amb unes precipitacions anuals semblants a les nostres pel 2000 i 2002) en lany sec sateny el nivell ms elevat, a linrevs que a Constant. A part, en lUll de llebre de Madrid constaten diferncies notables de pes de baia entre tractaments, s a dir, de menor pes de baia en no reg amb ms elevats antocians, la qual cosa no sobserva a Constant. Escalona 156 , en Ull de llebre a Mallorca, observa uns valors finals dantocians en verema ms elevats en la situaci de reg a la vegada que la producci augmenta amb el reg considerablement. Cal esmentar que en el cas de no reg lestrs s rigors, ja que la producci per cep s de 0.5 kg, que augmenta a 2.5 kg en el tractament de reg.
163
Bravdo, B; Hepner, Y; Loinger, C; Cohen, S; Tabacman, H. (1985). Effect of irrigation and crop level on growth, yield and wine quality of Cabernet sauvignon. Am J Enol Vitic 36:132-139 164 Hardie, WJ; Coinsidine, JA. (1976). Response of grapes to water-deficit stress in paricular stages of development. Am J Enol Vitic 27:55-61 165 Pirie AJG; Mullins, MG. (1980). Concentration of phenolics in skin of grape berries during fruit development and ripening. Am J Enol Vitic 31:34-36 (1980)
90
En conclusi, per a Cabernet es relacionen els parmetres delevat contingut dantocians, amb elevat grau i baia petita. En canvi, en Ull de llebre els continguts en antocians varien segons les anyades, sn ms sensibles als factors climtics de lany i sembla que el nivell mxim s independent de la mida de la baia.
6.3) Efectes de la irrigaci sobre els antocians individuals Com ja hem comentat, el contingut en antocians totals presenta valors diferents en situaci de reg i no reg. En aquest sentit, resulta interessant determinar si aquest increment es manifesta especialment en algun grup dantocians. Per a aix, a continuaci es presenten els resultats corresponents les proporcions dels antocians individuals durant 4 anys destudi:
Ull R 98 Dp-3-glu Cy-3-glu Pt-3-glu Pn-3-glu Mv-3-glu TOTAL no acilats 11,4 1,8 1,6 0,2 11,6 0,9 4,8 0,7 41,2 2,5 70,6 5,3 10,3 4,2 19,1 1,4 Ull NR 98 13,4 0,7 2,3 0,5 12,7 0,4 5,5 0,7 39,9 1,8 73,7 1,9 8,4 1,2 17,9 2,8 Ull R 99 18.5 4.8 2.5 1.2 14.1 2.1 5.2 1.2 38.2 3.3 78.4 5.8 4.6 0.5 16.9 5.4 Ull NR 99 12.3 2.6 1.5 0.5 10.9 1.5 3.8 0.6 40.0 1.8 68.6 3.8 5.3 0.9 26.1 3.1 Ull R 2000 13.9 2.0 2.3 0.2 12.2 0.3 3.8 0.4 41.1 0.1 73.2 1.2 3.1 0.2 23.6 1.1 Ull NR 2000 13.3 2.0 2.0 0.4 11.8 1.5 3.8 0.2 41.7 0.5 72.7 3.7 3.0 0.2 24.3 3.5 Ull R 2002 15.2 2.4 3.4 0.5 12.5 1.1 6.3 0.8 36.5 1.9 73.8 4.1 3.3 1.6 22.8 2.6 Ull NR 2002 13.2 1.8 3.9 0.5 10.4 1.1 6.5 0.5 26.1 1.4 60.1 3.1 1.6 0.8 36.6 3.1
Total acetilats
Total p-cumarilats
CS R 98 Dp-3-glu Cy-3-glu Pt-3-glu Pn-3-glu Mv-3-glu TOTAL no acilats 6.7 0.7 1.0 0.2 5.5 0.4 4.8 0.4 38.1 0.3 55.9 1.9 32.5 2.0 11.6 0.5
CS NR 98 6.9 1.0 0.9 0.2 6.0 1.0 5.3 1.2 42.1 6.6 61.2 9.4 26.0 12.0 12.8 2.6
CS R 99 6.7 0.5 0.7 0.1 5.2 0.3 4.0 0.1 40.1 0.2 56.7 1.0 31.5 0.5 11.8 1.0
CS NR 99 7.1 0.3 0.9 0.2 5.4 0.1 4.1 0.5 40.9 1.7 58.4 0.8 30.4 0.8 11.2 0.4
CS R 2000 11.1 0.9 1.1 0.7 7.5 0.6 4.1 1.0 42.7 1.4 66.5 2.3 25.7 2.2 7.7 0.1
CS NR 2000 10.6 0.6 1.0 0.3 7.4 0.5 3.4 0.5 43.0 1.1 65.4 1.6 26.1 1.4 8.5 0.4
CS R 2002 11.4 0.7 3.6 0.3 7.7 0.4 9.2 0.5 37.1 0.6 69.0 1.7 23.1 1.5 8.0 0.5
CS NR 2002 11.9 0.7 5.3 0.2 7.5 0.5 12.450.7 35.3 3.1 72.5 4.0 20.6 4.7 6.9 1.1
Total acetilats
Total p-cumarilats
Taula 1.4.6.6. Variaci en la composici antocinica en les situacions de reg i no reg en verema per Ull de llebre i 166 Lampreave, M. (2002). Fisiologia de labsorci en lecosistema vitcola sl-planta-atmosfera i repercussions en la qualitat del ram. Tesi doctoral, Dep Bioq CabernetURV i Biotecn sauvignon en les diferents campanyes. Sexpressen els valors percentuals.
91
Les diferncies en el moment de la verema en lacilaci entre les condicions de reg i no reg sn molt febles, i en sentit contrari a les esperables. En la majoria de casos, els valors dacilaci no sn significativament diferents o fins i tot sn inferiors en les condicions de reg. Aquests resultats entren en conflicte amb els daltres autors156, en qu les condicions de no irrigaci produeixen uns majors nivells dantocians acilats. De totes maneres, aquesta resposta dincrement de lacilaci en estats destrs depn tamb de la varietat, i no sempre sobserven. Les majors diferncies es detecten per la varietat Ull de llebre, en les campanyes 99 i 2002. En aquests casos, la situaci destrs hdric aconsegueix major proporci dantocians acilats. Tanmateix, no est clar lestrs hdric a qu est sotmesa la planta, ja que en lany 99 es sintetitzen ms antocians en la situaci de reg. Cal considerar que els resultats obtinguts en la nostra zona no han manifestat una repercussi marcada de lestrs hdric, en contrast amb els efectes que sobtenen en altres treballs. En els casos que sha obtingut una major incidncia de la manca de disponibilitat daigua sobre el contingut en antocians ha estat precisament en Cabernet per lany 2000 i per Ull de llebre en lany 2002.
Per tant, podem concloure que lefecte del reg sobre la composici antocinica de les dues varietats estudiades en la nostra zona no resulta determinant.
92
5. CONCLUSIONS
1. Mitjanant lanlisi de components principals, es poden diferenciar les 8 varietats en data de verema. Les variables que contribueixen amb major pes relatiu en els factors sn els nivells dacilaci. 2. Es pot establir una composici antocinica per a cada varietat, que roman prou estable amb lanyada. En aquest sentit, conv destacar per les seves peculiaritats la verietat Pinot noir, que no presenta acilaci; i la varietat Cabernet sauvignon, que s la nica de les varietats estudiades en qu predomina lacetilaci. 3. El contingut dantocians totals est fortament influt per la varietat, per tamb hi ha una intervenci de les caracterstiques climtiques de lanyada. 4. La dinmica devoluci del contingut dantocians al llarg de la maduraci ve determinada per la varietat i per lanyada, de manera que segons aquestes variables presenta una disminuci o no abans de la verema; cosa que implica que no coincideix la maduresa fenlica amb la tecnolgica. 5 Hi ha un canvi en la composici antocinica al llarg de la maduraci. Per una banda, t lloc un increment dels antocians acilats i, per laltra, un increment dels nivells de malvidina. 6. La disponibilitat daigua pot tenir efectes en el contingut i en la composici antocinica. Els efectes de les pluges acostumen a ser ms decisius que lestabliment de les dosis de reg, i la resposta varietal s diferent. En varietats ben adaptades al mesoclima, lestrs provoca un increment en els nivells dantocians i en el grau dacilaci dels mateixos. 7. Lestudi dels compostos antocinics tamb permet detectar varietats amb maduraci incompleta o mal adaptades, com el cas dull de llebre.
93
6. REFERNCIES BIBLIOGRFIQUES
1.
Strack,D; Wray, V. (1994). The anthocyanins, a The flavonoids: Advances in research since 1986 Chapman & Hall 2. Markham, KR; Gould, KS; Winefield, CS; Mitchell, KA; Bloor, SJ; Boase, MR. (2000). Anthocyanic vacuolar inclusions their nature and significance in flower colouration. Phytochemistry 55: 327-336 3. Chalker-Scott; L (1999). Environmental significance of anthocyanins in plant stress . responses. Photochemistry and Photobiology. 70(1): 1-9 4. Souquet, JM; Cheynier, V; Sarni-Manchado, P; Moutounet, M. (1996). Les composs phnoliques du raisin. J. Int. Sci. Vigne et Vin, Hors srie, 99-107 5. Climent D; Pardo T. (1993). Study of the phenolic composition of Bobal, Grenache and Tempranillo grapes; Riv di Vitic e di Enol, 46 (3) 35-44 6. Ortega Meder, M. D.; Rivas Gonzalo, J. C.; Vicente, J. L.; Santos Buelga, C (1994). . Diferenciacin de variedades de uvas tintas por su composicin antocinica. Revista Espaola de Ciencia y Tecnologia de Alimentos, 34 (4) 409-426 7. Arozarena, I.; Casp, A.; Marn, R.; Navarro, M. (2000). Differentiation of some Spanish wines according to variety and region based on their anthocyanin composition. European Food Research and Technology, 212 (1) 108-112 8. Eder R;Wendelin S;Barna J. (1994). Klassifizierung von Rotweinsorten mittels Anthocyananalyse. 1. Mitteilung: Anwendung multivariater statistischer Methoden zur Differenzierung von Traubenproben. Mitteilungen Klosterneuburg, Rebe und Wein, Obstbau und Fruechteverwertung;44: 201-212 9. Scienza A;Piergiovanni L;Visai C;Conca E;Romano F. (1986). Il profilo antocianico delle uve quale mezzo tassonomico per il riconoscimento dei vitigni rossi. Vignevini, 13: 75-81 10. Roggero JP;Larice JL;Rocheville-Divorne C;Archier P;Coen S. (1988). Composition anthocyanique des cepages. I. Essai de classification par analyse en composantes principales et par analyse factorielle discriminante. Revue Francaise d'Oenologie, Cahier Scientifique, 28 (112): 41-48 11. Gonzlez-Neves, G.;Gmez-Cordovs, C.;Barreiro, L. (2001). Anthocyanic composition of Tannat, Cabernet Sauvignon and Merlot young red wines from Uruguay. Journal of Wine Research;12 (2) 125-133 12. Holbach, B.;Marx, R.;Ackermann, M. (1997). Determination of anthocyanins composition of red wine by HPLC. Lebensmittelchemie. 51 (4) 78-80 13. Gonzalez-San Jose ML; Santa-Maria G; Diez C. (1990). Anthocyanins as parameters for differentiating wines by grape variety, wine-growing region, and wine-making methods. Journal of Food Composition and Analysis;3: 54-66 14. Hesford, F.;Schneider, K (1997). Anthocyanins, the natural red coloring matter of the . wine. Schw. Zeit. fr Obst- und Weinbau;133 (22): 559-561 15. Katalinic, V.;Males, P. (1997). Compositional changes in grape polyphenols throughout maturation. Journal of Wine Research 8 (3): 169-177 16. Kallithraka, S.;Arvanitoyannis, I. S.;Kefalas, P.;El-Zajouli, A.;Soufleros, E.;Psarra, E. (2001). Instrumental and sensory analysis of Greek wines; implementation of principal component analysis (PCA) for classification according to geographical origin. Food Chemistry;73 (4): 501-514
94
17.
Garca-Beneytez, E; Revilla, E; Cabello, F. (2002). Anthocyanin pattern of several red grape cultivars and wines made from them. European Food Research and Technology, 215 (1):32-37 18. Scienza A;Failla O;Anzani R;Mattivi F;Villa PL;Gianazza E;Tedesco G;Benetti U. (1990). Possible similarities between the Lambrusco with cleft leaves and some cultivated and wild grapevines grown in southern Trentino, North Italy. Vignevini, 17 (9): 25-36 19. Otteneder, H.;Holbach, B.;Marx, R.;Zimmer, M.. (2002). Identification of grape cultivars in red wine by means of their anthocyanin spectra. Mitteilungen Klosterneuburg, Rebe und Wein, Obstbau und Frchteverwertung, 52 (5-6): 187-194 20. Calo A;Di Stefano R;Costacurta A;Calo G. (1991). Characterization of Cabernet franc and Carmenere, Vitis sp., and explanations on their cultivation in Italy. Rivista di Viticoltura e di Enologia. 44 (3) 3-25 21. Valenti, L.;Mastromauro, F.;Brancadoro, L.;Bogoni, M.;Mattivi, F. (1997). The description and evaluation of grapevine land races in Oltrepo Pavese, northern Italy. Journal of Wine Research, 8 (2) 87-102 22. Crespan, M.;Cal, A.;Costacurta, A.;Milani, N.;Giust, M.;Carraro, R.;Di Stefano, R . (2002). Ciliegiolo and Aglianicone: The only varieties with a direct relationship to Sangiovese. Rivista di Vitic e di Enologia, 255 (2-3): 3-14 23. Burns, J.;Mullen, W.;Landrault, N.;Teissedre, P. L.;Lean, M. E. J.;Crozier, A.. (2002). Variations in the profile and content of anthocyanins in wines made from Cabernet Sauvignon and hybrid grapes. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50 (14) 4096-4102; 24. Scienza A;Mattivi F;Villa P;Gianazza E;Tedesco G;Failla O. (1994). Genetic relationships between Teroldego and some wine grape genotypes of different geographic origin. Bolletino dell'Instituto Agrario;Supplemento al 2 (3) 23-32 25. Del Caro A;Franco MA;Sferlazzo G;Mattivi F;Versini G;Monetti A;Castia T. (1994). Characterization of anthocyanic profiles of Vitis vinifera grown in Sardinia. Vignevini, 21 (11) 63-69 26. Rossoni, M.;Fasoli, V.;Labra, M.;Spinardi, A.;Failla, O.;Scienza, A.;Sala, F. (2001). Exploration of elite grapevine germplasm of Oltrep pavese (northern Italy) using genetic, chemotaxonomic and morphological markers. Advances in Horticultural Science, 15 (1-4):7278 27. Costantini, L.;Malossini, U.;Roncador, I.;Mattivi, F.;Grando, M. S. (2001). Cultivar identity control of Moscato rosa grapevines undergoing clonal selection. Advances in Horticultural Science, 15 (1-4): 56-60 28. Golodriga Pla; Doubovienko NP. (1978). Anthocyanins and genotype in the vine Genet. Amelior. Vigne. IIe Symp. Intern., Bordeaux.INRA, 413-416 29. Flamini, R.;Tomasi, D.. (2000). The anthocyanin content in berries of the hybrid grape cultivars Clinton and Isabella; Vitis, 39 (2) 79-81 30. Blouin, J; Guimberteau, G. (2002). Maduracin y madurez de la uva; Ed Mundi-Prensa 31. Baldi, A; Romani, A; Mulinacci, N; Vincieri, FF; Casetta, B. (1995). HPLC/MS application to anthocyanins of Vitis vinifera L.. J Agric Food Chem 43 (8):2104-2109 32. Ribreau-Gayon,P. (1964). Les composs phenoliques du raisin et du vin. Ann,. Phhysiol. Vg INRA 33. Shiraishi Sh;Watanabe Y;Okubo H;Uemoto Sh. (1986). Anthocyanin pigments of black-purple grapes related to variety Kyoho (Vitis vinifera L. * V. labrusca L.. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science, 55 123-129
95
34.
Yokotsuka K; Nishino N; Singleton VL. (1988). Unusual Koshu grape skin anthocyanins; American Journal of Enology and Viticulture; 39: 288-292 35. Goldy RG;Ballinger WE;Maness EP. (1986). Fruit anthocyanin content of some Euvitis * Vitis rotundifolia hybrids. J Am Soc for Hort Sci; 111: 955-960 36. Baldi A; Romani A; Mulinacci N; Vincieri FF. (1993). Polyphenolic compounds in Tuscan varieties of Vitis vinifera L.. J Int Sci Vigne et du Vin;27 201-215 37. Bucelli P; Faviere V; Giannetti F; Gigliotti A. (1991). Analytical features and evaluation of the aptitude of Colorino grapes for improving the quality of Chianti wine.Vignevini, 18 (3): 57-62 38. Roson JP;Moutounet M. (1992). Quantits danthocyanes et de tanins des raisins de quelques cepages du sud-ouest en 1988 et 1989. Revue Franaise d'Oenologie, 32 (135): 17-27 39. Bucelli P;Faviere V;Giannetti F;Gigliotti A. (1995). Evaluation of phenolic components of some black grape varieties grown in Tuscany. Rivista di Viticoltura e di Enologia, 48 (1): 39-50 40. Aguilo F;Diez C. (1995). Anthocyanins and watering in Vitis vinifera L. (in: Brouillard, R.; Jay, M.; Scalbert, A. (Eds.): Polyphenols 94. 17th International Conference on Polyphenols, Palma de Mallorca, Spain, May 23-27, 1994); Colloques de l'INRA (69) 231-232, 1995 41. Yokotsuka, K.; Nagao, A.; Nakazawa, K.; Sato, M. (1999). Changes in anthocyanins in berry skins of Merlot and Cabernet Sauvignon grapes grown in two soils modified with limestone or oyster shell versus a native soil over two years. American Journal of Enology and Viticulture, 50 (1) 1-12 42. Di Stefano, R.; Moriondo, G.; Borsa, D.; Gentilini, N.; Foti, S.. (1994). Influenza di fattori climatici e colturali sul profilo antocanico varietale; Annali dell'Istituto Sperimentale per l'Enologia Asti, 25 (1) 31-46 43. Arozarena, I.; Ayestarn, B.; Cantalejo, M. J.; Navarro, M.; Vera, M.; Abril, I.; Casp, A. (2002). Anthocyanin composition of Tempranillo, Garnacha and Cabernet Sauvignon grapes from high- and low-quality vineyards over two years. European Food Research and Technology, 214(4)303-309 44. Castia T;Franco MA;Mattivi F;Muggiolu G;Sferlazzo G;Versini G. (1992). Characterization of grapes cultivated in Sardinia: Chemometric methods applied to the anthocyanic fraction. Sciences des Aliments,12: 239-255 45. Keller, M; Hrazdina, G. (1998). Interaction of nitrogen availability during bloom and light intensity during veraison. II. Effects on anthocyanin and phenolic development during grape ripening. Am J Enol Vitic, 49 (3): 341-349 46. Sipiora, MJ; Gutirrez Granda, MJ. (1998). Effects of pre-veraison irrigation cutoff and skin contact time on the composition, color, and phenolic content of young Cabernet Sauvignon wines in Spain. Am J Enol Vitic, 49 (2): 152-162 47. Moriondo G;Gentilini N. (1992). Phenolic composition of some grape varieties grown in Valle d'Aosta. Riv Vitic e di Enol, 45 (3) 59-68 48. Bucelli, P.;Giannetti, F.;Dodi, S.;Scalabrelli, G. (1997). Preliminary results of anthocyanin and polyphenol studies with black grapes of Lunigiana, Italy. Annali dell'Istituto Sperimentale per l'Enologia Asti, 27 (1996-97) 221-234 49. Borsa, D.;Di Stefano, R. (2000). Polyphenol changes in colored grapes during drying. Rivista di Viticoltura e di Enologia, 53 (4) 25-35
96
50.
Cacho J; Fernandez P; Ferreira V; Castells JE.(1992). Evolution of five anthocyanidin3-glucosides in the skin of the Tempranillo, Moristel, and Garnacha grape varieties and influence of climatological variables. American Journal of Enology and Viticulture; 43 244-248 51. Mateus, N.;Machado, J. M.;De Freitas, V.. (2002). Development changes of anthocyanins in * Vitis vinifera* grapes grown in the Douro Valley and concentration in respective wines. Journal of the Science of Food and Agriculture, 82 (14) 1689-1695 52. Lanaridis, P.; Tzourou-Bena, I .(1997).Changes of anthocyanin contents during berry ripening of five greek red wine cultivars. Journal International des Sciences de la Vigne et du Vin, 31 (4) 205-212 53. Jordao, A. M.; Ricardo da Silva, J. M.; Laureano, O. (1998). Evolution of anthocyanins during grape maturation of two varieties (*Vitis vinifera* L.), Castelao Frances and Touriga Francesa.Vitis, 37 (2) 93-94 54. Gonzalez-San Jose ML; Diez C. (1992). Compuestos fenlicos en el hollejo de uva tinta durante la maduracin. Agrochimica; 36 63-70 55. Gonzalez-SanJose ML; Barron LJR; Diez C. (1990). Evolution of anthocyanins during maturation of Tempranillo grape variety, Vitis vinifera, using polynomial regression models. Journal of the Science of Food and Agriculture, 51 337-343 56. Chalmers, DJ; Faragher, JD; Raff; JW. (1973). Changes in anthocyanin synthesis as an index of maturity in red apple varieties; J. Hort Sci, 48: 387-392 57. Barcelo, J. M (1997). Management of berry ripening from enological point of view. . Effects on Syrah Cotes du Rhone quality wines. Progres Agricole et Viticole, 114 (12) 281-286 58. Lamikanra O. Development of anthocyanin pigments in muscadine grapes.HortScience, 23 597-599 59. Jeandet P; Sbaghi M; Bessis R; Meunier P. (1995). The potential relationship of stilbene, resveratrol, synthesis to anthocyanin content in grape berry skins. Vitis,34 (2) 91-94 60. Roggero, JP; Coen, S; Ragonnet, B. (1986). High performance liquid chromatography survey on changes in pigment content in ripening grapes of Syrah. An approach to anthocyanin metabolism. Am J Enol Vitic, 37, 77-83 61. Fernndez-Lpez, JA; Almela, L; Muoz, JA; Hidalgo, V; Carreo, J. (1998). Dependence between colour and individual anthocyanin content in ripening grapes. Food Research International, vol 31 (9), 667-672 62. DiStefano, R; Moriondo, G; Borsa, D; Gentilini, N; Foti, S. (1994). Influenza di fattori climatici e colturali sul profilo antocianico varietale. LEnotecnico, abr 1994, 73-77 63. Boss PK; Davies C; Robinson SP. (1996). Expression of anthocyanin biosynthesis pathway genes in red and white grapes. Plant Mol Biol, 32 (3) 565-569 64. Boss PK; Davies C; Robinson SP. (1996). Anthocyanin composition and anthocyanin pathway gene expression in grapevine sports differing in berry skin colour.Australian Journal of Grape and Wine Research; 2 (3) 163-170 65. Kobayashi, S.; Ishimaru, M.; Ding, C. K.; Yakushiji, H.; Goto, N. (2001). Comparison of UDP-glucose:flavonoid 3-*O*-glucosyltransferase (UFGT) gene sequences between white grapes (*Vitis vinifera*) and their sports with red skin. Plant Science, 160 (3) 543-550 66. Anderson, DW; Gueffroy, DE; Webb, AD; Kepner, RE. (1970). Identification of acetic acid as an acylating agent of anthocyanin pigments in grapes; Phytochemistry, vol 9 (7): 157983
97
67.
Shiraishi S; Watanabe Y (1988). Anthocyanin pigments in the blue-black tetraploid . grape cultivars 'Black Olympia', 'Pione' and 'Izunishiki', Vitis vinifera L. * V. labrusca L. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science; 57 (1) 17-21 68. Shiraishi SI; Watanabe Y. (1993). Anthocyanin pigments in the grape skins of several red Vitis vinifera cultivars bred in Japan. Journal of the Faculty of Agriculture Kyushu University; 36 (1-2) 63-67 69. Lay H; Draeger U (1991). Profiles of the pigments from different red wines. Wein. Wissenschaft, 46: 48-57 70. Revilla, E.; Garca-Beneytez, E.; Cabello, F.; Martn-Ortega, G.; Ryan, J. M (2001). . Value of high-performance liquid chromatographic analysis of anthocyanins in the differentiation of red grape cultivars and red wines made from them. Journal of Chromatography A, 915 (1-2) 53-60 71. Bernardino Garca. (2000). Treball de 12 crdits. URV. 72. Nez, V; Monagas, M; Gmez-Cordovs, MC; Bartolom, B. (2004). Vitis vinifera L.cv. Graciano grapes characterized by its anthocyanin profile . Postharvest Biol and Techn, 31: 69-79 73. Hmamouchi,M; Es-safi, N; Pellecuer, J; Essassi, EM. (1995). Anthocyanic composition of grape skins of four red grape varieties grown in Morocco; Bulletin de lOIV. 777-778, 907919 74. Matthews, MA; Anderson, MM. (1988). Fruit ripening in Vitis vinifera L: responses to seasonal water deficits. Am J Enol Vitic 39, 313-320 75. Jackson, DI; Lombard, PB. (1993). Environmental and management practices affecting grape composition and wine quality a review. Am J Enol Vitic, vol 44, n4, 409-429 76. Peterlunger, E; Sivilotti, P; Bonetto, C; Paladin, M. (2002). Water stress induces changes in polyphenol concentration in Merlot grapes and wines. Riv Vitic. Enol. N1: 51-66 77. GonzalezSanJose, ML; Diez, C. (1992). Relationship between anthocyanins and sugars during the ripening of grape berries. Food Chemistry, 43(3): 193-197 78. Hrazdina, G; Parsons, GF; Mattick, LR. (1986). Physiological and biochemical events during development and maturation of grape berries" Am J Enol Vitic 35 (4): 220-227 79. Freeman, BM; Kliewr, WM. (1983). Effect of irrigation, crop level and potassium fertilization on Carignan vines. II. Grape and wine quality; Am J Enol Vitic 34: 197-207 80. Matthews MA; Anderson, M. (1989). Reproductive development in grape (Vitis vinifera L.): responses to seasonal water deficits. Am J Enol Vitic. 40: 52-60 81. Escalona, JM (2003). Respuestas de la vid frente al dficit hdrico: efectos sobre la . fotosntesis y la transpiracin en hoja y en planta entera y su repercusin en la calidad del fruto; Tesi Doctoral; Dep Biologia UIB 82. Esteban, M. A.; Villanueva, M. J.; Lissarrague, J. R. (2001). Effect of irrigation on changes in the anthocyanin composition of the skin of cv. Tempranillo (Vitis vinifera L.) grape berries during ripening. J Sci Food Agric; 81 (4) 409-420 83. Piergiovanni,L; Volonteiro, G. (1983). Studio della frazione antocinaica delle uva. Tecnol Aliment-Imbottigliamento, 6: 22-28 84. Fernndez-Lpez, JA; Hidalgo, V; Almela, L; Lpez Roca, JM (1992). Quantitative . changes in anthocyanin pigments of Vitis vinifera cv Monastrell during maturation. J Sci Food Agric, 58, 153-155 85. Ryan, JM; Revilla, E. (2003). Anthocyanin composition of cabernet sauvignon and tempranillo grapes at different stages of ripening, J Agric Food Chem. 51, 3372-3378
98
86.
Budin, R. (1984). Accumulation of anthocyanins, sugars and organic acids in grapes of the Blue Franconia and Saint Laurence varieties during ripening. Kvansy Prum, 30: 55-58 87. Kampis, A; Kerny, Z; Hoschke, A; Hajdu, F. (1986). Evolution des pigments anthocyanins pendant la maturation des cpages rouges. Bull Liaison Groupe 13, 88. Bravdo, B; Hepner, Y; Loinger, C; Cohen, S; Tabacman, H. (1985). Effect of irrigation and crop level on growth, yield and wine quality of Cabernet sauvignon. Am J Enol Vitic 36:132-139 89. Hardie, WJ; Coinsidine, JA. (1976). Response of grapes to water-deficit stress in paricular stages of development. Am J Enol Vitic 27:55-61 90. Pirie AJG; Mullins, MG. (1980). Concentration of phenolics in skin of grape berries during fruit development and ripening. Am J Enol Vitic 31:34-36 (1980) 91. Lampreave, M. (2002). Fisiologia de labsorci en lecosistema vitcola sl-plantaatmosfera i repercussions en la qualitat del ram. Tesi doctoral, Dep Bioq i Biotecn URV
99
Captol 2. Catequines i proantocianidines en pinyols
2.1. INTRODUCCI Els flavan-3-ols, ms comunament coneguts com a catequines, i els seus derivats oligmers i polmers, els tanins, constitueixen una famlia de compostos fenlics que es troben en elevades concentracions en el ram i que juguen un paper preponderant en la qualitat del vi, al qual confereixen propietats astringents, de color, destructura, cos i de capacitat denvelliment grcies a la seva participaci en lestabilitzaci del color 167.
2.1.1. Estructura qumica

R3
OH
HO
O OH R1
R2 OH
Fig 2. 1.1. Estructura general dels flavan-3-ols
Els flavan-3-ols es caracteritzen per lestructura general representada en la figura 2.1.1. Els principals flavanols monomrics del ram sn (fig 2.1.2.) la (+)catequina i el seu ismer, la (-)-epicatequina, que tamb pot trobar-se en forma dster de lcid gl.lic (3-gal.lat depicatequina). Tamb ha estat descrita la presncia daltres formes monomriques, com la gallocatequina, el 3gallat de catequina i el 3-gallat de gallocatequina, per semblen especfics de certes varietats 168.
H OH H OH HO O OH H OH OH OH HO O OH H OH OH OH
HO
O H OH OH OH
(+)-catequina
OH OH HO O H OH OH OH HO
(-)-epicatequina
H OH O G OH OH OH OH HO
(-)-epigallocatequina
OH OH O H G OH
(+)-gallocatequina
gallat de (+)-catequina
H OH
gallat de (+)-gallocatequina
O OH O
Fig 2.1.2. Estructura dels principals flavan-3-ols monomrics detectats en ram
167
Cheynier, V; Moutounet, M; Sarni-Manchado, P. (2003). Los compuestos fenlicos. A Enologa: Fundamentos cientficos y tecnolgicos. Coord. Claude Fanzi, EMV Ediciones 168 Souquet, JM; Cheynier, V; Sarni-Manchado, P; Moutounet, M. (1996). Les composs phnoliques du raisin. J. Int. Sci. Vigne et Vin, Hors srie, 99-107
103
Les proantocianidines o tanins condensats es generen a partir dels flavan-3-ols i existeixen en una gran varietat de formes (des de dmers fins a polmers). El terme tanins pel qual es designa als oligmers i polmers de flavanols fa referncia a la seva capacitat dinteraccionar amb les protenes, i el terme proantocianidols (o proantocianidines), a la seva propietat dalliberar antocianidols en medi cid per ruptura de les unions intermonomriques. Dintre de les proantocianidines, reben el nom de procianidines aquelles que deriven de la catequina i lepicatequina, que en hidrlisi cida generen la molcula de cianidina; i el nom de prodelfinidines aquelles derivades de la gal.locatequina i lepigal.locatequina 169, que shidrolitzen a delfinidina en medi cid. La majoria de dmers i trmers identificats al ram pertanyen a la srie B, terme amb el qual es designa el tipus duni entre les unitats monomriques que els constitueixen (figura 2.1.3). En les proantocianidines de la srie B, la uni dels dos monmers es produeix entre les posicions C4-C6 o C4-C8. Els dmers presents en els pinyols del ram presenten lestructura que es recull a la figura 3: tenim aquells en qu luni s C4-C8 (dmers B1, B2, B3, B4), i aquells en qu luni s C4-C6 (dmers B5, B6, B7, B8)170,171.
OH OH HO HO OH OH OH HO OH O OH R1 R2 OH OH OH HO OH O OH R1 R2 R2 O R1 R1 R2 O OH HO O OH O O OH OH OH HO OH OH OH HO OH OH HO O OH OH
Procianidina B1 Procianidina B2
R1=OH; R2=H R1=H; R2=OH

HO HO
Fig 2.1.3. Principals dmers allats en Vitis vinifera: B1 (Ep 4 8 Cat); B2 (Ep 48 Ep), B3(Cat 48 Cat); B4 (Cat 4 8 Ep); B5 (Ep 4 6 Ep); B6 (Cat 46 Cat); B7 (Ep 46 Cat); B8 (Cat 4 6 Ep).
cat= catequina; Ep= epicatequina
Tamb shan identificat trmers, procianidines C1 i C2. 170 (figura 2. 1.4)
que
inclouen
les
Figura 2. 1.4. Estructura del trmer C1 (Ep (4 8) Ep (48) Ep)

169 170
Pascual-Teresa, S; Rivas-Gonzalo, JC; Santos-Buelga, C. (2000). Prodelphinidins and related flavanols in wine, Int J Food Science & Techn, 35, 33-40 Ricardo-da-Silva, JM. (1992). Procyanidines du raisin et du vin. Structure et proprietes chimiques; Tesi Doctoral. cole Nationale Sup Agronomique Montpellier 171 Freitas, VAP; Glories, Y; Bourgeois, G; Vitry, C. (1998). Characterisation of oligomeric and polymeric procyanidins from grape seeds by liquid secondary ion mass spectometry. Phytochemistry , vol 49, n5: 1435-1441
104
En articles recents 172 sha descrit tamb la presncia de dmers de la srie A en pinyols, pells i vins de Merlot i Cabernet sauvignon; concretament, la proantocianidina A2 (figura 2.1.5), malgrat que es trobi en unes concentracions molt baixes que evitarien que es manifests en els vins el seu carcter amargant. La srie A correspon a una uni C4-C8 simultnia a un pont ter C2-O-C7, com es recull a la figura 2.1.5.
Fig 2.1.5. Proantocianidina A2
Subunitats dextensi Subunitat terminal
Fig 2.1.6. Estructura general dels tanins. A partir dun monmer (subunitat terminal) es van estenent la cadena per laddici successiva de nous monmers
Quant a les formes polimriques, poden comprendre un nombre molt elevat de monmers, de tal manera que en les pells dalgunes varietats shan trobat fraccions de graus de polimeritzaci superiors a les 80 unitats 173. En ells es distingeixen les unitats terminals i les unitats dextensi de la cadena (fig 2.1.6).
2.1.2 Localitzaci i evoluci durant la maduraci Aquests compostos es distribueixen en les parts slides del ram: sobretot en els pinyols, per tamb en les pells174 i les rapes175. A la polpa shi poden trobar a nivells de traa. La naturalesa de les proantocianidines que sacumulen en cadascuna daquestes parts s diferent.
172
Vivas de Gaulejac, N; Vivas, N; Absalon, C; Nonier, MF. (2001). Identification du procyanidole A2 dans le raisin et le vin de Vitis vinifera L.CV. Merlot noir and abernet sauvignon, J. Int. Sci. Vigne Vin, 35, n1, 51-56 173 Souquet, JM; Cheynier, V; Brossaud, F; Moutounet, M. (1996). Polymeric proanthocyanidins from grape skins. Phytochemistry , vol 43, n2: 509-512 174 Freitas, VAP; Glories, Y. (1999). Concentration and compositional changes of procyanidins in grape seeds and skin of white Vitis vinifera varieties. J Sci Food Agric, 79: 1601-1606 175 Jordao, AM; Ricardo-da-silva; JM; Laureano, O. (2001). Evolution of proanthocyanidins in bunch stems during berry development (Vitis vinifera L.); Vitis 40(1), 17-22
105
Els pinyols sn ms rics en flavan-3-ols que les pells, amb una predominncia de la catequina sobre lepicatequina. Destaca la presncia de flavanols gal.loilats, encara que les procianidines no gal.loilades shi troben en presncia ms elevada, i els trmers es troben encara en menor proporci176. Els tanins de les pells difereixen dels dels pinyols principalment per la presncia de prodelfinidines en les pells 177, per tamb pel seu baix contingut en derivats gal.loilats i pel seu major grau de polimeritzaci 173 : encara que el contingut de tanins en les pells s fora menor que en pinyols, el contingut relatiu de proantocianidines polimriques en les pells s normalment ms gran que en les llavors, podent arribar a graus de polimeritzaci superiors a 30. Aquest fenomen podria provenir dalguna activaci per part de la llum de les reaccions de polimeritzaci 178. Els valors de concentraci de procianidines es situen generalment al voltant dels 200 700 mg/kg de ram. La procianidina B1 s la majoritria en les pells, mentre que la B2 s la majoritria als pinyols. En els vins s majoritria la B1, cosa que indica que lextractabilitat de les procianidines dels pinyols s limitada. 179 Alguns autors calculen la contribuci de pells i pinyols a la tanicitat dels vins a partir de les relacions que sestableixen entre el dmer B4, present nicament en els pinyols, i el B2, que es troba tant en pells com en pinyols 180. Hi ha una mplia variabilitat en les concentracions de catequines i proantocianidines en rapes, pells i pinyols en relaci a la varietat de ram. De fet, a diferncia del que succeeix amb els antocians, les varietats blanques no sn menys riques en aquests compostos que les varietats negres168 . Pel que fa a les varietats, les del grup de Pinot, que es caracteritzaven per un baix nivell dantocians, sn les que presenten els valors globals superiors en mg/kg de ram de catequines i proantocianidols 181,182. Cabernet tamb s descrita com una varietat amb elevats continguts de catequina i proantocianidines 183.
176
Ricardo da Silva JM;Belchior AP;Spranger MI;Bourzeix M. (1992). Oligomeric procyanidins of three grapevine varieties and wines from Portugal. Sciences des Aliments, 12 223-237 177 Escribano-Bailon MT; Guerra MT; Rivas-Gonzalo JC; Santos-Buelga C. (1995). Proanthocyanidins in skins from different grape varieties; Zeitschrift fuer Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung;200 (3) 221-224 178 Sun, B.;Ricardo-da-Silva, J. M.;Spranger, M. I .(2001). Quantification of catechins and proanthocyanidins in several Portuguese grapevine varieties and red wines; Ciencia e Tecnica Vitivinicola;16 (1) 23-34 179 Hmamouchi M;Es-Safi N;Boubekri C;Bourzeix M;Essassi EM. (1994). Qualitative and quantitative analysis of berry proanthocyanidins of four Moroccan grape varieties. Bulletin de l'O.I.V.;67 901-915 180 Freitas, V. A. P. de;Glories, Y.;Monique, A. (2000). Developmental changes of procyanidins in grapes of red *Vitis vinifera* varieties and their composition in respective wines; American Journal of Enology and Viticulture ; 51 (4) 397-403 181 Kovac V;Bourzeix M;Heredia N;Ramos T. (1990). Etude des catechines et proanthocynaidols de raisins et vins blancs; Rev Fran d'Oenologie ;30 (125) 714 182 Mattivi F;Nicolini G;Sanchez C. (1991). Comparison between the polyphenol content of Marzemino, Pinot noir and Sangiovese wines of 1989. Rivista di Viticoltura e di Enologia, 44 (1) 39-52 183 Auw, J. M.;Blanco, V.;O'Keefe, S. F.;Sims, C. A.. (1996). Effect of processing on the phenolics and color of Cabernet Sauvignon, Chambourcin, and Noble wines and juices. American Journal of Enology and Viticulture , 47 (3) 279-286
106
Les concentracions de procianidines tenen normalment el seu mxim en el moment del verolament, i desprs van decreixent fins a mantenir-se relativament constants al voltant del moment de la verema180. No obstant aix, en alguns casos aquest creixement no s uniforme i presenta variacions entre els anys 184.
2.1.3. Propietats que confereixen als vins
Les proantocianidines afecten propietats gustatives (amargor, astringncia), cromtiques i lestabilitat i capacitat denvelliment dels vins. Aquests efectes indiquen limportant paper que juguen en la qualitat del vi. De fet, en algunes prctiques enolgiques, el fet dafegir quantitats suplementries de pinyols en la fermentaci pot resultar en una millor variaci organolptica del vi185, encara que un excs condueix als efectes contraris 186. Astringncia: Els tanins interaccionen amb les glicoprotenes de la saliva, agregant-se i podent precipitar, cosa que causa la sensaci de sequedat en el paladar coneguda com astringncia. 187 Aquesta astringncia augmentaria amb el grau de polimeritzaci, de manera que les catequines tindrien un efecte amargant, per no astringent 188. Color: Aquestes molcules participen en processos de copigmentaci amb els antocians. Com ja hem descrit, els antocians constitueixen una altra famlia de flavonoides que es caracteritzen per donar coloracions vermell-blavoses a flors, fruits, etc i sn els principals responsables del color dels vins. Tanmateix, no en sn els nics, ja que tamb s important per al color del vi els processos de copigmentaci, s a dir, la interacci dun grup cromfor (antoci) amb un grup sense color (copigment) que modifica les propietats cromtiques del primer. Aix pot significar un increment de la coloraci i un desplaament del color cap a tonalitats ms blavoses. Molecularment, aquest efecte saconseguiria per un apilament dels anells aromtics de les molcules implicades en el procs. Dintre dels copigments, resulten molt importants els cids fenlics com el cafeic, el ferlic, el pcumric, etc.; per els flavan-3-ols tamb poden participar en el procs.
184 185
Katalinic, V.;Males, P.(1997). Compositional changes in grape polyphenols throughout maturation. Journal of Wine Research; 8 (3) 169-177 Kovac, V; Alonso, E; Revilla, E. (1995). The effect of adding supplementary quantities of seeds during fermentation on the phenolic composition of wines. Am J Enol Vitic . Vol 46, n3: 363-367 186 Laminkara, O; Garlick, D. (1987). Effects of grape skin and seeds on the composition and quality of Muscadine wines. Food Chem 26:245-251 187 Bravo, L. (1998). Polyphenols:chemistry, dietary sources, metabolism and nutritional significance. Nutr Rev ; 56, 317-333 188 Rochibaud, JL; Noble, AC. (1990). Astringency and bitterness of sellected phenolics in wine. J Sci Food Agric , 53, 343-353
107
Per altra banda, les catequines i les proantocianidines sn les responsables de part de la component groga del color189. Estabilitat i capacitat denvelliment del vi: Durant la vinificaci i lenvelliment sofreixen canvis estructurals importants a causa de reaccions doxidaci i polimeritzaci, que comporten els canvis de color i sensorials caracterstics daquests vins. Els antocians del ram sestabilitzen en la matriu vnica per una srie de reaccions que comporten la formaci de nous pigments ms estables. Entre el grup de reaccions possibles, hi ha la combinaci amb els flavan-3-ols, en processos de condensaci que poden estar mitjanats per molcules com lacetaldehid. Aquests nous compostos confereixen estabilitat al color del vi i constitueixen el fonament de levoluci dels vins joves cap als vins de criana. Propietats biolgiques: Tant les proantocianidines com els seus precursors, les catequines, sn compostos actius biolgicament, que poden actuar com a antioxidants190, antihipertensius, capturadors de radicals lliures, anticancergens, antivirals i antimicrobians. bviament, la seva solubilitat en el cos depn del grau de polimeritzaci 191. Pel que fa a lactivitat capturadora de radicals lliures, sha descrit que lesterificaci amb cid gl.lic naugmenta lactivitat, que per altra banda s superior en els dmers amb uni C4-C8 (procianidines B1-B4) que en els duni C4-C6 (dmersB5-B8). Totes aquestes propietats justifiquen linters a quantificar i identificar la seva presncia en rams i vi.
2.2. OBJECTIUS 1. Determinar la composici en catequines i proantocianidines oligmeres en els pinyols de diferents varietats negres, aix com del seu grau de polimeritzaci mitj, utilitzant diferents metodologies. 2. Avaluar-ne levoluci al llarg de la maduraci del ram. 3. Estudiar la influncia del reg en els anteriors punts.
189
Ribreau-Gayon, P; Glories, Y; Maujean, A; Dubordieu, Y. (1999). Phenolic compounds, a Handbook of enology, vol 2. The chemistry of wine, stabilization and treatments; Ed. John Wiley & Sons. 190 Teissedre,P.L; Waterhouse, A.L; Walzem, R.L; German, J.B; Frankel, e.n; Ebeler, S.E; Clifford, A.J. (1996). Composs phnoliques du raisin et du vin et sant; Bull. OIV 781-782:252-277
108
2.3. MATERIALS I MTODES 1. Mostreig Els estudis es van efectuar en pinyols de les varietats negres de la finca del Mas dels Frares, durant la campanya 2002. De 20 rams agafats aleatriament es separaven les pells, la polpa i els pinyols. Cada fracci era triturada en un morter amb nitrogen lquid, i la mostra congelada es conservava a 20C fins al moment de lextracci. 2. Extracci El procediment dextracci sefectu amb acetona 60%, que sha utilitzat sovint en lextracci de proantocianidines. 177, 192 Aix, 0.1 g de mostra sextreien amb 10 ml de solvent. Lextracte sevaporava en un rotavapor i la fracci aquosa sextreia tres vegades amb un volum de 10 ml dacetat detil. La fracci orgnica es tornava a rotavaporar, i es redissolia en 1 ml de metanol. 3. Quantificaci El procs de quantificaci de les catequines i les proantocianidines resulta problemtic, ja que es tracta duna famlia complexa, destructures diverses i diferent reactivitat. No hi ha cap assaig universal til, cosa que fa que els resultats difereixin segons la metodologia emprada193. En el nostre cas, les determinacions que es van dur a terme van ser 3: 1. Reacci amb aldehids 1.1. Assaigs colorimtrics 1.2. Cromatografia en capa fina 2. Separaci dels oligmers per HPLC 3. Estimaci del grau mitj de polimeritzaci per anlisi dels productes de trencament.
191 192 193
daSilva,J; Rigaud, J; Cheynier,V. (1991). Procyanidin dimers and trimers from grape seeds; Phytochemistry , 30:1259-1264 Brunet, MJ. (1999) Identificaci i transport plasmtic de les procianidines del vi, Tesi Doctoral. URV. Escribano-Bailn, M.T. (1993).Estudio de la Composicin Flavnica de la Semilla de la Uva, Tesi Doctoral. Facultat de Farmcia, Universitat de Salamanca.
109
2.3.1 REACCI AMB ALDEHIDS 2.3.1.1) Assaigs colorimtrics Aquests assaigs es fonamenten en latac electrfil que executen els aldehids protonats sobre lanell A de les catequines i proantocianidols, que t una densitat electrnica especialment elevada. La reacci depn de laldehid escollit; aix, per exemple, amb el formaldehid i lacetaldehid es formen complexes incolors que precipiten al cap de poc temps.194 Per utilitzar aquesta reacci com a mesura de quantificaci de catequines i proantocianidines, destaquen principalment 2 metodologies: a) Assaig de la vainillina b) Assaig del DMACH
a) Lassaig de la vainillina s fora especfic per un estret grup de flavanols (monmers i polmers) i dihidrocalcones que tenen un enlla senzill en la posici 2,3 i els grups hidroxil de lanell B en posici meta. El resultat s la formaci de complexos vermells solubles. Durant molts anys lassaig de la vainillina ha estat utilitzat extensivament com un mtode colorimtric estndard per a la determinaci de flavanols195; encara que la seva manca de reprodubilitat ha provocat molts estudis per tal doptimitzar el mtode. 196 Assaig de la vainillina
Absorbncia 500 nm 600 500 400 300 200 y = 4,1267x + 33,6 R2 = 0,9905 calibratge assaig vainillina
Mostra 125 l de mostra diluci 1:233) 305 l de vainillina en MeOH (1% p/v) 305 l de H2SO4 en MeOH Lectura a 500 nm passats 15 minuts
Blanc 125 l de mostra (diluci 1:233) 305 l de metanol 305 l de H2SO4 en MeOH
100 0 0 50 100 150 catequina (g/ml)
La recta patr sefectuava amb catequina 0-120 g/ml
194
Glories, Y. (1974). Recherches sur la structure et les propriets des composs phnoliques polymeriss des vins rouges. I- Prcipitation par laldhyde formique et par lacide chlorydrique concentr. Conn. Vigne Vin, 8, n1, 57-74 195 Price, ML; Scoyoc, SV; Butler, LG. (1978). A critical evaluation of the vanillin reaction as an assay for tannin in sorghum grain. J Agric Food Chem, 26, 1214-1218 196 Sun,B; Ricardo-da-Silva, J.M; Spranger, I. (1998)Critical factors of vanillin assay for catechins and proanthocyanidins; J.Agric.Food Chem ., 46, 4267-4274
110
b) El p-dimetilcinnamoaldehid (DMACH) s molt ms especfic que la vainillina, per t el desavantatge que el complex blau que genera resulta molt menys estable. 197 Assaig DMACH198
3000
calibratge DMACH Absorbncia 640 nm
Mostra 200 l de mostra (diluci 1:233) 500 l soluci DMACH*
Blanc 200 l de mostra (diluci 1:233) 500 l soluci HCl 37% en MeOH
2500
2000
y = 105.86x + 79.25 R = 0.9941

2
1500
y = 89.553x + 30.848 R = 0.9968

2
1000
500
Lectura a 640 nm passats 10 minuts 100 mg de DMACH dissolts en 10 ml de HCl 37% i enrasats a 100 ml amb MeOH
0 0 5 10 15 20 25 30
catequina/epicatequina (g/ml) catequina epicatequina Lineal (catequina) Lineal (epicatequina)
Es van efectuar dues rectes de calibratge, amb catequina i epicatequina, 0-25 g/ml. A partir daquestes rectes, sinterpolava el valor de catequines de les mostres. Aquest darrer mtode sha proposat com a ndex per fer una estimaci de lestat de condensaci de les proantocianidines, a partir de la relaci entre els valors que sobtenen mitjanant els assajos de Folin-Ciocalteu i de flavonoides199 respecte als valors obtinguts pel mtode del DMACH. El fonament s que, com ms elevat sigui el grau de polimeritzaci, menys accessibles a laldehid sn els llocs nuclefils dels tanins, de manera que el color format s ms feble quan el grau de condensaci s elevat, especialment si es formen estructures ramificades 197 .
2.3.1.2) Anlisi de catequines mitjanant cromatografia en capa fina La reactivitat dels aldehids protonats amb les catequines ha perms que sutilitzin com a agents revel.ladors en cromatografia en capa fina. Dentre ells, el ms comunament utilitzat s la vainillina en cid clorhdric concentrat 200, 201 o en cid sulfric202, per en alguns treballs sutilitza el DMACH en medi cid 203, que s particularment til en lanlisi
197 198
Nagel, CW; Glories, Y. (1991). Use of a modified Dimethylaminocinnamaldehyde reagent for analysis of flavanols, Am.J.Enol. Vitic., vol 42, n4, 364-366 Vivas N;Glories Y;Lagune L;Saucier C;Augustin M. (1994). Estimation of the polymerisation level of procyanidins from grapes and wines by use of pdimethylaminocinnamaldehyde; Journal International des Sciences de la Vigne et du Vin;28 319-336 199 Amerine,MA; Ough, CS. (1980). Methods for analysis of musts and wines, John Wiley & Sons, New York 200 Lea, AGH; Timberlake, CF; Singleton, VL.(1979). The procyanidins of white grapes and wines; Am J Enol Vitic 30, 289-300 201 Sun, B; Leandro, C; Ricardo Da Silva, JM; Spranger, I. (1998). Separation of grape and wine proanthocyanidins according to their degree of polymerization; J Agric Food Chem , 46, 1390-1396 202 Ruiz, J. (1999). Comunicaci personal 203 Vivar-Quintana, AM. (2001). Fraccionamento y estudio preliminar de la materia colorante del vino tinto. Tesi Doctoral. Fac. Farmcia, Univ Salamanca
111
de vins negres i dextractes de pells, ja que presenta lavantatge que permet diferenciar clarament les proantocianidines, que donen coloracions blavoses, dels compostos antocinics, que donen color vermell. La formaci de color resulta un aspecte avantatjs perqu permet una major especificitat que la detecci ultravioleta, amb vapors damoniac o amb vapors de iode, tamb utilitzades per la identificaci de catequines 204. La tcnica de la cromatografia en capa fina en fase de slica permet diferenciar les catequines fins al grau dhexmers192, 205 o fins i tot dheptmers206. Altres metodologies permeten tamb la separaci de les proantocianidines segons el seu grau de polimeritzaci, com sn la utilitzaci de columnes Sephadex LH-20207 o columnes Fractogel170 , per tenen linconvenient de resultar tcniques ms laborioses i menys econmiques. Per la separaci en la cromatografia en capa fina, sutilitzen cromatoplaques de slica (Merck, 20 x 20) i sempra com a eluent una mescla de tolu: acetona: cid actic (3:3:1), dacord amb lestablert en la bibliografia201 . El volum de crrega fou de 4
l
dextracte i de 2 l de patrons de catequina/epicatequina 10 mM en metanol, i de malvidina 1.02 mg/ml. La revelaci sefectua per pulveritzaci amb una de les segents solucions: a) Vainillina 10% en cid clorhdric 6N en metanol. b) DMACH 1% en cid sulfric 3M en metanol
catequines Procianidines B1-B4
Rf 0,8
0,6
0,4
Dmers gal.loilats, trmers 0,2 Trmers gal.loilats, Oligmers 0
Polmers
Fig 2.3.1.1. Separaci per TLC de les proantocianidines segons el seu grau de polimeritzaci. Adaptat de Sun.201
En aquestes condicions, sobt una separaci de les procianidines dacord al seu grau de polimeritzaci, tal i com es recull a la figura 2.3.1.1. Mitjanant aquesta metodologia es poden separar les catequines, que sn les que ms avancen en el front del dissolvent, els oligmers i els polmers. En aquest sentit, s una bona tcnica per avaluar la presncia de cadascuna daquestes fraccions, i tamb evita la interferncia
204 205 206
Merck. (1998). Anfarbungsreagienzen fr Dnschicht und Papier-Chromatography Oszmianski, J; Sapis, JC. (1989). Fractionation and identification of some low molecular weight grape seed phenolics. J Agric Food Chem 37, 1293-1297 Lea, AGH. (1978). The phenolics of cider: oligomers and polymers procyanidins; J SciFood Agric , 25, 1537-1545 207 Boukharta, M; Girardin, M; Metche, M. (1988). Procyanidines galloyles du sarment de vigne (Vitis vinifera). Sparation et identification par chromatographie liquide haute performance et chromatographie en pase gaseuze. J Crohromatogr 455, 4065-409
112
dels antocians en el cas dels dmers i monmers, ja que la seva Rf s diferent. Malgrat aix, el fet que les Rf dels ismers sigui similar176 suposa que en cada banda es poden trobar diversos ismers amb el mateix grau de polimeritzaci. Aix s particularment acusat en el cas de la fracci polimrica, en qu coincideixen totes les proantocianidines a partir dels pentmers.
2.3.2) ANLISI DE CATEQUINES PER HPLC La cromatografia lquida en fase reversa resulta una tcnica mpliament utilitzada per la determinaci de catequines i proantocianidines dmers. Tamb s possible lanlisi de trmers208 i fins i tot tetrmers209, per a majors graus de polimeritzaci, en incrementar el nombre dismers, resulta una co-eluci daquests compostos en un pic no resolt, tot i que recentment sha utilitzat tamb aquest pic per lestimaci de la fracci polimrica210. El sistema de detecci ms utilitzat s labsorbncia a 280 nm, encara que la seva inespecificitat ha propiciat la utilitzaci de sistemes de derivatitzaci amb DMACH208 . En la present tesi, la separaci cromatogrfica es va efectuar mitjanant HPLC en fase reversa, amb una columna Spherisorb ODS-2 (Waters) de 5 M de mida de partcula, 25 cm de longitud i 0,46 cm de dimetre intern. La temperatura de columa es mant constant a 25C, i el volum dinjecci de mostra s de 100 l. La detecci es monitoritza a =280 nm, encara que tamb es registren els resultats corresponents a =254 nm. Les fases mbils utilitzades foren: A (cid frmic 4.5%, de Panreac); B (90%A 10% acetonitril, de Carlo Erba). Leluci es va produir a flux constant de 1,5 ml/min, amb el segent gradient: 0 minuts, 0% B; 10 minuts, 40%B; 30 minuts, 60%B, 35 minuts, 100%B; 50 minuts, 100%B; 60 minuts, 0%B.177
Per a realitzar aquesta determinaci, es requereix que la mostra estigui en soluci aquosa, ja que si no tots els pics elueixen al principi del procs cromatogrfic. Per aquest motiu es va procedir a levaporaci del metanol dels extractes sota atmosfera de gas inert (nitrogen), i a la seva posterior redissoluci en un volum equivalent daigua milliQ.
208
S de Pascual-Teresa, S; Santos-Buelga, C; Rivas-Gonzalo, JC. (2000). Quantitative analysis of flavan-3-ols in spanish foodstuff and beverages. J Agric Food Chem, 48, 5331-5336 209 Carando, S; Teissedre, PL; Pascual-Martinez, L; Cabanis, JC. (1999). Levels of flavan-3-ols in french wines. J Agric Food Chem, 47, 4161-4167 210 Peng, Z; Hayasaka, Y; Iland, PG; Sefton, M; Hoj, P; Waters, EJ. (2001). Quantitative analysis of polymeric procyanidins (tannins) from grape (Vitis vinifera) seeds by reverse phase high-performance liquid chromatography ; J Agric Food Chem, 49, 26-31
113
En el cromatograma 2.3.1.1 es presenten els pics obtinguts per una mostra de pinyols. La identificaci, en no disposar de patrons comercials de tots els oligmers, es va efectuar a partir de la comparaci dels temps de retenci amb la bibliografia193 .
catequina
epicatequina B7 Trmer E-E-C cid gl.lic B1 B3 B4 B6 B2 B2-3O-gal..lat C1 epicatequina-3O-gal..lat B5
Cromatograma 2.3.1.1. Separaci cromatogrfica de catequines, dmers i trmers
La quantificaci es realitzava a partir de rectes patrons dcid gl.lic, catequina i epicatequina, en un rang de concentracions (0-100 resultats sexpressen com a catequina.
M).
En el cas dels oligmers, els
114
2.3.3. ESTIMACI DEL GRAU DE POLIMERITZACI MITJ PER DETERMINACI DELS PRODUCTES DE TRENCAMENT
OH HO O OH OH OH H O H+ O OH OH OH OH
OH HO O OH OH OH H+ O H O OH OH OH OH
La relativa facilitat amb qu es pot trencar lanell interflavonoid fa possible determinar la composici en subunitats de les proantocianidines, desprs del seu trencament mitjanant catlisi cida211. Aquest tipus de degradaci constitueix el fonament de la determinaci mitjanant lassaig en butanol/HCl212, en qu les unitats flavan-3-ol de la cadena soxiden per donar els corresponents antocians.
OH
En aquestes condicions cides, la despolimeritzaci de les proantocianidines (figura 2.3.3.1) t lloc de manera que les unitats terminals sn alliberades en forma de monmers flavan-3-ol, mentres que les subunitats dextensi generen intermedis flavan-3-ols electroflics, que poden ser capturats per reactius nucleoflics i generar aix adductes analitzables. Figura 2.3.3.1. Mecanisme de la Entre els agents nucleoflics ms utilitzats es troben reacci de despolimeritzaci el fluroglucinol i el benzil mercapt. El fluoroglucinol presenta una srie davantatges, com sn una major selectivitat en la formaci dels adductes, aix com el fet que s inodor, cosa que facilita el treball amb aquest reactiu213. Els adductes formats poden ser separats mitjanant HPLC, i dels resultats es pot calcular el grau mitj de polimeritzaci (mean degree of polymerization, mDP), a partir de la relaci entre les concentracions molars de les subunitats terminals respecte les subunitats totals (terminals + dextensi).
HO O HO O OH + OH OH + OH OH OH Nuclefil (Nuc) OH OH HO O OH OH Nuc
OH
mDP =
subunitats totals Subunitats terminals
211
Matthews,s; Mila,I; Scalbert,A; Pollet,B; Lapierre,C; Herv du Penhoat, CLM; Rolando,C; Donnelly, DMC. (1997). Method for estimation of proanthocyanidins based on their acid depolymerization in the presence of nucleophiles; J.Agric Food Chem.45, 1195-1201 212 Bate-Smith, E. (1955). Food, 23, 124 213 Kennedy, JA; Jones, GP. (2001). Analysis of proanthocyanidin cleavage products following acid-catalysis in the presence of excess phloroglucinol. J Agric Food Chem, vol 49(4), 1740-1746
115
Per altra banda, lanlisi dels productes de trencament tamb ens permet averiguar la participaci de cada monmer en la polimeritzaci. Els productes que es poden formar de la degradaci dels oligmers i polmers desprs de la catlisi cida sn els segents (figura 2.3.3.2):
OH OH HO O OH OH HO OH OH HO HO OH OH OH OH HO O OH OH HO O OH OH OH OH
a) Subunitats terminals: catequina, epicatequina, epicatequina-3-O-gal.lat b)

OH
OH
OH
OH
Adductes amb fluoroglucinol: Epicatequina-(4 2)-floroglucinol; catequina-(4 2)-floroglucinol; epicatequina-3-O-gallat-(4 2)floroglucinol
epigallocatequina-fluoroglucinol
OH HO O O O OH HO OH OH
epicatequina-fluoroglucinol
OH
catequina-fluoroglucinol
OH OH HO O OH OH
OH OH HO O OH OH
Epigallocatequina-(4 2)-floroglucinol;
OH
OH
epicatequina
OH HO O O O OH OH OH OH
catequina
HO OH OH OH
OH
fluoroglucinol
epicatequina-3-O-gallat
Figura 2.3.3.2. Estructura qumica dels adductes formats en la reacci de trencament en presncia dun nuclefil
Est descrita una inhibici de la reacci amb el floroglucinol quan al medi de reacci hi ha aigua213 . Amb un 20% daigua, la conversi global sinhibia en un 50%, i en casos particulars (concretament, ladducte amb epicatequina-3-O-gallat), la inhibici resultava del 63%. Per aquest motiu, lextracte que sutilitz en la reacci de despolimeritzaci era lextracte metanlic. La metodologia emprada fou similar a la citada en les fonts bibliogrfiques213 , tot i que augmentant la concentraci dcid. Aix, a un volum dextracte metanlic safegia un volum de soluci 10% de floroglucinol, 2% dcid ascrbic i 0,5 N de HCl. La barreja de reacci sincubava durant 20 minuts a 50C, i la reacci saturava amb 4 volums de soluci dacetat sdic 200 mM, que neutralitzava lexcs dcid. Per altra banda, la concentraci final de metanol en la mostra s del 20%, que resulta acceptable per a la separaci cromatogrfica.
116
La determinaci per HPLC dels adductes de floroglucinol es duia a terme adaptant el mtode per a la determinaci de catequines que sha descrit prviament, de manera que el flux saugmentava a 2 ml/min. En el cromatograma 2.3.3.1 es recull lordre deluci dels adductes de floroglucinol i les subunitats terminals, identificades a partir del seu temps de retenci. En les fonts bibliogrfiques sha dut a terme la caracteritzaci dels productes mitjanant LC-MS; mentre que en el nostre cas lassignaci sha fet per comparaci dels temps de retenci i per comparaci del cromatograma obtingut entre la mostra i un blanc en qu safegien els 4 volums dacetat sdic prviament a lcid, de manera que la reacci de despolimeritzaci no podia tenir lloc.
Epicatequinafloroglucinol
Ascrbic Epicatequina 3-O-gal.loatfloroglucinol
Floroglucinol Catequinafloroglucinol catequina epicatequina Epicatequina 3-O-gal.lat
Cromatograma 2.3.3.1. Separaci cromatogrfica dels productes de despolimeritzaci en medi cid dels tanins dels pinyols
Per calcular el grau de polimeritzaci mitj, es van utilitzar els segents valors dabsortivitat molar213:
Epicatequina-floroglucinol Catequina-floroglucinol Epicatequina-3-O-gal.loat-floroglucinol Epicatequina Catequina Epicatequina-3-O-gal.loat 4218 4218 14766 3988 3988 12611
El clcul del grau de polimeritzaci mitj (mDP) s la relaci entre el nombre de subunitats terminals, expressades en mols; respecte les unitat totals.
117
2.4. RESULTATS I DISCUSSI 2.4.1) Anlisi del contingut en catequines dels pinyols de les diferents varietats En les segents grfiques es recull levoluci en catequines dels pinyols al llarg del verolament i la maduraci per les varietats cultivades al Mas dels Frares. Els resultats corresponen a la campanya 2002. En la grfica es presenten els valors corresponents a lndex de vainillina i a lndex DMACH.
pinot noir 120 100 60 80 60 40 20 20 0
31/7/02 9/8/02 13/8/02
merlot 80
40
0
9/8/02 13/8/02 26/8/02 3/9/02 13/9/02
mtode vainillina cabernet sauvignon 80
mtode DMACH
mtode vainillina syrah 80
mtode DMACH
60
60
40
40
20
20
0
31/7/02 13/8/02 26/8/02 3/9/02 13/9/02 27/9/02
0
31/7/02 9/8/02 13/8/02 26/8/02 3/9/02 13/9/02
mtode vainillina ull de llebre 80
mtode DMACH
mtode vainillina garnatxa 80
mtode DMACH
60
60
40
40
20
20
0
31/7/02 9/8/02 26/8/02 3/9/02
0
31/7/02 9/8/02 13/8/02 26/8/02 3/9/02 13/9/02
mtode vainillina
mtode DMACH
mtode vainillina
mtode DMACH
118
monastrell 100 80
carinyena
80 60 60 40 40 20
20
0
31/7/02 9/8/02 13/8/02 26/8/02 3/9/02
0
31/7/02 9/8/02 13/8/02 26/8/02 3/9/02 13/9/02 20/9/02
mtode vainillina
mtode DMACH
mtode vainillina
mtode DMACH
Grfics 2.4.1.1. Proantocianidines totals calculades pels mtodes de la vainillina i del DMACH. Es representa levoluci al llarg de la maduraci per les diferents varietats objecte destudi.
Una primera observaci s que els resultats obtinguts mitjanant la metodologia de la vainillina resulten ms elevats que els corresponents amb el DMACH. Una possible explicaci seria com a conseqncia del propi mtode, ja que el DMACH no dna uns adductes tan estables, de manera que el color no resulta tampoc estable. Tanmateix, tamb cal contemplar que amb el mtode de la vainillina es sobreestimen els valors a causa duna menor especificitat, cosa que ja recull la bibliografia.198 De totes maneres, la correlaci entre les mesures sembla prou bona, ja que es mantenen les proporcions entre els valors calculats per les 2 metodologies. Encara que no presentin influncia en les determinacions de catequines en pinyols, els antocians, malgrat no reaccionar (o fer-ho molt feblement) amb aquests aldehids, s poden provocar una sobreestimaci de la lectura, sobretot en el cas de la vainillina, ja que absorbeixen a una longitud dona molt propera a la que es fa servir per efectuar la mesura (500 nm). Sembla, doncs, que la realitzaci dun blanc no resultaria suficient per corregir aquesta presncia. En el cas del DMACH, tamb shan trobat problemes en el cas que la mostra presenti color, ja que el reactiu provoca un canvi cromtic de la soluci que es tradueix en un increment de labsorbncia a 520 (provocada per lefecte hipercrmic de lcid respecte el i flavili dels antocians) i en nous pics dabsorbncia en la regi del groc, que podrien estar associats a absorci de tanins. El resultat s que tampoc esdev una mesura reproduble, cosa que desaconsella la seva utilitzaci directa en mostres colorejades (com sn extractes de pells o vins). La soluci metodolgica podria implicar lanlisi dels efectes de matriu per tal de fer rectes daddicions estndards, encara que pot resultar una
119
tasca extraordinriament feixuga. Per, lalternativa de fraccionament per columna de les mostres per tal de separar els antocians dels flavanols i tanins presenta el problema que resulta difcil trobar la metodologia apropiada per garantir una adequada separaci amb uns bons rendiments193 . Pel que fa al contingut, la tendncia general s que a mida que avana la maduraci de la baia, hi ha una disminuci en les catequines dels pinyols, encara que no sembli tan drstica com es descriu en la bibliografia. Aix podria ser degut a diferncies en lefectivitat del mtode segons letapa de mostreig: satribueix una major resistncia de les estructures dels pinyols en les primeres etapes del verolament, que comportarien una menor extractabilitat dels compostos fenlics. Quant als nivells segons les varietats, conv destacar: a) els alts valors de catequines en pinyol de Pinot noir i de Monastrell, que gaireb dupliquen els que es troben en les altres varietats. En ambds casos, els valors segons lndex de la vainillina es situarien al voltant dels 70 mg/g pinyol (al voltant dels 20 mg/g pinyol per lndex de DMACH). En el cas del Pinot noir, el fet que sigui una varietat de verema molt avanada (a lagost) podria influir en aquests continguts elevats. En el cas del monastrell, s evident que no ha assolit el nivell de maduresa adequat per la varietat. De fet, s de cicle llarg i no madura b en el mesoclima de Constant, motiu pel qual, seguint les pautes enolgiques establertes en la finca experimental de la facultat, es verema un mes abans de la maduresa tecnolgica per tal dutilitzar-lo per elaborar vi escums. b) Els valors per la varietat carinyena i garnatxa sn els ms baixos (50 mg/g en lassaig de vainillina; 10 mg/g en lassaig de DMACH). Novament lexplicaci podria venir raonada pel temps de maduraci, ja que aquestes dues sn de les varietats ms tardanes (amb veremes al 20 i 13 de setembre, respectivament). No obstant aix, Syrah i Merlot tenen una data de collita prxima a la de la garnatxa, i presenten uns valors ms elevats de catequines en pinyol. El fet de trobar aquests valors elevats apunta cap al major contingut fenlic que caracteritza a merlot i syrah per una banda, i per laltra, que en ambds casos les grfiques presenten un augment anmal en les darreres fases de la maduraci, que podria ser atribuble a un increment de lextractabilitat ms que a un increment real de la sntesi. c) El cabernet i lull de llebre, en canvi, assoleixen uns nivells de catequines en verema menors que merlot i syrah.
120
2.4.2 Procianidines oligmers per HPLC. En les segents grfiques es presenta levoluci dels monmers i oligmers de procianidines pels pinyols de les diferents varietats en la campanya 2002: 1. Carinyena
carinyena
catequines (g/kg pinyol) 7 6 5 4 3 2 1 0 31/7/02 9/8/2002 13/8/02 26/8/02 Epicatequina 3/9/2002 13/9/02 20/9/02 B2-3'-O-gal.lat B3 B6 B1 B4 B7 B2 B5 C1 proantocianidines (g/kg pinyol)
1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 31/7/02 9/8/2002
carinyena
13/8/02
26/8/02
3/9/2002
13/9/02
20/9/02
Catequina
Epicatequina-3,0-gal.lat
carinyena
c
Epicatequina3,0-gal.lat Epicatequina B4 B3 proantocianidines B2 B1 B2-3'-O-gal.lat C1 B7 B5 B6
Catequina
Grfics 2.4.2.1. Evoluci durant la maduraci en la varietat carinyena de: A) flavan.-3-ols monomrics. B) Proantocianidines oligomriques. Resultats expressats en g / kg pinyol (pes fresc). C) Representaci sectorial de la composici percentual dels flavanols i dels proantocianidols en el moment de la verema.
En la varietat Carinyena, hi ha una disminuci clara dels monmers, especialment de la catequina, en la maduraci, de tal manera que dunes concentracions inicials de 6,50,3 g/kg pinyol (pes fresc), els valors finals sn de 1,10,2 g/kg pinyol. De totes maneres, els valors sempre estan per sobre dels dmers i trmers determinats, els quals oscil.len en tot moment entre els 0,2 i els 0,4 mg/kg pinyol. Entre aquests oligmers, hi ha un descens de la B2 esterificada amb cid gl.lic, aix com de la B4.
121
2. Garnatxa
garnatxa catequines (g/kg pinyol) 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 31/7/02 9/8/2002 Catequina 13/8/02 26/8/02 3/9/2002 13/9/02 0 31/7/02 9/8/2002 B2-3'-O-gal.lat B3 B6 13/8/02 B1 B4 B7 26/8/02 3/9/2002 B2 B5 C1 13/9/02 1.2 proantocianidines (g/kg pinyol)
garnatxa
1 0.8 0.6 0.4 0.2
Epicatequina
garnatxa
Epicatequina
Epicatequina3,0-gal.lat B4 B3 proantocianidines B2 B5 B6
B7
Catequina
B1
C1 B2-3'-O-gal.lat
Grfics 2.4.2.2. Evoluci durant la maduraci en la varietat garnatxa de: A) flavan.-3-ols monomrics. B) Proantocianidines oligomriques. Resultats expressats en g / kg pinyol (pes fresc). C) Representaci sectorial de la composici percentual dels flavanols i dels proantocianidols en el moment de la verema.
En la Garnatxa, tamb hi ha una disminuci dels monmers al llarg de la maduraci del pinyol, tot i que resulta ms suau. En canvi, en els oligmers resulta, en general, molt ms estable al llarg de la maduraci, a excepci de la procianidina B2 esterificada amb cid gl.lic, que disminueix drsticament de concentraci. En contraposici, la corresponent forma no esterificada, la B2, es mant fora constant i a uns nivells relativament alts (al voltant dels 0.6 mg/kg pinyol). Aix suggereix que ms que una sntesi neta de B2, el que hi ha s una hidrlisi de lenlla ester de la forma gal.lada, de tal manera que, malgrat que hi pugui haver desaparici de B2 en processos de polimeritzaci, queden compensades per aquesta hidrlisi.
122
3) Merlot
merlot catequines (g/kg pinyol) 6 5 4 3 2 1 0 9/8/2002 13/8/02 Catequina 26/8/02 Epicatequina 3/9/2002 13/9/02 1.2 proantocianidines (g/kg pinyol)
merlot
1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 9/8/2002 13/8/02 26/8/02 B1 B4 B7 3/9/2002 B2 B5 C1
13/9/02
B2-3'-O-gal.lat B3 B6
merlot
Epicatequina3,0-gal.lat B3 Epicatequina B2 proantocianidines B1 B2-3'-O-gal.lat Catequina C1 B4 B5 B6
c
B7
Grfics 2.4.2.3. Evoluci durant la maduraci en la varietat merlot de: A) flavan.-3-ols monomrics. B) Proantocianidines oligomriques. Resultats expressats en g / kg pinyol (pes fresc). C) Representaci sectorial de la composici percentual dels flavanols i dels proantocianidols en el moment de la verema.
En el cas del Merlot, levoluci sembla concordar amb la de les varietats abans comentades, per b que la primera mostra analitzada, del 9 dagost, resulta una mica ms madura que les primeres mostres analitzades en les altres varietats. Podem suposar, doncs, que els nivells inicials estarien al voltant dels 10 g/kg pinyol. Conv destacar el fet que els nivells de catequina i epicatequina sn molt similars al llarg de tota la maduraci, i de fet al moment de la verema sn lleugerament ms alts els depicatequina, sobretot si considerem la suma de les dues formes (lliure i esterificada amb gl.lic). Aquests valors concorden amb els de la bibliografia214. Pel que fa als oligmers, tamb predominen les combinacions depicatequina: la B2 (Epicatequina Epicatequina), tant lliure com esterificada amb cid gl.lic, i la C1 (Epicatequina Epicatequina Epicatequina), aix com la B6 (Epicatequina Catequina) sn les majoritries al moment de la verema. La B2 especialment, augmenta al final del perode, cosa que est dacord amb resultats observats en altres regions. 215
214
Fuleki, T; Ricardo da Silva, JM.(1997). Catechin and procyanidin composition of seeds from grape cultivars grown in Ontario, J. Agric. Food Chem . 145, 1156-1160 215 Saint-Cricq de Gaulejac,N; Augustin, M; Vivas, N; Glories, Y.(1997). A biochemical approach to the evolution of procyanidin in grape seeds during the ripening of red grapes (Vitis vinifera L.cv. Merlot Noir); Journal of Wine Research, vol 8, n3, 159-167
123
4) Monastrell
monastrell
8 catequines (g/kg pinyol) 7 6 5 4 3 2 1 0 31/7/02 9/8/2002 13/8/02 26/8/02 3/9/2002
1.8
monastrell
proantocianidines (g/kg pinyol)
1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 31/7/02 9/8/2002 13/8/02 B1 B4 B7 26/8/02 B2 B5 C1
3/9/2002
Catequina
Epicatequina
monastrell
Epicatequina3,0-gal.lat Epicatequina B3 B2 proantocianidines B1 C1 B2-3'-O-gal.lat Catequina B4 B5 B6
B7
Grfics 2.4.2.4. Evoluci durant la maduraci en la varietat monastrell de: A) flavan.-3-ols monomrics. B) Proantocianidines oligomriques. Resultats expressats en g / kg pinyol (pes fresc). C) Representaci sectorial de la composici percentual dels flavanols i dels proantocianidols en el moment de la verema.
En monastrell hi ha un lleuger increment al final de la maduraci del contingut en catequines, i tamb hi ha un augment de la sntesi al principi del procs maduratiu. Aquest comportament s inusual, ja que prviament noms ha estat descrit184 un increment en el contingut fins a moments propers al verolament, i en canvi, el monastrell, a data de 13 dagost ja es trobava verolat. Cal comentar que la seva maduraci no ha estat completa, ja que s una varietat que es destina a la producci de vins escumosos, cosa que implica una verema avanada. En la composici doligmers, destaca labundncia del trmer C1. El fet que la seva abundncia sigui superior a la dels dmers indicaria que en aquest varietat es dna una alta tendncia a les reaccions de polimeritzaci dels tanins.
124
5) Syrah
syrah
catequines (g/kg pinyol) 8 proantocianidines (g/kg pinyol) 7 6 5 4 3 2 1 0 31/7/02 9/8/2002 Catequina 26/8/02 Epicatequina 3/9/2002 13/9/02
1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 31/7/02
syrah
9/8/2002
26/8/02 B1 B4 B7
3/9/2002 B2 B5 C1
13/9/02
syrah Epicatequina3,0-gal.lat
B3 Epicatequina B2 proantocianidines B1
B4
B5 B6 B7
C1 B2-3'-O-gal.lat Catequina
Grfics 2.4.2.5. Evoluci durant la maduraci en la varietat syrah de: A) flavan.-3-ols monomrics. B) Proantocianidines oligomriques. Resultats expressats en g / kg pinyol (pes fresc). C) Representaci sectorial de la composici percentual dels flavanols i dels proantocianidols en el moment de la verema.
Syrah presenta un comportament anmal quant a levoluci daquests compostos en comparaci amb les corbes que sobserven per daltres varietats, ja que els seus valors augmenten en acostar-se el moment de la verema. De fet, en la bibliografia es recullen alguns comportaments similars, encara que els valors no augmenten amb la magnitud que sobserva en els nostres resultats216. La grfica concorda, per, amb lobtinguda en el cas de la reacci amb aldehids, i per tant indicaria que, dhaver-hi alguna anomalia, correspondria al procs dextracci i no al de determinaci. Una possible explicaci s que es produeixi en el processament de les mostres una degradaci per part dels polmers. En la fase de rotavaporaci sintenta treballar per sota de 40C per tal devitar aquest procs, ja que sest evaporant un solvent amb caracterstiques lleugerament cides. No sembla, per, que aquest procs hagi afectat la resta de varietats objecte destudi. Pel que fa a la composici, els nivells depicatequina sn superiors que no pas els de catequina, i destaquen els elevats valors de lespcie B2-gal.lat.
216
Downey, M.O; Harvey, JS; Robinson, SP. (2003). Analysis of tannins in seeds and skins of Shiraz grapes throughout berry development; Austarlian Journal of Grape and Wine Research 9, 12-14
125
6. Pinot noir
pinot noir catequines (g/kg pinyol) 35 30 25 20 15 10 5 0 31/7/02 Catequina 9/8/2002 Epicatequina 13/8/02 proantocianidines (g/kg pinyol) 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 31/7/02 B2-3'-O-gal.lat B3 B6 9/8/2002 B1 B4 B7 B2 B5 C1 13/8/02 pinot noir
pinot noir Epicatequina-3,0-gal.lat
Epicatequina
Epicatequina3,0-gal.lat
B4 B3
B5
B6
B7
proantocianidines B2 Catequina B1 B2-3'-O-gal.lat C1
Grfics 2.4.2.6. Evoluci durant la maduraci en la varietat pinot noir de: A) flavan.-3-ols monomrics. B) Proantocianidines oligomriques. Resultats expressats en g / kg pinyol (pes fresc). C) Representaci sectorial de la composici percentual dels flavanols i dels proantocianidols en el moment de la verema.
Pinot Noir s la varietat que presenta uns nivells ms elevats de catequines i proantocianidines. De fet, els valors no corresponen als duna maduraci acabada, ja que el seu dest s lelaboraci de vins escumosos, i per tant la verema s preco amb la finalitat daconseguir un most amb lacidesa adequada. Aix implica que la maduresa en la composici fenlica encara no ha arribat al seu fi, motiu pel qual els nivells de catequina continuen sent quantitativament i relativa elevats. A ms, per ser una varietat que sadapta millor a zones fredes, el seu comportament en clima mediterrani mostra una acceleraci de la maduraci del ram que noms es reflecteix en la maduraci de la polpa, per sense existir correspondncia amb la maduraci fenlica dels pinyols. Aix doncs, els nivells de catequina segurament continuarien disminuint. Pel que fa als dmers i trmers, considerant lestabilitzaci que sobserva per daltres varietats, podrem inferir que el comportament seria similar i, per tant, no es reduirien massa ms els valors de concentraci que sobtenen a la data de la collita efectuada, en qu la proantocianidina predominant s la B1. En treballs daltres autors 217, els valors de B1 finals sn inferiors que els de B2 i similars als de C1, cosa que ens indicaria com podria anar seguint levoluci daquestes espcies.
217
Santos-Buelga, C; Francia-Aricha, EM; Escribano-Bailn, MT. (1995). Comparative flavan-3-ol composition of seeds from different grape varieties; Food Chemistry 53: 197-201
126
7.Ull de llebre
ull de llebre (no reg)
catequines (g/kg pinyol) 6 5 4 3 2 1 0 31/7/02 Catequina 9/8/2002 Epicatequina 26/8/02 3/9/2002 proantocianidines (g/kg pinyol) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 31/7/02 B2-3'-O-gal.lat B3 B6 9/8/2002 B1 B4 B7 26/8/02 B2 B5 C1 3/9/2002
ull de llebre (no reg) Epicatequina3,0-gal.lat Epicatequina B3 B4 B5 B6 proantocianidines B2
B1 Catequina B2-3'-O-gal.lat C1
B7
Grfics 2.4.2.7. Evoluci durant la maduraci en la varietat ull de llebre de: A) flavan.-3-ols monomrics. B) Proantocianidines oligomriques. Resultats expressats en g / kg pinyol (pes fresc). C) Representaci sectorial de la composici percentual dels flavanols i dels proantocianidols en el moment de la verema.
Per lull de llebre, la grfica torna a seguir el comportament habitual, en el sentit de disminuci dels continguts en catequines. Levoluci de les procianidines es caracteritza per una disminuci tamb de la majoria delles, amb excepci de la B2, la B6, la B4 i la B1. La composici mostra certes discrepncies amb altres resultats de les fonts bibliogrfiques217 . Es mantenen els nivells de les procianidines B2 i B4, per no aix els nivells de catequina, que en estudis dut a terme a Castilla-Len217 presenta uns valors finals ms elevats. Quant als nivells de B6, la segona proantocianidina amb ms quantitat en el nostre estudi, el treball citat no narriba a fer la quantificaci individual, ja que en la separaci aquesta procianidina es solapa amb un trmer. S que es fa una estimaci total de la suma de les procianidines B5-B8, amb uns resultats per sota dels que obtenim en la nostra anlisi. Aix sembla suggerir, malgrat la manca de ms estudis, que la composici catequnica dels pinyols del ram, malgrat estar clarament influda per la varietat, tamb deu estar afectada, com en el cas dels antocians, per tota una altra srie de factors.
127
8) Cabernet sauvignon
cabernet sauvignon (reg) catequines (g/kg pinyol) proantocianidines (g/kg pinyol) 12 10 8 6 4 2 0 31/7/02 9/8/2002 Catequina 13/8/02 26/8/02 Epicatequina 3/9/2002 13/9/02 27/9/02 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 -0.2 31/7/02 9/8/2002 B2-3'-O-gal.lat B3 B6 13/8/02 26/8/02 B1 B4 B7 3/9/2002 13/9/02 B2 B5 C1 27/9/02 cabernet sauvignon (no reg)
cabernet sauvignon (no reg) Epicatequina3,0-gal.lat B3
B4 B5 B6 B2
Epicatequina
proantocianidines
B7
B1 Catequina B2-3'-O-gal.lat
C1
Grfics 2.4.2.8. Evoluci durant la maduraci en la varietat cabernet sauvignon de: A) flavan.-3-ols monomrics. B) Proantocianidines oligomriques. Resultats expressats en g / kg pinyol (pes fresc). C) Representaci sectorial de la composici percentual dels flavanols i dels proantocianidols en el moment de la verema.
En Cabernet sauvignon, novament la grfica recull la disminuci en el temps de les concentracions de catequines. Els valors finals en catequina i epicatequina sassemblen ms als registrats per Santos-Buelga217 que als de Fuleki214 , que narribava a obtenir sobre els 0.6 g/kg pinyols. En canvi, els valors baixos en E-3-gal.lat sajusten ms als resultats daquest ltim, en qu es troben a nivells de traa, que no pas als dels primers, en qu guarda una relaci 1:3 respecte la catequina i lepicatequina. De fet, els valors van disminuint amb la maduraci, de manera que, per diferents maduracions, hi hauran uns continguts diferents, cosa que refora la hiptesi de variabilitat que ja indicaven els resultats obtinguts amb ull de llebre. En el que s que coincideixen les nostres determinacions amb les dels autors citats s en lordre dimportncia de les procianidines amb lenlla 4-8: la B2 s la majoritria, seguida per la B1; i a nivells menors, la B3 i la B4. Cap dels dos estudis presenta resultats per les de la srie denlla 4-6.
128
Discussi general 1) Continguts finals Segons la concentraci de procianidines, les varietats es poden establir en els segents grups: 1- Pinot t unes concentracions 2 o 3 vegades ms grans que les altres varietats. En verolament els valors sn de 50 g de catequina /kg pinyol. Els valors finals es situen sobre els 20-25 g de catequina/kg pinyol. 2- Syrah i Monastrell tenen uns valors elevats en el moment de la verema, entre 10-20 g/kg, que no difereixen excessivament dels valors en el moment del verolament. 3- Cabernet t uns valors elevats en el moment del verolament, sobre els 25 g/kg pinyol, per els valors finals sn de 7-8 g/kg. 4- Merlot cont en verema entre 7-8 g de catequina/kg pinyol. Per a diferncia de cabernet, els valors en el verolament sn baixos. 5- Garnatxa t uns valors finals baixos, per sota dels 6 g/kg pinyol, per en el moment del verolament sn alts. 6- Carinyena i ull de llebre tenen els valors ms baixos de totes les varietats, i en el moment de la verema estan per sota dels 6 g de catequina/ kg pinyol. Com ja hem comentat, el pinot noir no assoleix la seva mxima maduresa en la finca mas dels frares, ja que es destina a la producci descumosos. Per tant, la degradaci de procianidines que t lloc al llarg de la maduraci no ocorre en aquesta varietat en tota la seva potncia. Malgrat aix, els valors elevats concorden amb els descrits en la bibliografia218: Bourzeix et al. 218 tamb destaquen lelevat contingut en catequina i epicatequina de Pinot noir, que es troba per sobre dels 1000 mg/kg ram. En els seus estudis tamb es ressalten els valors elevats en cabernet sauvignon (344 mg/kg ram) i merlot (601 mg/kg ram), i els valors ms discrets en garnatxa (173 mg/kg ram) o carinyena (94 mg/kg ram) Amb Syrah, Downey216 obt uns valors finals en catequines de 4 g/kg pinyol, similars als que obtenen Kennedy et al. 219, i fora inferiors als del nostre treball.
218
Bourzeix, M; Weyland, D; Heredia, N. (1986). tude des catechines et des procyanidols de la grappe de raisin, du vin et dautres drivs de la vigne. Bulletin de lOIV,;669-670: 1177-1254 219 Kennedy, JA; Troup, GJ; Pilbrow, JR; Hutton, DR; Hewitt, D; Hunter, CR; Ristic, R; Iland, PG; Jones, GP. (2000). Development of seed polyphenols in berries from Vitis vinifera L.cv. Shiraz. Aust J Grape and Wine Research 6, 244-254
129
2) Evoluci Es pot observar que en la majoria dels casos la dinmica daquests compostos contempla una disminuci contnua dels monmers a partir del verolament fins al moment de la verema. Aquestes disminucions concorden amb les descrites per altres autors, com de Freitas et al.180, 174; Kennedy et al.219, 220, Jordao et al. 175 o Downey et al.216 . Noms Monastrell i Syrah descriuen un comportament errtic, ja que augmenten a meitat del perode de maduraci. En el cas de Syrah, segueix augmentant fins al moment de la verema. La disminuci en contingut s superior en la catequina que en lepicatequina, cosa que sescau amb una major velocitat de desaparici. Kennedy219 estableix que el comportament s duna cintica de 2n ordre, consistent amb les de reaccions doxidaci radicalria descrites per Plumb221.
3) Composici Syrah s una varietat caracterstica quant a la composici en flavan-3-ols, ja que s la nica en qu els continguts depicatequina resulten superiors en tota la fase de maduraci. Aquesta caracterstica coincideix amb les descripcions de la varietat que es troben als treballs de Kennedy219 i Downey216 . La resta de varietats presenten uns continguts majors en catequina que en epicatequina al llarg de tota levoluci, per en els estadis finals poden igualar-se (cas de carinyena o ull de llebre) o fins i tot, com en el cas de merlot, invertir la tendncia. Merlot, syrah i ull de llebre presenten valors similars de catequina i epicatequina en data de verema; les altres varietats mostren quantitats ms elevades de catequina que depicatequina. En treballs de Santos-Buelga217 tamb observen aquesta equivalncia en el moment de la verema, per a excepci de merlot, lobtenen per a altres varietats (garnatxa, monastrell). La presncia desters gal.loilats dels flavan-3-ols en els pinyols s una caracterstica que suscita molts estudis, ja que no shan trobat precursors gal.loilats de les procianidines.
220 221
Kennedy, JA; Matthews, MA; Waterhouse, AL. (2000). Changes in grape seed polyphenols during fruit ripening. Phytochemistry 55, 77-85 Plumb, GW; Pascual-Teresa, SD; Santos-Buelga, C; Cheynier, V; Williamson, G. (1998). Antioxidant properties of catechins and proanthocyanidins: effect of polymerization, galloylation and glycolisation. Free Radical research 29, 351-358
130
La gal.loilaci t lloc sobre lepicatequina, com ja anota Santos-Buelga217 . De totes maneres, pot haver-hi sobreestimaci de les seves quantitats en el cromatograma, ja que alguns autors com Waterhouse222 atribueixen una absorbncia a 280 nm superior a les espcies no-gal.loilades.
Per altra banda, hi ha molta variaci en el contingut de procianidines. Destaquen els nivells del Pinot noir, que malgrat ser una varietat de poca concentraci fenlica, presenta uns valors de proantocianidines molt elevats. Tamb es pot observar que hi ha una variaci composicional, ja que no totes les varietats mantenen les mateixes proporcions en els dmers. De fet, totes elles presenten elevats nivells del dmer depicatequina galloilat, per difereixen en la resta doligmers de la srie B. En Pinot noir predomina la procianidina B1, resultats que coincideixen amb els treballs de Bourzeix 218. En les altres varietats, excepte Carinyena, predomina la B2 en la seva forma lliure o gal.loilada. En Merlot, Syrah i Garnatxa sn remarcables els nivells elevats de trmers.
222
Waterhouse, AL; Ignelzi, S; Shirley, JR. (2000). A comparison of methods for quantifying oligomeric proanthocyanidins from grape seed extracts; Am J Enol Vitic, 51 (4): 383-389
131
2.2.1.
Comparaci situacions reg i no reg
La segent figura recull levoluci per al cas de les varietats ull de llebre i cabernet sauvignon, en condicions de reg i no reg. a) cabernet sauvignon
cabernet sauvignon (reg)
12 catequines (g/kg pinyol) 10 8 6 4 2 0 31/7/02 9/8/2002 13/8/02 26/8/02 3/9/2002 13/9/02 27/9/02 0 31/7/02 9/8/2002 13/8/02 26/8/02 3/9/2002 13/9/02 27/9/02 12
cabernet sauvignon (no reg)
catequines (g/kg pinyol)
10 8 6 4 2
Catequina
Epicatequina
Catequina
Epicatequina
1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 31/7/02 9/8/2002 13/8/02 26/8/02 3/9/2002 13/9/02 27/9/02
1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 31/7/02 9/8/2002 13/8/02 26/8/02 3/9/2002 13/9/02 27/9/02
B1 B4 B7
B2 B5 C 1
B1 B4 B7
B2 B5 C 1
cabernet sauvignon (reg)
cabernet sauvignon (no reg)
Epicatequina
Epicatequina3,0-gal.lat B4 B3 B5 B6
C
Epicatequina
Epicatequina3,0-gal.lat B3
B4 B5 B6
proantocianidines
B7 B2 C1
B2 proantocianidines B1 Catequina B2-3'-O-gal.lat
B7 C1
Catequina
B1 B2-3'-O-gal.lat
Grfics 2.4.2.9. Evoluci durant la maduraci en la varietat cabernet sauvignon en condicions de reg (esquerra) i no reg (dreta) de: A) flavan.-3-ols monomrics. B) Proantocianidines oligomriques. Resultats expressats en g / kg pinyol (pes fresc). C) Representaci sectorial de la composici percentual dels flavanols i dels proantocianidols en el moment de la verema.
Com es pot comprovar, la situaci de reg sembla causar un retard en la desaparici de les catequines i les proantocianidines, de manera que els nivells disminueixen molt
132
menys drsticament que en baies no irrigades. Tamb genera una major quantitat de catequines (monmers) en el pinyol al moment de la verema, malgrat que aquest efecte es produeix per una estabilitzaci final del contingut. Igualment, la situaci dirrigaci ofereix uns valors de proantocianidines en verema superiors, tot i que la composici final (grfica sectorial) no es veu afectada. El fet que els pesos frescs dels pinyols no difereixin entre les situacions de reg i no reg (amb uns valors de 0,780,05 g/baia, i 0,750,08 g/baia, per les situacions de reg i no reg, respectivament), indica que no es produeix un efecte de diluci i, per tant, les diferncies entre uns valors i altres han de ser degudes al balan entre nova sntesi i desaparici per degradaci o per uni amb altres subunitats monomriques per augmentar el grau de polimeritzaci.
b) ull de llebre
ull de llebre (reg)
6 catequines (g/kg pinyol) catequines (g/kg pinyol) 6
A
5 4
0 31/7/02 9/8/2002 13/8/02 26/8/02 3/9/2002
0 31/7/02 9/8/2002 26/8/02 3/9/2002
Catequina
Epicatequina
Catequina
Epicatequina
ull de llebre (reg)

1 0.9 proantocianidines (g/kg pinyol) 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 31/7/02 9/8/2002 13/8/02 26/8/02 3/9/2002 1
B
0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 31/7/02 9/8/2002 26/8/02
3/9/2002
B1 B4 B7 ull de llebre (reg)
B2 B5 C1
B1 B4 B7 ull de llebre (no reg)
B2 B5 C1
Epicatequina3,0-gal.lat B4 Epicatequina B2 B3 B5 B6 proantocianidines
Epicatequina3,0-gal.lat
Epicatequina
B3
B4
B5 B6
B2 proantocianidines B7 Catequina C1 B1 B2-3'-O-gal.lat C1
B1 Catequina B2-3'-O-gal.lat
B7
Grfics 2.4.2.10. Evoluci durant la maduraci en ull de llebre en condicions de reg (esquerra) i no reg (dreta) de: A) flavan.-3-ols monomrics. B) Proantocianidines oligomriques. Resultats expressats en g / kg pinyol (pes fresc). C) Representaci sectorial de la composici percentual dels flavanols i dels proantocianidols en el moment de la verema.
133
En ull de llebre la situaci de reg tamb sembla provocar una desaparici suau del contingut de catequines, per cal tenir en compte que els valors inicials sn significativament menors que en la situaci de no reg. Quant a composici, la irrigaci sembla conduir a petites diferncies en els valors dalgunes proantocianidines en ull de llebre, especialment en el cas de la B2. Aix, en situaci de reg sembla que hi ha un major nivell de la B2 gal.loada, que provoca una disminuci final en la concentraci de la procianidina B2 lliure. A diferncia del que passava amb el cabernet, no hi ha variaci en els nivells finals de catequines monmeres, encara que en el tractament de reg estan en unes proporcions lleugerament per sota respecte les proantocianidines del que succeeix en situaci de no reg.
Com a conclusi general, podem establir per les 2 varietats que en ceps regats la disminuci de les catequines i oligmers s progressiva al llarg del perode : no s tan rpida i presenta uns esglaonats augments i disminuci fins la verema. Aquests resultats concorden amb els que obtenen Kennedy et al.220 en tractaments amb reg estandrd, reg excessiu i dficit de reg, en qu observen que les velocitats de desaparici dels monmers sn incrementades pels dficits hdrics. Sembla que el reg pot retardar la maduraci del pinyol, i aix fa que en cabernet en data de verema, el tractament de reg atenyi uns nivell de prop del doble que el no reg. Els oligmers segueixen un patr similar, sent els ms abundants B2, B6 i B7. En ull de llebre, en no reg sobserva un comportament semblant, per les diferncies en els valors finals sn menors que per la varietat cabernet. Quant als oligmers, tamb en el reg sobserven els valors ms elevats, i en aquest cas, els dmers ms abundants sn el B2 i B6. A diferncia dels antocians, per als quals abunden els estudis de la influncia dels factors sobre els seus continguts, hi ha pocs treballs realitzats que relacionin els continguts en catequines i procianidines oligmers amb factors ambientals o culturals. Un daquests treballs, el de Mateus et al.223, mostra que laltitud (que es relaciona amb una menor temperatura i humitat) pot exercir una influncia en aquests continguts, encara que el seu efecte depn de la varietat. Els nostres estudis semblen tamb indicar que les concentracions daquests compostos sn un parmetre ms subjecte a la influncia dels factors que el que resultaven ser els antocians.
134
2.4.3 Determinaci dels graus de polimeritzaci Una primera aproximaci als valors del grau de polimeritzaci saconsegueix mitjanant la utilitzaci de la cromatografia en capa fina. En la cromatoplaca 2.4.31 es recull el resultat abans i desprs del revelat amb DMACH i vainillina, respectivament. En el cas del DMACH, la coloraci inicial blavosa dna pas al cap de poc temps a tonalitats verdoses-marronoses, mentre que amb la vainillina dna coloracions vermelloses.
A B C
monmers dmers trmers
polmers Cromatoplaca 2. 4.3.1. Separaci mitjanant cromatografia en capa fina de les catequines i proantocianidines dextractes de pinyol i pell per la varietat ull de llebre. Es presenta la placa abans del revelat (A), desprs del revelat amb DMACH (B),i deprs del revelat amb vainillina (C): 1,9) Catequina/Epicatequina 10 mM; 2) Malvidina; 3, 5, 7) Extractes de pinyol; 4,6,8) Extracte de pells.
En la figura es pot apreciar en els pinyols les bandes corresponents a catequines, a procianidines dimriques i trmers, per tamb resulta observable la presncia daltres oligmers i de polmers, que prcticament no elueixen en la cromatografia. En les pells, el contingut de flavan-3-ols monomrics s molt minoritari en comparaci amb el dels pinyols, de manera que en el revel.lat amb vainillina (C) prcticament no es diferencien dels antocians. No obstant aix, el fet que les taques en la zona dels oligmers de major grau de polimeritzaci presentin coloracions blavoses en la seva reacci amb el DMACH indica la presncia daquests compostos en alt grau de polimeritzaci (B). De fet, s difcil separar completament els antocians de les proantocianidines en aquests tipus dextracte, cosa que suggereix lexistncia dinteraccions, ja sigui covalents o no covalents entre ambds grups de molcules, encara que no est clar si es tracta dun artefacte de lallament o b si aquestes associacions es formen ja al llarg del desenvolupament de la baia224.
223
Mateus, N; Marques, S; Gonalves, A; Machado, J; deFreitas, V. (2001), Proanthocyanidin composition of red Vitis vinifera varieties from the Douro valley during ripening: influence of cultivation altitude. Am J Enol Vitic 52 (2): 115-121 224 Keneddy, JA; Hayasaka, Y; Vidal, S; Waters, E; Jones, GPO. (2001). Composition of grape skin proanthocyanidins at different stages of berry development. J Agric Food Chem, 49, 5348-5355
135
En les segents cromatoplaques es presenta el contingut en algunes varietats:
Cromatoplaques 2.4.3.2. Separaci per TLC i revelat amb DMACH. 1,9) Catequina/Epicatequina 10 mM; 2) Malvidina; 3, 5, 7) Extractes de pinyol; 4,6,8) Extracte de pells.3 i 4) mostres de maduraci; 5 i 6) mostres de meitat de maduraci; 7 i 8) mostres de verolament
Els resultats sn complementaris dels obtinguts en la separaci mitjanant lanlisi per HPLC, en el sentit que es pot observar una disminuci dels monmers en els pinyols al llarg de la maduraci, que fa que noms siguin detectables en les mostres de cabernet, ull de llebre i syrah, que eren precisament les que valors ms alts en presentaven en el moment de la verema. Per altra banda, tamb serveix per detectar de forma qualitativa la presncia de dmers i trmers, i per constatar, per la presncia de la banda corresponent, lexistncia de polmers. Tanmateix, el mtode no permet fer una estimaci clara daquest grau de polimeritzaci, ja que coincideixen en la banda oligmers i polmers de diferent mida. Altres autors203, utilitzant un sistema ms polar, de tolu: acetona: cid frmic (3:6:1), permeten leluci daquesta banda polimrica, tot i que no est feta lassignaci. De fet, aquesta assignaci s dificultosa a causa de la manca de patrons comercials ms enll de
136
tetrmers225. En general, els graus de polimeritzaci es determinen de fraccions allades aplicant tcniques de despolimeritzaci, de RMN, despectrometria de masses, o per cromatografia de gel permeaci 225. Resulten ms concloents els graus de polimeritzaci calculats pel mtode de la despolimeritzaci en presncia de fluoroglucinol. En les segents taules sen recullen els valors al llarg del verolament per als pinyols:
Mon 31/7 Epicat-f Cat-f Catequina E3G-f Epicatequina Ep-3-G total Total terminal mDP 12.4 1.1 3.0 0.3 2.1 0.2 2.3 0.2 1.3 0.1 0.6 0.5 21.7 2.3 4.2 0.8 5.2 0.6 Sy 31/7 Epicat-f Cat-f Catequina E3G-f Epicatequina Ep-3-G total Total terminal mDP 10.1 1.2 2.2 0.5 1.6 0.2 2.5 0.8 2.3 0.8 0.4 0.3 19.1 3.3 5.2 1.5 3.8 0.5 Gx 31/7 Epicat-f Cat-f Catequina E3G-f Epicatequina Ep-3-G total Total terminal mDP 1.4 0.5 1.4 0.1 1.1 0.1 2.8 0.2 1.4 0.1 0.7 0.6 12.8 1.6 4.9 0.9 2.6 0.2 Mon 13/8 11.1 0.9 2.1 0.2 2.0 0.2 1.3 0.1 1.1 0.1 0.6 0.4 18.2 2.0 3.0 0.7 6.2 0.9 Sy 13/8 7.6 0.9 1.4 0.2 1.3 0.2 1.4 0.2 1.0 0.3 0.2 0.1 12.9 1.8 2.6 0.5 5.1 0.4 Gx 13/8 10.6 0.9 2.0 0.2 1.9 0.2 2.3 0.2 1.1 0.1 0.3 0.3 18.3 1.8 3.7 0.6 4.9 0.3 Mon 26/8 14.3 1.2 3.9 0.3 2.5 0.2 1.4 0.1 1.0 0.1 0.5 0.3 23.6 2.4 3.0 0.7 8.2 1.2 Sy 26/8 7.0 2.1 1.4 0.8 1.3 0.6 1.0 0.4 1.0 0.4 0.2 0.1 11.8 4.2 2.1 0.8 5.8 0.4 Gx 26/8 9.4 0.8 1.4 0.1 1.9 0.2 1.7 0.1 1.2 0.1 0.4 0.3 16.0 1.6 3.3 0.5 4.9 0.4 Mon 3/9 11.9 1.0 2.7 0.2 2.5 0.2 1.0 0.1 0.7 0.1 0.5 0.4 19.2 2.0 2.1 0.5 9.2 1.7 Sy 13/9 9.8 1.6 2.4 1.4 2.1 0.7 1.6 0.6 1.6 0.6 0.2 0.1 17.6 4.7 3.3 1.1 5.3 0.5 Gx 13/9 9.4 0.8 1.6 0.1 2.3 0.2 1.5 0.1 1.0 0.1 0.3 0.3 16.2 1.6 2.9 0.5 5.7 0.5
225
Cheynier, V; Fulcrand, H. (2003). Analysis of polymeric proanthocyanidins and complex polyphenols, a Methods in polyphenol analysis, Editat per Santos-Buelga, C i Williamson,G, The Royal Society of Chemistry
137
Cs 31/7 Epicat-f Cat-f Catequina E3G-f Epicatequina Ep-3-G total Total terminal mDP 6.6 0.6 0.8 0.1 1.0 0.1 1.6 0.1 0.9 0.1 0.4 0.3 11.3 1.2 2.9 0.5 4.0 0.3 Ull 31/7 Epicat-f Cat-f Catequina E3G-f Epicatequina Ep-3-G total Total terminal mDP 8.8 0.7 1.0 0.1 1.8 0.2 0.9 0.1 0.6 0.1 0.6 0.4 13.8 1.5 2.2 0.5 6.4 1.3 Car 31/7 Epicat-f Cat-f Catequina E3G-f Epicatequina Ep-3-G total Total terminal mDP 3.7 0.3 0.7 0.1 0.4 0.1 0.7 0.1 0.4 0.1 0.2 0.1 6.3 0.7 1.4 0.3 4.7 0.5 Mt 9/8 Epicat-f Cat-f Catequina E3G-f Epicatequina Ep-3-G total Total terminal mDP 2.36 0.3 0.11 0.1 0.34 0.1 0.6 0.1 0.44 0.1 0.18 0.1 4.03 0.7 1.23 0.3 3.28 0.5
Cs 13/8 9.3 0.8 1.7 0.1 1.5 0.1 1.5 0.1 1.1 0.1 0.3 0.2 15.3 1.5 2.8 0.5 5.4 0.4 Ull 13/8 9.9 0.8 1.8 0.2 2.2 0.2 1.2 0.1 0.6 0.1 0.5 0.4 16.2 1.7 2.3 0.6 7.4 1.4 Car 13/8 3.8 0.3 0.6 0.1 0.4 0.1 0.3 0.1 0.4 0.1 0.2 0.1 5.7 0.6 0.9 0.2 6.9 1.2 Mt 13/8 3.73 0.3 0.15.1 0.450.1 0.86.1 0.55.1 0.250.1 6.00 1.67 3.60
Cs 3/9 7.3 0.6 0.8 0.1 1.2 0.1 1.0 0.1 0.6 0.1 0.2 0.1 11.1 1.1 1.8 0.3 6.2 0.6 Ull 26/8 8.9 0.8 1.3 0.1 2.0 0.2 0.8 0.1 0.5 0.1 0.4 0.3 13.9 1.4 1.8 0.4 8.1 1.4 Car 26/8 1.41 0.3 0.03 0.01 0.11 0.02 0.11 0.02 0.08 0.02 0.05 0.01 1.79 0.3 0.24 0.03 7.36 2.2 Mt 26/8 2.61 0.10 0.35 0.45 0.02 0.30 0.02 0.16 0.01 3.97 0.3 0.91 0.03 4.36 2.2
Cs 13/9 7.5 0.6 0.9 0.1 1.2 0.1 0.9 0.1 0.7 0.1 0.2 0.1 11.5 1.1 1.9 0.3 6.2 0.5 Ull 3/9 1.35 0.1 0.02 0.01 0.20 0.03 0.10 0.03 0.06 0.01 0.05 0.01 1.78 0.2 0.22 0.03 8.28 0.2 Car 20/9 1.7 0.2 0.03 0.01 0.13 0.02 0.12 0.02 0.11 0.01 0.00 0.00 0.02 0.2 0.02 0.02 7.38 1.48 Mt 13/9 2.05 0.2 0.060.01 0.33.02 0.23 0.02 0.20 0.01 0.10 0.00 2.97 0.2 0.53 0.02 5.57 1.48
138
PN 31/7 Epicat-f Cat-f Catequina E3G-f Epicatequina Ep-3-G 1.62 0.3 0.09 0.1 0.09 0.1 0.92 0.1 0.39 0.1 0.08 0.1
PN 7/8 3.37 0.3 0.19 0.1 0.18 0.1 1.35 0.1 0.64 0.1 0.13 0.1
PN 13/8 2.79 0.3 0.16 0.01 0.13 0.02 0.97 0.02 0.47 0.02 0.12 0.01
total Total terminal mDP
3.20.7 1.40.3 2.29 0.5
5.860.6 2.130.2 2.76 1.2
4.640.3 1.560.03 2.98 2.2
Taules 2.4.1. Quantificaci dels adductes generats en la reacci de despolimeritzaci amb floroglucinol. Es donen els valors per a cada adducte, per a les subunitats terminals, els sumatoris i el grau de polimeritzaci mitj (MDP) corresponent.
En relaci a altres tcniques de determinaci dels graus de polimeritzaci, els valors obtinguts amb el mtode del floroglucinol sn comparables als resultats de les cromatografies de gel permeaci, i a la vegada resulten superiors a les estimacions que sobtenen mitjanant assaigs colorimtrics225 De les diferents varietats, els valors ms elevats en grau de polimeritzaci corresponen a Monastrell, que assoleix uns nivells mitjans de 9.2 Unitats de monmer per molcula. Aix concorda amb el que sha observat en lanlisi dels dmers i trmers, en qu ja sapuntava aquesta possibilitat pel fet que presentava uns valors elevats de trmer respecte els dmers. Tamb presenta uns valors elevats la carinyena, encara que en aquest cas no hi ha una correlaci amb els nivells de trmer C1. Cal tenir en compte, per, que la separaci cromatogrfica no arriba a separar tots els trmers, i per tant no se narriba a fer la identificaci. De totes maneres, aquests sn graus mitjans, cosa que significa que poden trobar-se espcies amb graus de polimeritzaci majors. En diverses experimentacions170 es fa una separaci prvia per cromatografia de les diferents fraccions segons la seva mida molecular, i resulta relativament fcil allar tetrmers. En canvi, els menors graus es troben en Pinot noir, que presenta uns nivells molt elevats dels monmers, cosa que pot explicar aquests baixos nivells de polimeritzaci. Es constata que al llarg de la maduraci dels pinyols, naugmenta el grau de polimeritzaci. Aix pot tenir importncia en la qualitat del vi, ja que en augmentar el grau
139
de polimeritzaci, en disminueix lamargor i lextractabilitat, per naugmenta lastringncia. La composici daquests polmers seria principalment dunitats monmer depicatequina, com indica el fet que en totes les varietats salli gran porporci de ladducte epicatequinafloroglucinol. Aquestes observacions coincideixen amb les de tots els autors, que en els oligmers allats destaquen que les subunitats dextensi sn fonamentalment depicatequina, mentre que les subunitats diniciaci sn catequina 217,213,211. Lalta participaci daquest monmer en les estructures polimriques podria explicar el fet que els valors de lepicatequina lliure en pinyols siguin inferiors a la catequina. Igualment, lincrement en el grau de polimeritzaci mitj justifica la desaparici en el pinyol tant de catequina com depicatequina monmer que sobserva al llarg de levoluci. Curiosament, la varietat Syrah, que presentava un increment del contingut en aquest monmers al final de la maduraci, tamb registra una disminuci del grau de polimeritzaci final. Aix podria ser a causa dalgun tipus dhidrlisi dels tanins del pinyol, que podria ser un efecte fisiolgic o b un procs interferent al llarg de la manipulaci de la mostra. Per altra banda, tamb es posa de manifest la participaci de lepicatequina gal.loilada en les estructures polimriques, en major proporci fins i tot que la catequina, com demostren els valors de concentraci del corresponent adducte amb floroglucinol (E3G-f). Aix doncs, aquest flavan-3-ol est implicat fonamentalment en la formaci de subunitats dextensi que condueixen a les formes polimriques. Aquesta evoluci del grau de polimeritzaci mitj obtingut mitjanant procediments de tiolisi coincideix amb els resultats obtinguts per Saucier et al.226. Els mateixos autors observen que aquesta polimeritzaci tindria lloc associada a la paret cel.lular. Tamb obtenen resultats en aquest sentit les separacions mitjanant cromatografia dexclusi, tant amb columna de slica-gel227 com amb columna TSK-Toyopearl HW-40215 . Tamb observa Kennedy , aplicant el mtode del trencament amb floroglucinol, lincrement del grau de polimeritzaci en pells de Syrah224. No obstant aix, els resultats obtinguts poden ser discrepants, ja que el mateix Kennedy observa una disminuci del grau de polimeritzaci en els pinyols219 , per en canvi Downey et al. nobserven un increment per a la mateixa varietat en pinyols, per una disminuci en pells216 . Sembla que les condicions dextracci poden ser decisives en la diferncia en aquest comportament, ja que en incrementar els graus de polimeritzaci tamb en disminueix la seva solubilitat. A ms, tamb caldria
226
Saucier, C; Geny, L; Glories, Y. (2003). Composition et localisation cellulaire des tanins de ppins de raisin au cours de la maturation de la baie. 7e Sympoisum International dOenologie, Editions Tec & Doc, 111-113 227 Waterhouse, AL. (2003). A new understanding of seed tannin ripening; Seed Report, online
140
avaluar els rendiments de la reacci de tiolisi, procs complicat a causa de la dificultat de disposar de patrons idonis i representatius. En aquest sentit dels rendiments de la reacci, Kennedy apunta que la possible formaci dadductes covalents al llarg de la maduraci que no poden ser degradats en la reacci de tiolisi220 , o loxidaci dels tanins al llarg de la maduraci, de lextracci o de la reacci de trencament, conduirien a enllaos no susceptibles de ser atacats per la reacci de trencament i, per tant, a una infraestimaci dels graus de polimeritzaci.
2.5. CONCLUSIONS 1. Les metodologies de lassaig de la vainillina i de lassaig DMACH permeten estimar el contingut de catequines i proantocianidines en extractes de pinyols, per cada mtode implica una reactivitat diferent i, per tant, condueix a uns valors numrics diferents. 2. A diferncia del que succea amb els antocians, es dna una gran variaci en els continguts de catequines i proantocianidines oligmeres al llarg de la maduraci. En aquest sentit, les catequines disminueixen de manera molt ms drstica, mentre que les procianidines tenen disminucions ms suaus o fins i tot estabilitzacions i increments al llarg de la maduraci. 3. En el moment de la verema, les varietats difereixen en la seva composici en flavan-3-ols. En general, predomina la catequina i la procianidina B2. 4. La varietat pinot noir s la que presenta valors ms alts de catequines en pinyols. 5. Els graus de polimeritzaci augmenten al llarg de la maduraci en totes les varietats, com posen de manifest els resultats obtinguts mitjanant el trencament dels polmers en presncia de floroglucinol. En els polmers participa fonamentalment lepicatequina, que pot presentar gal.loilaci. 6. Els tractaments de reg semblen provocar uns majors continguts de catequines i proantocianidines en pinyols, especialment en cabernet sauvignon, continguts que podrien estar associats a un diferent grau de maduraci en pinyol.
141
2.6. REFERNCIES BIBLIOGRFIQUES

1.
Cheynier, V; Moutounet, M; Sarni-Manchado, P. (2003). Los compuestos fenlicos. A Enologa: Fundamentos cientficos y tecnolgicos. Coord. Claude Fanzi, EMV Ediciones 2. Souquet, JM; Cheynier, V; Sarni-Manchado, P; Moutounet, M. (1996). Les composs phnoliques du raisin. J. Int. Sci. Vigne et Vin, Hors srie, 99-107 3. Pascual-Teresa, S; Rivas-Gonzalo, JC; Santos-Buelga, C. (2000). Prodelphinidins and related flavanols in wine, Int J Food Science & Techn, 35, 33-40 4. Ricardo-da-Silva, JM. (1992). Procyanidines du raisin et du vin. Structure et proprietes chimiques; Tesi Doctoral. cole Nationale Sup Agronomique Montpellier 5. Freitas, VAP; Glories, Y; Bourgeois, G; Vitry, C. (1998). Characterisation of oligomeric and polymeric procyanidins from grape seeds by liquid secondary ion mass spectometry. Phytochemistry, vol 49, n5: 1435-1441 6. Vivas de Gaulejac, N; Vivas, N; Absalon, C; Nonier, MF. (2001). Identification du procyanidole A2 dans le raisin et le vin de Vitis vinifera L.CV. Merlot noir and abernet sauvignon, J. Int. Sci. Vigne Vin, 35, n1, 51-56 7. Souquet, JM; Cheynier, V; Brossaud, F; Moutounet, M. (1996). Polymeric proanthocyanidins from grape skins. Phytochemistry, vol 43, n2: 509-512 8. Freitas, VAP; Glories, Y. (1999). Concentration and compositional changes of procyanidins in grape seeds and skin of white Vitis vinifera varieties. J Sci Food Agric, 79: 1601-1606 9. Jordao, AM; Ricardo-da-silva; JM; Laureano, O. (2001). Evolution of proanthocyanidins in bunch stems during berry development (Vitis vinifera L.); Vitis 40(1), 1722 10. Ricardo da Silva JM;Belchior AP;Spranger MI;Bourzeix M. (1992). Oligomeric procyanidins of three grapevine varieties and wines from Portugal. Sciences des Aliments, 12 223-237 11. Escribano-Bailon MT; Guerra MT; Rivas-Gonzalo JC; Santos-Buelga C. (1995). Proanthocyanidins in skins from different grape varieties; Zeitschrift fuer LebensmittelUntersuchung und -Forschung;200 (3) 221-224 12. Sun, B.;Ricardo-da-Silva, J. M.;Spranger, M. I .(2001). Quantification of catechins and proanthocyanidins in several Portuguese grapevine varieties and red wines; Ciencia e Tecnica Vitivinicola;16 (1) 23-34 13. Hmamouchi M;Es-Safi N;Boubekri C;Bourzeix M;Essassi EM. (1994). Qualitative and quantitative analysis of berry proanthocyanidins of four Moroccan grape varieties. Bulletin de l'O.I.V.;67 901-915 14. Freitas, V. A. P. de;Glories, Y.;Monique, A. (2000). Developmental changes of procyanidins in grapes of red *Vitis vinifera* varieties and their composition in respective wines; American Journal of Enology and Viticulture; 51 (4) 397-403 15. Kovac V;Bourzeix M;Heredia N;Ramos T. (1990). Etude des catechines et proanthocynaidols de raisins et vins blancs; Rev Fran d'Oenologie;30 (125) 7-14 16. Mattivi F;Nicolini G;Sanchez C. (1991). Comparison between the polyphenol content of Marzemino, Pinot noir and Sangiovese wines of 1989. Rivista di Viticoltura e di Enologia, 44 (1) 39-52
142
17.
Auw, J. M.;Blanco, V.;O'Keefe, S. F.;Sims, C. A.. (1996). Effect of processing on the phenolics and color of Cabernet Sauvignon, Chambourcin, and Noble wines and juices. American Journal of Enology and Viticulture, 47 (3) 279-286 18. Katalinic, V.;Males, P.(1997). Compositional changes in grape polyphenols throughout maturation. Journal of Wine Research; 8 (3) 169-177 19. Kovac, V; Alonso, E; Revilla, E. (1995). The effect of adding supplementary quantities of seeds during fermentation on the phenolic composition of wines. Am J Enol Vitic. Vol 46, n3: 363-367 20. Laminkara, O; Garlick, D. (1987). Effects of grape skin and seeds on the composition and quality of Muscadine wines. Food Chem 26:245-251 21. Bravo, L. (1998). Polyphenols:chemistry, dietary sources, metabolism and nutritional significance. Nutr Rev ; 56, 317-333 22. Rochibaud, JL; Noble, AC. (1990). Astringency and bitterness of sellected phenolics in wine. J Sci Food Agric, 53, 343-353 23. Ribreau-Gayon, P; Glories, Y; Maujean, A; Dubordieu, Y. (1999). Phenolic compounds, a Handbook of enology, vol 2. The chemistry of wine, stabilization and treatments; Ed. John Wiley & Sons. 24. Teissedre,P.L; Waterhouse, A.L; Walzem, R.L; German, J.B; Frankel, e.n; Ebeler, S.E; Clifford, A.J. (1996). Composs phnoliques du raisin et du vin et sant; Bull. OIV 781782:252-277 25. daSilva,J; Rigaud, J; Cheynier,V. (1991). Procyanidin dimers and trimers from grape seeds; Phytochemistry, 30:1259-1264 26. Brunet, MJ . (1999). Identificaci i transport plasmtic de les procianidines del vi, Tesi Doctoral. URV. 1999 27. Escribano-Bailn, M.T.(1993). Estudio de la Composicin Flavnica de la Semilla de la Uva, Tesi Doctoral (1993). Facultat de Farmcia, Universitat de Salamanca. 28. Glories, Y. (1974). Recherches sur la structure et les propriets des composs phnoliques polymeriss des vins rouges. I- Prcipitation par laldhyde formique et par lacide chlorydrique concentr. Conn. Vigne Vin, 8, n1, 57-74 29. Price, ML; Scoyoc, SV; Butler, LG. (1978). A critical evaluation of the vanillin reaction as an assay for tannin in sorghum grain. J Agric Food Chem, 26, 1214-1218 30. Sun,B; Ricardo-da-Silva, J.M; Spranger, I. (1998)Critical factors of vanillin assay for catechins and proanthocyanidins; J.Agric.Food Chem., 46, 4267-4274 31. Nagel, CW; Glories, Y. (1991). Use of a modified Dimethylaminocinnamaldehyde reagent for analysis of flavanols, Am.J.Enol. Vitic., vol 42, n4, 364-366 32. Vivas N;Glories Y;Lagune L;Saucier C;Augustin M. (1994). Estimation of the polymerisation level of procyanidins from grapes and wines by use of pdimethylaminocinnamaldehyde; Journal International des Sciences de la Vigne et du Vin;28 319-336 33. Amerine,MA; Ough, CS. (1980). Methods for analysis of musts and wines, John Wiley & Sons, New York 34. Lea, AGH; Timberlake, CF; Singleton, VL.(1979). The procyanidins of white grapes and wines; Am J Enol Vitic 30, 289-300 35. Sun, B; Leandro, C; Ricardo Da Silva, JM; Spranger, I (1998). Separation of grape . and wine proanthocyanidins according to their degree of polymerization; J Agric Food Chem, 46, 1390-1396
143
36. 37.
Ruiz, J. (1999). Comunicaci personal Vivar-Quintana, AM. (2001). Fraccionamento y estudio preliminar de la materia colorante del vino tinto. Tesi Doctoral. Fac. Farmcia, Univ Salamanca 38. Merck. (1998). Anfarbungsreagienzen fr Dnschicht und Papier-Chromatography 39. Oszmianski, J; Sapis, JC. (1989). Fractionation and identification of some low molecular weight grape seed phenolics. J Agric Food Chem 37, 1293-1297 40. Lea, AGH. (1978). The phenolics of cider: oligomers and polymers procyanidins; J SciFood Agric, 25, 1537-1545 41. Boukharta, M; Girardin, M; Metche, M. (1988). Procyanidines galloyles du sarment de vigne (Vitis vinifera). Sparation et identification par chromatographie liquide haute performance et chromatographie en pase gaseuze. J Crohromatogr 455, 4065-409 42. S de Pascual-Teresa, S; Santos-Buelga, C; Rivas-Gonzalo, JC. (2000). Quantitative analysis of flavan-3-ols in spanish foodstuff and beverages. J Agric Food Chem, 48, 5331-5336 43. Carando, S; Teissedre, PL; Pascual-Martinez, L; Cabanis, JC. (1999). Levels of flavan-3-ols in french wines. J Agric Food Chem, 47, 4161-4167 44. Peng, Z; Hayasaka, Y; Iland, PG; Sefton, M; Hoj, P; Waters, EJ. (2001). Quantitative analysis of polymeric procyanidins (tannins) from grape (Vitis vinifera) seeds by reverse phase high-performance liquid chromatography; J Agric Food Chem, 49, 26-31 45. Matthews,s; Mila,I; Scalbert,A; Pollet,B; Lapierre,C; Herv du Penhoat, CLM; Rolando,C; Donnelly, DMC. (1997). Method for estimation of proanthocyanidins based on their acid depolymerization in the presence of nucleophiles; J.Agric Food Chem.45, 1195-1201 46. Bate-Smith, E. (1955). Food, 23, 124 47. Kennedy, JA; Jones, GP. (2001) Analysis of proanthocyanidin cleavage products following acid-catalysis in the presence of excess phloroglucinol. J Agric Food Chem, vol 49(4), 1740-1746 48. Fuleki, T; Ricardo da Silva, JM.(1997). Catechin and procyanidin composition of seeds from grape cultivars grown in Ontario, J. Agric. Food Chem. 145, 1156-1160 49. Saint-Cricq de Gaulejac,N; Augustin, M; Vivas, N; Glories, Y.(1997). A biochemical approach to the evolution of procyanidin in grape seeds during the ripening of red grapes (Vitis vinifera L.cv. Merlot Noir); Journal of Wine Research, vol 8, n3, 159-167 50. Downey, M.O; Harvey, JS; Robinson, SP. (2003). Analysis of tannins in seeds and skins of Shiraz grapes throughout berry development; Austarlian Journal of Grape and Wine Research 9, 12-14 51. Santos-Buelga, C; Francia-Aricha, EM; Escribano-Bailn, MT. (1995). Comparative flavan-3-ol composition of seeds from different grape varieties; Food Chemistry 53: 197-201 52. Bourzeix, M; Weyland, D; Heredia, N. (1986). tude des catechines et des procyanidols de la grappe de raisin, du vin et dautres drivs de la vigne. Bulletin de lOIV,;669-670: 11771254 53. Kennedy, JA; Troup, GJ; Pilbrow, JR; Hutton, DR; Hewitt, D; Hunter, CR; Ristic, R; Iland, PG; Jones, GP . (2000). Development of seed polyphenols in berries from Vitis vinifera L.cv. Shiraz. Aust J Grape and Wine Research 6, 244-254 54. Kennedy, JA; Matthews, MA; Waterhouse, AL. (2000). Changes in grape seed polyphenols during fruit ripening. Phytochemistry 55, 77-85 55. Plumb, GW; Pascual-Teresa, SD; Santos-Buelga, C; Cheynier, V; Williamson, G. (1998). Antioxidant properties of catechins and proanthocyanidins: effect of polymerization, galloylation and glycolisation. Free Radical research 29, 351-358
144
56.
Waterhouse, AL; Ignelzi, S; Shirley, JR. (2000). A comparison of methods for quantifying oligomeric proanthocyanidins from grape seed extracts; Am J Enol Vitic, 51 (4): 383-389 57. Mateus, N; Marques, S; Gonalves, A; Machado, J; deFreitas, V. (2001), Proanthocyanidin composition of red Vitis vinifera varieties from the Douro valley during ripening: influence of cultivation altitude. Am J Enol Vitic 52 (2): 115-121 58. Keneddy, JA; Hayasaka, Y; Vidal, S; Waters, E; Jones, GPO. (2001). Composition of grape skin proanthocyanidins at different stages of berry development. J Agric Food Chem, 49, 5348-5355 59. Cheynier, V; Fulcrand, H. (2003). Analysis of polymeric proanthocyanidins and complex polyphenols, a Methods in polyphenol analysis, Editat per Santos-Buelga, C i Williamson,G, The Royal Society of Chemistry 60. Saucier, C; Geny, L; Glories, Y. (2003). Composition et localisation cellulaire des tanins de ppins de raisin au cours de la maturation de la baie. 7e Sympoisum International dOenologie, Editions Tec & Doc, 111-113 61. Waterhouse, AL. (2003). A new understanding of seed tannin ripening; Seed Report, online
145
El contingut dels compostos fenlics en el ram s un condicionant del seu contingut posterior en els vins, per no el determina de manera absoluta. La comparaci de la composici fenlica del ram i del vi mostra que juntament amb les molcules directament procedents de la baia, apareixen en el vi tamb altres fenols. Aix s a causa, per una banda, de la influncia del procs de la maceraci, i per laltra, de la reactivitat daquestes molcules dintre de la matriu vnica. Ambds sn processos en qu es modifica aquesta composici fenlica: 1) lextracci dels compostos fenlics en la maceraci no s equivalent per a tots els compostos, de manera que les concentracions trobades en el ram no tenen perqu traduir-se de manera proporcional posteriorment en el most ni en el vi. 2) el vi s una matriu complexa en qu els compostos fenlics experimenten tota una srie de reaccions, que condueixen a una estabilitzaci o una degradaci del color.228 Aix doncs, la composici fenlica del vi depn a la vegada de la matria prima i del tipus de vinificaci adoptat, que influeix en fenmens fsics com la difusi daquests components des de les parts slides cap al most; i, per altra banda, influeix sobre els fenmens bioqumics i qumics en els quals estan implicats els polifenols (oxidaci, degradaci, condensaci). En els dos captols segents abordarem lefecte dels dos processos, centrant lestudi fonamentalment en els antocians.
228
Zamora,F; Elaboracin y crianza del vino tinto: aspectos cientficos y prcticos; AMV Ediciones, Mundi-Prensa (2003)
149
Captol 3. Extracci dels antocians al llarg de la maceraci
3.1. INTRODUCCI El vi negre s un vi macerat, de manera que en el procs de maceraci hi ha una extracci fraccionada del material del ram229. El grau dextracci influeix en la quantitat i estabilitat del color, lastringncia i lestructura tnica del vi, el seu potencial per envellir i la seva composici aromtica 230. Durant la vinificaci, noms una tercera part dels compostos fenlics del ram s extreta selectivament al vi, amb una extractabilitat i un rendiment final fortament influts per la varietat vinfera. A partir daquesta premissa, sha desenvolupat el concepte de potencial fenlic del ram, en contraposici al de maduresa tecnolgica mimetitzant el procs de vinificaci per tal dobtenir informaci quantitativa sobre el contingut de compostos fenlics extractables en el ram231. Aquests poden provenir de la polpa, la pell, les llavors i les parts llenyoses. Per aquest motiu, la mida del ram (relaci pell/most) o el nombre de pinyols per baia sn parmetres que afecten la posterior concentraci fenlica en els mostos i vins. Cal considerar que el volum de la baia s proporcional al cub del seu radi, mentre que lrea de pell s proporcional al quadrat. Aix provoca que de baies amb una relaci elevada pellofes:most, en resulten vins de ms concentraci en potassi, pH, contingut de flavonoides, contingut dantocians, aroma, color i astringncia, podent arribar a uns nivells dextracci excessiva, de vins massa concentrats. Lextracci dels constituents del ram al vi s essencialment un procs de difusi, que segueix normalment un comportament de saturaci, caracteritzat per una primera fase exponencial que condueix posteriorment a una fase estacionria sense increment dextracci. La velocitat i extensi de la fase exponencial estan fortament infludes per la
229 230 231
Peynaud. (1984). Knowing and making wine. John Wiley & Sons, New York Zoecklein,B. (1991). An overview of maceration during red winemaking. Aust & NZ Wine Ind J., 6: 265-267 Mateos, S., Valls, J., Nadal M.; Arola, L. (2001) Estudio de la madurez fenlica sobre diferentes variedades tintas y su relacin con el color de los vinos. Tecnologa del vino, n 2, Sept-Oct, pp 45-50
153
Composici fenlica en vi
natura qumica del constituent, la seva concentraci i localitzaci en la baia, i pels mtodes de processament. Aix, el temps de contacte, el ratio entre lquid i slid, els continguts relatius de most, pells, pinyols i rapes, o la inclusi de rapes en la maceraci sn factors importants que afecten lextracci.
3.1.1. Difusi dels compostos fenlics al most Els diferents compostos fenlics estan localitzats en diferents parts del ram i tenen diferents solubilitats i difusivitats respecte la fase aquosa o alcohlica, en un equilibri influt per la temperatura i lambient qumic del most232. 1. Els compostos fenlics no flavonoides ja estan presents al most, ja que es solubilitzen des de les pells cap a la fase aquosa. 2. Els antocians tamb sn solubles en aigua, i per tant sn extrets a una velocitat relativament rpida, de manera que als primers dies de fermentaci sassoleix un mxim en els antocians monomrics. Desprs daquest punt, sovint hi ha un decreixement, a causa de ladsorci sobre les lies de llevat i les parts slides del ram, d una petita part de degradaci, i de la seva inclusi en cristalls de bitartrat potsic que es van insolubilitzant a mesura que el contingut etanlic augmenta 233. El coneixement dels continguts dantocians extractables permet poder dissenyar adequadament el procs de vinificaci 234, ja que el percentatge de polifenols individuals respecte el contingut total s indicatiu de lelecci de la millor tcnica de vinificaci. En el cas dels antocians, el seu mecanisme de difusi des de les pells del ram fins al most sembla estar afectat per lestructura molecular, per factors varietals i per la composici de la fase lquida235. En alguns estudis dextractabilitat sha observat una major facilitat dextracci de la peonidina-3-glucsid respecte la malvidina-3-glucsid236, per en contraposici, en altres estudis s la malvidina el principal compost recuperat, amb valors
232 233
Parley, A. (1997).Voodoo and the art of winemaking. Part II. Technology of red wine vinification. Lincoln University. Parley, A. (1997). The effect of pre-fermentation enzyme maceration on extraction and colour stability in pinot noir wine; Tesi Doctoral. Lincoln University. 234 Mattivi, F.;Prast, A.;Nicolini, G.;Valenti, L. (2002).Validation of a new method to measure the polyphenolic potential of red grapes and discussion of its use in enology; Rivista di Viticoltura e di Enologia; 55 (2-3) 55-74 235 Di Stefano, R.; Borsa, D.; Gentilini, N. (1994). Estrazione degli antociani dalle bucce dell'uva durante la fermentazione. Annali dell'Istituto Sperimentale per l'Enologia Asti; 25 (1) 31-46;It, 236 Dell'Oro V;Di Stefano R. (1991). Carbonic maceration. Evolution of vanillic and syringic acids and anthocyanins during conservation of Barbera and Nebbiolo grapes in carbon dioxide. Vini d'Italia, 33 (4) 53-62
154
daproximadament un 90% 237. Daquests estudis, sembla inferir-se que la recuperaci depn fonamentalment de la concentraci de lantoci en la matria prima, el ram. Tamb sobserva que les formes antociniques varien segons el tipus de processament. Aix, malgrat que la maceraci tradicional i la intensiva donen uns continguts similars dantocians en el most, la maceraci intensiva afavoreix un increment de les formes hidroxilades (cianidina, delfinidina) i una prdua de les formes acilades. La maceraci carbnica canvia els ratios dantocians entre el most i el vi i promou lextracci dels antocians-3-monoglucsids no acilats; i la maceraci en calent afavoreix una major extracci inicial dels antocians hidroxilats en el most, per una prdua dels mateixos i dels acilats en el vi final. De fet, en general el procs maceratiu comporta un empobriment en el contingut de derivats acilats, efecte al qual sha dafegir que les formes acilades es descomponen ms rpidament que les no acilades durant el processament238. Hi ha altres factors que poden implicar prdua de material antocinic. Malgrat que al llarg de la fermentaci hi ha una gran extracci dels antocians de les pells, tamb hi ha una prdua daquests compostos a causa de la seva oxidaci, precipitaci i adsorci sobre els llevats. La presncia detanol, acetaldehid i altres compostos al llarg de la fermentaci comporta canvis en el mecanisme de difusi i la precipitaci dantocians tant monomrics com polimrics. La presncia de nivells elevats dacetaldehid (en els casos de fermentacions de mostos clarificats o filtrats o en qu els llevats tenen carncies metabliques) sembla ser responsable de prdues significatives en la quantitat dantocians235 . Aquests efectes seran ms mpliament discutits en el segent captol de la present tesi.
3. Els flavan-3-ols i els seus oligmers, les procianidines, sn ms solubles en alcohol, i estan localitzats principalment en els pinyols, malgrat que la majoria de varietats tamb presenten quantitats significatives daquests flavonoids en les pells. Per la seva localitzaci i solubilitat, el seu contingut incrementa lentament a mesura que progressa la fermentaci alcohlica 239. Lextracci dels flavan-3-ols i les proantocianidines dels pinyols s un aspecte important de la llargada del temps de maceraci.
237
Vivas de Gaulejac, N.;Nonier, M. F.;Guerra, C.;Vivas, N. (2001). Anthocyanin in grape skins during maturation of * Vitis vinifera* L. cv. Cabernet Sauvignon and Merlot noir from Bordeaux terroirs. Journal International des Sciences de la Vigne et du Vin; 35 (3) 149-156 238 La Notte E;Liuzzi VA;Esti M. (1992). The polyphenolic wine components. 2. Note: Anthocyanins content and composition in relation to different winemaking techniques. Vignevini; 19 (10) 49-55;1992 239 Rizzon, L.A. (1985). Incidence de la macration sur la composition chimique des vins. Tesi Doctoral. Bordeaux II.
155
Encara que els pinyols presenten unes quantitats ms elevades de tanins, els tanins de les pells, a causa de la seva localitzaci i major polaritat (especialment en el cas de les prodelfinidines) sn ms fcilment extractables240. Les condicions de vinificaci poden modificar el contingut de proantocianidines del vi i, per tant, modificar-ne les propietats organolptiques. La distribuci de cada tipus de monmer, oligmer i polmer en el vi jove est estretament relacionada amb el contingut en la varietat. Aix, la varietat Pinot noir, que t un alt contingut de flavan-3-ols i proantocianidines en els pinyols per s molt ms pobre en les pells, origina vins ms rics en (+)-catequina i (-)-epicatequina que els vins de Cabernet Sauvignon241. Per altra banda, de prctiques enolgiques que condueixin a una major extracci dels pinyols en resulten vins ms tnics.
3.1.2. Procs de maceraci en negres El ram est altament compartimentat en cllules amb paret cellular de pectines, cellulosa i hemicellulosa; i que mantenen una comunicaci entre elles mitjanant una capa de pectina. Una bona prctica de maceraci requereix que es degradi aquesta capa per tal dalliberar les cllules, i que es trenquin les parets cellulars per tal dalliberar-ne els components. Aix es pot aconseguir mitjanant la utilitzaci de maceraci mecnica, calor, enzims pectoltics, maceraci en fred, o per combinaci de tots ells.
a) Maceraci mecnica: El procs maceratiu tradicional implica la realitzaci peridica de remuntatges per facilitar un major contacte entre les pells i el most, i millorar aix lextracci de compostos fenlics. A ms, els remuntatges actuen regulant la temperatura del most i airejant-lo, la qual cosa inhibeix lacetidificaci del vi i afavoreix el creixement dels llevats i, per tant, possibilita un desenvolupament ms rpid de la fermentaci alcohlica. Entre els factors amb ms incidncia sobre leficincia del procs maceratiu es poden citar la temperatura, loxigenaci, el temps de maceraci i lagitaci del barret242.
240 241
Souquet, JM; Cheynier, V; Brossaud, F; Moutounet, M. (1996). Polymeric proanthocyanidins from grape skins. Phytochemistry , vol 43, n2: 509-512 Karuamanchir, A; Tsang, E; Goldberg, DM; Diamnandis, EP; Soleas, GJ; Catechin and epicatechin concentrations of red wines from 15 different regions; (1996). Am. J. Enol. Vitic . 47: 357 242 Vivas N;Galvin C;Chabot PH. (2001). Maceration techniques in the production of red quality wines. Progres Agricole et Viticole , 109 79-88
156
La durada de la maceraci permet regular la quantitat de polifenols extractables i la seva estructura. Temps ms llargs de contacte provoquen generalment ms color, ms flavonoids, ms procianidines, menys antocians monomrics, ms compostos fenlics polimrics i ms pigments polimrics 243,244,245. En contraposici, les maceracions curtes condueixen a vins lleugers, amb poca quantitat de polifenols. En aquestes maceracions curtes hi haur una bona extracci dantocians, ja que difonen ja en lencubat, i arriben al seu mxim al 5-6 dia, per no aix dels tanins, lextracci dels quals t lloc preferentment durant la fase alcohlica. Conseqentment, el vi tindr un grau de condensaci baix per la carncia de tanins i aix implicar una menor estabilitat. Quan el temps de maceraci sallarga, s possible extreure tanins ms condensats que confereixen al vi la seva estructura i mitjanant la combinaci amb antocians donen lloc a formes ms estables en el temps.246 Aquest procs shaur dadaptar al tipus de vi que es desitja obtenir, en funci del seu consum com a vi jove o com a vi de criana en bta247.
La tendncia generalitzada delaborar vins negres amb un contingut elevat en polifenols com a conseqncia de la demanda actual del mercat, ha donat lloc al desenvolupament de noves tecnologies de vinificaci com la maceraci prefermentativa en fred, laddici denzims pectoltics al most, o el calentament de la pasta per millorar el contingut polifenlic dels vins negres 248.
b) La maceraci prefermentativa en fred consisteix a disminuir la temperatura inicial del procs fermentatiu, de manera que es modifica lextracci dantocians, aromes i tanins a causa de la seva diferent solubilitat: en allargar el perode dextracci no alcohlica, augmenta el contingut dantocians i daromes.249,250
243
Sims, CA;M Bates, RP. (1990). Effects of skin fermentation time on the phenols, ellagic acid sediment and sensory characteristics of a red Vitis rotundifolia wine. Am. J. Enol. Vitic . 45: 56-63 244 Scudamore-Smith, PD; Hooper, RL; McLaren, ED. (1990). Colour and phenolic changes of Cabernet sauvignon wine made by simultaneous yeast/bacterial fermentation and extended pomace contact. Am.J. Enol. Vitic. 41: 57-67 245 Auw, JM; Blanco, V; OKeefe, SF; Sims, CA. (1996). Effect of processing on the phenolics and colour of Cabernet sauvignon, Chambourcin and Noble wines and juices; Am.J.Enol.Vitic . 47: 279-286 246 Mayen, E; Mrida, J; Medina, M. (1994). Free anthocyanins and polymeric pigments during the fermentation and postfermentation standing of musts from Cabernet Sauvignon and Tempranillo grapes. Am. J. Enol. Vitic ., vol 45, 161-166 247 Zamora, F. (1998). Los compuestos fenlicos del vino tinto y su capacidad para la crianza; Jornada Tcnica sobre Aspectos cientficos del color del vino. URV 248 Arfelli G;Chiavari G;Castellari M;Amati A. (1992). The influence of wine making on polyphenolic compounds content in wines obtained from grapes of different cultivars. 2. Anthocyanins. Vignevini, 19 (9) 49-55 249 Couasnon, M. (1999). Une nouvelle technique: La macration pr-fermentaire froid Extraction la nige carbonique. 1ere partie: Rsultats oenologiques. Rev. Oenol. Tech. Vitivinic. Oenol. 92, 26-30 250 Baraut, C; Joulain, H; Landron, C. Comment vinifier les vins de garde?, Viti, 222, 46-47
157
En aquesta tcnica sempra neu carbnica, que provoca un major trencament de les pells, la qual cosa afavoreix lextracci. Si es congelen els rams a 4C , el gel format causa la ruptura de les cllules, i les pells tendeixen a separar-se de les polpes, de manera que quan es puja la temperatura a 10C lextracci dels compostos fenlics augmenta. A ms, en retardar la fermentaci uns quants dies, no es forma el barret i per tant el contacte entre el most i el ram s ms ntim. Tamb presenta una srie davantatges addicionals relacionats amb les baixes temperatures, com sn la inhibici de les polifenoloxidases, de les bactries actiques i dels llevats oxidatius 251. c) Termovinificaci: La velocitat de lextracci de compostos fenlics sincrementa significativament en augmentar la temperatura, que t un efecte de degradar les parets cellulars, incrementar les reaccions enzimtiques, i augmentar la difusi dels compostos fenlics. No obstant aix, al llarg de la fermentaci alcohlica conv establir un control trmic, perqu si la temperatura resulta elevada pot provocar problemes daturades de fermentaci, aix com de prdua daromes 252. En la termovinificaci, sutilitzen altes temperatures abans de la fermentaci per tal dextreure color i compostos fenlics, i desprs daquesta extracci sinicia el procs fermentatiu. Aquest procs pot afectar la composici del most, i per exemple sha observat que laplicaci de calor a la pasta provoca un increment de lextractibilitat dels compostos acilats 253 . Similar fonament t la tcnica dexpansi flash, en qu els rams sn escalfats a 85 C durant 5 minuts, i desprs sn sotmesos a una expansi flash sota buit a 60 mbar. A aquesta temperatura i pressi, part de laigua de les cllules passa a fase vapor, i la pressi diferencial que sexerceix sobre les parets cellulars provoca la seva ruptura. La maceraci posterior aporta una major extracci dantocians i compostos fenlics, sense afectar el balan entre les fraccions extretes ni lestabilitat de les mateixes254. d) Maceraci enzimtica: Els enzims pectoltics es troben en el ram de forma natural, i en quantitat suficient per a la degradaci de les pellofes durant la vinificaci i lalliberament al most de compostos fenlics i aromtics. Els preparats enzimtics comercials amb activitat principal de tipus pectoltic - i un ampli espectre dactivitats
251
Zamora, F. (2002). Extraccin y estabilizacin de la materia colorante en la vinificacin en tinto; a Maceracin y Extraccin de color. Gonierno de la Rioja. Consejera de Agricultura, Ganadera y Desarrollo Rural. 2002. 252 Merida, J; Moyano, L; Millan, C; Medina, M. (1991). Extraction of phenolic compounds in controlled macerations of Pedro Ximenez grapes; Vitis 30: 117127 253 Meier W;Steidl R;Eder R;Wendelin S. (1990). Der Einfluss verschiedener Verarbeitungsmethoden auf die Anthocyanzusammensetzung von Rotweinen. Mitteilungen Klosterneuburg, Rebe und Wein, Obstbau und Fruechteverwertung; 40 : 241-2491
158
secundries (cel.lulases, hemicel.lulases, glucosidases, proteases) - permeten accelerar i optimitzar aquesta activitat natural. La seva acci extractiva t lloc al llarg de les primeres hores de maceraci, i allibera en primer lloc els antocians i els tanins poc polimeritzats. Leficcia del procs pot estar influda per la temperatura, el pH del most, la varietat de ram i la presncia dinhibidors. Alguns autors dubten de la seva eficcia 255, ja que en ocasions provoquen una disminuci del color, atribuda a acci -glicosidasa present com a impuresa en els preparats. Aquestes impureses de -glicosidasa tamb hidrolitzen lenlla ester dels antocians-glucsid, cosa que desestabilitza lestructura dels adductes que formen els copigments, responsables dun efecte hipercrmic que caracteritza el color dels vins joves. De fet, encara que en els primers dies hi ha una major extracci dels antocians, els nivells finals no difereixen dels obtinguts sense el tractament, motiu pel qual aquesta metodologia seria aconsellable noms en casos que el temps de maceraci hagi de ser breu.
3.2. OBJECTIUS 1. Es va proposar destudiar la difusi dels antocians individuals al most en el procs maceratiu al llarg del temps, per tal de veure la influncia de lestructura qumica en aquest procs. 2. Per altra banda, lestudi es va dur a terme amb diferents varietats, per comprovar si en aquesta extracci es podia establir un comportament varietal.
254 255
Anon, F. (1995).Flash expansion. A technology under development. Revue des Oenologues et des Techniques Vitivinicoles et oenologiques 77: 18-20 Lovino, R; Di Benedetto, G; Scazzarriello, G. (1997). Limpiego di enzimi pectolitici nella vinificazione in rosso di uve dellItalia meridionale. LEnotecnico, 33:75-86
159
3.3. MATERIALS I MTODES Per preparar les vinificacions sobtenia most a partir de 800 g de baies madures que es premsaven amb un colador xins. Les pells i el most obtingut es recollien en flascons mbar de 2 litres de capacitat i sinoculava la soca comercial de llevat QA23 (Lallemand). Per simular el procs de remuntatge, es feia una inversi del flasc de manera diria, i per homogenitzar el medi aquesta operaci es feia abans de la presa de mostra. De mostra sextreien 5 ml de manera peridica, que eren centrifugats a 5000g durant 5 minuts per eliminar les parts slides. El sobrenedant net es filtrava a travs duna membrana de 0,45
M
(Millipore) i constitua la mostra a injectar en el HPLC, mtode de determinaci ja comentat en el captol 1 de la present tesi. El seguiment de les fermentacions es realitzava mesurant la densitat i, quan sarribava al final de la fermentaci alcohlica, es determinaven els sucres residuals mitjanant el kit de glucosa/fructosa de Roche.
3.4. RESULTATS I DISCUSSI El contingut dantocians en les baies per a cada varietat en el moment de la verema es van determinar per HPLC, i es recull a la taula 3.4.1.
Cabernet sauvignon NO ACILATS Dp-3-glu Cy-3-glu Pt-3-glu Pn-3-glu Mv-3-glu ACETILATS 1262355 20666 208 14343 6517 828224 Syrah 437133 279 64 4413 5023 31186 Monastrell 956256 11133 8733 14539 11646 498115 Merlot 133880 21132 556 18822 13811 74618 Ull de llebre 880127 16136 257 14327 468 50557 Pinot noir 822283 359 112 5515 11437 607220 0 Garnatxa 863287 4720 4314 5722 21684 499159 165 9228 956310 Carinyena 68670 11310 153 1069 293 42345 294 30220 101787
504155 18842 3410 27710 361 p0 16556 46768 16221 30829 29236 CUMARILATS TOTAL 1932563 1093204 1152288 192269 1208128 822283 Taula 3.4.1 Valors de concentraci (mg/g baia) dantocians en les varietats emprades en les microvinficacions
160
En les segents grfiques es recull lextracci dels antocianidin-3-glucsids i del global dantocians acetilats i p-cumarilats, per cadascuna de les fermentacions realitzades; s a dir, per a cada varietat objecte destudi. 1) Cabernet sauvignon
cabernet sauvignon antocians (mg/l) 1200 1000 antocians (mg/l) 800 600 400 200 0 0 2 total 3-glu 4 dia 6 total pc-glu 8 10 TOTAL cabernet sauvignon
400.0 350.0 300.0 250.0 200.0 150.0 100.0 Dp Cy Pt Pn Mv 50.0 0.0 1 2 3 4 5 dia 6 7 8 9
total ac-glu
Grfica 3.4.1. a) Evoluci dels antocians monoglucsid (total 3-glu), acetilats (ac-glu) i p-cumarilats (pc-glu) al llarg de la maceraci per a la varietat cabernet. b) Evoluci dels cinc antocians monoglucsids: Dp (delfinidina-3-glu), Cy (cianidina-3-glu), Pt (petunidina-3-glucsid), Pn (peonidina-3-glucsid), Mv (malvidina-3-glucsid)
Cabernet sauvignon s la varietat que proporciona una concentraci ms alta dantocians en el most. Aix ve motivat per la conjunci de dos factors: per una banda, lelevada quantitat dantocians que tenen les seves pells, i per laltra, que s una varietat de gra petit. Aix fa que els seus mostos siguin concentrats en compostos fenlics. La velocitat dextracci s rpida, per no sassoleix la saturaci fins al 6 dia, segurament a causa de les elevades concentracions que presenta. Posteriorment, encara que en el medi ja shagi produt etanol, que contribueix a la solubilitzaci dels compostos fenlics, hi ha una disminuci del contingut dels antocians. Lexplicaci ms plausible s ladsorci daquests compostos a les parts slides del ram, aix com a les parets del llevat, apreciable en forma de precipitat si es centrifuguen les mostres. La disminuci s particularment elevada pel cas de la malvidina, que en ser lantoci majoritari afecta decisivament en les quantitats totals. Una caracterstica observable, que desprs tamb es manifesta en les altres varietats, s la superior extracci dels antocianidin-3-glucsids respecte la dels corresponents derivats acilats, especialment en el cas dels derivats cumarilats. Dentre els antocianidin-3-glucsids, la malvidina s la que difon ms rpidament, seguida de la delfinidina i, ja en menor grau, la petunidina. En canvi, tant la peonidina com la cianidina sn molt ms difcils dextreure. Cal tenir en compte que en la velocitat del procs tamb hi influeix la concentraci, i en el cas de la cianidina les concentracions sn baixes.
161
2) Syrah
syrah antocians (mg/l) 800 700 600 500 400 300 200 100 0 0 2 total 3-glu 4 dia 6 total pc-glu 8 TOTAL 10
antocians (mg/l) 400.0 350.0 300.0 250.0 200.0 150.0 100.0 50.0 0.0 1 2 3 4 5 6 7 8 Dp Cy Pt Pn Mv Mv Pn Pt Cy 1 2 3 4 5 6 Dp
syrah
total ac-glu
Grfica 3.4.2. a) Evoluci dels antocians monoglucsid (total 3-glu), acetilats (ac-glu) i p-cumarilats (pc-glu) al llarg de la maceraci per a la varietat syrah. b) Evoluci dels cinc antocians monoglucsids: Dp (delfinidina-3-glu), Cy (cianidina-3-glu), Pt (petunidina-3-glucsid), Pn (peonidina-3-glucsid), Mv (malvidina-3-glucsid)
En Syrah, la situaci s similar a la del Cabernet sauvignon: es tracta duna varietat de gra petit amb alt contingut dantocians. Hi ha una extracci rpida dels antocians, en major mesura en el cas dels no acilats, i en aquest cas, el plateau sassoleix el dia 5, per no hi ha una disminuci posterior del contingut en antocians per processos dadsorci. Una possible explicaci s que en la fermentaci de syrah, encara que els darrers dies no sacabaven de consumir els sucres residuals, els valors de densitat sempre estigueren per sota dels de cabernet. En un medi ms dens, les reaccions dadsorci resulten ms probables. La malvidina-3-glucsid s preponderantment lantoci que ms sextreu, en nivells molt ms elevats (350 mg/l) que els de la petunidina (50 mg/l)
3) Monastrell
monastrell antocians (mg/l) 700 600
500.0
monastrell
500 400 300 200 100 0 0 1 total 3-glu 2 3 dia 4 5 total pc-glu 6 TOTAL 7
antocians (mg/l)
400.0 300.0
200.0
100.0
0.0
dia
total ac-glu
Grfica 3.4.3. a) Evoluci dels antocians monoglucsid (total 3-glu), acetilats (ac-glu) i p-cumarilats (pc-glu) al llarg de la maceraci per a la varietat monastrell. b) Evoluci dels cinc antocians monoglucsids: Dp (delfinidina-3glu), Cy (cianidina-3-glu), Pt (petunidina-3-glucsid), Pn (peonidina-3-glucsid), Mv (malvidina-3-glucsid)
162
En monastrell semblen produir-se dos plateaus; un primer el dia 2, i laltre el dia 5. La causa s una frenada en lextracci dels antocians monoglucsid, ja que pels derivats acilats, encara que amb menor velocitat, lextracci s ms constant. Com ja succea en les pells, la proporci dantocians acilats s baixa. Quant als antocians-3-glucsid, a part de la malvidina, tamb hi ha una extracci elevada de petunidina i peonidina, i sobretot de delfinidina cap als darrers moments de la maceraci. 4) Merlot
merlot antocians (mg/l) merlot
600 500 400 300 200 100 0 0 1

total 3-glu 0.0 1 2 3 dia 4 5 6 Dp Cy Pt Pn antocians (mg/l) 300.0
200.0
100.0 Mv
3
total ac-glu
dia
4
total pc-glu
6
TOTAL
Grfica 3.4.4 a) Evoluci dels antocians monoglucsid (total 3-glu), acetilats (ac-glu) i p-cumarilats (pc-glu) al llarg de la maceraci per a la varietat merlot. b) Evoluci dels cinc antocians monoglucsids: Dp (delfinidina-3-glu), Cy (cianidina-3-glu), Pt (petunidina-3-glucsid), Pn (peonidina-3-glucsid), Mv (malvidina-3-glucsid)
En merlot, la velocitat inicial de difusi resulta menor. Malgrat ser una de les varietats amb majors quantitats al ram de derivats acilats, novament s molt baixa la seva extracci, especialment en el cas dels cumarilats. Pel que fa referncia a lextracci dels antocianidin-3-glucsids, de nou s predominant lextracci de malvidina, mentre que de la resta sobtenen uns rendiments dextracci molt baixos. 5) Ull de llebre
ull de llebre antocians (mg/l) ull de llebre
400 350
300 antocians (mg/l)
300 250 200 150 100 50 0 0 1

total 3-glu
250 200 150 100 Dp Cy Pt Pn Mv 50 0
dia 4 total ac-glu
7
TOTAL
4 dia
total pc-glu
Grfica 3.4.5. a) Evoluci dels antocians monoglucsid (total 3-glu), acetilats (ac-glu) i p-cumarilats (pc-glu) al llarg de la maceraci per a la varietat ull de llebre. b) Evoluci dels cinc antocians monoglucsids: Dp (delfinidina-3glu), Cy (cianidina-3-glu), Pt (petunidina-3-glucsid), Pn (peonidina-3-glucsid), Mv (malvidina-3-glucsid)
163
En Ull de llebre, quan acaba la fermentaci alcohlica encara no sha assolit el nivell de plateau. De fet, en aquesta varietat sembla que hi hagi un alentiment del procs maceratiu al cap del 2n dia, per desprs tornar-se a promoure lextracci. Una possible explicaci s que, en ser una varietat de ram gran, hi ha una relaci molt menor de pells respecte baies, i t una elevada densitat del most, cosa que dificultaria el procs extractiu en els primers dies. Els antocians que sextreuen tan rpidament al principi provindrien de rams sobremadurats, en qu hi ha hagut un alt grau de desintegraci cellular i que, per tant, permeten un alliberament ms rpid del seu contingut.
6) Pinot noir
pinot noir antocians (mg/l)
300 250
200.0
pinot noir
200 150 100 50 0 0 1

total 3-glu
antocians (mg/l)
150.0
100.0
50.0 Dp Cy Pt Pn Mv
0.0
dia 4
7
TOTAL
4 dia
total ac-glu
total pc-glu
Grfica 3.4.6. a) Evoluci dels antocians monoglucsid (total 3-glu), acetilats (ac-glu) i p-cumarilats (pc-glu) al llarg de la maceraci per a la varietat pinot noir. b) Evoluci dels cinc antocians monoglucsids: Dp (delfinidina-3glu), Cy (cianidina-3-glu), Pt (petunidina-3-glucsid), Pn (peonidina-3-glucsid), Mv (malvidina-3-glucsid)
En pinot noir, que s una varietat de gra petit, tamb es dna una rpida extracci dels antocians. Sarriba en poc temps als valors mxims de saturaci, que es mantenen fins al 5 dia, en qu comena una davallada. Com es pot comprovar en la grfica, aquest efecte s especialment acusat en el cas de la malvidina. A ms de pel ja descrit efecte dadsorci sobre les parts slides, una causa daquesta desaparici podria ser la participaci dels antocians en productes de combinaci amb els flavan-3-ols. Els vins de Pinot noir no sn gaire rics en antocians, ja que, com hem vist, no presenten derivats acilats en les pells. Per sn vins molt tnics, perqu la quantitat de flavan-3-ols monmers i polmers en els pinyols s molt elevada, i aquesta elevada presncia pot afavorir que sestableixin reaccions de polimeritzaci que impliquin la participaci i, per tant, desaparici dels antocians com a espcies allades.
164
7) Garnatxa
garnatxa antocians (mg/l) garnatxa
300 250 200 150 100 50 0 0 1

total 3-glu Mv Pn antocians (mg/l) 200
100
3
dia total ac-glu
4
total pc-glu
5
TOTAL
0 1 2 3 dia 4 5 Dp
Pt Cy
Grfica 3.4.7. a) Evoluci dels antocians monoglucsid (total 3-glu), acetilats (ac-glu) i p-cumarilats (pc-glu) al llarg de la maceraci per a la varietat garnatxa. b) Evoluci dels cinc antocians monoglucsids: Dp (delfinidina-3-glu), Cy (cianidina-3-glu), Pt (petunidina-3-glucsid), Pn (peonidina-3-glucsid), Mv (malvidina-3-glucsid)
En Garnatxa succeeix el comportament clssic de les varietats de gra gran: la velocitat de difusi s lenta, i els nivells finals dantocians sn baixos, igual que lull de llebre. Per a aquesta varietat la fermentaci alcohlica acaba en noms 5 dies, ja que el contingut inicial de sucres en el most era menor. Aquesta rapidesa en la fermentaci alcohlica implica que el procs extractiu no shauria completat en el moment dacabar el procs fermentatiu. La malvidina s lantoci extret en proporcions ms elevades. 8) Carinyena
antocians (mg/l) carinyena carinyena
400 350
300.0 antocians (mg/l)
300 250 200 150 100 50 0 0 2

total 3-glu
250.0 200.0 150.0 100.0 Dp Cy Pt Pn Mv 50.0 0.0
dia
6
total pc-glu
8
TOTAL
10
5 dia
total ac-glu
Grfica 3.4.8. a) Evoluci dels antocians monoglucsid (total 3-glu), acetilats (ac-glu) i p-cumarilats (pc-glu) al llarg de la maceraci per a la varietat carinyena. b) Evoluci dels cinc antocians monoglucsids: Dp (delfinidina-3-glu), Cy (cianidina-3-glu), Pt (petunidina-3-glucsid), Pn (peonidina-3-glucsid), Mv (malvidina-3-glucsid)
En Carinyena, que tamb s una varietat de gra gran, hi ha no obstant una velocitat dextracci elevada en les primeres fases, fins arribar al plateau. Posteriorment, comencen a disminuir les concentracions dels antocians en el medi. El fet que es tracti duna fermentaci llarga podria afavorir els processos dadsorci, que en aquest cas semblen implicar majoritriament la delfinidina-3-glucsid, que gaireb ha desaparegut del medi al darrer dia de maceraci.
165
Discussi general a) Evoluci de lextracci Levoluci de lextracci dels antocians segueix en general un perfil tpic de saturaci (fig 3.4.9) com el que descriu la bibliografia 232, 244, 256. En molts casos, per, hi ha una disminuci dels nivells dantocians cap al final de la fermentaci alcohlica. Aix succeeix principalment amb varietats en qu la fermentaci s ms llarga (carinyena i Grfica 3.4.9. Grfica global devoluci de la quantitat dantocians totals al llarg de la fermentaci alcohlica per les cabernet). Segons Singleton257, al diferents varietats estudiades principi de la maceraci t lloc una extracci rpida seguida duna associaci lenta dels antocians amb altres compostos, que provoca la disminuci daquests antocians lliures en dissoluci. Aquestes interaccions poden donar-se entre els propis antocians o amb altres molcules com els tanins. En experincies realitzades en la DO Peneds258, els resultats apunten en aquest sentit, ja que la proporci dels antocians polimrics va augmentant a mesura que avancen els dies de maceraci. La disminuci tamb pot ser a causa duna adsorci sobre els llevats 259, i de fet, en els nostres experiments es pot observar color en les lies, cosa que refora aquesta segona hiptesi.
1200
ANTOCIANS TOTALS
1000
antocians (mg/l)
800
600
400
200
0 0 Garnatxa Pinot noir
3 4 5 6 Cabernet sauvignon Merlot Syrah dia de llebre Ull
8 9 Monastrell Carinyena
10
Es pot observar que la velocitat de lextracci depn de la varietat, i est fortament influda pel contingut i la composici antocinica de la mateixa. Seguidament es comentaran els dos aspectes.
256
Martnez, J; Lpez, R; Santamara, P; Barua, M; Gutirrez, AR. (2002).Experiencias sobre maceracin en vinos de tempranillo, a Maceracin y extraccin de color. Consejera de Agricultura, Ganadera y Desarrollo Rural. Gobierno de La Rioja. 2002. 257 Singleton, VL; Trousdale, EK. (1992). Anthocyanin-tannin interactions explaining differences in polymeric phenols between white and red wines. Am J Enol Vitic, 43: 63-70 258 Pardo, R; Castro, JJ. (2003). Estudio de la extraccin de compuestos fenlicos de variedades tintas durante la vinificacin en la DO Peneds; Viticultura/Enologa Profesional, n87, 37-42 259 Vasserot, Y; Caillet, S; Maujean, A. (1997). Study of anthocyanin adsorption by yeast lees. Effect of some physicochemical parameters. Am J Enol & Vitic, 48: 433-437
166
b) Capacitat extractiva segons les varietats Es van trobar grans diferncies entre la capacitat de diferents varietats per permetre lextracci dels antocians (grfica 3.4.10 ).
carinyena ull de llebre syrah pinot noir monastrell merlot cabernet sauvignon garnatxa
0
1017 376 1208 290 1093 702 822 210 1152 661
vi
baia
1922 484 1932 1065 956 235

500 1000 1500 2000
antocians totals (mg/g baia o mg/l)
Grfica 3.4.10. Contingut dantocians totals en baia (mg/kg baia) i mxims assolits en les corresponents vinificacions (expressats en mg/l)
Syrah i monastrell van donar les majors extraccions en relaci al seu contingut inicial en pell. Cabernet va presentar una extracci mitjana alta i aconsegueix en el vi nivells fins i tot superiors a syrah i monastrell. En canvi, carinyena, garnatxa, ull de llebre i pinot noir donaven unes concentracions molt menors de les que sesperarien del seu nivell en els rams, la qual cosa fa que originin vins de poca coloraci. Tamb dna una baixa extracci merlot, per tot i aix, els continguts en el vi encara es poden considerar elevats. Lextracci dels antocians est fortament influda per la varietat (figura 3.4.9) i per la concentraci dantocians en la baia. Cabernet sauvignon, la varietat de major contingut antocinic, s qui permet una major extracci dels antocians, seguida de Syrah i Monastrell. Tanmateix, hi ha varietats delevat contingut en antocians, com merlot i ull de llebre, que
167
donen uns rendiments inferiors. Hi ha altres parmetres que determinen el grau dextracci, com s lestat dintegritat de les pells, factor que est molt relacionat amb el grau de maduresa del ram. Aix, per exemple, els resultats que originen Carinyena o ull de llebre, varietats considerades tradicionalment de molt color, indiquen una mala adaptaci daquestes varietats al clima de la zona, que es tradueix en una maduresa insuficient que dificulta el procs maceratiu. En el cas de Merlot, altres estudis en altres anys no mostren la baixa extractabilitat que obtenim en el nostre experiment.
Altres treballs sobre maduraci fenlica en el ram que es realitzen en la Facultat dEnologia231, indiquen una extractabilitat potencial en la pell de la baia diferent segons les varietats, i agrupen les varietats de ms a menys extractabilitat en: a) syrah, cabernet i merlot; b) ull de llebre c) garnatxa i carinyena.
Resulta conflictiva la comparaci dels continguts dantocians en les maceracions del nostre treball amb les daltres autors, a causa de la variabilitat de procediments enolgics emprats, aix com de la manca dinformaci sobre els continguts inicials en els rams. Per cabernet sauvignon, Pardo i Castro258 obtenen uns valors mxims en la maceraci de 800 mg/l, similars als nostres o als de Cabezudo et al.260, i superiors als valors de 400 mg/l obtinguts per Scudamore-Smith et al244 o als 300 mg/l que obtenen Chicn et al266 Pardo i Castro258 tamb realitzen lexperincia de maceraci amb les varietats Merlot i Ull de llebre, i obtenen en ambds casos unes concentracions dantocians totals ms elevades que les nostres. Conv dir que el procs dextracci s diferent, ja que treballen amb dipsits de 50 000 litres amb remontatges peridics cada 15 minuts, cosa que explica la major extracci que obtenen, ja que en general, les macrovinificacions condueixen a majors concentracions que les microvinificacions244 . Tamb obtenen valors ms elevats dantocians en ull de llebre Cabezudo et al.260 en la regi de Castilla la Mancha, que confirmen les nostres hiptesis duna ineficient maduraci daquesta varietat en el nostre mesoclima, tot i que els valors obtinguts per Mayen et al246 sn encara ms baixos, sobre els 250 mg/l. El treball de Cabezudo260 tamb posa de manifest lelevat contingut antocinic en vins de Syrah, per sobre dels 800 mg/l.
260
Cabezudo, MD; Vicario, A. (2004). Principales compuestos fenlicos de los vinos tintos de zonas clidas: Cabernet Sauvignon, Cencibel/Tempranillo y Shiraz. Tecnologa del vino, 15: 73-78
168
c) Extractabilitat segons la natura qumica Els antocianidin-glucsids no acilats sn els principals pigments presents en el vi en tots els casos, mentre que la presncia en el vi final dels antocians acilats amb lcid pcumric s menor de la que presenten en la pell de la baia, i per tant, semblen ser menys extractables. En canvi, les quantitats dantocians acetilats es corresponen fora ms amb les que ja es trobaven al ram. Aquestes diferncies es recullen en la grfica 3.4.11.
antocians no acilats 1400
antocians (mg/l o mg/kg baia)
1200
1000
800
600
400
200
garnatxa
antocians acetilats
cabernet
merlot
monastrell
no acilats, baia
ull de llebre no acilats, vi

500
syrah
carinyena pinot noir

antocians p-cumarilats
500
400
400
300
300
200
200
100
100
garnatxa
cabernet merlot monastrell syrah acetilats, baia acetilats, vi
ull de llebre
carinyena
garnatxa
cabernet merlot monastrell syrah ull de llebre p-cumarilats, baia p-cumarilats, vi
carinyena
Grfica 3.4.11. Comparaci entre els nivells dantocians en baia i en vi
Sobserva que els nivells dextracci dels antocians p-cumarilats s quantitativament la menor de totes les famlies dantocians i en canvi, els dels derivats acetilats sn els majors. Tanmateix, en els valors finals en vi, en tractar-se de varietats en qu els nivells dantocians acetilats sn baixos, segueixen sent els antocians no acilats els majoritaris. Aix tamb explica que les varietats amb elevat contingut dantocians acetilats, com cabernet sauvignon
169
o syrah, presentin valors ms elevats dantocians totals en el vi que altres varietats en qu hi ha major contingut dels antocians p-cumarilats, com ull de llebre i carinyena. Merlot tamb t uns alts continguts dantocians acetilats, lextracci dels quals es correspon amb les observacions anotades; no obstant aix, lextracci dels antocians sense acilar resulta escassa, motiu pel qual els seus nivells finals en antocians esdevenen sensiblement inferiors als esperables. Aquests resultats concorden amb els dels treballs realitzats per LaNotte et al.246, en qu lextractabilitat dels derivats p-cumarilats s significativament molt ms baixa per totes les varietats vinferes estudiades. Aquest s un resultat que es manifesta tamb en els vins finals, com demostren els treballs dArozarena et al.261, en qu els derivats p-cumarilats passen a ser minoritaris, tant en varietats en qu hi ha alts nivells dacetilaci (cabernet, merlot); com fins i tot en varietats en qu estan presents com a derivats acilats majoritaris (graciano, tempranillo, garnatxa o carinyena), o els treballs de Revilla et al262, que obt resultats similars als de la present tesi per a vins de cabernet sauvignon i ull de llebre. De fet, Marx et al.263 arriben a proposar la relaci derivats acetilats / derivats p-cumarilats com a una caracterstica que permet diferenciar vins de cabernet sauvignon de vins hbrids, tot i que Burns et al. 264 demostren que tal mesura pot conduir a falsos positius. Els resultats de baixa extractabilitat dels antocians cumarilats per a totes les varietats tamb coincideixen amb els de treballs de Leone et al265. Tanmateix, en treballs de Chicn et al266 o de Roggero et al.267 els vins obtinguts contenen nivells superiors dantocians pcumarilats. En el treball de Chicn et al.266 els vins sobtenen mitjanant la tcnica del bazuqueig, i sembla que les extractabilitats poden variar mpliament segons el mtode de maceraci, com recull Mazza268. Aquest aspecte resulta especialment interessant per les caracterstiques de major estabilitat i intensitat del color proporcionada pels antocians pcumarilats 269.
261
Arozarena, I; Casp, A; Marn, R; Navarro, M. (2000). Differentiation of some Spanish wines according to variety and region based on their anthocyanin composition. Eur Food Res Technol 212: 108-112 262 Revilla, E; Garca-Beneytez, E; Cabello, F; Martn-Ortega, G; Ryan, JM. (2001). Value of high-performance liquid chromatographic analysis of anthocyanins in the differentiation of red grape cultivars and red wines made from them; J Chromatography A; 915: 53-60 263 Marx, R; Holbach, B; Ottender, H. (2000). Determination of nine characteristic anthocyanins in wine by HPLC. Off Int. Vigne 2000 264 Burns, J; Mullen, W; Landrault, N; Teissedre, PL; Lean, MEJ; Crozier, A. (2002). Variations in the profile and content of anthocyanins in wines made from Cabernet Sauvignon and hybrid grapes; J Agric Food Chem 50, 4096-4102 265 Leone, AM; La Notte, E; Gambacorta, G. (1984). Gli antociani nelle fasi di macerazione e di elaborazione del vino. Linfluenza della tecnica diffusiva sulla loro estrazione. Vignevini, 4, 17 266 Chicn, RM; Snchez-Palomo, E; Cabezudo, MD. (2002). El color y la composicin en polifenoles de los vinos tintos varietales de Castilla-La Mancha (Espaa); Afinidad , 500: 435-443 267 Roggero, JP; Archier, P; Coen, S. (1992). tude par HPLC des compositions phnolique et anthocyanique dun mot de raisin en fermentation; Sciences des Aliments, 12: 37-46 268 Mazza, G. (1995). Anthocyanins in grapes and grape product. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 35(4):341-371 269 Mazza, G; Miniati, E. (1993). Grapes. A Anthocyanins in fruits, vegetables and grains; CRC Press
170
Entre els antocians no acilats, la malvidina s el predominant al llarg del periode estudiat, durant el qual els seus valors superen en la majoria de casos (Carinyena, Syrah, Ull de llebre, Garnatxa, Merlot) el 80% dels antocians totals. Per a Cabernet sauvignon i Pinot noir, tamb es troben valors elevats de Delfinidina, mentre que en monastrell tamb destaca la petunidina. En canvi, els nivells de cianidina sn baixos per a totes les varietats, bviament per la baixa concentraci existent en el ram daquest antoci. Els nivells elevats de malvidina en la fermentaci tamb estan mpliament descrits en la bibliografia, en els treballs de LaNotte238, Arfelli 248 , Chicn266, Roggero267, Cheynier et al.270, o Sims et al.243.
3. 5. CONCLUSIONS 1) Lextracci dels antocians en el vi ve condicionada per la seva estructura qumica, de manera que, en comparaci als nivells en la baia, els derivats p-cumarilats sn els que sextreuen en menor extensi, mentre que els derivats acetilats sn els que originen millors recuperacions. Els antocians no acilats tindrien una resposta intermitja, per en presentar uns nivells molt ms alts en baia que els derivats acetilats, mantenen uns nivells superiors en els vins. De la mateixa manera, els nivells de malvidina-3-glucsid resulten superiors als de les altres antocianidines. 2) Aquesta diferent extracci segons la composici antocinica provoca un comportament varietal diferent front la maceraci segons el contingut i la composici en antocians de les varietats. Aix doncs, varietats amb altes concentracions dantocians pcumarilats en baia donen maceracions ms pobres en antocians. 3) En algunes varietats com merlot, ull de llebre o carinyena, la composici i concentraci antocinica no justifiquen els resultats obtinguts en vi, observaci que significa que hi incideixen altres factors.
270
Cheynier, V.; Arellano, H; Souquet, JM; Moutounet, M. (1997). Estimation of the oxidative changes in phenolic compounds of carignane during winemaking. Am J Enol Vitic , 48(2): 225- 228
171

1. 2.
Peynaud. (1984). Knowing and making wine. John Wiley & Sons, New York Zoecklein,B. (1991). An overview of maceration during red winemaking. Aust & NZ Wine Ind J., 6: 265-267 3. Mateos, S., Valls, J., Nadal M.; Arola, L. (2001) Estudio de la madurez fenlica sobre diferentes variedades tintas y su relacin con el color de los vinos. Tecnologa del vino, n 2, Sept-Oct, pp 45-50 4. Parley, A. (1997).Voodoo and the art of winemaking. Part II. Technology of red wine vinification. Lincoln University. 5. Parley, A. (1997). The effect of pre-fermentation enzyme maceration on extraction and colour stability in pinot noir wine; Tesi Doctoral. Lincoln University. 6. Mattivi, F.;Prast, A.;Nicolini, G.;Valenti, L. (2002).Validation of a new method to measure the polyphenolic potential of red grapes and discussion of its use in enology; Rivista di Viticoltura e di Enologia; 55 (2-3) 55-74 7. Di Stefano, R.; Borsa, D.; Gentilini, N. (1994). Estrazione degli antociani dalle bucce dell'uva durante la fermentazione. Annali dell'Istituto Sperimentale per l'Enologia Asti; 25 (1) 31-46;It, 8. Dell'Oro V;Di Stefano R. (1991). Carbonic maceration. Evolution of vanillic and syringic acids and anthocyanins during conservation of Barbera and Nebbiolo grapes in carbon dioxide. Vini d'Italia, 33 (4) 53-62 9. Vivas de Gaulejac, N.;Nonier, M. F.;Guerra, C.;Vivas, N. (2001). Anthocyanin in grape skins during maturation of *Vitis vinifera* L. cv. Cabernet Sauvignon and Merlot noir from Bordeaux terroirs. Journal International des Sciences de la Vigne et du Vin; 35 (3) 149-156 10. La Notte E;Liuzzi VA;Esti M. (1992). The polyphenolic wine components. 2. Note: Anthocyanins content and composition in relation to different winemaking techniques. Vignevini; 19 (10) 49-55;1992 11. Rizzon, L.A. (1985). Incidence de la macration sur la composition chimique des vins. Tesi Doctoral. Bordeaux II. 12. Souquet, JM; Cheynier, V; Brossaud, F; Moutounet, M. (1996). Polymeric proanthocyanidins from grape skins. Phytochemistry, vol 43, n2: 509-512 13. Karuamanchir, A; Tsang, E; Goldberg, DM; Diamnandis, EP; Soleas, GJ; Catechin and epicatechin concentrations of red wines from 15 different regions; (1996). Am. J. Enol. Vitic. 47: 357 14. Vivas N;Galvin C;Chabot PH. (2001). Maceration techniques in the production of red quality wines. Progres Agricole et Viticole, 109 79-88 15. Sims, CA;M Bates, RP. (1990). Effects of skin fermentation time on the phenols, ellagic acid sediment and sensory characteristics of a red Vitis rotundifolia wine. Am. J. Enol. Vitic. 45: 56-63 16. Scudamore-Smith, PD; Hooper, RL; McLaren, ED. (1990). Colour and phenolic changes of Cabernet sauvignon wine made by simultaneous yeast/bacterial fermentation and extended pomace contact. Am.J. Enol. Vitic. 41: 57-67
172
17.
Auw, JM; Blanco, V; OKeefe, SF; Sims, CA. (1996). Effect of processing on the phenolics and colour of Cabernet sauvignon, Chambourcin and Noble wines and juices; Am.J.Enol.Vitic. 47: 279-286 18. Mayen, E; Mrida, J; Medina, M. (1994). Free anthocyanins and polymeric pigments during the fermentation and postfermentation standing of musts from Cabernet Sauvignon and Tempranillo grapes. Am. J. Enol. Vitic., vol 45, 161-166 19. Zamora, F. (1998). Los compuestos fenlicos del vino tinto y su capacidad para la crianza; Jornada Tcnica sobre Aspectos cientficos del color del vino. URV 20. Arfelli G;Chiavari G;Castellari M;Amati A. (1992). The influence of wine making on polyphenolic compounds content in wines obtained from grapes of different cultivars. 2. Anthocyanins. Vignevini, 19 (9) 49-55 21. Couasnon, M. (1999). Une nouvelle technique: La macration pr-fermentaire froid Extraction la nige carbonique. 1ere partie: Rsultats oenologiques. Rev. Oenol. Tech. Vitivinic. Oenol. 92, 26-30 22. Baraut, C; Joulain, H; Landron, C. Comment vinifier les vins de garde?, Viti, 222, 4647 23. Zamora, F. (2002). Extraccin y estabilizacin de la materia colorante en la vinificacin en tinto; a Maceracin y Extraccin de color. Gonierno de la Rioja. Consejera de Agricultura, Ganadera y Desarrollo Rural. 2002. 24. Merida, J; Moyano, L; Millan, C; Medina, M. (1991). Extraction of phenolic compounds in controlled macerations of Pedro Ximenez grapes; Vitis 30: 117-127 25. Meier W;Steidl R;Eder R;Wendelin S. (1990). Der Einfluss verschiedener Verarbeitungsmethoden auf die Anthocyanzusammensetzung von Rotweinen. Mitteilungen Klosterneuburg, Rebe und Wein, Obstbau und Fruechteverwertung; 40 : 241-2491 26. Anon, F. (1995).Flash expansion. A technology under development. Revue des Oenologues et des Techniques Vitivinicoles et oenologiques 77: 18-20 27. Lovino, R; Di Benedetto, G; Scazzarriello, G (1997). Limpiego di enzimi pectolitici . nella vinificazione in rosso di uve dellItalia meridionale. LEnotecnico, 33:75-86 28. Martnez, J; Lpez, R; Santamara, P; Barua, M; Gutirrez, AR. (2002).Experiencias sobre maceracin en vinos de tempranillo, a Maceracin y extraccin de color. Consejera de Agricultura, Ganadera y Desarrollo Rural. Gobierno de La Rioja. 2002. 29. Singleton, VL; Trousdale, EK. (1992). Anthocyanin-tannin interactions explaining differences in polymeric phenols between white and red wines. Am J Enol Vitic, 43: 63-70 30. Pardo, R; Castro, JJ. (2003). Estudio de la extraccin de compuestos fenlicos de variedades tintas durante la vinificacin en la DO Peneds; Viticultura/Enologa Profesional, n87, 37-42 31. Vasserot, Y; Caillet, S; Maujean, A. (1997). Study of anthocyanin adsorption by yeast lees. Effect of some physicochemical parameters. Am J Enol & Vitic, 48: 433-437 32. Cabezudo, MD; Vicario, A. (2004). Principales compuestos fenlicos de los vinos tintos de zonas clidas: Cabernet Sauvignon, Cencibel/Tempranillo y Shiraz. Tecnologa del vino, 15: 73-78 33. Arozarena, I; Casp, A; Marn, R; Navarro, M. (2000). Differentiation of some Spanish wines according to variety and region based on their anthocyanin composition. Eur Food Res Technol 212: 108-112 34. Revilla, E; Garca-Beneytez, E; Cabello, F; Martn-Ortega, G; Ryan, JM. (2001). Value of high-performance liquid chromatographic analysis of anthocyanins in the
173
differentiation of red grape cultivars and red wines made from them; J Chromatography A; 915: 53-60 35. Marx, R; Holbach, B; Ottender, H. (2000). Determination of nine characteristic anthocyanins in wine by HPLC. Off Int. Vigne 2000 36. Burns, J; Mullen, W; Landrault, N; Teissedre, PL; Lean, MEJ; Crozier, A. (2002). Variations in the profile and content of anthocyanins in wines made from Cabernet Sauvignon and hybrid grapes; J Agric Food Chem 50, 4096-4102 37. Leone, AM; La Notte, E; Gambacorta, G. (1984). Gli antociani nelle fasi di macerazione e di elaborazione del vino. Linfluenza della tecnica diffusiva sulla loro estrazione. Vignevini, 4, 17 38. Chicn, RM; Snchez-Palomo, E; Cabezudo, MD. (2002). El color y la composicin en polifenoles de los vinos tintos varietales de Castilla-La Mancha (Espaa); Afinidad , 500: 435443 39. Roggero, JP; Archier, P; Coen, S. (1992). tude par HPLC des compositions phnolique et anthocyanique dun mot de raisin en fermentation; Sciences des Aliments, 12: 37-46 40. Mazza, G. (1995). Anthocyanins in grapes and grape product. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 35(4):341-371 41. Mazza, G; Miniati, E. (1993). Grapes. A Anthocyanins in fruits, vegetables and grains; CRC Press 42. Cheynier, V.; Arellano, H; Souquet, JM; Moutounet, M. (1997). Estimation of the oxidative changes in phenolic compounds of carignane during winemaking. Am J Enol Vitic, 48(2): 225- 228
174
Captol 4. Efectes de la composici fenlica i la seva evoluci sobre el color del vi
4.1) INTRODUCCI A causa de la natura de la qumica dels antocians, no es correlaciona sempre de manera directa el color dun vi amb el seu contingut antocinic 271. Cal tenir en compte que, mentre que en les cllules de la pell els antocians es troben de forma localitzada en compartiments cellulars com els antocianoplasts, el vi s una matriu molt ms complexa amb presncia de gran quantitat de molcules que poden interaccionar amb les molcules dantocians i causar fenmens dalteraci de color, o fins i tot conduir a la formaci de productes nous de major estabilitat. Entre els factors que determinen la manifestaci del color per part dels antocians, cal destacar el pH, el SO2, la copigmentaci i la polimeritzaci.
4.1.1) Efecte del pH

Cati flavili (vermell)
En solucions aquoses lleugerament cides, els antocians existeixen en 4 formes en equilibri qumic (figura 4.1.1): el cati flavili Base quinoidal (blau) (vermell), lanhidrobase quinonoidal (blava), la pseudobase carbinol (incolora) i la calcona (incolora o lleugerament groga)272. A pH per sota de 2.0, els antocians Pseudo-base carbinol (incolora) Calcona (groc) es troben bsicament en la forma Figura 4.1.1. Equilibri dels antocians en funci del pH catinica. A mesura que augmenta el pH, t lloc una rpida desprotonaci que condueix a la forma quinonoidal. En medi aqus, la hidrataci del cati flavili origina la forma hemiacetlica, que es troba en equilibri amb la calcona, encara que aquesta transformaci a calcona s molt lenta. Aquest equilibri
R R OH R OH R O O +H+ HO O
+
OGl
OGl
OH
OH
+ H2O
OH
OH R
OH
HO
OH
HO
OGl
OGl
OH
OH
271
Sommers, TC; Evans. (1977). Spectral evaluation of young red wines: Anthocyanin equilibria, total phenolics, free and molecular SO2, and chemical age; J Sci Food Agric 28:279-287 272 Houbiers, C; Lima, J; Maanita, A; Santos, H. (1998). Color stabilization of malvidin-3-glucoside: self-aggregation of the flavylium cation and copigmentation with the Z-chalcone form; J Phys Chem B, 102, 3578-3585
177
dhidrataci depn de lestructura de lantoci, de manera que en els antocians-3,5diglucsids s ms rpid que en els corresponents 3-monoglucsids.273 En el rang de pH dels vins, la forma predominant s lhemiacetlica, i noms un 20% dels antocians es trobaria en la seva forma colorejada vermella. 4.1.2) Efecte del sulfurs El dixid de sofre, que saddiciona en els vins en forma de metabisulfit per les seves propietats antioxidants i antimicrobianes, es lliga als antocians per generar una forma incolora, en una reacci dequilibri.
4.1.3) Fenmens de copigmentaci Lefecte copigmentatiu es postula com el responsable de la intensitat de color dels vins joves, en qu encara no hi ha hagut temps perqu es puguin donar reaccions de polimeritzaci. Es coneix amb el terme copigmentaci el fenomen pel qual es formen associacions moleculars o complexos entre pigments i molcules no colorejades, i que provoca un efecte hipercrmic dincrement de labsorbncia i, en alguns casos, un canvi en la mx del pigment (desplaament batocrmic o hipsocrmic).274 Mitjanant la utilitzaci de les tcniques de dicromisme circular i de RMN-H1 sha proposat la ra molecular daquests desplaaments: el copigment i el cati flavilium de lantoci formen un apilament que sestableix per interaccions hidrofbiques, en qu els orbitals dels anells, rics en Figura 4.1.2. Apilament entre anells aromtics electrons, es solapen i es mantenen junts per forces que origina lefecte copigmentatiu electrosttiques. Aquestes interaccions - dels orbitals implicats en lapilament sn similars a les que es troben en els nuclesids. L estabilitzaci del i flavilium s el que provoca lefecte hipercrmic (figura 4.1.2). Per altra banda, els residus glicosdics que queden fora del complex prevenen de la hidrataci del C2 del i flavilium, que dna la forma incolora hemiacetlica. Per tant, laigua es distribueix al voltant daquest nucli inaccessible, formant una capa en qu augmenten els
O
+
273
Heredia, FJ; Francia-Aricha, EM; Rivas-Gonzalo, JC; Vicario, IM; Santos-Buelga, C. (1998). Cromatic characterization of anthocyanins from red grapes I.pH effect; Food Chemistry , vol 63,n4, 491-498 274 Boulton, R. (2001).The Copigmentation of Anthocyanins and Its Role in the Color of Red Wine: A Critical Review, Am. J. Enol. Vitic . 52 (2): 67-87
178
ponts dhidrogen entre les molcules daigua, cosa que fa que globalment lenergia lliure disminueixi. Els tipus de molcules que actuen de forma usual en la copigmentaci dels antocians del ram inclouen els flavanols, els flavonols, els cids fenlics, altres polifenols, alcaloides o aminocids. Per a ms, tamb shan descrit interaccions entre els antocians i altres compostos orgnics (lctic, galacturnic, pectines, cel.lulosa, etc) 275. Un cas especial de copigmentaci seria la auto-associaci dantocians, que vindria promoguda pels grups aromtics, carbonil i els sucres que tenen presents els antocians. La magnitud de lefecte de copigmentaci depn primordialment de la natura i quantitat de lantoci i de la molcula de copigment, del pH, de la temperatura i de la composici de la matriu aquosa.276
4.1.3.1) Efectes de la concentraci

Una alta concentraci dantocians provoca un increment de labsorbncia i del desplaament batocrmic. No obstant aix, la magnitud de lincrement s depenent, per a un antoci donat, de la relaci molar entre el pigment i el copigment, de tal manera que a major quantitat de copigment, major s lefecte.274
4.1.3.2) Efectes estructurals

Lefecte de copigmentaci augmenta amb el grau de metoxilaci i glicosilaci dels antocians. Aix significa que es manifesta ms amb la malvidina que amb les altres antocianidines de Vitis vinifera. Per altra banda, lacilaci en els antocians pot provocar un efecte positiu de copigmentaci intramolecular. En casos en qu lagent acilant s un cid hidroxicinnmic (com s l`cid p-cumric, present com hem vist en el captol 1 en diverses varietats dantocians), aquest pot rotar amb el residu glucosil que el suporta per tal de situar-se sobre lanell de lantoci i formar aix un copigment estable.277 Aix significaria que vins amb major proporci daquests antocians donarien majors intensitats cromtiques.
275
Mazzarazcchio, P; Pifferi, P; Kindt, M; Munyaneza, A, Barbiroli, G. (2004). Interactions between anthocyanins and organic food molecules in model systems; Int. J. Food Sci. And Techn., 39, 53-59 276 Mazza, G., and Brouillard, R. (1990). The mechanism of co-pigmentation of anthocyanins in aqueous solutions. Phytochem. 29:1097-1102. 277 George, F; Figuereido, P; Toki, K; Tatsuzawa, F; Saito, N; Brouillard, R. (2001). Influence of trans-cis isomeration of coumaric acid substituents on colour variance and stabilisation in anthocyanins, Phytochemistry 57: 791-795
179
Lestequiometria del complex format entre la molcula de copigment i lantoci varia segons els casos; aix, per exemple, en el cas de lcid cafeic interaccionarien 2 molcules per cada molcula dantoci. Igualment, la fora de lassociaci del complex tamb depn de quines siguin les molcules implicades.
Lefecte del pH sobre la copigmentaci est molt relacionat amb lefecte del pH sobre lequilibri dels antocians. Per sota de pH 1, com que tots els antocians es troben en forma de i flavilium, lefecte de copigmentaci no produeix cap increment dabsorbncia. El pH ptim per lefecte de copigmentaci s entre 3-5 (que s on subicarien els vins negres). En aquest cas, noms el 20% dels antocians es trobarien en la forma flavilium, mentre que la fracci majoritria es trobaria en la forma hemiacetlica, en qu sha hidratat la molcula. En aquestes condicions, s que es produeix lefecte copigmentatiu, lacci de lapilament impedeix la hidrataci de lantoci i, en conseqncia, evita la seva prdua de color vermell. Aquest fet fa que shipotetitzi que la copigmentaci funciona perqu retarda la hidrataci i estabilitza el i flavili, responsable del color, dintre del complex.
4.1.3.3) Efecte del pH
4.1.3.4) Efectes del solvent

Com que la copigmentaci depn de lestabliment de les interaccions hidrofbiques que estabilitzen el complex format, a mesura que disminueix la concentraci daigua disminuiria la magnitud de lefecte. Aquest s lefecte que es produeix a mesura que en la fermentaci es genera etanol.278
4.1.3.5) Efectes de la Temperatura

Els copigments sn exotrmics i especialment sensibles a la temperatura. A mesura que la temperatura de la soluci aquosa sapropa al punt debullici, el color de la soluci saproxima ms al dels antocians sols. Molecularment, lexplicaci s clara: lestructura de la matriu aquosa que envolta el complex i lestabilitza per interaccions hidrofbiques es destrueix i, per tant, provoca la ruptura de lestructura del copigment, que llavors pot hidratar-se i passa a la forma hemiacetlica incolora.
278
Somers, T.C., and Evans, M.E. (1979). Grape pigment phenomena: Interpretation of major colour losses during vinification. J. Sci. Fd. Agric . 30:623-633.
180
4.1.4) Reaccions de condensaci Segons molts investigadors, la copigmentaci dels antocians seria el primer pas cap a la formaci de pigments ms estables.279, 280 En un medi aqus com s el vi, els antocians senzills que es troben a la pell del ram no haurien de romandre estables durant massa temps. De fet, els antocians presents en el ram es poden considerar estructuralment dels ms simples que es troben en el regne vegetal: en les flors, per exemple, es caracteritzen per ser estructures qumicament sofisticades que estabilitzen el color.281 No obstant aix, en el vi s'estabilitza el color grcies a l'evoluci dels antocians cap a la formaci de nous cromfors qumics. Perqu un vi jove mantingui el seu color al llarg dels anys, els seus antocians s'han de combinar amb els tanins per generar pigments vnics que no es troben al ram, encara que els seus precursors provinguin de les pells i els pinyols o dels llevats. Aix, al llarg de l'envelliment el contingut polifenlic del vi esdev progressivament ms complex, la qual cosa afecta directament les seves propietats cromtiques 282. Noms petites quantitats dels antocians extrets de les pells durant la fermentaci es detecten en vins envellits, encara que el color del vi es mant. Aix s perqu, juntament amb els antocians, dos tipus de pigments contribueixen al color dels vins negres. En primer lloc, els pigments polimrics, un grup molt heterogeni de biomacromolcules formades per la condensaci dels antocians amb tannins. En segon lloc, els piranoantocians, que resulten de laddici nuclefila de vinilfenols o carbonils (com enols) als antocians seguits de reaccions de ciclaci i oxidaci.283 Les reaccions de condensaci es posen en evidncia per la desaparici dels antocians lliures, que sn progressivament reemplaats pels compostos polimrics formats. Shan establert diversos mecanismes (figura 4.1.3) que condueixen a aquests nous pigments de condensaci, lestructura dels quals roman en molts casos hipottica 284 :
279
Liao H., Cai Y., Haslam E., (1992). Polyphenol interactions. Anthocyanins : copigmentation and color changes in red wines. J. Sci. Food Agric ., 59, 299305. 280 Brouillard, R; Dangles, O. (1994). Anthocyanin molecular interactions: the first step in the formation of new pigments during wine aging?. Food Chem, 51, 265-270 281 Brouillard, R; Chassaing, S; Fougerousse, A. (2003). "Why are grape/fresh wine anthocyanins so simple and why is it that red wine color lasts so long?" Phytochemistry 64: 1179 118 282 I. Revilla, I; Perez-Magarino, S; Gonzalez-SanJose, ML; Beltran, S. (1999)." Identification of anthocyanin derivatives in grape skin extracts and red wines by liquid chromatography with diode array and mass spectrometric detection" . Journal of Chromatography A, 847: 8390 283 Hakansson, A; Pardon, K; Hayasaka, Y; Sa, M; Herderich, M. (2003). Structures and colour propierties of new red wine pigments. Tetrahedron Leters 44 :4887-4891 284 Remy, S; Fulcrand, H; Labarbe, B; Cheynier, V; Moutounet,M. (2000). "First confirmation in red wine of products resulting from direct anthocyanintannin reactions". J Sci Food Agric 80:745-751
181
OH OH HO O
OH OH R2 OH HO O
+
CONDENSACI DIRECTA
flavanol
R2 OH HO O
+
R1 OGl
R3 HO
OH
OH
R1 OGl
CONDENSACI MITJANADA PER ACETALDEHID

acetaldehid + flavanol
HO R2
O H3 C HO H
R2 OH
+
OH
OH R2
R1 OGl
FORMACI DE PIRANOANTOCIANS
pirvic, o vinilfenols
OH HO O
+
OH Polmers (violacis)
R1 OGl
O R3 PIRANOANTOCIANS O VITISINES(ataronjats)
Figura 4.1.3. Esquema resum de les principals reaccions de condensaci descrites
4.1.4.1) Condensaci directa entre antocians i flavanols En un principi, es suposava que els nous pigments que conduen a levoluci del color durant la maduraci del vi eren els combinats dels antocians i els flavan-3-ols. Hi ha 2 mecanismes dacci postulats. 1) Addici de tipus A-T (figura 4.1.4). En aquest cas, lantoci jugaria un paper delectrfil, mentre que el tan faria de nuclefil. El mecanisme de formaci postulat s similar al de la formaci de les sals de xantili d associaci de flavanols: els antocians poden reaccionar de manera directa amb els flavan-3-ols i formar polmers de colors ms grogosos en presncia dacetaldehid o dcid glioxlic. El mecanisme que seguirien seria la uni del C4 de lanell flavili de lantoci amb el C8 de la catequina, que generaria un producte incolor285. Aquest, quan s deshidratat i oxidat, genera el i xantili, de coloraci grogosa. Aquests cromfors tamb poden donar-se entre 2 molcules de flavanol, i serien
182
els responsables de labsorbncia dels vins en la regi de 400-500 nm.286, 287 Per altra banda, ladducte pot no evolucionar cap a la formaci duna sal de xantil.li, sin com a un compost bicclic.
sal de xantil.li
HO O
+
R2 OH
R1 OGl
R2
OH
antoci
HO O
+
R2 OH HO O OH
O OH OH OH
R1 OGl
R1 OGl
OH
OH
O H O OH
HO O
R2 OH
OH HO O OH
HO
OH OH
OGl OH
R1
OH OH
OH O OH OH
flavanol
OH
Figura 4.1.4. Esquema de la reaccide condensaci directa entre antoci i flavanol
bicicle
2. Addici de tipus T-A (figura 4.1.5): En aquest cas, lantoci actua de nuclefil i s susceptible a latac de compostos electrfils com carbocations resultants de la ruptura de les proantocianidines.
OH HO O OH OH OH HO O OH OH OH R2 R2 OH O
+
OH
flavanol antoci
HO O
+
OH R1
HO
R1 OGl
OH OGl OH
Fig 4.1.5. Esquema de la reacci de condensaci entre flavanol i antoci

285
Remy-Tanneau,S; Le Guernev, C; Meudec, E; Cheynier, V. (2003). Characterization of a colorless anthocyanin-flavan-3-ol dimer containing both carbobcarbon and ether interflavonoid linkages by NMR and Mass Spectometry. J. Agric. Food Chem. 51: 3592-3597 286 Es-Safi, N; Le Guernev, C; Labarbe, B; Fulcrand, H; Cheynier, V; Moutounet, M; Structure of a new Xanthylium salt derivative. (1999).Tetrahedron Letters 40: 5869-5872
183
4.1.4.2) Condensacions mitjanades per acetaldehid L'acetaldehid es troba de forma natural en els vins, com a producte del metabolisme dels llevats durant la fermentaci o com a producte d'oxidaci de l'etanol. Pel que fa al primer cas, els nivells d'acetaldehid produts varien segons l'espcie i soca de llevat, aix com de les condicions de temperatura, oxigen i SO2. L'anaerobiosi, un baix pH, una alta concentraci de sucres, la presncia de SO2, i les baixes temperatures semblen induir la formaci d'acetaldehid per part dels llevats. 288 De fet, no noms els llevats poden originar l'acetaldehid, sin que aquest tamb pot ser subproducte del metabolisme de les bactries actiques i lctiques. Per altra banda, l'acetaldehid tamb es pot generar en el vi a partir d'una oxidaci de l'etanol, en una reacci acoblada a l'oxidaci de certs compostos fenlics. De fet, prctiques enolgiques com la microoxigenaci, consistent a laportaci de petites quantitats doxigen de manera continuada al vi, nafavoreixen la formaci.
Lacetaldehid participa en reaccions de condensaci que condueixen a la formaci de compostos (figura 4.1.6) en qu sestableixen lligams metil-metin ( CH3-CH<), tamb coneguts com a compostos lligats per etil, i que sn prominents en els primers mesos del vi.289 En presncia dacetaldehid, els flavanols OH condensen amb els antocians mitjanant ponts etil HO que sestableixen entre les posicions nucleofliques O-CH OH O OH dels seus anells floroglucinol. Com a resultat, es H C-CH HO HO O formen pigments flavanol-etil-antoci, de tonalitat O-CH OH ms violcia que els antocians originals. Aquestes O-Glucosa OH substncies soriginarien primer com a dmers, per Figura 4.1.6. Estructura dels compostos finalment formar polmers que poden precipitar si lligats per etil assoleixen una massa molecular crtica. En el mecanisme daquesta reacci, es forma primer un adducte entre la catequina i lacetaldehid en forma catinica (la qual cosa implica que hi ha un efecte del pH), per desprs reaccionar
3 3 + 3 287
Es-Safi, N; Le Guernev, C; Fulcrand, H; Cheynier, V; Moutounet, M. (2000). Xanthylium salts formation involved in wine colour changes. Int. J. Food Science and Technology, 35: 63-74 288 Liu, S-Q; Pilone, G.J. (2000). "An overview of formation and roles of acetaldehyde in winemaking with emphasis on microbiological implications". Int. J. Food Sci. And Techn., 35: 49-61 289 Atanasova, A; Fulcrand, F; Le Guernev, C; Cheynier, V; Moutounet, M. (2002). Structure of a new dimeric acetaldehyde malvidin-3-glucoside condensation product. Tetrahedron letters 43: 6151-6153
184
amb lantoci; no obstant aix, la reacci de condensaci tamb pot tenir lloc com a autoassociaci de catequina, en un procs competitiu. 290 En aquests nous pigments, la part antocinica presenta una major resistncia a la decoloraci per SO2 i una major preferncia a la formaci de la base quinona (de coloraci blava) en lloc de lhemiacetal (incolor). Aix es posa de manifest en avaluar lefecte del pH sobre el pigment: en augmentar a pH=5.5, la soluci de pigment esdev progressivament ms violeta, mentre que la de lantoci s incolora ja a pH=4.0. Tot i aix, lestabilitat dels dmers s menor que la de lantoci, ja que el pont es pot trencar (en una reacci afavorida en medis cids). Malgrat aix, el vi mantindria el color, ja que el trencament recupera lantoci, per s probable que combinacions amb major grau de polimeritzaci puguin ser ms estables. 291 De fet, en estudis similars amb epicatequina, shan arribat a allar productes trimrics i tetrmers, encara que en cap cas impliquen ms de dues molcules de lantoci, la qual cosa fa que es proposi un mecanisme dacci en qu lantoci s lespcie atacada pel carbocati flavanol-acetaldehid, per no pot actuar desprs com a agent atacant. 292 Similars estudis de condensaci shan dut a terme amb la proantocianidina B2293. A ms de lacetaldehid, altres aldehids presents en el vi han demostrat tenir tamb aquest efecte pont i generar per tant combinacions entre antocians i flavanols. En solucions model, sha comprovat que altres aldehids, com lisovaleraldehid, el benzaldehid, el formaldehid, el propionaldehid o lisobutiraldehid, presents en el vi (especialment en els vins dOporto), generen nous pigments que inclouen en la seva estructura la malvidina i epicatequina, epigalocatequina, o procianidines (B2, B4) 294 .
OH OGl
Aquestes reaccions de condensaci per aldehid es poden establir tamb entre molcules de flavanol, formant compostos incolors del tipus flavanol-etil-flavanol. Per altra banda, en estudis en solucions model, tamb shan detectat, mitjanant tcniques espectroscpiques, combinacions en
290
R1 HO R2
OH H O
+
R2 OH R1 OGl
H3C HO
OH
Figura 4.1.7. Estructura dels compostos lligats per etil en qu noms participen antocians
Rivas-Gonzalo,JC; Bravo-Haro, S; Santos-Buelga, C. (1995). Detection of compounds formed through the reaction of malvidin-3-monoglucoside and catechin in the presence of acetaldehyde. J.Agric.Food Chem, 43:1444-1449 291 Escribano-Bailn, T; lvarez-Garca, M; Rivas-Gonzalo, JC; Heredia, FJ; Santos-Buelga, C. (2001). Color and stability of pigments derived from the acetaldehyde-mediated condensation between malvidin-3-0-glucoside and (+)-catechin. J. Agric Food Chem, 49: 1213-1217 292 Es-Safi, N; Fulcrand, H; Cheynier, V; Moutounet, M;. (1999). Studies on the acetaldehyde-induced condensation of (-)-Epicatechin and Malvidin-3-OGlucoside in a model solution system. J. Agric. Food Chem, 47: 2096-2102 293 Dallas, C; Ricardo-da-Silva, JM; Laureano, O. (1996).Products fromed in wine solutions involving anthocyanins, procyanidin B2, and acetaldehyde" J. Agric. Food Chem. 44: 2402-2407 294 Pissarra, J; Loureno, S; Gonzlez-Params, A; Mateus, N; Santos-Buelga, C; de Freitas, V. (2003). Formation of new anthocyanin-alkyl/aryl-flavanol pigments in model solutions. Analytica Chimica Acta, en premsa
185
qu noms participen antocians (fig 4.1.7): en combinar la malvidina-3-glucsid amb lacetaldehid, es genera un nou pigment que presenta dos mxims dabsorbncia en el rang del visible, a 450 i 528 nm. Per altra banda, lanlisi de la fracci polimrica tamb dna senyal en ESI-MS del dmer i fins i tot de trmers daquesta estructura, resultats que confirmen la intervenci daquest mecanisme en la formaci de pigments polimrics que contribueixen a lestabilitat del vi.
4.1.4.3) Condensacions mitjanades per cid pirvic o cids vinilfenols: Formaci de Vitisines o piranoantocians Les vitisines (fig 4.1.8) sn pigments que es caracteritzen per la presncia dun anell pirnic addicional a lestructura de lantoci. Aquestes vitisines causen canvis en el color de la soluci: per una banda, aquests compostos resisteixen la decoloraci causada pel sulfurs, i expressen ms color que la corresponent malvidina. Per altra, causen un desplaament hipsocrmic cap a coloracions taronjamarronoses.
R2 OH
HO
R1 H O OH O O O OH OR R3
Figura 4.1.8. Estructura general de les vitisines
Al principi, es va observar que les vitisines es generen a partir de la reacci amb cid pirvic, que es cicla sobre lanell flavili de lantoci. Detectades inicialment en vins295, es va dilucidar el mecanisme de la seva formaci mitjanant ls de solucions model. Combinant la malvidina-3-glucsid i lcid pirvic, es va obtenir la vitisina A, i tamb es van generar les corresponents formes acilades (3acetilvitisina A i 3-p-cumarilvitisina A) a partir de la malvidina-3-glucsid acilada amb actic i p-cumric, respectivament 296 (fig 4.1.9). Totes tres formes shan pogut detectar posteriorment en vins 297. Lestructura , identificada mitjanant tcniques de FABMS i de RMN (1H i 13C) suggereix que correspondria a la malvidina-3-glucsid amb un CH=CCOOH addicional entre la posici 4 i lhidroxil en posici 5 de la molcula.
295
Cameira dos Santos, PJ; Brillouet, JM; Cheynier, V; Moutounet, M;. (1996). Detection and partial characterisation of new anthocyanin pigments in wine. J. Sci. Food Agric .70: 204-208 296 Romero, C; Bakker, J. (1999). Interactions between grape anthocyanins and pyruvic acid, with effect of pH and acid concentration on anthocyanin compsition and colour in model solutions. J.Agric. Food Chem., 47 (3130-3139)
186
OMe OH
+ +
OMe OH
OMe OH
+
HO
HO OM e HO O OH O OH OH O
HO OMe HO O O OH O C OCH 3 O OH
OMe HO O O Vitisina B OH OH OH
C OOH Vitisina A
COO H
3-acetilVitisina A
Figura 4.1.9. Estructura de vitisines
Tamb sha detectat en vins la vitisina B, que seria lestructura descarboxilada de la vitisina A, en qu el pont el forma CH=CH, i la corresponent acetilvitisina B. 298 No sha detectat encara la cumarilvitisina B, tot i que cal tenir en compte que la cumarilvitisina A tamb es va detectar ms tard que les altres vitisines A. De fet, la detecci s difcil, perqu el senyal que donen en els mtodes cromatogrfics clssics per a lanlisi dantocians s feble. Encara que sembli una contradicci, aix no significa que no tinguin importncia pel color del vi, ja que aquests cromatogrames sobtenen en condicions molt cides, en qu els antocians existeixen en la forma flavili, altament colorejada. Per al pH del vi, aquests antocians existirien en la forma hemiacetlica incolora. En canvi, el color de les vitisines est molt menys afectat per el pH, de manera que encara que la seva absortivitat molar sigui menor a pH cids, al pH del vi la seva coloraci s ms gran que la dels antocians. 299 A ms, tamb est descrit que les constants de velocitat de degradaci daquests adductes amb pirvic sn molt ms baixes que les que corresponen als respectius antocians300. Aix explica que hi hagi un important increment en el percentatge de vitisines entre un vi jove i el corresponent de criana, ja que la disminuci de les vitisines ser molt menor que la dels antocians procedents del ram. Per tot aix, encara que les seves concentracions siguin baixes, el seu efecte contribueix fortament al color dels vins envellits. 301 En solucions model sotmeses a un procs
297
Mateus, N; Silva, AMS; Vercauteren, J; de Freitas, V. (2001). Occurence of anthocyanin-derived pigments in red wines J. Agric. Food Chem. 49: 48364840 298 Bakker, J; Timberlake, CF. (1997). Isolation, identification, and characterization of new color-stable anthocyanins occuring in some red wines; J. Agric. Food Chem. 45: 35-43 299 Vivar-Quintana, AM; Santos-Buelga, C; Rivas-Gonzalo, JC. (2002). Anthocyanin-derived pigments and colour of red wines;. Analytica Chimica Acta 458: 147-155 300 Mateus, N; de Freitas, V. (2001).Evolution and stability of anthocyanin-derived pigments during Port wine aging. J. Agric. Food Chem . 49:5217-5222 301 Bakker,J; Bridle,P; Bellworthy, SJ; Garca-Viguera, C; Reader, HP; Watkins, SJ; Effects of sulfur dioxide and must extraction on color, phenolic composition and sensory quality of red table wine. (1998). J.Sci.Food Agric . 78, 297-307
187
denvelliment, la presncia de vitisina A generava uns vins molt ms vermellosos-ataronjats que els vins vermell-marronosos que sobtenien sense laddici de pirvic. 302 bviament, la seva formaci est afavorida per un increment en la quantitat dcid pirvic. Aquest cid s present en el vi com a producte dexcreci dels llevats, on actua com a intermediari de la via Embden-Meyerhof-Parnas, i la seva mxima concentraci t lloc aproximadament quan la meitat dels sucres han estat fermentats. La formaci de les vitisines s mxima a un pH al voltant de 2.7-3.0, i est afavorida per les baixes temperatures, no perqu afavoreixi la sntesi, sin perqu les altes temperatures en faciliten la degradaci.302 Desprs de la reacci amb el pirvic, shan descrit altres reaccions similars de ciclaci i oxidaci que tenen lloc amb altres molcules, com ara els vinilfenols303.
4.2) OBJECTIUS
Amb lobjectiu de fer un estudi preliminar del color en relaci amb les varietats vinferes estudiades, es va plantejar treballar amb solucions model i amb vins. Els objectius concrets van ser: 1. Estudiar la reactivitat dels antocians amb lacetaldehid en solucions model i en vins, a diferents pH, per avaluar quins possibles productes poden formar-se en levoluci dels vins. 2. Estudiar lefecte de copigmentaci en solucions model, per establir quins copigments poden participar ms activament en el canvi de les propietats cromtiques dels antocians
302
Romero, C; Bakker, J. (2000).Effect of storage tenperature and pyruvate on kinetics of anthocyanin degradation, vitisin A derivative formation, and color characteristics of model solutions;. J. Agric. Food Chem. 48, 2135-2141 303 Mateus, N; de Pascual-Teresa, S; Rivas-Gonzalo, JC; Santos-Buelga, C; de Freitas, V. (2002). Structural diversity of anthocyanin-derived pigments in port wines. Food Chemistry 76: 335-342
188
4.3) MATERIALS i MTODES

Per tal de veure quina era la influncia de la varietat i de la composici antocinica sobre el color del vi, es va treballar en 2 aspectes: 1) Una soluci sinttica dantocians. 2) Mostres de vins joves monovarietals de la campanya 2002 de la finca experimental Mas dels frares. A lhora de preparar la soluci sinttica, es va decidir obtenir-la a partir dels extractes duna varietat negra. Es va triar la varietat Merlot perqu, com sha vist al captol 1, era una varietat amb un contingut antocinic fora elevat i, sobretot, perqu era la varietat amb uns nivells ms elevats de complexitat, en el sentit que tenia una gran proporci tant de derivats acetilats com de derivats p-cumarilats. Aix anava b per al nostre estudi, ja que ens proposvem veure la influncia dels antocians acilats sobre alguns dels efectes descrits. Lextracci es va fer de manera anloga a la descrita en el captol 1 de la present tesi, partint dun volum ms gran de mostra (1,4 grams) i fent lextracci amb 3 volums de 100 ml de la soluci extraient. Posteriorment, es va fer una purificaci per columna. La separaci havia de complir 2 objectius: en primer lloc, ens havia de proporcionar una fracci prou pura dantocians; i en segon lloc, leluci havia de ser possible amb un solvent no acidificat, ja que posteriorment convenia evaporar lextracte purificat per tal de redissoldrel amb soluci sinttica, i que estigus a un pH=3.2, similar al del vi. Per a tal efecte, es va treballar amb les segents columnes (fig 4.2.1): 1) Dowex 1 (Sigma) 2) Gel de slice (Panreac) 3) Poliamida (Sigma) 4) Sephadex LH-20 (Pharmacia) 5) Sephadex G-15 (Pharmacia) 6) Sephadex G-100 (Pharmacia) 7) Toyopearl HW-50 (Tosoh) 8) PVPP (Sigma) I les fases mbils emprades van ser: 1) 10 ml aigua milliQ
189
2) 5 ml etanol (Panreac) 3) 15 ml etanol 4) 10 ml etanol 1% frmic (Panreac) 5) acetona 50% frmic En la segent taula es representa en vermell en quines 4.2.1. Separaci en columnes Fig fraccions elua la matria colorant:
aigua etanol Etanol 1% frmic Acetona 50% frmic
Dowex 1 Gel de slice Poliamida Sephadex LH-20 Sephadex G-15 Sephadex G-100 Toyopearl PVPP
Taula 4.1 Eluci de compostos antocinics per les diferents columnes. Es marquen en color els eluents que arrosseguen matria colorant, i es deixen en blanc si no elueixen.
Dentre les columnes, la de PVPP, la G-15 i la Dowex 1 noms alliberaven matria colorant amb el solvent de major polaritat. El mateix succea amb la de poliamida, encara que ja deixava eluir en condicions menys drstiques. En canvi, les de Sephadex G-100 i la de gel de slice no retenien els antocians. La Toyopearl deixava eluir en totes les condicions, cosa que indicaria que permet un fraccionament de les molcules responsables del color. No obstant aix, la recuperaci de color que sobtenia en la fracci etanlica era molt baixa. Lelecci final fou, doncs, la columna Sephadex LH-20. 3.4 grams de Sephadex LH-20 (Pharmacia) shidrataven amb 100 ml daigua milliQ en agitaci durant 3 hores. Desprs es procedia a reblir la columna (una xeringa de 10 ml x 1 cm de dimetre). 1 ml de mostra es deixava dipositar sobre el llit de la columna. Posteriorment, safegien 10 ml daigua milliQ, fins que comenava a eluir la fracci colorejada. A continuaci selua amb etanol. Els primers mililitres es descartaven, ja que encara contenien un alt percentatge daigua, que dificultaria levaporaci, i a ms, encara presentaven un pH cid (a causa del frmic present en lextracci). La resta de volum (50
190
ml) detanol era desprs evaporat amb un rotavapor, i el residu sec es resuspenia amb 10 ml de soluci sinttica (etanol 12%, 5 g/l tartric, pH=3.2 o pH=2.0). Posteriorment, es va determinar la quantitat dantocians en la soluci final, per comparaci de les lectures dabsorbncia a 530 nm respecte a un patr de malvidina-3glucsid 0,175 mg/ml. El resultat fou de 261 mg/ml., i es va efectuar una determinaci per HPLC, per tal dassegurar la presncia dels diferents antocians. El segent pas va ser plantejar un experiment de polimeritzaci amb acetaldehid. Les condicions de lassaig van ser les que es descriuen a la bibliografia293 : per una banda, la concentraci dantocians es va ajustar a 150 mg/l, la de (+)-catequina hidrat (Fluka) i (-)epicatequina (Sigma) es va ajustar a una concentraci 1 mM, i la dacetaldehid (Sigma), a unes concentracions del 0.4%, molt superiors als valors que es poden trobar en els vins, per tal de forar els processos en els quals interv lacetaldehid. Sefectu un blanc de catequina/epicatequina, aix com un blanc dacetaldehid. Es va fer un seguiment de levoluci de lespectre del visible i la determinaci per HPLC dels antocians que romanien en la soluci. El mateix estudi es va dur a terme sobre mostres de vins joves monovarietals de Carinyena, cabernet sauvignon, garnatxa, merlot, syrah i ull de llebre; corresponents a la campanya 2002 de la finca Mas dels Frares, per en aquest cas noms es va treballar amb acetaldehid. Finalment, per tal destudiar com podien afectar a les propietats cromtiques de lextracte dantocians diferents molcules presents en el vi, es va fer un estudi de lespectre cromtic amb laddici dcids hidroxicinnmics, concretament el cafeic, el cinnmic, el cumric, i el ferlic (Sigma), en una concentraci final 10 mM. Tamb es va decidir provar lefecte daltres cids aliftics majoritaris en el vi, com sn lcid actic (Sigma), el mlic (Sigma), el ctric (Sigma), el lctic (Sigma), el tartric (Sigma) i el succnic (Panreac), i que sha descrit que tenen efecte en solucions model dantocians individuals275 . Per a aix, es van preparar diferents alquotes dextracte per cadascun dells, i per cada alquota es va afegir un dels cids en una concentraci final de 0.1 M. El pH dels cids abans dafegir-los es va ajustar a 3.2 o a 2.0 amb hidrxid potssic 2N (Sigma).
191
4.4) RESULTATS I DISCUSSI 4.4.1) Reaccions de condensaci mitjanades per acetaldehid en solucions model Laddici dacetaldehid i catequina + epicatequina en quantitats elevades a la soluci model provoca un rpid canvi en el perfil cromtic de lextracte, aix com en la quantitat dantocians caracterstics del ram (figura 4.4.1). En lespectre dabsorci transcorreguts cinc dies del moment de laddici, es produeix un desplaament batocrmic cap a un nou mxim dabsorci: passa de 523,6 a 540,5 nm. Aix significa que la soluci passa a tenir una coloraci violcia. Tamb saprecia un efecte hipercrmic daugment de labsorbncia. Lespatlla que sobserva en la regi entre 420-480 s caracterstica dels productes de condensaci mitjanant acetaldehid 293 ,289. Els productes formats serien de natura polimrica, ja que al cap de pocs dies sobservava un precipitat violaci en la soluci.
a pH=3.2
5
1000
b
800
max=540.5
600
400
1 3 4 6 7 10 8 9
200 control dia 1 + Acetaldehid, + Cat, Epic, dia 1 control dia 5 + Acetaldehid, + Cat, Epicat dia5 400 450 500 550 600 650
* * * *
11 12 13 14
15
16
Figura 4.4.1. a) Cromatograma dels antocians al primer dia (color blau) i al cap de 5 dies de laddici dacetaldehid i catequina/epicatequina (color vermell). B) Es presenta tamb lespectre de la soluci en les condicions control i en les condicions amb acetaldehid i catequina/epicatequina al primer i al cinqu dia.
1: Dp-3-glu; 2: Cy-3-glu; 3: Pt-3-glu; 4: Pn-3-glu; 5: Mv-3-glu; 6: Dp-ac-glu; 7: Cy-ac-glu; 8: Pt-ac-glu; 9: Pn-ac-glu; 10: Mv-acglu; 11: Dp-pc-glu; 12: Mv-cf-glu; 13: Cy-pc-glu; 14: Pt-pc-glu; 15: Pn-pc-glu; 16: Mv-pc-glu.
En el cromatograma (figura 4.4.1), es detecten nous pics (marcats amb lasterisc *): un pic (A) contigu al de la petunidina-3-glucsid, i uns altres en la zona que correspondria als antocians acetilats. Aquests darrers coincideixen en temps de retenci amb productes lligats per etil obtinguts per Rivas-Gonzalo et al.290en solucions model amb malvidina-3-glucsid, i catequina, tot i que caldria confirmar la seva estructura mitjanant tcniques espectroscpiques. Concretament, en el citat treball obtenen 2 ismers corresponents a la molcula de malvidina lligada pel pont etil a la molcula de catequina.
192
Per tal de forar encara ms les condicions, es van comparar els resultats amb els corresponents a un pH ms cid (figura 4.4.2). Com podem veure, les reaccions de condensaci estan afavorides a baixos pH. En aquest cas, al cap del primer dia ja es produen prdues significatives dels antocians, i la soluci adquiria immediatament tonalitats violcies:
1800
a pH=2.0 *
1600 1400 1200
max=544.5 1000 800 600 400 200 control dia 1 + Acetaldehid, + Cat, Epic, dia 1 control dia 5 + Acetaldehid, + Cat, Epicat dia5 450 500 550 600 650
*
B A
0 400
* *
Figura 4.4.2. a) Cromatograma dels antocians al primer dia (color blau) i al cap de 3 dies de laddici dacetaldehid i catequina/epicatequina (color vermell, a pH=2.0. b) Es presenta tamb lespectre de la soluci en les condicions control i en les condicions amb acetaldehid i catequina/epicatequina al primer i al cinqu dia.
En lespectre, que es va enregistrar al cap de 5 dies de reacci, es pot apreciar que el desplaament batocrmic s considerable (arriba als 544.5 nm) i, tot i que pot semblar que desapareix lefecte hipercrmic, en realitat el que succeeix s que hi ha una gran prdua de material colorant a causa de la formaci de precipitats, de natura polimrica. De fet, lefecte hipercrmic es manifesta en un principi, abans dinciar-se les prdues per polimeritzaci. En aquestes condicions ms drstiques, sobt un major nombre de nous pics, en noms un dia de reacci, i en el cromatograma al 3r dia (figura 4.4.2) les concentracions dantocians estan ja molt disminudes respecte les inicials. De fet, al 5 dia les concentracions sn gaireb inapreciables, motiu pel qual sha optat per presentar els resultats corresponents al 3r dia. Novament, es genera tota una srie de pics en la zona que correspon als derivats acetilats, i que podrien correspondre, segons els treballs bibliogrfics, a lestructura de productes lligats per etil. Tamb apareix un nou pic (B), tot i que en molt baixa concentraci, contigu al de la cianidina. En estudis de Dallas et al.293 , treballant amb una soluci model de noms cianidina, sobt tamb un pic contigu a la de la molcula
193
dantoci, lestructura del qual correspon a un adducte de cianidina amb el flavan-3-ol. Aix ens suggereix que el pic contigu a la petunidina (A), detectat tant a pH 2.0 com a pH 3.2, podria correspondre a un adducte petunidina-flavan-3-ol, similar a lanteriorment descrit.
Quant a les solucions control, la presncia dacetaldehid condua a un molt lleuger desplaament batocrmic de 1.5 nm en el mxim dabsorci, en absolut comparable als que sobtenien amb la mescla dacetaldehid i catequina + epicatequina. Tanmateix, es podia apreciar una certa desaparici dels antocians, com es pot observar a la figura 4.4.3:
PH=2.0
PH=3.2
Figura 4.4.3. Cromatograma dels antocians al primer dia (color blau) i al cap de 5 dies de laddici dacetaldehid (color vermell); a diferents pH)
En les solucions control sense afegir cap dels reactius utilitzats (acetaldehid, catequina, epicatequina), no es van apreciar canvis ni en les propietats cromtiques ni en les molcules que les composaven al cap de 5 dies.
194
4.4.1.b) Determinaci de les constants de velocitat Per tal de manifestar la diferent reactivitat dels diferents antocians en les dues solucions, es va fer una estimaci de la seva velocitat de desaparici. De la representaci de lrea integrada en front del temps (fig 4.4.4), es pot observar que el comportament de la reacci s exponencial negativa, que correspon a una reacci de primer ordre, lequaci de velocitat de la qual s: v= k [Antoci]
10000 rea 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 0 20 40 60 80 hores pH 2.0 pH 3.2 100 120 140
I, en ser un comportament exponencial, tenim: [Antoci] = [Antoci]0 . e -kt
On k s la constant de velocitat, i t s el temps.
Figura 4.4.4. Desaparici de la malvidina-3-glucsid en la soluci model amb acetaldehid i catequina/epicatequina als dos pH destudi
Aquesta observaci concorda amb els treballs de Dallas et al293 . Fent una representaci logartmica i amb un clcul de la regressi per mnims quadrats, es pot calcular el valor daquesta constant de velocitat a partir del valor del pendent (fig 4.4.5). Pot demostrar-se que aquest valor s independent de les unitats utilitzades (ja siguin rea o concentraci), i noms depn del temps. ln[Antoci] = ln[Antoci]0 k t
ln (rea)
10 9 8 7 6 5
0 20 pH=2.0 40 pH 3.2 60
hores
y = -0.0096x + 9.0718 R2 = 0.9936
y = -0.0414x + 9.331 R2 = 0.988
80
100
120
140
Lineal (pH=2.0)
Lineal (pH 3.2)
Figura 4.4.5. Representaci logartmica de desaparici de la malvidina-3-glucsid en la soluci model amb acetaldehid i catequina/epicatequina als dos pH destudi. El pendent correspon a la constant de velocitat
195
La taula 4.4.1 recull les constants, expressades en hores1, de desaparici dantocians per les dues condicions de treball, la de pH 2.0 i la de pH 3.2:
K velocitat (pH=2.0) h-1

Dp-3-glu Cy-3-glu Pt-3-glu Pn-3-glu Mv-3-glu Pt-ac-glu Pn-ac-glu Mv-ac-glu Cy-pc-glu Pt-pc-glu Pn-pc-glu Mv-pc-glu -0.040 -0.042 -0.057 -0.054 -0.035 -0.032 -0.029 -0.022 -0.013 -0.006 -0.038 -0.048
K velocitat (pH=3.2) h-1
Relaci k(2.0)/k (3.2)
-0.0083 -0.0064 -0.0094 -0.0100 -0.0090 -0.0108 -0.0053 -0.0056 -0.0064 -0.0094 -0.0100 -0.0090
4.8 6.6 6.1 5.4 3.9 3.0 5.5 3.9 2.0 0.6 3.8 5.3
Taula 4.4.1. Constants de velocitat determinades en desaparici drea pels antocians a pH=2.0 i pH=3.2
Les constants de velocitat a pH cid sn de lordre dentre 3-6 vegades ms elevades que les corresponents al pH del vi; aix justifica que la velocitat de desaparici sigui tamb ms elevada. En un medi a pH=3.2, ms similar al del vi, es posen de manifest algunes diferncies quant a reactivitat daquests compostos. A diferncia de les observacions de Romero i Bakker 302, 304, que en solucions model dantocians allats descriuen unes constants de velocitat de desaparici de lordre de 3-4 vegades superiors pels antocians acilats, especialment els p-cumarilats, en els nostres estudis no sobserva aquest fenomen i, de fet, els antocians acetilats sn els que presenten una menor reactivitat (gaireb la meitat). En els estudis citats, per, treballen en unes concentracions encara ms elevades dacetaldehid, de lordre de 200 mM, i treballen en solucions model dels antocians allats, cosa que pot justificar la diferncia en els resultats. Dintre dels monoglucsids, a pH= 2.0, la petunidina s la ms reactiva, seguida de la peonidina i la malvidina, encara que a pH=3.2 no hi ha diferncies significatives. En els experiments de Dallas et al.293 tamb arriben a uns valors similars entre la malvidina i la peonidina. Per en el seu cas, la cianidina resulta lleugerament ms reactiva que la malvidina. De totes maneres, els seus experiments tamb treballen amb solucions model de
196
lantoci allat, i no amb una barreja dantocians, per la qual cosa un efecte dinteracci podria justificar les diferncies.
En la taula 4.4.2 es recullen les constants de velocitat de desaparici en el cas de laddici nica dacetaldehid, calculades segons la metodologia descrita anteriorment:
K velocitat (pH=2.0)
Dp-3-glu Cy-3-glu Pt-3-glu Pn-3-glu Mv-3-glu Pt-ac-glu Pn-ac-glu Mv-ac-glu Cy-pc-glu Pt-pc-glu Pn-pc-glu Mv-pc-glu -0.0030 -0.0031 -0.0033 -0.0035 -0.0035 -0.0034 -0.0044 -0.0036 -0.0035 -0.0025 -0.0028 -0.0030
K velocitat (pH=3.2)
-0.0028 -0.0026 -0.0026 -0.0025 -0.0024 -0.0028 -0.0023 -0.0056 -0.0021 -0.0031 -0.0029 -0.0031
Taula 4.4.2. Constants de velocitat determinades en desaparici drea pels antocians a pH=2.0 i pH=3.2
Les constants de velocitat sn de lordre de 10 vegades inferiors en el cas de la soluci a pH=2.0; i 3-4 vegades inferiors a les de la soluci a pH=3.2. En aquestes condicions, la reactivitat s lleugerament superior en les condicions ms cides, per no hi ha una influncia del pH en la reactivitat tan marcada com en les reaccions en qu participaven lacetaldehid i els flavan-3-ols. Conv tenir present que en la situaci control sense addici dacetaldehid, ni catequina ni epicatequina, no sobservava aquesta desaparici dels antocians.
Aix doncs, podem veure que lacetaldehid participaria en dos processos que promouen la desaparici en els vins de les formes antociniques provinents del ram. Per una banda, en presncia de flavan-3-ols (que en el vi es troben procedents de lextracci de les pells o dels pinyols) tindria lloc una reacci de condensaci que provoca un desplaament cap a tonalitats violcies i que pot arribar a provocar laparici de precipitats de natura polimrica. Per altra banda, tamb participaria, sense involucrar molcules de
304
Romero, C; Bakker, J. (2000). Effect of acetaldehyde and several acids on the formation of vitisin A in model wine anthocyanin and colour evolution. Int. J. Food Sci. And Techn 35: 129-140
197
flavan-3-ol, en altres reaccions sensiblement ms lentes que condueixen a la desaparici dels antocians en el vi. La velocitat de desaparici depn de la constant de velocitat, per tamb s proporcional a la concentraci de lantoci. Aix significa que, a majors concentracions, hi ha una major desaparici. En els vins elaborats amb la varietat Vitis vinifera, en qu lantoci majoritari s la malvidina, la desaparici daquest antoci per reaccions com les de condensaci ser, doncs, ms elevada que per als altres antocians, malgrat que la seva constant de velocitat sigui menor. En canvi, els nivells dantocians acilats ja sn de per si petits, i per tant la velocitat de desaparici ser menor. De totes maneres, com ja hem comentat en el captol anterior, en general, lextracci de derivats p-cumarilats en el procs de maceraci s escassa, de manera que s la famlia dantocians minoritria en els vins. A conseqncia de les reaccions de desaparici en qu poden estar implicades, el resultat s que la seva presncia en vins acostuma a ser limitada. De fet, en vins de criana lnic antoci que es detecta al cap duns mesos denvelliment s la malvidina-3-glucsid, pel fet de ser el majoritari en el vi inicial; mentre que els altres es troben en molts baixos nivells o no es detecten. Resulta controvertida la influncia que poden exercir aquests nous pigments en el color dels vins envellits. Per una banda, shan allat en el vi, per per laltra, les seves caracterstiques cromtiques no corresponen al perfil cromtic dels vins de criana. En els vins de criana i els vins envellits, la proporci dantocians procedents del ram s efectivament molt baixa, per en canvi el color s ms intens, i amb un lleuger desplaament cap a tonalitats vermell-teula. En canvi, en la soluci model, el desplaament ha estat cap a zones ms blavoses. Aix reflecteix que en el vi es produeixen una altra srie de reaccions per acci de lacetaldehid, tot i que els experiments efectuats amb les solucions model aporten informaci sobre possibles molcules que es formarien.
198
4.4.2 ) Reaccions de condensaci mitjanades per acetaldehid en Vins monovarietals Com ja hem comentat, laddici dacetaldehid a les solucions model sense participaci de flavanols provocava una desparici molt lenta dels antocians, i un molt lleuger desplaament batocrmic de la mx. En canvi, la situaci canvia quan safegeix lacetaldehid a vins joves. Les segents grfiques (figura 4.4.6) presenten lespectre entre 400-650 nm dels diferents vins monovarietals estudiats, desprs de laddici dacetaldehid.
cabernet sauvignon merlot 1400 1200 1000 800 800 600 600 400 200 0 400 450 500 550 600 650 400 200 0 400 450 500 550 600 650 1600 1400 1200 1000
Vi cabernet Vi cabernet + acet. d3 garnatxa
Vi cabernet + acet. d1 Vi cabernet + acet. d5 carinyena
Vi merlot Vi merlot + acet. d3
Vi merlot + acet. d1 Vi merlot + acet. d5
450 400
600
500 350 300 250 300 200 150 100 100 50 0 400 450 500 550 600 650 0 400 450 500 550 600 650 200 400
Vi Garnatxa Vi Garnatxa + acet. d3
Vi Garnatxa + acet. d1 Vi Garnatxa + acet. d5 ull de llebre
Vi carinyena Vi carinyena + acet. d3
Vi carinyena + acet. d1 Vi carinyena + acet. d5 syrah
1400 1200
2000 1800 1600
1000 800 600 400 200 0 400 450 500 550 600 650
1400 1200 1000 800 600 400 200 0 400 450 500 550 600 650
Vi ull de llebre Vi ull de llebre + acet. d3
Vi ull de llebre + acet. d1 Vi ull de llebre + acet. d5
Vi syrah Vi syrah + acet. d3
Vi syrah + acet. d1 Vi syrah + acet. d5
Figura 4.4.6. Espectres dabsorci a la regi del visible dels diferents vins monovarietals, i evoluci al cap d1, 3 i 5 dies daddicionar acetaldehid
199
En aquest cas, es produeix un desplaament hipsocrmic dels mxims dabsorci, cap a zones ms ataronjades. Aquest desplaament no s igual per a tots els vins monovarietals. En la taula 4.4.3 es presenten aquests desplaaments:
mx vi 528 527,5 531.5 522.5 525.5 529
mx vi+acetaldehid 511 510 524 514.5 518 525
mx
Cabernet sauvignon Merlot Syrah Garnatxa Carinyena Ull de llebre
17 17,5 7.5 8 7.5 4
Taula 4.4.3. Magnitud dels desplaaments hipsocrmics obtinguts en vins monovarietals per laddici dacetaldehid
Per altra banda, en tots ells sobt un desplaament hipercrmic, aix s, un increment de la intensitat de labsorbncia. Aquests desplaaments hipsocrmic i hipercrmic s resulten ms caracterstics dels vins envellits o de criana305 . Per tant, la soluci model no resultava representativa del que succeeix en un vi envellit, ja que els antocians no donaven increment de color quan sels enfrontava a lacetaldehid. Tampoc sembla que en aquestes reaccions hi hagi participaci dels flavan-3-ols, ja que lespectre que sobt s justament el contrari. Per tal de veure la relaci daquest canvi cromtic amb el contingut en els antocians individuals, es van comparar els cromatogrames en els diferents dies. A continuaci es presenta un exemple (figura 4.4.7), corresponent al vi monovarietal de cabernet sauvignon, que era dels que presentava major variaci en lespectre.
*
Figura 4.4.7. Desaparici dels antocians per efecte de laddici dacetaldehid en els vins monovarietals. En blau es respresenta el contingut el primer dia, i en vermell al cap de 3 dies daddicionar lacetaldehid.
200
Pot apreciar-se que, malgrat aquest increment del color que presenten els vins, hi ha una disminuci de la concentraci dels antocians individuals. Per tant, sembla clar que aquests antocians despareixen del medi per es formen estructures ms colorejades per efecte de lacetaldehid. Tot i aix, noms sobserva un nou pic (*) en el cromatograma per efecte de laddici dacetaldehid. En els treballs de Vivar-Quintana 305, en afegir acetaldehid en concentracions 800 mg/l a un vi, aconseguien detectar, en molt baixa quantitat, al cap de 120 hores, compostos amb mxims dabsorci desplaats a la zona de 500-513 nm, i que identificaven mitjanant LC-MS com a derivats de la famlia de les vitisines, amb substituents acetil, cumaril i tamb de procianidines. El pic aparegut sembla coincidir, almenys en temps de retenci, amb el de lacetilvitisina B, compost detectat en vins, tot i que no shan pogut efectuar estudis estructurals que confirmin aquesta hiptesi. Aix doncs, tal i com comenta Vivar-Quintana 305 , lacetaldehid no actua noms formant productes de condensaci lligats per etil, sin que tamb pot causar laparici de molcules destructura vitisina. Conv senyalar que, malgrat que la concentraci daquests pigments s baixa, poden ser molt importants en el color, ja que el cromatograma est enregistrat en unes condicions molt cides, que no corresponen a les del vi. En les condicions danlisi, a pH cid, tots els antocians es troben en forma de cati flavili, i per tant totes donen color. Per al pH del vi, els antocians es trobarien en la forma hemiacetlica incolora. De totes maneres, sembla clar que en el vi hi ha dhaver algun altre tipus de molcules que intervinguin el color, i que no sn recollides en el cromatograma. En aquest sentit, resulten interessants treballs com els de Peng et al.306, que utilitzen columnes de poliestir/divinilbenz, amb les quals aconsegueixen detectar, a ms dels antocians monmers, un pic amb antocians polimrics. Aquest pic, present ja en vins joves, augmenta de concentraci i de proporci relativa durant lenvelliment del vi, i pot ser molt important en el color dels vins.
305 306
Vivar- Quintana, AM. (2001).Fraccionamento y estudio preliminar de la materia colorante en el vino tinto. Tesi doctoral. Univ Salamanca Peng,Z; Iland, PG; Oberholster, A; Sefton, MA; Waters, EJ. (2002). Analysis of pigmented polymers in red winew by reverse phase HPLC. Aust. J. Grape and wine research 8, 70-75
201
4.4.3) Fenmens de copigmentaci en solucions model a) cids hidroxicinnmics Lefecte dels cids sobre el color de les solucions dantocians depn de lestructura de lcid. Quan aquest s un cid hidroxicinnmic, es manifesta un efecte hipercrmic i batocrmic, com es recullen a a la figura 4.4.8 i a la taula 4.4.4:
pH2.0
1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0
pH3.2
400
450 soluci control
500
550 control + cafeic control + ferlic
600
650
700
400
450 soluci control control + cumric
500
550 control + cafeic control + ferlic
600
650
700
control + cinnamic
control + cinnamic
control + cumric
Figura 4.4.8. Espectre visible de lefecte copigmentatiu entre la soluci model i diferents cids fenlics, a pH=2.0 i pH=3.2
mx (pH=2.0) 522.0 523.7 522.5 523.7 524.0
mx (pH=3.2) 523.6 525.7 524.6 525.2 528.8
control control + cafeic control + cinnmic control + cumric control + ferlic
Taula 4.4.4. Magnitud dels desplaaments batocrmics obtinguts en solucions model per laddici dcids hidroxicinnmics
Tots els cids cinnmics provoquen un efecte hipercrmic i un efecte batocrmic en ambds valors de pH. En alguns treballs, els pH molt cids no produeixen efecte 307, 308 309, mentre que en daltres el color a causa de la copigmentaci continua sent ms pronunciat a pH 1 o inferiors. Lcid ferlic s el que crea un efecte de copigmentaci major, tot i que en la bibliografia275 , en solucions individuals de delfinidina-3-glucsid, de peonidina-3glucsid, de malvidina-3-glucsid, i de petunidina-3-glucsid, arriba a provocar desplaaments de ms de 10 nm en els mxims dabsorci al cap de poques hores. Almenys en la nostra soluci model, aquests efectes no sn tan acusats, cosa que podria ser causada
307 308 309
Asen, S; Jurd, L. (1972). Co-pigmentation og anthocyanins in plant tissues and its effect on color. Phytochemistry 11: 1139-1145 Davies, AJ; Mazza, G. (1995). Copigmentation of simple and acylated anthocyanins with colorless phenolic compounds. J Agric Food Chem 41:716-720 Lebengood, J. (1996). A survey on copigmentation in cabernet sauvignon wines Tesi doctoral, Univ Califrnia, Davis
202
per una resposta diferent segons lestructura dels antocians, o per altres possibles associacions antoci-antoci amb les quals haurien de competir els cids hidroxicinnmics. Els cids hidroxicinnmics sn dels copigments ms mpliament descrits, ja que permeten la interacci dels seus anells aromtics amb els orbitals del cati flavili de lantoci, estabilitzant-ne lestructura 310. Les seves propietats dincrementar el color han condut a noves prctiques daddici pre-fermentativa daquests copigments, que resulta en un increment del 60% del color del vi jove en cas de la utilitzaci dcid cafeic311. De fet, els cids benzoics i cinnmics ja sn presents de manera natural als vins negres, en unes concentracions que oscil.len entre els 50-200 mg/l en total312. b) cids aliftics Lefecte no s tan espectacular quan es tracta dcids aliftics, com es recull en la figura 4.4.9 i la taula 4.4.5:.
pH 2.0 800 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 340 390 control + tartric control + succnic 440 490 540 590 640 690 700 600 500 400 300 200 100 0 340 390 440 control + mlic control + succnic 490 540 control + lctic control + ctric 590 640 690 pH 3.2
control + mlic control + ctric
control + lctic soluci control
control + actic
control + actic control
Figura 4.4.9. Espectre visible de lefecte copigmentatiu entre la soluci model i diferents cids aliftics, a pH=2.0 i pH=3.2
control actic ctric lctic mlic succnic tartric
mx (pH=2.0) 521.5 521.5 521.5 520.5 521.5 521.5 521.0
mx (pH=3.2) 523.6 523.4 523.8 523 523.2 524.5
Taula 4.4.5. Magnitud dels desplaaments hipsocrmics obtinguts en solucions model per laddici dcids aliftics
310
Brouillard, R; Wigand, MC; Dangles, o; Cheminat, A. (1991). pH and solvent effects on the copigmentation reaction of malvin with polyphenols, purine and pyrimidine derivatives. J Chem Soc Perkin Trans, 2:1235-1241 311 Daras-Martn, J; Carrillo, M; Daz, E; Boulton, R. (2001). Ehnhancement of red wine colour by pre-fermentation addition of copigments. Food Chemistry 73, 217-220 312 Cheynier,V.; Moutounet, M; Sarni-Manchado,P. (2003). Los compuestos fenlicos, a Enologa: Fundamentos cientficos y tecnolgicos.
203
Com es pot observar en la grfica 4.4.9, es manifesta un efecte hipercrmic per lacci dels cids aliftics. Aquest efecte s de magnitud quantitativament menor que lobtingut amb els cids hidroxicinnmics (recordem que els nivells de concentraci amb qu sha treballat sn 10 vegades superiors en el cas daquests cids aliftics). Lefecte depn tamb del pH de treball, ja que a pH ms cids (2.0) les diferncies respecte la situaci control sn menys acusades, i sestableixen menys diferncies entre els cids aliftics. s especialment acusat lefecte de lcid lctic, que tamb sobserva en els treballs de Mazzaracchio et al.275 . Hi ha diferents hiptesis que justifiquen aquest efecte. Per una banda, lacci molecular que postulen Mazzaracchio et al seria la de lestabliment d interaccions electrosttiques i la formaci de ponts dhidrogen i interaccions hidrofbiques que resulten en una expulsi de laigua del cati flavili, cosa que permet apilaments auto-associatius que produeixen lefecte cromtic. Per altra banda, Boulton274 indica la necessitat dun contrai que compensi la crrega del cati flavili, i els experiments dAsen307 , Brouillard310 i Davies i Mazza308 posen de manifest que la carncia daquests contraions disminueix lefecte copigmentatiu. Els vins sn tampons dominats pels ions bitartrat, per en qu tamb intervenen en el poder tamponador els ions lactat, els bisuccinat, els dihidrogen fosfat o els bisulfat274 , la variaci dels quals en els vins pot ser significant. Els nostres resultats semblen confirmar la influncia del contrai en lefecte copigmentatiu. Per a una discussi acurada, conv considerar els pKa daquests cids aliftics, que es recullen a la taula 4.4.6:
cid actic succnic mlic lctic ctric tartric pKa 4.76 4.16, 5.61 3.40, 5.11 3.246 3.14, 4.77, 6.34 2.98, 4.34
Taula 4.4.6. pKa dels cids aliftics
La constant dacidesa (Ka) estableix la relaci entre les formes aniniques i neutres, de manera que, donat un cid AH s fcil deduir lequaci: 10pH-pKa = [A -] / [AH] A pH=2.0, la majoria dcids estan en la forma neutra, de manera que la proporci dani present en la soluci model ser escassa. Aix justifica que lefecte dincrement del color sigui tamb redut.
204
A pH=3.2, hi ha majors diferncies. La magnitud de lefecte hipercrmic est clarament relacionada amb el valor del pKa. Lactic, que s lacid ms feble, seria doncs el menys dissociat en aquest pH i, en conseqncia, el que menys podria estabilitzar el cati flavili. Aix explica que no presenti diferncies respecte les condicions control. S que les presenten lcid succnic i lcid mlic, encara que en el cas del succnic seria esperable un efecte menor. El segent cid, el ctric, ja t un valor de pKa inferior al del pH, i per tant, la concentraci de i citrat s superior a la forma neutra i, en conseqncia, t lefecte hipercrmic. En el cas de lcid lctic, malgrat tenir un pKa superior al del ctric, t un considerable efecte. Aquest efecte hipercrmic, aix com el desplaament batocrmic han estat descrits275 , encara que en el nostre cas els efectes sn significativament menors. El mecanisme dacci seria la formaci de ponts dhidrogen, que allunyarien laigua del i flavili, evitant-ne aix la conversi a forma hemiacetlica. Lefecte de lcid lctic s especialment important, ja que s el producte de la fermentaci malo-lctica, desenvolupada pels bacteris lctics. En aquest procs, es produeix una desacidificaci del medi, cosa que implicaria una prdua de color vermell a causa de lequilibri que mant el i flavili; per sembla que en part lefecte quedaria compensat per lincrement hipercrmic resultat del fenomen de copigmentaci amb lcid lctic format.
pH 3.2
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0 340 390 440 490 540 590 640 690
control control + actic
control + mlic control + succnic
control + lctic control + ctric
Figura 4.4.10. Espectre visible de lefecte copigmentatiu entre la soluci model i diferents cids aliftics, a pH=3.2 al cap de 5 dies de laddici
Aquest efecte encara es potencia si es torna a registrar lespectre al cap duns dies dhaver afegit lcid (figura 4.4.10). En les condicions control hi ha una prdua considerable de color, mentre que es mant en les altres condicions, i en el cas de lcid lctic, fins i tot es potencia. Per tant, els cids aliftics estabilitzarien el color de la soluci.
205
Dels resultats obtinguts amb els cids hidroxicinnmics i els cids aliftics podem establir que en el cas dels primers, que aporten anells aromtics que poden participar en lapilament, hi ha una contribuci tant per un efecte incrementador del color com per un desplaament de lespectre visible cap a regions ms blavoses. En canvi, en el cas daltres cids que no poden participar de lapilament, el resultat seria un increment de la copigmentaci per autoassociaci dels propis antocians, que genera un lleuger desplaament batocrmic del color, de manera que en aquests casos lefecte que es manifesta fonamentalment s lhipercrmic. Conv comentar que, a ms dels cids aliftics, shan descrit altres molcules que no presenten anells aromtics per que poden actuar, en canvi, com a copigments, com sn larginina. 313
4.5) CONCLUSIONS
1. En solucions model amb la presncia dantocians, laddici dacetaldehid i un flavan-3-ol, provoca que els antocians shi combinin per formar compostos de color violaci que precipiten al cap de pocs dies. La velocitat daquesta reacci depn del pH del medi i de la concentraci de lantoci, per tamb de la seva natura qumica. 2. En vins, laddici dacetaldehid provoca un desplaament del mxim dabsorbncia cap a tonalitats ms ataronjades. Aquest comportament s diferent del de les solucions model i, per tant, implica que en el mecanisme hi participen altres molcules que les catequines. 3. Els cids hidroxicinnmics tenen un efecte hipercrmic i batocrmic sobre el color en solucions model. Lefecte s particularment ms acusat en el cas de lcid ferlic. 4. Alguns cids aliftics, especialment lcid lctic, tamb poden modificar les propietats cromtiques dels antocians, contribuint a augmentar la intensitat cromtica del vi. Aquesta funci est afectada per la naturalesa de lcid.
313
Asen, S; Stewart, RN; Norris, KH; Co-pigmentation of anthocyanins in plant tissues and its effect on color; Phytochemistry 11:1139-1145 (1972)
206
6) REFERNCIES BIBLIOGRFIQUES
1.
Sommers, TC; Evans. (1977). Spectral evaluation of young red wines: Anthocyanin equilibria, total phenolics, free and molecular SO2, and chemical age; J Sci Food Agric 28:279-287 2. Houbiers, C; Lima, J; Maanita, A; Santos, H. (1998). Color stabilization of malvidin3-glucoside: self-aggregation of the flavylium cation and copigmentation with the Z-chalcone form; J Phys Chem B, 102, 3578-3585 3. Heredia, FJ; Francia-Aricha, EM; Rivas-Gonzalo, JC; Vicario, IM; Santos-Buelga, C. (1998). Cromatic characterization of anthocyanins from red grapes I.pH effect; Food Chemistry, vol 63,n4, 491-498 4. Boulton, R. (2001).The Copigmentation of Anthocyanins and Its Role in the Color of Red Wine: A Critical Review, Am. J. Enol. Vitic. 52 (2): 67-87 5. Mazzarazcchio, P; Pifferi, P; Kindt, M; Munyaneza, A, Barbiroli, G. (2004). Interactions between anthocyanins and organic food molecules in model systems; Int. J. Food Sci. And Techn., 39, 53-59 6. Mazza, G., and Brouillard, R. (1990). The mechanism of co-pigmentation of anthocyanins in aqueous solutions. Phytochem. 29:1097-1102. 7. George, F; Figuereido, P; Toki, K; Tatsuzawa, F; Saito, N; Brouillard, R. (2001). Influence of trans-cis isomeration of coumaric acid substituents on colour variance and stabilisation in anthocyanins, Phytochemistry 57: 791-795 8. Somers, T.C., and Evans, M.E. (1979). Grape pigment phenomena: Interpretation of major colour losses during vinification. J. Sci. Fd. Agric. 30:623-633. 9. Liao H., Cai Y., Haslam E., (1992). Polyphenol interactions. Anthocyanins : copigmentation and color changes in red wines. J. Sci. Food Agric., 59, 299-305. 10. Brouillard, R; Dangles, O. (1994). Anthocyanin molecular interactions: the first step in the formation of new pigments during wine aging?. Food Chem, 51, 265-270 11. Brouillard, R; Chassaing, S; Fougerousse, A. (2003). "Why are grape/fresh wine anthocyanins so simple and why is it that red wine color lasts so long?" Phytochemistry 64: 1179 118 12. Revilla, I; Perez-Magarino, S; Gonzalez-SanJose, ML; Beltran, S. (1999)." Identification of anthocyanin derivatives in grape skin extracts and red wines by liquid chromatography with diode array and mass spectrometric detection" . Journal of Chromatography A, 847: 8390 13. Hakansson, A; Pardon, K; Hayasaka, Y; Sa, M; Herderich, M. (2003). Structures and colour propierties of new red wine pigments. Tetrahedron Leters 44 :4887-4891 14. Remy, S; Fulcrand, H; Labarbe, B; Cheynier, V; Moutounet,M. (2000). "First confirmation in red wine of products resulting from direct anthocyanintannin reactions". J Sci Food Agric 80:745-751 15. Remy-Tanneau,S; Le Guernev, C; Meudec, E; Cheynier, V. (2003). Characterization of a colorless anthocyanin-flavan-3-ol dimer containing both carbob-carbon and ether interflavonoid linkages by NMR and Mass Spectometry. J. Agric. Food Chem. 51: 3592-3597 16. Es-Safi, N; Le Guernev, C; Labarbe, B; Fulcrand, H; Cheynier, V; Moutounet, M; Structure of a new Xanthylium salt derivative. (1999).Tetrahedron Letters 40: 5869-5872
207
17.
Es-Safi, N; Le Guernev, C; Fulcrand, H; Cheynier, V; Moutounet, M. (2000). Xanthylium salts formation involved in wine colour changes. Int. J. Food Science and Technology, 35: 63-74 18. Liu, S-Q; Pilone, G.J. (2000). "An overview of formation and roles of acetaldehyde in winemaking with emphasis on microbiological implications". Int. J. Food Sci. And Techn., 35: 49-61 19. Atanasova, A; Fulcrand, F; Le Guernev, C; Cheynier, V; Moutounet, M. (2002). Structure of a new dimeric acetaldehyde malvidin-3-glucoside condensation product. Tetrahedron letters 43: 6151-6153 20. Rivas-Gonzalo,JC; Bravo-Haro, S; Santos-Buelga, C. (1995). Detection of compounds formed through the reaction of malvidin-3-monoglucoside and catechin in the presence of acetaldehyde. J.Agric.Food Chem, 43:1444-1449 21. Escribano-Bailn, T; lvarez-Garca, M; Rivas-Gonzalo, JC; Heredia, FJ; SantosBuelga, C. (2001). Color and stability of pigments derived from the acetaldehyde-mediated condensation between malvidin-3-0-glucoside and (+)-catechin. J. Agric Food Chem, 49: 12131217 22. Es-Safi, N; Fulcrand, H; Cheynier, V; Moutounet, M;. (1999). Studies on the acetaldehyde-induced condensation of (-)-Epicatechin and Malvidin-3-O-Glucoside in a model solution system. J. Agric. Food Chem, 47: 2096-2102 23. Dallas, C; Ricardo-da-Silva, JM; Laureano, O. (1996).Products fromed in wine solutions involving anthocyanins, procyanidin B2, and acetaldehyde" J. Agric. Food Chem. 44: 2402-2407 24. Pissarra, J; Loureno, S; Gonzlez-Params, A; Mateus, N; Santos-Buelga, C; de Freitas, V. (2003). Formation of new anthocyanin-alkyl/aryl-flavanol pigments in model solutions. Analytica Chimica Acta, en premsa 25. Cameira dos Santos, PJ; Brillouet, JM; Cheynier, V; Moutounet, M;. (1996). Detection and partial characterisation of new anthocyanin pigments in wine. J. Sci. Food Agric.70: 204-208 26. Romero, C; Bakker, J. (1999). Interactions between grape anthocyanins and pyruvic acid, with effect of pH and acid concentration on anthocyanin compsition and colour in model solutions. J.Agric. Food Chem., 47 (3130-3139) 27. Mateus, N; Silva, AMS; Vercauteren, J; de Freitas, V. (2001). Occurence of anthocyanin-derived pigments in red wines J. Agric. Food Chem. 49: 4836-4840 28. Bakker, J; Timberlake, CF. (1997). Isolation, identification, and characterization of new color-stable anthocyanins occuring in some red wines; J. Agric. Food Chem. 45: 35-43 29. Vivar-Quintana, AM; Santos-Buelga, C; Rivas-Gonzalo, JC. (2002). Anthocyaninderived pigments and colour of red wines;. Analytica Chimica Acta 458: 147-155 30. Mateus, N; de Freitas, V. (2001).Evolution and stability of anthocyanin-derived pigments during Port wine aging. J. Agric. Food Chem. 49:5217-5222 31. Bakker,J; Bridle,P; Bellworthy, SJ; Garca-Viguera, C; Reader, HP; Watkins, SJ; Effects of sulfur dioxide and must extraction on color, phenolic composition and sensory quality of red table wine. (1998). J.Sci.Food Agric. 78, 297-307 32. Romero, C; Bakker, J. (2000).Effect of storage tenperature and pyruvate on kinetics of anthocyanin degradation, vitisin A derivative formation, and color characteristics of model solutions;. J. Agric. Food Chem. 48, 2135-2141
208
33.
Mateus, N; de Pascual-Teresa, S; Rivas-Gonzalo, JC; Santos-Buelga, C; de Freitas, V. (2002). Structural diversity of anthocyanin-derived pigments in port wines. Food Chemistry 76: 335-342 34. Romero, C; Bakker, J. (2000). Effect of acetaldehyde and several acids on the formation of vitisin A in model wine anthocyanin and colour evolution. Int. J. Food Sci. And Techn 35: 129-140 35. Vivar- Quintana, AM. (2001).Fraccionamento y estudio preliminar de la materia colorante en el vino tinto. Tesi doctoral. Univ Salamanca 36. Peng,Z; Iland, PG; Oberholster, A; Sefton, MA; Waters, EJ. (2002). Analysis of pigmented polymers in red winew by reverse phase HPLC. Aust. J. Grape and wine research 8, 70-75 37. Asen, S; Jurd, L. (1972). Co-pigmentation og anthocyanins in plant tissues and its effect on color. Phytochemistry 11: 1139-1145 38. Davies, AJ; Mazza, G. (1995). Copigmentation of simple and acylated anthocyanins with colorless phenolic compounds. J Agric Food Chem 41:716-720 39. Lebengood, J. (1996). A survey on copigmentation in cabernet sauvignon wines Tesi doctoral, Univ Califrnia, Davis 40. Brouillard, R; Wigand, MC; Dangles, o; Cheminat, A. (1991). pH and solvent effects on the copigmentation reaction of malvin with polyphenols, purine and pyrimidine derivatives. J Chem Soc Perkin Trans, 2:1235-1241 41. Daras-Martn, J; Carrillo, M; Daz, E; Boulton, R. (2001). Ehnhancement of red wine colour by pre-fermentation addition of copigments. Food Chemistry 73, 217-220 42. Cheynier,V.; Moutounet, M; Sarni-Manchado,P. (2003). Los compuestos fenlicos, a Enologa: Fundamentos cientficos y tecnolgicos. 43. Asen, S; Stewart, RN; Norris, KH; Co-pigmentation of anthocyanins in plant tissues and its effect on color; Phytochemistry 11:1139-1145 (1972)
209
Sntesi dantocians en cultius in vitro
En les darreres dcades ha esdevingut un rpid increment de la recerca cientfica i tecnolgica en lmbit dels cultius vegetals. Amb aquest terme es defineix el cultiu in vitro de plantes, llavors, parts de planta (teixits, rgans, embrions, cllules, protoplasts, etc.) en un medi nutrient sota condicions asptiques 314. Aquest camp dinvestigaci es basa en la premissa que les plantes es poden separar en els seus components (rgans, teixits o cllules), que desprs poden ser manipulats in vitro i, sovint, regenerar plantes completes315. Histricament, els cultius vegetals neixen a partir de les afirmacions de la Teoria Cellular de Schwann (1839), primer a sostenir que cada cllula dun organisme, en condicions adequades, s capa dun desenvolupament independent. Aquesta teoria, doncs, est lligada al concepte de totipotncia: la capacitat duna cllula de regenerar el fenotip de lorganisme complet i diferenciat del qual deriva.316 Els primers intents de cultius in vitro daten de principis del segle XX, quan Haberlandt, el 1902, establ el cultiu en medi sal suplementat amb sacarosa de cllules del teixit mesfil de les fulles. No obstant aix, aquestes cllules no van dividir-se, a causa de la manca de factors reguladors del creixement en el medi. Per s comunament acceptat el seu nom com a pare del cultiu tissular 317. Els primers cultius tissulars vertaders, en el sentit estricte de cultius prolongats de materials no-organitzats, no arribaren fins el 1939, en qu Gautheret, Nobecourt i White, en treballs independents, utilitzaren cllules meristemtiques per generar cultius de creixement continu de tomquet, pastanaga i de tabac. Poc temps desprs es van iniciar cultius dembrions (1941) i de cal.lus (1942), a partir dels quals es podien regenerar rgans (1950). En les dcades posteriors sestabl el paper de les vitamines i dels factors de creixement, com ladenina (1950), les citokinines o les auxines, que intervenen decisivament
314 315 316
Chawla, HS. (2002). Introduction to plant biotechnology. Second edition, Science Publishers, Inc. Hall, RD. (1999). Plant cell culture protocols; Humana Press Ignacimuthu, S. (1997).Plant Biotechnology, Science Publishers, inc.
213
en els processos de diferenciaci cellular i dorganognesi, claus en els cultius cellulars, ja que determinen si aquests es dirigiran a un estadi de dediferenciaci cel.lular o b a un estadi de competncia previ a un procs de diferenciaci (organognesi) que condueixi a la regeneraci de lrgan o de la planta318. A partir del 1960 es va desenvolupar la micropropagaci, s a dir, la multiplicaci vegetativa in vitro, i els cultius de cllules en suspensi a partir del trencament dels cultius de cal.lus. Als anys 70 sestabl la inducci de lembriognesi somtica, procs mitjanant el qual sobtenen embrions no-zigtics que desenvolupen posteriorment la planta sencera, i el cultiu de protoplasts, cllules vegetals de les quals sha extret la paret. Actualment, grcies a la tecnologia de lADN recombinant, shan pogut efectuar transformacions de cl.lules, amb la qual cosa sobtenen per regeneraci plantes modificades genticament amb nous carcters (transgniques: resistncia a herbicides, insectes, virus,etc.) 319
2. COMPONENTS DELS CULTIUS VEGETALS Els cultius vegetals consisteixen en (esquema III.1) un material vegetal, al que sanomena explant, que en condicions asptiques es fa crixer i dividir en un medi nutrient sota unes condicions determinades i fixades.
Condicions asptiques
Explant Medi nutrient Condicions ambientals
Esquema III. 1. Cultius vegetals
317
Gautheret, RJ. (1985). History of plant tissue and cell culture: a personal account; a Cell culture and somatic cell genetic of plants, vol 2, Ed . Vasil. Academic Press, Inc. 318 Schwarz, O; Beauty, RM. (1996). Propagation from nonmeristematic tissues organogenesis. A Plant Tissue Culture Concepts and Laboratory exercises; Ed. Trigiano, RN; Gray, DJ. CRC Press 319 Chawla, HS.(2002) Transgenics in crop improvement a Introduction to plant biotechnology. Second edition, Science Publishers, Inc.
214
Segons la naturalesa de lexplant, sestableixen 4 tipus diferents de cultius vegetals: a) Cultius de plantes completes b) Cultius drgans/teixits c) Cultius de cal.lus d) Suspensions cel.lulars a i b) Cultius de plantes completes i drgans i teixits Tant en els cultius de plantes completes com en els drgans i teixits, lexplant s teixit meristemtic, que en les condicions adequades es desenvolupa fins regenerar el teixit, lrgan o la planta. En aquests casos, els cultius mantenen una integritat estructural i, per tant, una estabilitat gentica i metablica. Aix fa que, a part de la seva utilitzaci per efectuar estudis de les propietats fisiolgiques dels teixits/rgans/plantes en condicions ambientals ben definides, tamb sutilitzin per la propagaci clonal despcies, coneguda amb el nom de micropropagaci, lesquema general de la qual es presenta en la figura III.1 320. La micropropagaci s la multiplicaci vegetativa in vitro, que proporciona una descendncia clonal, i s molt important en casos despcies de difcil multiplicaci.321. Amb aquesta tcnica, saconsegueixen multiplicacions rpides, que poden arribar a ser de 1 mili a lany.
Fragmentaci
Etapa 1: Establiment en cultiu
Etapa 2: Multiplicaci dels propguls
Etapa 3: Arrelament
Planta mare
Pas a torretes
Etapa 4: Transferncia a lambient natural
figura III.1. Representaci general de la tcnica de micropropagaci

320
Vieitez, AM; Ballester,A; Vieitez, ML; Sanjose, MC; Vieitez, P; Vieitez, E. (1987). Propagacin de planata leosas por cultivos in vitro. Dip. Provincial, Pontevedra 321 Rout,R; Samantaray, S; Das, P. (2000). In vitro manipulation and propagation of medicinal plants; Biotechnology advances, vol 18 (2), 91-120
215
c) Cultius de cal.lus Els cal.lus (figura III.2) sn masses en contnua divisi dagregats cel.lulars desorganitzats i pobrament diferenciats. Es fan crixer generalment en plaques Petri, tubs de vidre o Erlenmeyers sobre medi solidificat amb agar322. A causa daix, hi ha gradients qumics i fsics en la massa de cal.lus, ja que hi ha un aport unidireccional de nutrients (provinents del medi Figura III.2. Cultiu de cal.lus de Vitis vinifera nutritiu, que es troba a sota) i de gasos i de llum (que provenen de damunt)323. En termes morfolgics, poden ser molt variables: des dels cal.lus durs/compactes, en qu les cl.lules tenen un extens i fort contacte, als cal.lus friables, consistents en petits agregats de cl.lules pobrament associades. Aquests darrers sn els ms adequats per la posterior iniciaci de suspensions cel.lulars 324. En general, la font de lexplant en els cultius de cal.lus sn regions drgans que es fereixen en la planta. Quan un rgan s lesionat, sindueix una resposta de reparaci de la zona lesionada que consisteix a la inducci de la divisi de les cl.lules adjacents per sellar la ferida, i posteriorment sendureix la zona amb dipsits de lignina, suberina, cera, etc per tal de recuperar la barrera protectiva de la planta. Si es trasllada la zona ferida a un cultiu asptic abans que la resposta comenci, es poden aconseguir els cultius de cal.lus, en qu la resposta inicial de divisi pot ser estimulada i induda per continuar indefinidament sota la influncia exgena de la composici qumica del medi de cultiu323 . Els cultius de cal.lus tenen un ampli rang daplicacions. Poden ser utilitzats directament com a font de material cel.lular per a estudis bioqumics, per a la producci de metablits secundaris, o per a la regeneraci de plantes i lobtenci de variants somaclonals. Per la seva utilitzaci ms comuna s com a pas intermedi per la iniciaci de cultius de suspensions cel.lulars325.
322 323
Pieik, RLM. (1987). In vitro culture of higher plants Martins Mijhoff Publishers Hall, RD. (1991). The initiation and maintenance of callus cultures of carrot and tobacco; a Plant Tissue Culture Manual; ed. K Lindsey; Kluwer Academic Publishers. 324 Dixon, RA. (1985). Isolation and maintenace of callus and cell suspension cultures; a Plant cell culture: a practical approach, ed RA Dixon; IRL Press 325 Caponetti, JD. ((1996). Nutrition of callus cultures; a Plant tissue culture concepts and laboratory exercises, ed RN Trigiano, DJ Gray; CRC Press
216
d) Suspensions cel.lulars Idealment, un cultiu de suspensi de cl.lules de planta consistiria en una poblaci de cl.lules allades en suspensi, en agitaci contnua, en un medi nutritiu lquid. Per generalment no sassoleix, perqu sempre es troba un cert grau dassociaci. De fet, sovint els cultius amb agregats de 0.5-1 mm de dimetre sn ms assequibles, creixen perfectament i depenent de lobjectiu de la recerca sn suficients per complir els requisits de treball (malgrat que, com ms fina s una Figura III.3. Suspensions cel.lulars de Vitis vinifera varietats Gamay Freaux i suspensi, major s la uniformitat del cultiu). 326 Gamay Freaux tintorera, fetes crixer en Les suspensions cel.lulars ms utilitzades sn de erlemneyers tipus BATCH, en qu les cl.lules es fan crixer en un volum fix de medi lquid i es mantenen rutinriament transferint una porci del cultiu crescut a nou medi fresc a intervals regulars (figura III.3). En general, les cl.lules duna suspensi tenen vacuoles relativament grans, una fina capa de citoplasma i una paret cel.lular fina i arrodonida (figura III.4). Les suspensions cel.lulars constitueixen una poblaci relativament homognia de cl.lules que poden ser exposades rpidament i uniforme a agents qumics addicionats Figura III.4. Cl.lules (x400) de exgenament, i sn el material a escollir per experiments Vitis vinifera en suspensi. bioqumics que investiguen la inducci enzimtica 327,328 lexpressi gnica 329,330, el metabolisme dels compostos addicionats 331 i lallament i caracteritzaci de mutants 332. No obstant aix, la principal utilitzaci daquest tipus de cultius en suspensi s la producci de metablits secundaris dinters industrial o teraputic.
326 327
Hall, RD. (1991)The initiation and maintenance of plant cell suspension cultures a Plant Tissue Culture Manual; ed RD.Hall; Kluwer Academic Publishers Drnenburg, H; Knorr, D. (1988). Monitoring the impact of high-pressure processing on the biosynthesis of plant metabolites using plant cell cultures, Trends in Food Science & Technology , vol 9 (10), 355-361 328 Anderson, M,D.; Chen, Z; and Klessig; D. (1998). Possible involvement of lipid peroxidation in salicylic acid-mediated induction of PR-1 gene expression , Phytochemistry , Vol 47(4) 555-566 (1998) 329 Parmentier-Line,C; Panta,G; Rowland, L. (2002). Changes in dehydrin expression associated with cold, ABA and PEG tretaments in blueberry cell cultures; Plant Science, 162 (2) 273-282 330 Sobkowiak,R; Deckert,J. (2003).Cadmium-induced changes in growth and cell cycle gene expression in supension-culture cells of soybean; Plant Physiology and Biochemistry , 41 (8), 767-772 331 Koehl,J; Owald,W; Kohn, H; Elstner, EF; Heiser, I. (2003). Different responses of two tobacco cultivars and their cell suspension cultures to quercinin, a novel elicitin from Phytophtora quercina; Plant Physiology and Biochemistry , vol 41 (3), 261-269 (2003) 332 Akashi, H; Kurata, H; Seki, M; Taira, K and Furusaki;, S (2002). Screening for transgenic plant cells that highly express a target gene from genetically mixed cells, Biochemical Engineering Journal, 10 (3), 175-182
217
MATERIALS I MTODES Material vegetal Els presents estudis es van efectuar amb cl.lules de Gamay Fraux, varietat tintorera, proporcionades gentilment per lequip del Dr. Latch (Tolouse). Aquest cultiu s el que sutilitza per a prcticament tots els estudis que es troben en la Bibliografia de suspensions cel.lulars en Vitis vinifera. Tamb es va establir una lnia de cultiu de cl.lules Gamay Fraux no tintorera. Ambds sobtenen a partir de cl.lules de la polpa, per en el cas de la varietat tintorera una mutaci possibilita que siguin sintetitzadores dantocians. Els primers cultius amb qu es va treballar eren cultius de cal.lus, de manera que es proced a lestabliment de les suspensions cel.lulars disgregant aquests cal.lus en medi lquid. Desprs de 3 dies, aquest medi lquid es transferia a un volum major, separant els cmuls grans. Aquest pas s important, ja que si no les suspensions tindrien un baix grau de friabilitat, que condiciona lhomogenetat del cultiu. Medi El medi utilitzat era el Murashige-Skoog amb modificacions333.
Macroelements de Gamborg Nitrat de potassi Sulfat damoni Clorur de calci Fosfat de sodi monosdic Sulfat de magnesi Sulfat de ferro EDTA Compostos orgnics Sacarosa Hidrolitzat de casena Factors de creixement Kinetina cid alfa-naftalenactic 2.5 g/l 150 mg/l 150 mg/l 150 mg/l 250 mg/l 139.5 mg/l 186.6 mg/l 20 g/l 250 mg/l Microelements de Murashige i Skoog Sulfat de mangans cid bric Sulfat de zenc Iodur potssic Molibdat de sodi Sulfat de coure Clorur de cobalt 10 mg/l 3 mg/l 2 mg/l 0.75 mg/l 0.25 mg/l 0.25 mg/l 0.25 mg/l
0.2 mg/l 0.1 mg/l
Vitamines de Morel Pantotenat de calci Inositol Biotina cid nicotnic Tiamina Piridoxina
1 mg/l 0.1 g/l 0.01 mg/l 1 mg/l 1 mg/l 1 mg/l
El pH sajustava a 6.0 amb KOH 2M. En el cas del medi slid, es suplementava el medi amb una concentraci de 7 g/l dagar bacteriolgic americ.
333
Gamborg, O. (1991). Media preparation; a Plant Tissue Culture Manual; ed Robert D.Hall; Kluwer Academic Publishers
218
Les suspensions cel.lulars es mantenen a temperatura ambient (ca 25 C), amb un fotoperiode de 12 hores a 6000 lux, i en agitaci constant de 150 rpm. Per mantenir els cultius de cal.lus, es transfereix aspticament una petita porci del cultiu en un medi fresc. El subcultiu sestableix cada quatre setmanes. En canvi, les suspensions cel.lulars, en presentar un creixement molt ms rpid, requereixen dun canvi de medi setmanal. Es transfereix aspticament 1/5 del volum del cultiu inicial en medi fresc. Conv dir que, a causa dels treballs de diversos autors, que senyalen que les transferncies successives acaben fent que es perdin les condicions inicials de les suspensions, de forma peridica es torna a establir la suspensi cel.lular a partir del cultiu de cal.lus.
Condicions fsiques
219
REFERNCIES BIBLIOGRFIQUES
1.
Chawla, HS . (2002). Introduction to plant biotechnology. 2nd edition, Science Publishers, Inc. 2. Hall, RD. (1999). Plant cell culture protocols; Humana Press 3. Ignacimuthu, S. (1997).Plant Biotechnology, Science Publishers, inc. 4. Gautheret, RJ. (1985). History of plant tissue and cell culture: a personal account; a Cell culture and somatic cell genetic of plants, vol 2, Ed . Vasil. Academic Press, Inc. 5. Schwarz, O; Beauty, RM. (1996). Propagation from nonmeristematic tissues organogenesis. A Plant Tissue Culture Concepts & Laboratory exercises; Ed. Trigiano, RN; Gray, DJ. CRC Press 6. Chawla, HS .(2002) Transgenics in crop improvement a Introduction to plant biotechnology. Second edition, Science Publishers, Inc. 7. Vieitez, AM; Ballester,A; Vieitez, ML; Sanjos, MC; Vieitez, P; Vieitez, E. (1987). Propagacin de planata leosas por cultivos in vitro. Dip. Provincial, Pontevedra 8. Rout,R; Samantaray, S; Das, P (2000). In vitro manipulation and propagation of . medicinal plants; Biotechnology advances, vol 18 (2), 91-120 9. Pieik, RLM. (1987). In vitro culture of higher plants Martins Mijhoff Publishers 10. Hall, RD. (1991). The initiation and maintenance of callus cultures of carrot and tobacco; a Plant Tissue Culture Manual; ed. K Lindsey; Kluwer Academic Publishers. 11. Dixon, RA. (1985). Isolation and maintenace of callus and cell suspension cultures; a Plant cell culture: a practical approach, ed RA Dixon; IRL Press 12. Caponetti, JD. ((1996). Nutrition of callus cultures; a Plant tissue culture concepts and laboratory exercises, ed RN Trigiano, DJ Gray; CRC Press 13. Hall, RD. (1991) The initiation and maintenance of plant cell suspension cultures a Plant Tissue Culture Manual; ed RD.Hall; Kluwer Academic Publishers 14. Drnenburg, H; Knorr, D. (1988). Monitoring the impact of high-pressure processing on the biosynthesis of plant metabolites using plant cell cultures, Trends in Food Science & Technology, vol 9 (10), 355-361 15. Anderson, M,D.; Chen, Z; and Klessig; D. (1998). Possible involvement of lipid peroxidation in salicylic acid-mediated induction of PR-1 gene expression , Phytochemistry, Vol 47(4) 555-566 (1998) 16. Parmentier-Line,C; Panta,G; Rowland, L. (2002). Changes in dehydrin expression associated with cold, ABA and PEG tretaments in blueberry cell cultures; Plant Science, 162 (2) 273-282 17. Sobkowiak,R; Deckert,J. (2003).Cadmium-induced changes in growth and cell cycle gene expression in supension-culture cells of soybean; Plant Physiology and Biochemistry, 41 (8), 767-772 18. Koehl,J; O wald,W; Kohn, H; Elstner, EF; Heiser, I. (2003). Different responses of two tobacco cultivars and their cell suspension cultures to quercinin, a novel elicitin from Phytophtora quercina; Plant Physiology and Biochemistry, vol 41 (3), 261-269 (2003) 19. Akashi, H; Kurata, H; Seki, M; Taira, K and Furusaki S (2002). Screening for transgenic plant cells that highly express a target gene from genetically mixed cells, Biochemical Engineering Journal, 10 (3), 175-182 20. Gamborg, O. (1991). Media preparation; a Plant Tissue Culture Manual; ed Robert D.Hall; Kluwer Academic Publishers
220
Captol 5. Influncia de diferents factors en la sntesi dantocians en cultius in vitro
5.1) INTRODUCCI Les plantes constitueixen una via de subministrament de carbohidrats, protenes i greixos, principalment en lmbit de lalimentaci. Per a ms, tamb constitueixen una valuosa font dun rang molt ampli de metablits secundaris, que sn utilitzats com a productes farmacutics, agroqumics, aromes, colorants, biopesticides i additius alimentaris. En termes globals, el 80% dels aproximadament 30 000 productes naturals coneguts sn dorigen vegetal.334 Els cultius cel.lulars sn una estimable font alternativa a la planta completa per a lobtenci de metablits dalt valor afegit. En ser cl.lules indiferenciades totipotents, cadascuna delles ret tota la informaci gentica i per tant s capa de produir tot el ventall de productes qumics que sintetitzava la planta sencera. A ms, presenta lavantatge que els cultius cel.lulars no es veuen afectats per les limitacions geogrfiques, estacionals i climtiques335. Daquesta manera, shan utilitzat cultius cel.lulars per lobtenci de diversos compostos, que es recullen en la taula 5.1:
COMPOSTOS FENLICS ALCALOIDES 336 TERPENOIDES 337 QUINONES 338 ESTEROIDES 334
Antocians Estilbens Tanins339 Flavanols340 cids fenlics 341 Lignines
Acridines Betalanes Quinolizidines Furonoquinones Isoquinolines Purines Piridines
Carotens Monoterpens Sesquiterpens Diterpens Triterpens
Antroquinones Benzoquinones Naftoquinones
Glicsids cardacs Pregnenolona
Taula 5.1. Metablits dinters obtinguts mitjanant suspensions cel.lulars vegetals

334 335 336
Ramachandra, S,. Ravishankar, G.A. (2002).Plant cell cultures:Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances 20 101153 DiCosmo, F; Misawa, M. (1995). Plant cell and tissue culture: alternatives for metabolite production. Biotechnology advances, 13 (3): 425-453 Wink, M. (1987). Physiology of the accumulation of secondary metabolites with special reference to alkaloids; a Cell culture and somatic cell genetics of plants, ed F Constabel i IK Vasil; Academic Press 337 Banthorpe, DK. (1988). Monoterpenes and sesquiterpenes; a Cell culture and somatic cell genetics of plants. Volume 5: Phytochemicals in plant cell cultures; Ed F. Constabel; IK Vasil; Academic Press 338 Koblitz, H. (1988). Anthraquinones; a Cell culture and somatic cell genetics of plants. Volume 5: Phytochemicals in plant cell cultures; Ed F. Constabel; IK Vasil; Academic Press 339 Yazaki, K; Yoshida, T; Okuda, T. (1991). Tannin production in cell suspension cultures of Geranium thunbergii. Phytochemistry, 30 (2): 501-503 340 Prusky, D; Hamdan, H; Ardi, R; Keen, NT. (1996). Induction of biosynthesis of epicatechin in avocado suspension cells treated with an enriched CO2 atmosphere. Physiological and molecular plant pathology, 48, 171-176
223
Cal tenir present que els metablits secundaris es caracteritzen per la seva baixa abundncia relativa (aproximadament de menys del 1% del carboni total de la planta) 342. Per tant, conv buscar estratgies per augmentar-ne la productivitat en els cultius. Per a aix, es busca provocar condicions destrs en el cultiu, la qual cosa saconsegueix incidint sobre el medi nutrient o les condicions ambientals. Les situacions destrs (canvis en la pressi osmtica, temperatura, condicions de pH, toxines , infeccions virals, radiaci UV) canvien els patrons cel.lulars de protenes, de manera que, en general, promouen les vies de metabolisme secundari enfront de les de metabolisme primari i conseqentment, condueixen a la formaci de metablits secundaris.
Suspensions cellulars productores dantocians Els antocians sn uns dels metablits secundaris ms presents en els cultius in vitro, a causa dels seus possibles usos com a colorants alimentaris, i com a preparats farmacutics. En el primer camp, sapliquen en refrescos, melmelades, o productes de pastisseria. Quant als seus efectes teraputics, com succeeix amb altres compostos fenlics, tenen activitats quimiopreventives antimutagniques343, antihipertensives, antioxidatives 344, i de reducci de lesions heptiques345. Shan establert cultius productors dantocians en patata 346, rosa347, pastanaga348, maduixa349 i Vitis350, a ms daltres espcies 351,352,353,354,355. Per a cada tipus, la composici antocinica s diferent.
341
Funk, C; Brodelius, PE. (1992). Phenylpropanoid metabolism in suspension cultures of Vanilla planifolia Andr. IV. Induction of vanillic acid formation. Plant Physiol 99, 256-262 342 Bourgaud, F.; Gravot, A; Milesi. S:; Gontier, E. (2001). Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science 161: 839851 343 Castonguay,A; Gali, H; Perchellet, E; Gao, X; Boukharta, M; Jalbert, G; Okuda, T; Yoshida, T; Hatano, T; Perchellet, JP. (1997). Antitumorigenic and antipromoting activities of ellagic acid, ellagitannins, and oligomeric anthocyanin and procyanidin. Int. J. Oncol. 10, 367-373 344 Espin, JC; Soler-Rivas, C; Winchers, HJ; Garcia-Viguera, C. (2000). Anthcoyanin-based natural colorants: a new source of antiradical activity for foodstuff. J Agric Food Chem, 48, 1588-1592 345 Magnuson, BA. (2002).Evidence of cancer inhibition by anthocyanin-rich extracts. a I Konezak-Islam (ed.), Proceedings of the International Workshop on anthcoyanins resrearch and development in anthocyanins, Australia, p 23. 346 Konczak-Islam, I; Okuno, S.; Yoshimoto, M; Yamakawa, O. (2003); Composition of phenolics and anthocyanins in a sweet potato cell suspension culture, Biochemical Engineering Journal, 14 (3): 155-161 347 R. Filippini, R. Caniato, A. Piovan and E. M. Cappelletti . (2003). Production of anthocyanins by Catharanthus roseus, Fitoterapia, 74 (1-2), 62-67 348 Ozeki, Y. (1996). Regulation of anthocyanin synthesis in carrot suspension cultured cells; J Plant Res, 109: 343-351 349 Wei, Z; Seki, M; Furusaki,S.; Middelberg, APJ. (1998). Anthocyanin Synthesis, Growth and Nutrient Uptake in Suspension Cultures of Strawberry Cells, Journal of Fermentation and Bioengineering, 86 (1), 72-78 350 Hirasuna,T.J; Shuler, M.L.; Lackney, VK; Spanswick, R.M. (1991). Enhanced anthocyanin production in grape cell cultures, Plant Science , 78 (1): 107-120 351 Meyer, J.E; Ppin, MF; Smith, M.A. (2002). Anthocyanin production from Vaccinium pahalae: limitations of the physical microenvironment. Journal of Biotechnology, 93 (1), 45-57 352 Callebaut, A.; Hendrickx, G.;. Voets, A. M; Motte, J. C.. (1990). Anthocyanins in cell cultures of Ajuga reptans. Phytochemistry , 29(7): 2153-2158 353 Zhong J, Yoshida, T. (1993). Effects of temperature on cell growth and anthocyanin production in suspension cultures of Perilla frutescens. Journal of Fermentation and Bioengineering, 76 (6), 530-531 354 Wellmann, E; Hrazdina, G; Grisebach, H; (1976) Induction of anthocyanin formation and of enzymes related to its biosynthesis by UV light in cell cultures of Haplopappus gracilis. Phytochemistry, 15(6): 913-915
La majoria daquests cultius sn heterogenis, on creixen simultniament cllules pigmentades i cllules no pigmentades356. Totes tenen en major o menor mesura - la capacitat de sintetitzar antocians 357 per aquesta no s expressada en les cl.lules no pigmentades358. Aix fa que la freqncia de les cl.lules pigmentades pugui ser molt baixa, ja que la pigmentaci prov d un procs de citodiferenciaci 359. Per obtenir uns rendiments adequats dantocians, la bibliografia proposa solucions diverses. Molts investigadors augmenten la productivitat seleccionant lnies cel.lulars potencialment productives. Per altra banda, la biosntesi est condicionada tamb per factors fsics i qumics del cultiu, com sn la mida de lincul, el pH, la temperatura, ls del.licitors, la llum, lestrs hdric, o la font de nitrogen. En el cas concret de les suspensions cel.lulars de Vitis vinifera, sha constatat que, a ms dantocians, tamb sn una font valuosa daltres compostos, com estilbens360 o catequines 361, que en moltes ocasions han estat descrits com a compostos biolgicament actius. En aquest sentit, un ampli camp daplicaci dels cultius in vitro contempla lobtenci en quantitats suficients daquests compostos per tal de disposar, amb el fi defectuar estudis de bioactivitat362, dun material de partida suficient i econmic que fins i tot pot obtenir-se marcat si es subministren precursors radioactius en el medi363. Per altra banda, les supensions cel.lulars han perms lallament i caracteritzaci de nombroses activitats enzimtiques difcilment allables in vivo364,365,366, o lelucidaci dels mecanismes pels quals actuen els atacs fngics sobre el ram367,368.
355
Kakegawa, K; Hattori, E; Koike, K; and Takeda, K. (1991). Induction of anthocyanin synthesis and related enzyme activities in cell cultures of Centaurea cyanus by UV-light irradiation, Phytochemistry , 30 (7): 2271-2273 356 Hall, RD; Yeoman, MM. (1986). Temporal and spatial heterogeneity in the accumulation of anthocyanins in cell cultures of Catharanthus roseus. J Exp Botany, 37, 486-498 357 Hall, RD; Yeoman, MM. (1987). Intercellular and intercultural heterogeneity in secondary metabolite accumulation in cultures of Catharanthus roseus following cell line selection. J Exp Botany , 38(193):1391-1398 358 Marshall, Smith. MA; Lee, C; Deroles, S; Davies, KM. (2002). Differential gene expression between pigmented and non-pigmented cell culture lines of Daucus carota. Plant Cell, Tissue and Organ Culture , 70:91-97 359 Seitz, HU; Hinderer, W. (1988). Anthocyanins; a Cell culture and somatic cell genetics of plants. Volume 5: Phytochemicals in plant cell cultures; Ed F. Constabel; IK Vasil; Academic Press 360 Waffo, T; Decendit, A: Vercauteren, J; Deffieux, G; Mrillon, JM. (1996). Trans-resveratrol-3-O- -glucoside (piceid) in cell suspension cultures of Vitis vinifera; Phytochemistry , 42(6), 1591-1593 361 Decendit, A; Gopal, K; Waffo, P; Deffieux, G; Badoc, A; Mrillon, JM. (1996). Anthocyanins, catechins, condensed tannins and piceid production in Vitis vinifera cell bioreactor cultures. Biotechnology letters, 6: 659-662 362 Waffo, P; Fauconneau, B; Dffieux, G; Huguet, F; Vercauteren, J; Mrillon, JM. (1998). Isolation, identification, and antioxidant activity of three stilbene glucosides newly extracted from Vitis vinifera cell cultures. J Nat Prod, 61: 655-657 363 Krisa, S; Waffo, P; Dcendit, A; Deffieux, G; Vercauteren, J; Mrillon, JM. (1999). Production of 13C-labelled anthocyanins by Vitis vinifera cell suspension cultures. Phytochemistry , 51: 651-656 364 Bailly, C; Cormier, F; Do, CB. (1997). Characterization and activities of S-adenosyl-L-methionine:cyanidin 3-glucoside 3-O-methyltransferase in relation to anthocyanin accumulation in Vitis vinifera cell suspension cultures. Plant Science 122:81-89 365 Lofty, S; Fleuriet, A; Ramos, T; Macheix, JJ. (1989). Biosynthesis of phenolic compounds in Vitis vinifera cell suspension cultures: study on hydroxycinnamoyul CoA:ligase. Plant Cell Reports, 8:93-96 366 Suzuki, N; Sakuta, M; Shimizu, S; Komamine, A. (1995). Changes in the activity of 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate (DAHP) synthase in suspension-cultured cells of Vitis. Physiologia Plantarum, 94: 591-596 367 Deswarte, C; Canut, H; Klaebe, A; Roustan, JP; Fallot, J. (1996). Transport, cytoplasmatic accumulation and mechanism of action of the toxin eutypine in Vitis vinifera cells. J Plant Physiol, 149: 336-342
225
5.2) OBJECTIUS 1. Estudiar la influncia de diferents factors sobre la sntesi dantocians en cultius in vitro, per tal dobtenir unes condicions de treball que siguin adequades per efectuar-ne estudis metablics. 2. Avaluar els canvis en la composici antocinica que provoquen els diferents agents.
5.3) MATERIALS i MTODES Els medis de cultiu es preparaven seguint les condicions descrites en lapartat general de cultius cel.lulars. Les paricularitats de cada experiment shan indicat en lapartat de resultats i discussi, per facilitar la lectura de la memria.
Determinacions
Pes fresc: Es filtra un volum de 5 ml de suspensi, i es renta amb aigua destil.lada per eliminar restes de sucres. Es pesen les cl.lules. Pes sec: Es transfereix un volum de cl.lules a un filtre sec i tarat, es deixa 24 hores a 60C i es determina el pes sec per diferncia de pes. Nombre de cl.lules: Cal un tractament previ amb trixid de crom al 70% per disgregar els cmuls de cl.lules. Sincuba 1 hora a 60C, sagita vigorosament i sefectua el comptatge en una cambra de Neubauer. Antocians totals: Es pesa una quantitat de 100 mg de material fresc i saplica 1 ml de soluci detanol absolut al 80% amb HCl 1 N. Es llegeix labsorbncia a 535 nm al cap dun dia. Pels clculs saplica el coeficient dextinci molar de la peonidina-3-glucsid 369(15100 l/mol*cm), que s lantoci majoritari en aquests cultius. Antocians individuals: Lextracci i la quantificaci dels antocians per HPLC sefectua seguint les mateixes directrius que shan exposat en el captol 1. Anlisi de glucosa, fructosa, sacarosa: Sutilitza el kit de determinaci enzimtic de Roche.
368
Morales, M; Bru, R; Garca-Carmona, F; Ros-Barcel, A; Pedreo, MA. (1998). Effect of dimethyl- -cyclodextrins on resveratrol metabolism in Gamay grapevine cell cultures before and after inoculation with Xylophilus ampelinus. Plant, cell, tissue and organ culture , 53:179-187 369 Cabrita, L; Fossen, T; Andersen, MO. (2000). Colour and stability of the six common anthocyanidin-3-glucosides in aqueos solutions; Food Chem. 68: 101107
5.4) RESULTATS I DISCUSSI I. Factors que influeixen en la sntesi dantocians totals
5.4.1. Efecte de lestrs osmtic Laigua s essencial com a medi per a les activitats bioqumiques de la cllula. Un dels recursos ms utilitzats en suspensions cellulars per augmentar la productivitat de metablits dinters s afegir al medi de cultiu un agent osmtic. Lestat hdric de la cllula dependr de lenergia lliure de les seves molcules daigua, que constitueix el seu potencial hdric. En una cllula, aquest potencial consisteix bsicament en el potencial de turgncia i el potencial osmtic. Mentre mantenen una pressi de turgncia positiu, les cllules han de regular el seu potencial osmtic per ajustar-se al potencial osmtic extern370. Daquesta manera, si simposen potencials osmtics elevats en el medi de creixement, saltera lactivitat cellular, i aix pot conduir a la sntesi de metablits secundaris. Els soluts ms freqentment utilitzats per incrementar la pressi osmtica del medi sn els alcohols de glcids (poliols) com el manitol, el sorbitol o el polietilenglicol.
Per avaluar la incidncia de lestrs osmtic sobre el creixement i la producci dantocians, es va treballar en el medi base de Murisahge-Skoog (80 ml), al qual es va afegir sorbitol en condicions creixents (75 mM, 150 mM, 225 mM) en erlenmeyers de 250 ml. Lelecci del sorbitol com a agent destrs osmtic es fonament en la seva condici de nometabolitzable per les cllules, en el sentit que s metablicament ms inert que altres sucres 371, de manera que el seu efecte es manifestar principalment com a agent dincrement de losmolaritat del medi.
Control
Sorbitol 75 mM
Sorbitol 150 mM
Sorbitol 225 mM
Es va determinar levoluci en el pes fresc, el pes sec i lacumulaci dantocians per les diferents condicions.
370 371
Xiong, L. Zhu, JK. (2002). Molecular and genetic aspects of plant responses to osmotic stress. Plant, Cell and Environment, 25: 131-139 Wang, HL; Lee, PD; Liu, LF; Su, JC. (1999). Effect of sorbitol induced osmotic stress on the changes of carbohydrate and free amino acid pools in sweet potato cell suspension cultures. Bot. Bull. Acad. Sin. 40:219-225
227
1.1) Pes fresc Les corbes de creixement dels cultius vegetals presenten una fase de latncia, 0.2 en qu les cllules sadapten a les noves 0.15 condicions del medi, una etapa de creixement exponencial, en qu hi ha una 0.1 contnua divisi mittica, i una darrera 0.05 fase estacionria en qu comena la mort cellular 372. Aquest comportament 0 dia 16 0 2 4 6 8 10 12 14 sobserva en el grfic 5.4.1.1, que recull la control sorbitol 75 mM sorbitol 150 mM sorbitol 225 mM progressi del pes fresc de cl.lules al Grfic 5.4.1.1. Evoluci del pes fresc dels cultius en diferents situacions destrs hdric llarg del cultiu, per a diferents concentracions de sorbitol en el medi. Sobserva que el creixement cel.lular en les condicions control va comenar al 4t dia i va mostrar el comportament sigmoidal tpic. En anar augmentant losmolaritat del medi, es retardava linici de la fase exponencial, de manera que en unes concentracions de 75 i 150 mM de sorbitol aquesta etapa no siniciava fins al 5 dia, i en el cas de les concentracions de 225 mM no sapreciava una fase clara fins al 7 dia. En condicions destrs osmtic, la densitat del cultiu est clarament disminuda respecte les condicions control, de manera proporcional a lestrs imposat en el medi. Es troben diferncies significatives en el creixement entre cadascuna de les condicions destrs aplicades. Aix resulta despecial inters a lhora de seleccionar el que sanomena medi de producci dels metablits secundaris, ja que sha darribar a un comproms entre la sntesi i la capacitat de creixement del cultiu.
0.25 pes fresc (g/lm) pes fresc
1.2) Pes sec En la grfica del pes sec (grfica 5.4.1.2) saprecia tamb el comportament sigmoidal tpic, per en aquest cas no hi ha diferncies entre les corbes de creixement en condicions control i en condicions estressades. En canvi, en la fase estacionria en situaci control, hi ha una disminuci clara en el pes sec, que correspondria a una fase de mortalitat. Els resultats indiquen que el contingut daigua de les cllules s clarament diferent en una situaci control respecte una situaci amb estrs osmtic. En situaci control, el volum cellular s major, i per aix el pes fresc resulta ms elevat, per una bona part daquest pes
372
King, PJ; Street, HE. (1977). Growth patterns in cell cultures; a Plant tissue and cell culture; edited by HE Street; Blackwell Scientific Publications

0.014
fresc laporta laigua que contenen les cl.lules. Aix fa que els pesos secs sigualin. Cal tenir en compte que en les situacions destrs a qu est sotms el medi de cultiu, la diferncia de concentraci salina entre el medi intracel.lular i extracel.lular s molt forta, de manera que un transport daigua dintre de la cllula suposaria un gran gast control sorbitol 75 mM sorbitol 150 mM sorbitol 225 mM energtic per poder vncer el gradient. En Grfic 5.4.1.2. Evoluci del pes sec en cultius en diferents canvi, en les cl.lules control, els principals situacions destrs hdric soluts del medi (concretament, la font de carboni: la sacarosa) van desapareixent en ser metabolitzats per al creixement cellular, de manera que desapareix aquest estrs i poden incorporar majors quantitats daigua.
pes sec (g/ml)
0.012 0.01 0.008 0.006 0.004 0.002 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 dia
1.3) Nombre de cl.lules Les grfiques de pes fresc i pes sec plantejaven un dubte: si el pes sec era 3.E+06 similar en totes les condicions, podria succeir que en realitat les diferncies en el 2.E+06 pes fresc no corresponguessin a un major 1.E+06 nombre de cl.lules, sin simplement a un major contingut daigua de les mateixes. 0.E+00 0 2 4 6 8 10 12 En alguns protocols sutilitza el dia control sorbitol 75 mM sorbitol 150 mM sorbitol 225 mM comptatge de cl.lules com a mesura de Grfic 5.4.1.3. Evoluci del nombre de cl.lules totals en cultius en diferents situacions destrs hdric creixement en suspensions cel.lulars 373. Per s necessari vncer linconvenient de lelevat grau dagregaci que presenten les cl.lules en aquests tipus de cultius. Per a aix, la metodologia ms comunament utilitzada en la bibliografia s el tractament amb trixid de crom per trencar aquests cmuls. En la grfica 5.4.1.3 es presenta el resultat de mesures per triplicat del nombre de cl.lules comptades en una cambra de Neubauer. Es pot observar que les condicions ms drstiques destrs, que sn les de sorbitol 225 mM, provoquen un menor nombre de cl.lules en el medi, mentre que en les condicions control hi ha una
nombre de cl.lules / ml 4.E+06 cl.lules
373
Stepan-Sarkissian, G; Grey, D. (1990). Growth and determination and medium analysis a Methods in Molecular Biology. Plant Cell and Tissue Culture, vol 6; JW Pollard & JM Walker; The Humana Press
229
major proliferaci cel.lular. Per tant, podem concloure que les situacions destrs inhibeixen efectivament la divisi mittica i la multiplicaci cel.lular. No obstant aix, els resultats presenten un error estndard molt gran , ja que el tractament amb el trixid de crom no acaba de disgregar els cmuls i aix dificulta lhomogenetat de la mostra en el moment de fer el comptatge, com es pot veure en la figura 5.4.1. Per aquest motiu es va decidir descartar aquesta metdica com a mesura de creixement. De fet, la majoria de grups que treballen amb cultius cel.lular refereixen els seus resultats respecte a pesos (frescs o secs).
Figura 5.4.1. Observaci de les cl.lules de suspensions cel.lulars de Vitis vinifera al microscopi ptic (100 augments)
1.4) Antocians Pel que fa a la producci dantocians pel cultiu, es pot observar (grfic 5.4.1.4) que hi ha un increment en la quantitat referida al pes fresc fins arribar a un mxim en el moment que comena el creixement exponencial, a partir del qual es multiplica la massa cellular, la cllula entra en divisi contnua, i la relaci metablit secundari/pes fresc va disminuint. La concentraci dantocians en un medi estressat arribava als 1400
g/g
antocians ( g/g pes frec)
1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16
control
sorbitol 75 mM
sorbitol 150 mM
s o r b i t o l 2 2 5 dia mM
Grfic 5.4.1.4. Evoluci del nombre de cl.lules totals en cultius en diferents situacions destrs hdric
pes fresc, que corresponen a aproximadament el doble de les condicions no estressades. De fet, els darrers dies la coloraci de les cl.lules en condicions control deixa de ser pigmentada per ser blanca, en un efecte que es manifesta en major grau en les situacions menys estressades. Si es deixen passar uns dies, la coloraci passa a ser marronosa, caracterstica dels compostos fenlics oxidats.374
374
Cormier, F; Couture, R; Do, CB; Pham, TQ; Tong, VH. (1997). Properties of anthocyanins from grape cell culture; J. Food Science, 62 (2), 246-248
Discussi
Diversos treballs en qu s utilitzen agents com la sacarosa o el manitol estableixen lacumulaci dantocians en situacions destrs osmtic. En el cas de la sacarosa, en ser un substrat metabolitzable per la cl.lula, el potencial osmtic canvia al llarg dels dies de cultiu. Do i Cormier375 mesuren el potencial osmtic de la soluci i observen un increment en els primers dies, atribuble a laugment de sucres reductors provinents de la hidrlisi de la sacarosa, i una disminuci a partir que les cl.lules comencen a metabolitzar-los. El mateix equip 376 posa de manifest que en les condicions destrs es produeix un augment del nombre de cl.lules pigmentades, en un procs de dediferenciaci daquestes cl.lules no productores, de tal manera que lacumulaci dantocians estaria promoguda per un increment del nombre de cl.lules que nexpressen les vies. Alguns autors sostenen la relaci entre la producci dantocians i la interrupci de la divisi cel.lular, que menaria a una mxima acumulaci en la fase estacionria 377. A la vista de loposici dels nostres resultats i els daltres autors a aquestes hiptesis, l afirmaci sembla al menys, discutible, tot i poder dependre de les condicions del cultiu i de lexplant utilitzat. Tholakalabavi et al.378 en suspensions de pollancre posen de relleu que en les situacions destrs osmtic causades per glucosa o manitol, lligat a lacumulaci dantocians hi ha un increment de lactivitat deaminasa, que s la que condueix a la producci de compostos fenlics. A ms, tamb observen que les cl.lules estressades acumulen altres soluts com sucres, aminocids, i cids orgnics. Tot aix sembla ser conseqncia del menor volum cellular que assoleixen les cl.lules en condicions dalta pressi osmtica. El comportament que sobserva en general s que, en augmentar el contingut de sacarosa en els medis, disminueix el pes fresc i augmenta lacumulaci dantocians375, 379. Tot i aix, la productivitat no augmenta en el mateix sentit, ja que la inhibici del creixement pot representar una producci global neta dantocians inferior. Per tant, quan es pretn lobtenci industrial dantocians, sn aconsellables medis amb un estrs no tan rigors, ja que en situacions estressants excessives t lloc una prematura mort cel.lular i un emmarroniment dels cultius per acci oxidativa.
375
Do, CB; Cormier, F. (1990). Accumulation of anthocyanins enhanced by a high osmotic potential in grape (Vitis vinifera L.) cell suspensions. Plant cell Reports, 9:143-146 376 Cormier, F; Crevier, H; Do, CB. (1990) Effects of sucrose concentration on the accumulation of anthocyanins in grape (Vitis vinifera) cell suspension.. Can J Bot, 68: 1822-1825 377 Kakegawa, K; Suda, J; Sugiyama, M; Komamine, A. (1995). Regulation of anthocyanin biosynthesis in cell suspension cultures of Vitis in realtion to cell division. Physiologia plantarum 94:661-666 378 Tholakalabavi, A; Zwiazek, J; Thorpe, T. (1997). Osmotically-stressed poplar cell cultures: anthocyanin accumulation, deaminase activity, and solute composition. J. Plant Physiol, 151: 489-496 379 Mori, T; Sakurai, M. (1995). Effects of riboflavin and increased sucrose on anthocyanin production in suspended strawberry cell cultures. Plant Science 110: 147-153
231
Com ja sha comentat en el bloc 1 de la present tesi, tamb in vivo es dna lefecte positiu de lestrs hdric sobre la sntesi dantocians. En aquest sentit, la disponibilitat de suspensions cel.lulars pot ser de molta utilitat a lhora dinvestigar a nivell molecular i enzimtic les raons daquest comportament.
5.4.2) Efecte de lestrs nitrogenat La composici mineral dels medis de cultiu de supensions cel.lulars vegetals pot ser complexa. Dentre els seus components, la font de nitrogen s un dels que ha acaparat ms atenci respecte al seu efecte en la sntesi de productes secundaris. El nitrogen pot ser subministrat en forma de nitrat o sals damoni, o en forma de compostos orgnics (aminocids, urea, hidrolitzat de casena). La limitaci en el subministrament de nitrogen a les cl.lules cultivades tendeix a suprimir-ne el creixement i, en alguns sistemes, afavorir la sntesi de productes secundaris. Sha comprovat que el ratio amoni/nitrat i els nivells totals de nitrogen afecten marcadament la producci daquests metablits secundaris334. Per avaluar lefecte de les carncies de nitrogen, es va decidir comparar les situacions control amb situacions de carncia de nitrat i amb situacions dexcs de nitrat. A ms, es va afegir el factor destrs hdric en concentracions 150 mM, a partir de lexperiment anterior. Daquesta manera, es van establir 6 condicions de treball:
0 mM sorbitol 150 mM sorbitol
0 g/l nitrat
Medi 0 Medi C Medi 50
Medi 0s Medi Cs Medi 50s
2,5 g/l nitrat
5 g/l nitrat
En els medis 0 i 0s, en qu no safegeix nitrat, es va suplementar el medi amb sulfat potssic per tal dequilibrar la concentraci de ions respecte la soluci control (C) i daquesta manera corregir el diferent estrs hdric que suposa la diferent concentraci de nitrat de la soluci control respecte la condici destrs nitrogenat.
Es van efectuar les determinacions de pes fresc, pes sec i antocians totals. 1) Pes fresc En la grfica de pes fresc (grfica 5.4.2.1) es pot apreciar, com en 250 lexperiment anterior, que les condicions destrs osmtic (0s, Cs, 50s) 200 presenten un creixement menor que les 150 respectives condicions control (0, C, 50) per tots tres casos. 100 Pel que fa a la resposta en relaci a la 50 font nitrogenada, saprecia clarament que la 0 carncia de nitrat inhibeix drsticament el 0 2 4 6 8 10 0 0s c cs 50 50s pes fresc de les cl.lules, que tenen una fase exponencial molt menys acusada en el cas Grfic 5.4.2.1. Evoluci del pes fresc dels cultius en destrs nitrogenat (0). En les situacions diferents situacions destrs nitrogenat ms extremes, que sn les destrs nitrogenat i estrs hdric (0s), fins i tot no sestableix la corba de creixement sigmoidal tpica, sin una fase contnua i lenta de creixement.
300
pes fresc
pes fresc (mg/ml)
2) Pes sec Els cultius no presenten tantes diferncies quant als pesos secs (grfica 5.4.2.2). Saprecia que les condicions sense estrs hdric (0, C, 50) presenten la fase exponencial amb una anticipaci dun dia respecte les condicions estressades. Per altra banda, el creixement global en la situaci en carncia de nitrat (0) s significativament menor a partir del comenament de la fase exponencial del creixement, com era desperar, ja que el nitrogen s essencial per al creixement i la divisi cellular.
pes sec (mg/ml)
12
pes sec
10
0 0 2 0 4 0s c cs 6 50 8 50s 10
Grfic 5.4.2.2. Evoluci del pes fresc dels cultius en diferents situacions destrs hdric
233
3) Antocians Quant a la producci dantocians 1200 (grfic 5.4.2.3), la sntesi est molt 1000 incrementada en les situacions dabsncia 800 de nitrat en el medi (0, 0s). El fet que el metabolisme primari i el creixement 600 estiguin inhibits en aquestes condicions 400 estimula clarament el metabolisme secundari. En aquest cas, a diferncia del 200 que succea en el de lestrs osmtic, el 0 mxim no sassoleix en el moment previ a 0 2 4 6 8 10 0 0s c cs 50 50s linici de la fase exponencial, sin que va Grfic 5.4.2.3. Evoluci del contingut en antocians dels cultius augmentant linealment fins al perode en diferents situacions destrs hdric estacionari. Aix concorda amb el que descriuen diversos autors, que situen en aquesta fase del creixement lacumulaci de metablits secundaris. Com hem pogut establir en aquestes experincies, sembla que aquesta afirmaci noms s certa en aquells casos en qu hi ha una inhibici prou marcada de la multiplicaci cellular, ja que en cas contrari la maquinria metablica afavoreix el metabolisme primari. Per altra banda, tamb cal fer la consideraci que, a mesura que el cultiu creix, desapareix el nitrat del medi, sense que aix suposi una activaci de la biosntesi dantocians per part del cultiu. Aix significaria que el moment en qu es determina que el cultiu sigui productor o no del metablit dinters s en la fase de latncia.
antocians ( g/ml)
antocians
La font de nitrogen s un dels parmetres ms importants en la producci dantocians en suspensions cel.lulars. Diversos estudis mostren que el tipus i el contingut de font nitrogenada afecten tant al creixement com al rendiment de productes secundaris formats. En general, un increment de les fonts de nitrogen condueix a un increment del creixement del cultiu i a una disminuci de lacumulaci dantocians 380, 381. Per resulten ms decisius que el nitrogen total els continguts en amoni i nitrat, i la relaci entre ambds. Aix, per
380
Discussi
Do, CB; Cormier, F. (1991). Effects of high ammonium concentrations on growth and anthocyanin fromation in grape (Vitis vinifera L.) cell suspension cultured in a product medium. Plant, cell, tissue and organ culture , 27:169-174 381 Mori, T; Sakurai, M. (1994). Production of anthocyanin from strawberry cell suspension cultures; Effects of sugar and nitrogen. (1994). Journal of food science, 59(3): 588-593
exemple, Mori i Sakurai381 constaten que una baixa relaci amoni:nitrat dna productivitats superiors en cultius de maduixa, i en aquestes condicions la producci s superior en concentracions 30 mM de la suma dels dos compostos que no pas a 60 mM. En la present tesi, per, obtenim uns valors de producci dantocians molt elevats quan la relaci entre amoni i nitrat s alta. Aquesta caracterstica diferenciaria les suspensions cel.lulars de maduixa de les de Vitis. Estudis de Do i Cormier380 tamb senyalen aquest efecte negatiu en lacumulaci dantocians en Vitis de laugment en la font damoni. Altres estudis fets amb hbrids de Vitis tamb troben aquest efecte espectacular de producci dantocians en medis on sha suprimit el nitrat, en una acci que no es reprodueix en la supressi de cap altre component del medi. Aquest fet implica que la seva repercussi transcendeix als efectes de la simple limitaci de nutrient 382. Una proposta que plantegen Hirasuna et al.350 s que el nitrat de les vacuoles s expulsat al citoplasma per compensar les mancances en el medi, i llavors les cl.lules podrien utilitzar la incorporaci dels antocians en les vacuoles per compensar losmolaritat. En aquesta incorporaci participaria lATPasa del tonoplast, enzim que s inhibit en excs de nitrat. En augmentar la divisi cel.lular, lestat de la majoria de cl.lules s la divisi mittica i, per tant, les vies de metabolisme secundari es troben inhibides. Per aquest motiu, els mxims de sntesi es situen poc abans del comenament de la fase exponencial. En canvi, en les situacions destrs nitrogenat, en qu la divisi mittica est inhibida al llarg de tot el cicle, els mxims de sntesi arriben ms tard, quan la cl.lula es troba ja en plena fase exponencial, i es mantenen en la fase estacionria.
Lefecte inhibidor del contingut antocinic per labundncia de font nitrogenada s un efecte que tamb es dna in vivo, tot i que no en aquestes escales. Alts continguts de nitrogen retarden lacumulaci de compostos fenlics, especialment dantocians, en la baia383. En aquest sentit, com ja succea amb les condicions destrs hdric, la disponibilitat de cultius cel.lulars pot ser dajuda a lhora dabordar els efectes bioqumics que expliquen aquest fenomen.
382
Kim, S; Kim, S. (2002): Effect of nitrogen source on cell growth and anthocyanin production in callus and cell suspension cultures of Sheridan grapes. J Plant Biotechnology, 42:83-89 383 Keller, M; Hrazdina, G. (1998). Interaction of nitrogen availability during bloom and light intensity during veraison. II. Effects on anthocyanin and phenolic development during grape ripening. Am J Enol and Vitic , 49(3): 341-349
235
5.4.3. Efecte del pH: El pH s un parmetre fonamental en els medis de cultiu, ja que s fcil de manipular, i afecta el balan inic del medi, que influeix a la vegada en la producci de metablits secundaris en cultius de plantes. En general, la majoria de medis sutilitzen en un rang de pH entre 5.0-6.0, tot i ser qestionable que aquest sigui el rang adequat per qualsevol lnia cel.lular. 384 Autors com Zhang troben mxima acumulaci dantocians en cultius de maduixa a pH superiors (8.7), mentre que per a cultius de Vitis es troben valors mxims dacumulaci a pH cids385. El pH del medi de cultiu es mant relativament constant, tot i que pot variar per efecte de la lisi cel.lular. 386 Per a estudiar la influncia del pH en la producci dantocians, es va treballar amb 5 valors de pH; un que correspon a les condicions habituals de preparaci del medi (pH=6.0), dos de ms cids (4.75, 3.5) i dos de ms bsics (7.25, 8.5). Lexperiment es va repetir en 4 condicions diferents destrs: un medi control (C); un medi amb estrs nitrogenat (0), en qu es suprimeix el nitrat del medi; un medi amb estrs osmtic (Cs), en qu safegeix sorbitol al medi control; i un medi amb estrs nitrogenat i estrs hdric (medi 0s), sense nitrat per amb sorbitol.
pH 0 0S C CS 3.5 4.75 6 7.25 8.5
Estrs nitrogenat : 0 g/l nitrat Estrs nitrogenat + estrs osmtic 0 g/l nitrat, 150 mM sorbitol Control Estrs osmtic 150 mM sorbitol
En lestudi, es va determinar el pH de la soluci, el pes fresc, i el contingut en antocians totals.
384
Zhang, W; Furusaki, S. (1997). Regulation of anthocyanin synthesis in suspension cultures of strawbeery cell by pH; Biotechnology Leters, 19 (11), 10571061 385 Suzuki, M. (1995). Enhancement of anthocyanin accumulation by high osmotic stress and low pH in grape cells (Vitis hybrids); J. Plant. Physiol. 147, 152155 386 Jardin, B; Tom, R; Chavarie, C; Rho, D; Archambault, J. (1995). Stimulated indole alkaloid release from Catharanthus roseus immobilized cultures. Initial studies; J Biotechnol 21: 43-62
1. pH
pH
7.0
pH
7.0
0
6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 0 2 4 6 8 10 12 14
0S
6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 0 2 4 6 8 10 12 14
pH
pH
7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 0 2 4 6 8 10 12 14
7.0
Cs
6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 0 2 4 6 8 10 12 14
pH=3.5
pH=4.75
pH=6
pH=7.25
pH=8.5
Grfics 5.4.3.1. Evoluci del pH del medi al llarg del temps en cultius en qu saplica un diferent pH inicial. Saplica en condicions destrs nitrogenat (0), control (C), destrs hdric (C s) i destrs nitrogenat i hdric (0 s).
Malgrat lampli rang imposat (3.5-8.5) en el pH dels medis preparats, no saconsegueix la seva imposici en el cultiu. El procs desterilitzaci per autoclau ja en provoca una neutralitzaci per als medis ms bsics, de manera que el rang passa a ser de 3.5-6.75. Per altra banda, es pot observar (grfics 5.4.3.1) un potent efecte tamponador de la suspensi cel.lular, de manera que per a totes les condicions de pH inicial es tendeix a un mateix valor de pH des de linici de la fase de latncia. Aquest efecte amortidor provoca que les diferncies finals daquest parmetre siguin fora menors en totes les condicions, tant de control com destrs. Tan sols les condicions ms cides mantenen el pH diferent de la resta, en els casos destrs nitrogenat (0, 0s). Aix doncs, el pH inicial no s decisiu en el pH del medi de cultiu. En canvi, s que sobserva un efecte de la situaci destrs sobre el valor de pH al qual tendeix el cultiu. En les condicions amb estrs de font nitrogenada (0, 0s) el pH sestabilitza al voltant de 5; mentre que en les condicions control de nitrogen (C, Cs) el pH del medi va augmentant a mesura que avana el creixement. Aquesta diferncia
237
provindria del diferent nivell de creixement entre les dues condicions. En les solucions control el creixement cel.lular s rpid, i sassoleix abans la fase estacionria de mort cel.lular. Sobserva un emmarroniment del medi quan sassoleix el mxim de creixement, que correspon a lalliberament del contingut citoplasmtic pel procs de necrosi cellular i la seva posterior oxidaci. Aquests processos comportarien una basificaci del medi, que es veu afavorida a ms per lelevada relaci entre massa cel.lular: medi de cultiu que t lloc en aquestes condicions. En haver-hi molt creixement, el volum de medi que resta disponible s menor i, per tant, els productes abocats resulten ms concentrats. En canvi, les condicions destrs nitrogenat mantenen durant molts dies de cultiu el color vermell caracterstic dels antocians, i en letapa estacionria el medi tendeix a acidificar-se.
2) Pes fresc
pes fresc (mg/ml)
pes fresc (mg/ml)
100
100
0s
50
50
0 0 2 4 6 8 10 12 14
pes fresc (mg/ml)
C
250
pes fresc (mg/ml)
300
300
10
12
14
Cs
250
200
200
150
150
100
100
50
50
0 0 2 4 6 8 10 12 14
0 0 2 4 6 8 10 12 14
pH=3.5
pH=4.75
pH=6
pH=7.25
pH=8.5
Grfics 5.4.3.2. Evoluci del pes fresc al llarg del temps en cultius en qu saplica un diferent pH inicial. Saplica en condicions destrs nitrogenat (0), control (C), destrs hdric (C s) i destrs nitrogenat i hdric (0 s).
En els grfics de pes fresc (grfics 5.4.3.2) es constata que per a la situaci control (C), no hi ha diferncies significatives en la corba de creixement respecte al pH inicial, aspecte que coincideix amb les observacions de Zhang et al.384 . En canvi, en les condicions destrs (0, 0s, Cs)es manifesta un efecte del pH sobre el pes fresc. Sinhibeix el creixement en les situacions ms drstiques (pH=3.5 i pH= 8.5), per no en les intermitges (pH=4.75, o 7.25). En els darrers dies, hi ha una disminuci del pes fresc en totes les condicions, que correspondria a la situaci de necrosi cel.lular ja apuntada. Aquesta situaci es manifesta de manera particular si el medi est estressat amb sorbitol (Cs). 3) Antocians
antocians ( g/g pes fresc)
6000
9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000
0
5000
0s
4000
3000
2000
1000 1000 0 0 2 4 6 8 10 12 14 0 0 2 4 6 8 10 12 14
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0 2 4 6 8 10 12 14
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0 2 4 6 8 10 12 14
Cs
pH=3.5
pH=4.75
pH=6
pH=7.25
pH=8.5
Grfics 5.4.3.3. Evoluci dels antocians totals al llarg del temps en cultius en qu saplica un diferent pH inicial. Saplica en condicions destrs nitrogenat (0), control (C), destrs hdric (C s) i destrs nitrogenat i hdric (0 s).
En les condicions estudiades, hom pot observar (grfic 5.4.3.3) que lefecte del pH difereix segons el rigor de lestrs imposat. En la situaci control (C), de mxim creixement cel.lular no influt pel pH inicial, tampoc la producci dantocians difereix
239
significativament entre uns casos i els altres, i de fet sn superiors per al pH de 6.0, considerat lestndard en el nostre medi. En canvi, per a una situaci amb estrs hdric (Cs), s la situaci de major acidesa (pH=3.5), que causava un menor creixement, la que provoca una major acumulaci dantocians. Aquest s un efecte que no est nicament relacionat amb el creixement del cultiu, ja que les condicions ms bsiques (pH=8.5), malgrat tenir un creixement similar, no comporten una major acumulaci dels antocians. En les situacions destrs nitrogenat (0), les condicions ms extremes (pH=3.5, 8.5) sn les que provoquen major contingut dantocians. I en una situaci destrs hdric i estrs nitrogenat (0s) sembla que la biosntesi est encara ms promoguda per a les condicions cides.
Discussi
El pH s un parmetre que necessita interaccionar amb algun altre factor destrs, com lestrs nitrogenat o lestrs hdric, per tal de manifestar influncia sobre la sntesi dels antocians i el seu creixement. En les condicions establertes com a control, les variacions en els dos parmetres sn discretes. En canvi, quan simposa un estrs, el pH exerceix certa influncia, de manera que en les condicions ms cides causa una disminuci del creixement i un augment de la producci dantocians. Aix est dacord amb les observacions de Suzuki385, que obtenia major producci dantocians a pH=4.5 que a 7.0 en suspensions dhbrids de Vitis en condicions destrs osmtic causat per sacarosa (30 g/l). Tot i aix, en els nostres experiments es necessit dun pH inferior per aconseguir tal efecte. Aquests resultats mostren un comportament diferent als obtinguts en cultius de maduixa per part de Zhang i Furusaki384, on es postulen les condicions bsiques com les que donen una major i ms rpida producci dantocians. Dacord amb els nostres resultats i els daltres autors 384, 387, les suspensions cel.lulars tenen un gran poder tamponador. Aix causa que el pH al cap de 3 dies depengui en major mesura de les condicions destrs del medi que no pas del pH imposat inicialment. Noms en la situaci de pH ms cid (3.5) aquesta capacitat tamponadora es veu lleugerament
387
Ho CH; Shanks, JV. (1992). Effects of initial medium pH on growth and metabolism of C. Roseus hairy root cultures. Biotechnol. Letteers, 14: 959-964
limitada, i no arriba al valor dequilibri que aconsegueixen les altres condicions. Si assumim que el valor de pH al qual tendeixen els cultius correspondria amb el valor del pH intrnsec, podem concloure que aquest valor es situa al voltant de pH=5.0 per a les condicions destrs, per s lleugerament superior en la situaci control. Aquest efecte esmortedor de les cl.lules en cultiu s similar al descrit per Zhang i Furusaki384 per a cl.lules de maduixa, tot i que en el seu experiment no treballaven amb condicions destrs osmtic ni nitrogenat. En alguns treballs, per vncer aquesta tendncia correctora del pH que sorigina en els cultius, sutilitza com a medi de cultiu una soluci tamp388, que evita lacci amortidora i no sembla provocar canvis en el creixement, per que pot conduir a diferncies en la sntesi de compostos dinters. Diversos treballs utilitzen els canvis de pH per promoure la lisi cel.lular i provocar lalliberament dels compostos dinters en el medi389, fenomen dindubtable aplicaci en processos biotecnolgics. En el nostre cas no saconsegueix aquest fet, ja que en els casos de major producci, que sn els destrs nitrogenat, no hi ha aquest alliberament; i en els casos en qu s es produeix, el fenomen t lloc quan aquests ja shan oxidat. Aix concorda amb els treballs de Cormier et al.390, que conclouen que lalliberament dels antocians de les suspensions cellulars de Vitis vinifera noms pot aconseguir-se mitjanant mtodes destructius.
388
Morgan, JA; Barney, CS; Penn, AH; Shanks, JV. (2000). Effects of buffered media upon growth and alkaloid production of Catharanthus roseus hairy roots; Appl Microbiol Biotechnol, 53: 262-265 389 Saenz LA; Maldonado, IE; Moreno, O; Ciau, R; Lopez, M; Oropeza, C; Loyola, VM. (1993). Effect of the medium pH on the release of secondary metabolites from roots of Datura stramonium. Appl Biochem Biotechnol 38:257-267
241
5.4.4) Efecte de lincul La mida de lincul s tamb un parmetre important en els subcultius de suspensions cel.lulars vegetals. Existeix una mida dincul crtica per sota de la qual el subcultiu no prosperar391, i contrriament, saconsegueix un increment de la productivitat en augmentar la mida de lincul, tot i que a partir de certs nivells ja no es modifica el mxim de concentraci cel.lular 392. A ms, lincul inicial pot tamb influir la producci de metablits. Amb aquestes premisses, es va plantejar un experiment amb diferents volums inicials dincul (300 mg, 600 mg, 900 mg i 1500 mg), per veure el seu efecte en suspensions cel.lulars de Vitis vinifera. Novament es va treballar amb les condicions destrs nitrogenat i estrs hdric. Es va determinar el creixement del cultiu mitjanant el pes fresc- i el contingut en antocians totals 1) Pes fresc
pes fresc (mg/ml)
140 120 100 80 60 40 20 0 0 2 C 4 6 8 10 12 14
pes fresc (mg/ml)
140 120 100 80 60 40 20 0 0
0S
2 CS
10
12
14
pes fresc (mg/ml)
200
pes fresc (mg/ml)

2 4 6 8 10 12 14 incul 600 mg
200
150
150
100
100
50
50
0 0
0 0 2 4 6 incul 1500 mg 8 10 12 14
incul 300 mg
incul 900 mg
Grfics 5.4.4.1. Evoluci del pes fresc al llarg del temps en cultius amb diferent mida dincul inicial (300, 600, 900 i 1500 mg). Saplica en condicions control (C), destrs nitrogenat (0), hdric (C s) i nitrogenat i hdric (0 s).
390 391 392
Cormier, F; Do, CB; Moresoli, C. (1992). Anthocyanin release from grape (Vitis vinifera L.) cell suspension. Biotechnol Letters, 14(11): 1029-1034 Su, WW; Lei, F. (1993). Rosmarinic acid production in perfused Anchusa officinalis culture: effect of inoculum size; Biotechnology letters, 15, 1035-1038 Zhong, JJ; Toshida, T, (1995). High-density cultivation of Perilla frutescens cell suspensions for anthocyanin production: Effects of sucrose concentration and inoculum size; Enzyme Microb. Technol., 17: 1073-1079
La mida de lincul modifica la corba de creixement en totes les condicions (grfics 5.4.4.1). Aquesta modificaci consisteix a un retard en linici de la fase exponencial en disminuir la mida de lincul. Aix saprecia clarament en la situaci control (C): lincul de 1500 mg arriba a la fase exponencial el 4t dia, per el de 300 mg triga 8 dies a arribar-hi. Lefecte s similar en les altres condicions. La mida inicial de lincul tamb afecta al mxim de poblaci cel.lular que es pot aconseguir en cada condici. En la situaci control (C) no sobserven diferncies, ja que tots els inculs emprats arriben a un pes fresc de 200 mg/ml. En canvi, en les condicions destrs hdric (Cs) i destressos nitrogenats (0, 0s), hi ha una relaci directa: en disminuir el volum inicial que es subcultiva, disminueix el creixement del cultiu. Sarriba a un valor crtic en les condicions destrs nitrogenat (0, 0s): el menor incul, de 300 mg, no prospera, el seu creixement cel.lular est gaireb totalment inhibit. 2) Antocians
a n t o c i a n s ( g/g pes fresc)
5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0 2 4 6 8 10 12 14 0
5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0 2 Cs 4 6 8 10 12 14 0s
5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0 2 4 6 8 10 12 14 C
5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0 2 4 6 8 10 12 14
incul 300 mg
incul 600 mg
incul 900 mg
incul 1500 mg
Grfics 5.4.4.2. Evoluci dels antocians totals endel temps en cultius amb diferent mida dincul inicial (300, 600, 900 i 1500 mg). Saplica en condicions control (C), destrs nitrogenat (0), hdric (C s) i nitrogenat i hdric (0 s).
243
La influncia de la mida de lincul quant a lacumulaci dantocians (grfics 5.4.4.2) est molt lligada al creixement cellular que possibilita. En les condicions sense estrs nitrogenat (C, Cs), en augmentar la mida de lincul augmenta el creixement i disminueix el mxim dacumulaci dantocians. Com ja succea amb el creixement, lacumulaci tamb es retarda segons la mida de lincul. En les situacions destrs nitrogenat (0, 0s), la mida de lincul no tindria un paper tan rellevant, ja que els valors mxims de concentraci sn similars independentment de lincul.
Discussi
La mida de lincul inicial determina el creixement i el contingut dantocians que es poden obtenir en les supensions cellulars. En les nostres condicions destudi, un incul de 1500 mg en un volum de 100 ml permet la mxima proliferaci cellular en la situaci control, per tamb la mnima sntesi dantocians. Inculs menors provoquen lefecte contraposat. Aquest efecte de lincul tamb lobserven Mori et al.393 en cultius de maduixa: en augmentar-ne la mida, diminueix la productivitat. En canvi, en altres cultius com els de Perilla frutescens, la mxima producci dantocians t lloc com ms gran s lincul 392 . Tanmateix, en ambds treballs estableixen uns valors crtics per sobre i per sota dels quals no sestimula la producci. En el nostre experiment no sembla que hgim assolit aquest valor crtic mnim en les condicions sense estrs nitrogenat, ja que lincul menor (300 mg) encara dna un creixement comparable al de la resta dinculs i, per altra banda, incrementa notablement lacumulaci dantocians. Contrriament, en situacions destrs resulta ja excessivament redut aquest volum dincul. Altres autors350 destaquen que en la producci dantocians en cultius de ram no s noms important la mida de lincul, sin tamb el nombre de subcultius que se nhan fet prviament. Desprs duna srie de subcultius en medi nutrient, t lloc una reducci de la producci dantocians; en canvi, en suspensions fresques iniciades de cal.lus la producci s sensiblement major.
393
Mori, T; Sakurai, M; Shigeta, J; Yoshida, K; Kondo, T. (1993). Formation of anthocyanins from cell cultured from different parts of strawberry plants. Journal of Food Science , 58(4): 788-792
5.4.5) Efecte de la font de carboni Un dels principals requeriments del medi de cultiu en les suspensions cel.lulars s la font de carboni. La majoria dels cultius no sn autotrfics, s a dir, no sn capaos de fixar el carboni mitjanant la fotosntesi; i per aix s necessari afegir sucres al medi nutrient. Shan provat un gran nombre de fonts de carboni per comprovar-ne la capacitat per suportar el creixement de cultius cel.lulars vegetals.394. Dentre ells, els que donen millors rendiments de producci de biomassa sn la sacarosa i la glucosa, per el seu comportament s diferent. Per altra banda, tamb shan descrit altres carbohidrats, com la fructosa o la trehalosa, que poden utilitzar-se com a font de carboni. La trehalosa s un disacrid com la sacarosa, per de paper completament contrari: t un efecte protector contra la deshidrataci, les altes i baixes temperatures, i lestrs osmtic. 395 A ms dinfluir en la biomassa, un increment en la concentraci de sucres pot comportar un increment en el rendiment de producci de metabolisme secundari, a causa de lestrs hdric que suposa. Per tal destudiar la diferent resposta de les suspensions cel.lulars de Vitis vinifera a la font de carboni, es van plantejar les segents condicions destudi:
0 Medi fructosa Medi glucosa Medi sacarosa Medi trehalosa 0s C Cs 21 g/l fructosa 21 g/l glucosa 20 g/l sacarosa 22 g/l trehalosa
Novament es van plantejar els experiments en 4 situacions diferents, corresponents a la condici control (C), destrs hdric (Cs), destrs nitrogenat (0) i de combinaci dels dos estressos (0s).
394
Fowler, MW; Stepan-Sarkissian, G. (1985). Carbohydrate source, biomass productivity and natural product yield in cell suspension cultures; a Primary and seconsary metabolism o f plant cell cultures, KH Neumann, W Barz & E Reinhard, Ed Springer-Verlag
395
Novo,MT; Beltran, G; Torija, MJ; Poblet, M; Rozs, N; Guillamn, JM; Mas, A; . (2003). Changes in wine yeast storage carbohydrate levels during preadaptation, rehydration and low temperature fermentations; Int.J. Food Microbiology 86: 153-161
245
1) Pes fresc En primer lloc, analitzem la influncia de la font de carboni sobre el creixement en cada condici (grfics 5.4.5.1):
pes fresc (mg/ml)
0
100
pes fresc (mg/ml)
0s
100
50
50
2 C
10
12
14
2 Cs
10
12
14
pes fresc (mg/ml)
200
pes fresc (mg/ml)
200
150
150
100
100
50
50
10 08 2 medi fructosa
12 4
6 medi glucosa
14
2 10 8 medi sacarosa
12 6 14 8 medi trehalosa
10
12
14
Grfics 5.4.5.1. Evoluci del pes fresc al llarg del temps en cultius amb diferenst font de carboni (fructosa, glucosa, sacarosa i trehalosa). Saplica en condicions control (C), destrs nitrogenat (0), hdric (C s) i nitrogenat i hdric (0 s).
La utilitzaci de sacarosa com a substrat promou en totes les condicions estudiades un creixement superior i un inici de la fase exponencial ms preco. En laltre extrem es situa la trehalosa, que retarda el creixement en totes les condicions, de manera que no sarriba a establir clarament una fase exponencial. Per en contraposici, el creixement en medi trehalosa s el que resulta ms independent de les condicions del medi. La glucosa i la fructosa tenen un comportament intermedi entre els dos extrems. Dentre les dues, la glucosa s el substrat ms aprofitable per al creixement. La fructosa s fora menys utilitzable, sobretot en les condicions destrs hdric (0s, Cs); i de fet en la situaci 0s inhibeix completament el creixement. s ressaltable que en les condicions control (C), a excepci de la trehalosa, tots els carbohidrats utilitzats condueixen a un creixement similar. En canvi, en les situacions destrs hdric (0s, Cs) sestableixen clarament diferncies en aquest creixement final en el sentit de mxim creixement en medi sacarosa.
2) Consum de sucres Les segents grfiques recullen la dinmica de metabolitzaci dels sucres durant els dies de cultiu. Es presenten, per cada medi, les 4 condicions destrs amb qu sha treballat. a) Medis sacarosa
18 18 0
sucres (g/l)
sucres (g/l)
16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 18 2 4 6 8 10
16 14 12 10 8 6 4 2 0
0s
12 18 C
10
12
14
sucres (g/l)
sucres (g/l)
16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 2 4 6 8 10 12
16 14 12 10 8 6 4 2 0
Cs
14
10
12
14
glucosa
fructosa
sacarosa
Grfics 5.4.5.2. Dinmica dels hidrats de carboni en els medis sacarosa en les diferents condicions destudi. 0= estrs nitrogenat; 0s= estrs nitrogenat+estrs hdric; C= control; Cs= estrs hdric
Els grfics 5.4.5.2 mostren els canvis dinmics de la sacarosa, la glucosa i la fructosa durant el cultiu en els medis preparats amb sacarosa com a font de carboni. En totes les condicions, la sacarosa s hidrolitzada extracel.lularment a glucosa i fructosa. Aquest fet es posa de manifest per la disminuci en la concentraci de sacarosa i el concomitant augment de les concentracions de glucosa i fructosa. Aquests sistema de captaci de sacarosa est descrit en un rang ampli de cultius cel.lulars, com per exemple cultius de maduixa, de teix o de rosa394, 396, i shan desenvolupat models matemtics que relacionen aquesta conversi amb el creixement del cultiu i la producci de metablits secundaris397,398.
396
Zhang, W; Seki, M; Furusaki, S; Middelberg, AP. (1998). Anthocyanin synthesis, growth and nutrient uptake in suspension cultures of strawberry cells. Journal of Fermentation and Bioengineering, 86(1): 72-78 397 Ppin, MF; Archambault, J; Chavarie, C; Cormier, F. (1995). Growth kinetics of Vitis vinifera cell suspension cultures: I. Shake Flask Cultures; Biotechnology and bioengineering, 47: 131-138 398 Guardiola, J; Iborra, JL; Cnovas, M. (1995). A model taht links growth and secondary metabolite production in plant cell suspension cultures. Biotechnology and Bioengineering, 46: 291-297
247
En essncia, la conversi consisteix a la hidrlisi de la sacarosa en el medi extern, en la superfcie de la paret cellular o en linterior de la paret. Els monosacrids obtinguts entrarien posteriorment al citosol per incorporar-se a les vies metabliques. Aquesta activitat invertasa tamb ha estat decrita en cultius drgans concretament de baia- de ram, i Prez et al. han comprovat399 que augmenta amb la concentraci de sacarosa del medi. Aquesta activitat est establerta tamb in vivo, associada al desenvolupament de la baia. Aix, arriba a un valor mxim quan ha comenat lacumulaci de sucres, i posteriorment decreix lleument400. Durant els primers dies, i coincidint amb la fase de latncia del cultiu, augmenta el contingut de glucosa i fructosa en el medi, productes de la hidrlisi de la sacarosa. Posteriorment, per, sn metabolitzats, i sinicia la fase de creixement exponencial dels cultius. Els nivells de glucosa sn en tot moment inferiors que els de fructosa, cosa que indica que la primera es metabolitza preferentment. En el moment que sesgota, sinicia el consum actiu de la fructosa. Les niques diferncies que comporten les diferents situacions destrs consisteixen a retardar aquests processos. Aix doncs, no semblen afectar lactivitat invertasa, per lesgotament dels sucres esdev ms tard. De fet, en les condicions destrs nitrogenat (0, 0s), quan sinterromp lestudi encara es disposa de fructosa metabolitzable al medi, ja que la lentitud del creixement permet que no es consumeixi completament. b) Medis Glucosa Si es substitueix la sacarosa del medi per glucosa, desprs de la fase de latncia en comena el consum (grfics 5.4.5.3). En condicions sense estrs nitrogenat (C, Cs), de major creixement, la glucosa s ms rpidament consumida, tot i no arribar a lesgotament. En aquest punt shaur arribat a Grfics 5.4.5.3. Consum de glucosa en els medis en qu aquesta era lnica font de carboni, per a les diferents un mxim de densitat cellular, i la glucosa condicions destudi. 0= estrs nitrogenat; 0s= estrs residual indicaria un excs inicial. nitrogenat+estrs hdric; C= control; Cs= estrs hdric En canvi, en situaci destrs nitrogenat (0, 0s), els nivells de glucosa encara romanen elevats al darrer dia destudi, ja que el creixement ha estat molt inferior.
16 14 12 10
glucosa (g/l)
MEDIS GLUCOSA
8 6 4 2 0
10
12
14
0, glucosa
0s, glucosa
C, glucosa
Cs, glucosa
399
Prez, FJ; Meza, P; Berti, M; Pinto, M. (2000). Effect of carbon source and sucrose concentration on growth and hexose accumulation of grape berries cultured in vitro. Plant, cell, tissue and organ culture, 61:37-40 400 Ruffner, HP; Adler, S; Rast, DM (1990). Soluble and wall associated forms of invertase in Vitis vinifera L.. Phytochemistry 29:2083-2086
c) Medis fructosa Amb un medi en qu la font de carboni s exclusivament fructosa, el consum daquest sucre s similar del medi amb glucosa. La metabolitzaci de la fructosa resulta tamb superior en les condicions sense estrs nitrogenat, per en cap dels casos sarriba a esgotar (Grfics 5.4.5.4). fructosa, 0 fructosa, 0s fructosa, c fructosa, cs Si comparem les corbes de glucosa i Grfics 5.4.5.4. Consum de fructosa en els medis fructosa en les diferents condicions destudi. fructosa, podem observar que quan al medi 0= estrs nitrogenat; 0s= estrs nitrogenat+estrs hdric; C= noms hi ha presncia de glucosa o fructosa, es control; Cs= estrs hdric produeix un consum similar dambdues. Tenint en compte que el creixement era major en el cas del medi amb glucosa, podem concloure que la fructosa es metabolitza duna manera menys eficient. La glucosa es pot incorporar a la via glucoltica via hexoquinasa, i daqu sobt energia que la cl.lula pot consumir en el creixement. Lafinitat de lhexoquinasa per la fructosa s menor, per podria incorporar-se al metabolisme mitjanant una fructoquinasa especfica.
16 14 12 10 8 6 4 2 0
fructosa (g/l)
MEDIS FRUCTOSA
10
12
14
El fet que tant en el medi amb glucosa com en el medi amb fructosa no sescurci el periode de latncia sin que, ans al contrari, aquest es perllongui, s indicador que aquesta fase no est determinada nicament per lacci de les invertases que hidrolitzen la sacarosa als seus components. d) trehalosa
20
trehalosa (g/l)
18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 2 4 6 8
MEDIS TREHALOSA
10
12
14
0s
cs
Grfics 5.4.5.6. Consum de trehalosa en els medis en qu aquesta s la ncia font de carboni, per les diferents condicions destudi. 0= estrs nitrogenat; 0s= estrs
nitrogenat+estrs hdric; C= control; Cs= estrs hdric
Els nivells de trehalosa es mantenen fora elevats durant tot lestudi i de manera similar en totes les condicions, cosa que justifica el poc creixement cel.lular obtingut en medis que utilitzen aquesta font de carboni (Grfics 5.4.5.6). De fet, la trehalosa no s un carbohidrat energtic, sin de reserva i protecci en situacions de dessecaci.
249
3) Antocians
4500
4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0
0
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0
0s
10
12 C
14
10
12 Cs
14
3000
3000
2500
2500
2000
2000
1500
1500
1000
1000
500
500
10
12
14
10
12
14
10
12
14
medi fructosa
medi glucosa
medi sacarosa
medi trehalosa
Grfics 5.4.5.1. Dinmica dacumulaci dantocians al llarg del temps en cultius amb diferents font de carboni (fructosa, glucosa, sacarosa i trehalosa). Saplica en condicions control (C), destrs nitrogenat (0), hdric (C s) i nitrogenat i hdric (0 s).
En el cas de les fonts de carboni, no es compleix lobservaci daltres experiments conforme als quals corresponia una major productivitat dantocians en aquells casos dinhibici del creixement. En condicions destrs nitrogenat (0, 0s), la sacarosa s el substrat que dna uns rendiments superiors dantocians per pes fresc. Tenint en compte que aquesta era tamb la situaci que permetia un major creixement, podem concloure que la sacarosa resulta el substrat que sost una major productivitat. Contrriament, la trehalosa ofereix els nivells ms baixos dantocians, tot i que tolerava el mnim creixement del cultiu. En les condicions sense estrs nitrogenat (C, Cs), es mant el comportament de la trehalosa, per no aix el de la sacarosa. De fet, els nivells dantocians que sobtenen amb medi sacarosa no difereixen gaire dels que sobtenen en medi glucosa. Sembla, doncs, que en aquestes concentracions la sacarosa actuaria ms com a metablit energtic, permetent el creixement, que com a agent osmtic promotor de la sntesi dantocians. En canvi, la fructosa permet una major sntesi dantocians, especialment en el cas de lestrs osmtic (Cs). Per en aquesta ocasi, sembla clar que el comportament s a causa de la inhibici del creixement.
Discussi
Dentre totes les fonts de carboni testades, la sacarosa resulta la que proporciona major creixement en totes les condicions, i malgrat aix, la que proporciona ms elevades produccions dantocians. Altres autors arriben a la mateixa conclusi en altres cultius, com Narayan i Venkataraman401 en pastanaga, o Mori i Sakurai381 en maduixa. En aquests treballs tamb es posa de manifest que la glucosa condueix a uns creixements i produccions similars, per els resultats dels nostres experiments precisen que en situacions destrs, els medis amb glucosa veuen repercutit negativament tant el creixement com la biosntesi dantocians. La fructosa sembla inhibir el creixement i aportar una major concentraci antocinica en situacions sense estrs nitrogenat. Nagarajan et al.402 van destacar els millors rendiments que obtenien en cultius de pastanaga de la utilitzaci de fructosa, per sobre que la de sacarosa. En els treballs de Mori i Sakura381 no sobserva aquest efecte beneficis de la fructosa; i en els treballs de Narayan i Venkataraman402 fins i tot inhibeix tant el creixement com la producci dantocians. De fet, la fructosa t una metabolitzaci ms lenta que la glucosa, especialment quan es troben ambds combinats en el medi, a causa del menor rendiment energtic que sembla treure la cl.lula del seu consum. La trehalosa no s un substrat energtic per les cl.lules en suspensi. Hi ha altres sucres que es descriuen com a no metabolitzables en altres suspensions productores dantocians, com la rafinosa401; i daltres que ho sn en molt baixa proporci, com la xilosa, la manosa, la ramnosa i larabinosa381. Per de fet, la trehalosa juga altres papers que no desenvolupen les citades molcules: aquest disacrid sacumula en les vacuoles com a carbohidrat de reserva, i dna resistncia a la planta enfront la dessecaci 403. Per tant, tindria una funci protectora i no pas energtica, motiu pel qual shavia pensat en ella com a protector front a lestrs osmtic. Tanmateix, no promou la sntesi dantocians, tot i que la seva acci alentint el metabolisme es perfila de molta utilitat en la complicada labor de la crioperservaci de cl.lules 404, encara que no shan efectuat estudis concloents al respecte. Per altra banda, tamb pot ser important en la regulaci de la utilitzaci de carbohidrats i, en conseqncia, del control de la via glucoltica403 .
401
Narayan, MS; Venkataraman, LV. (2002). Effect of sugar and nitrogen on the production of anthocyanin in cultured carrot (Daucus carota) cells, J Food Science , 67(1):84-86 402 Nagarajan, RP; Keshavarz, E; Gerson, DF. (1989). Optimization of anthocyanin yield in a mutated carrot cell line (Daucus carota) and its implications in large scale production. J. Ferment. Bioeng 68:102-106 403 Schluepmann, H; Pellny, T; van Dijken, A; Smeekens, S; Paul, M. (2003). Trehalose-6-phosphate is indispensable for carbohydrate utilization and growth in Arabidopsis thaliana. Plant Biology, 100(11): 6849-6854 404 Crowe, JH; Crowe, LM; Oliver, AE; Tsvetkova, N; Wolkers, W; Tablin, F. (2001). The trehalose myth revisited: introduction to a symposium on stabilization of cells in the dry state. Cryobiology, 43: 89-105
251
II. DETERMINACI DELS ANTOCIANS INDIVIDUALS Amb levidncia que les diferents condicions aplicades sobre els cultius cel.lulars impliquen grans diferncies en el contingut total dantocians, es va plantejar analitzar si les diferents condicions conduen a diferncies tamb en el perfil antocinic.
5.4.6) Efectes dels estressos La composici dels medis destrs sefectu seguint les pautes ja exposades en el punt 5.4.1 daquest captol. Lextracci, separaci i identificaci dantocians es va efectuar de la mateixa manera que pels antocians de les pells, metodologia ja descrita en el captol 1. Els cromatogrames 5.4.6.1 recullen els perfils en diferents condicions destrs al 7 dia de cultiu.
Pn-3-glu
CONTROL (C)
Cy-3-glu
Cy-ac-glu
Pn-ac-glu Cy-pc-glu
Pn-pc-glu
Pn-3-glu
Estrs hdric Cs)
Pn-pc-glu Cy-ac-glu Pn-ac-glu Cy-pc-glu
Cy-3-glu
Pn-3-glu
Estrs nitrogenat (0)
Cy-3-glu Mv-3-glu Pt-3-glu Dp-3-glu Cy-ac-glu Pn-ac-glu
Cy-pc-glu
Pn-pc-glu
Mv-pc-glu Mv-ac-glu
Pn-3-glu
Estrs hdric + Estrs nitrogenat (0s)
Cy-3-glu
Cy-pc-glu Mv-3-glu Dp-3-glu Pt-3-glu Cy-ac-glu Pn-ac-glu Mv-ac-glu
Pn-pc-glu
Mv-pc-glu
Cromatogrames 5.4.6.1. Modificaci del perfil antocinic de les suspensions cel.lulars en funci de lestrs aplicat al medi. Dp=delfinidina; Cy=cianidina; Pt=petunidina; Pn=peonidina; Mv=malvidina; ac=acil; pc=pcumaroil
En les suspensions cel.lulars de Gamay Freaux lantoci majoritari s la peonidina, seguit de la cianidina. Aix representa un tret diferencial respecte els antocians de les pells, que fonamentalment eren malvidnics. Es pot constatar que les condicions destrs, a ms de conduir a un increment net dels antocians totals, tamb sn responsables de canvis en la seva composici, especialment en els casos destrs nitrogenat. Aix doncs, malgrat que es produeix un increment de concentraci en tots els antocians, composicionalment no augmenten tots de la mateixa manera. Sestableix una diferncia en el contingut dantocians acilats en el residu glucosdic. Com sobserva als cromatogrames 5.4.6.1 i es representa a la figura 5.4.6.1, les situacions destrs comporten un increment composicional de les formes p-cumaroilades, i una disminuci de les acetilades i les no acilades respecte la situaci control. Tant en la situaci destrs hdric (Cs) com en la destrs nitrogenat (0) saconsegueixen unes proporcions del 49% en antocians p-cumaroilats, i una disminuci significativa dels no acilats. La combinaci dels dos estressos (0s) no t un efecte sinrgic, ja que els nivells dantocians no acilats es mantenen paradoxalment ms estables sota lefecte dambds estressos.
Control ("C")
acetilats 18% pcumarilats 23% no acilats 59%
Estrs hdric ("Cs")

pcumarilats 49% acetilats 15% no acilats 36%
Estrs nitrogenat ("0")

Estrs nitrogenat +Estrs hdric ("0s")

Figura 5.4.6.1. Percentatges composicionals dels antocians no acilats, dels acetilats i dels p-cumarilats segons les condicions destrs imposades al medi.
En altres captols ja hem destacat la importncia de lacilaci en lestabilitzaci del color mitjanant el procs de copigmentaci. Per a ms, en lmbit dels cultius cel.lulars, resulta interessant perqu est presumiblement involucrada en el transport dantocians cap a les vacuoles 405, en les quals hi ha una acumulaci preferent daquests antocians respecte els no acilats406.
405
Springob, K; Nakajima, J; Yamakazi, M; Saito, K. (2003). Recent advances in the biosynthesis and accumulation of anthocyanins. Nat Prod Rep, 20: 288303 406 Conn, S; Zhang, W; Franco, C. (2003). Anthocyanic vacuolar inclusions (AVIs) selectively bind acylated anthocyanins in Vitis vinifera L. (grapevine) suspension culture. Biotechnology Letters, 25:835-839
253
Tamb sestableixen diferncies quant als 5 antocians monoglucsids. Com es pot veure en el cromatograma 5.4.6.1 i com es plasma en la figura 5.4.6.2, lestrs nitrogenat causa un increment dels antocians totals, per a nivell composicional hi ha una control estrs hdric ests nitrogenat estrs nitrogenat + estrs hdric disminuci relativa de les quantitats de dp-3-glu cy-3-glu pt-3-glu pn-3-glu mv-3-glu peonidina, tot i que continua sent Figura 5.4.6.2. Percentatges composicionals dels 5 antocians no acilats, segons les condicions destrs imposades lantoci majoritari, i un increment en al medi. els nivells de cianidina. Tamb en aquestes condicions augmenten les concentracions de delfinidina, petunidina i malvidina, que en les condicions control i destrs hdric sn quasi indetectables. Lincrement de concentraci, aix com el diferent perfil dantocians, s el que justifica laspecte que presenten les cl.lules crescudes en condicions destrs nitrogenat, que sn duna tonalitat vermell intens molt ms acusada que les condicions control, en qu el cultiu adquireix tonalitats rosades.
100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%
Aquests resultats ens porten a establir les segents consideracions sobre les rutes biosinttiques en cultius cel.lulars (figura 5.4.6.3): El fet que en les Fenilalanina condicions destrs hdric no hi hagi un increment concomitant Naringenina flavanona tant dels nivells de Pn-pc-glu F3'H F3'5'H Dihidrokaempferol com de Pn-3-glu, suggereix que Cianidina Delfinidina lacilaci de lantoci s un procs posterior a la formaci delfinidina-3-glucsid cianidina-3-glucsid de lantocianidina. Els antocians, segons el model de Roggero, es MT MT MT sintetitzen a partir de metilaci seguint dues vies:
UFGT UFGT
OH
OH
OH H
OH OH
HO
HO
OGl uc
OGl uc
OH
OH
OM e
O Me
OM e
OH H
OH
OH
HO
HO
OH OGluc
HO
O Me OGluc
OGl uc OH
OH
OH
peonidina-3-glucsid
petunidina-3-glucsid
malvidina-3-glucsid hidroxilasa;
a) Cianidina Peonidina b) Delfinidina Petunidina Malvidina
Figura 5.4.6.3. Ruta biosinttica de formaci dels antocians.

F3H=flavonoid-3hidroxilasa; F35H= flavanoid 35 MT=metiltransferasa; UFGT: UDP flavanoid glucodil transferasa
Sembla, doncs, que en els cultius la via que predomina s la primera. Aix implica que en les cl.lules mutants de la varietat Gamay Freaux estaria inhibida lactivitat de la flavanoid-35-hidroxilasa, que s la que condueix a la sntesi de delfinidina. En canvi, les condicions destrs permeten lactivaci dels enzims de la segona via, i aix condueix a la sntesi daquests 3 antocians. En treballs de Nakamura407, postulen un increment de la metilaci en limitar el creixement en cultius de maduixa. En condicions de baixos nivells dauxina -concretament, lcid 2,4-diclorofenoxiactic (2,4-D) sinhibeix el creixement, i hi ha un increment del ratio peonidina:cianidina. Aix fa que els autors suggereixin un efecte dactivaci de lantocian-metiltransferasa (MT), que s lenzim responsable, per metilaci de lanell B de lantoci, de la transformaci de cianidina a peonidina. Els resultats que observem en el nostre cas, s a dir, lincrement en els nivells de cianidina, indicarien un altre mecanisme dactuaci i que, per tant, la inhibici del creixement seria una altra conseqncia, i no pas la causa, del canvi en les vies biosinttiques dantocians. Conv mencionar que es van efectuar determinacions similars per als altres factors que influeixen el contingut total dantocians (pH, mida de lincul i font de carboni). Tanmateix, i tot i que en alguns treballs amb altres cultius shan manifestat diferncies408, en cap cas sapreciava una variaci respecte la corresponent condici (control, estrs nitrogenat o estrs hdric) de referncia.
1b. Reaccions de biotransformaci per produir antocians acilats La constataci que el perfil dantocians pot ser modificat en funci de les condicions del medi ens va portar a plantejar un experiment de biotransformaci. Sentn com a Biotransformaci laprofitament de la maquinria dels cultius vegetals per tal de modificar substrats que safegeixen al medi en nous productes de superior valor afegit. En el nostre cas, pretenem que subministrant al medi un agent acilant es dugus a terme la reacci dacilaci en els cultius cel.lulars, i obtenir antocians substituts en el residu glucosdic amb diferents agents acilants. Els antocians acilats sn molt apreciats en lmbit de la indstria alimentria com a additius colorants, ja que presenten una major estabilitat que els
407
Nakamura, M; Seki, M; Furusaki, S;. (1998). Enhanced anthocyanin methylation by growth limitation in strawberry suspension culture; Enzyme Miucrob. Technol., vol 22, 404-408 408 Sakurai, M; Mori, T; Seki, M; Furusaki, S. (1996). Changes of anthocyanin composition by conditioned medium and cell inoculum size using strawberry suspension culture. Biotechnology letters, 18(10): 1149-1154
255
corresponents antocianidin-glucsids i, per tant, retenen millor el color. Similars experiments shavien dut a terme amb xit en cultius de pastanaga409 i de patata410, en qu sintroduen a la molcula dantoci cids benzoics i cids cinnmics, com lcid p-cumric. En la nostra metodologia, es va decidir dabordar aquestes reaccions de biotransformaci utilitzant com a possibles agents acilants lcid actic, el p-cumric i el cafeic, ja que en Vitis vinifera es poden detectar de forma natural els antocians acilats corresponents a tots tres, i lcid ferlic i lcid cinnmic, que tamb es troben presents en quantitats importants en les cl.lules de ram. Procediment experimental: Per tenir una concentraci 150 M en el medi de cada cid, es van preparar solucions stock 15 mM en tamp MES 1% (p/v), que s un tamp comunament utilitat en cultius cellulars vegetals. Per a totes les solucions, es va ajustar el pH a 6.0 amb KOH 2N i es van esterilitzar per filtraci de 22m. En cada medi autoclavat safegia 1 ml daquestes solucions, i es procedia a fer el cultiu de la forma habitual.
En la taula es recull la producci final en grams de cada cultiu i la seva concentraci en antocians:
control actic cafeic cinnmic cumric ferlic
Resultats i discussi
7.0 g pes fresc 4.6 mg ant/g 16.9 g pes fresc 0.20 mg ant/g
control
Laddici dun cid sembla estimular lleugerament el creixement dels cultius i, a la vegada, inhibir la sntesi dantocians. Sembla que la via de sntesi de compostos fenlics presenta un efecte de retroinhibici per formaci de producte, de manera que el fet que hi
409
Dougall, DK; Baker, DC; Gakh, EG; Redus, MA; Whittemore, NA. (1998). Anthocyanins from wild carrot suspension cultures acylated with supplied carboxylic acids. Carbohydrate research, 310:177-189 410 Plata, N; Konczak-Islam, I; Jayram, S; McClelland, K; Woolford, T; Franks, P. (2003). Effect of methyl jasmonate and p-coumaric acid on anthocyanin composition in a sweet potato cell suspension culture. Biochemical Engineering Journal, 14: 171-177
hagi excs de compostos fenlics pot inhibir la sntesi, amb la qual cosa la fenilalanina no sincorpora a aquesta ruta biosinttica i pot destinar-se al metabolisme primari. En les condicions de treball, no tingu lloc la reacci de biotransformaci. La determinaci cromatogrfica no va revelar la presncia de cap nou pic en el cas dels medis en qu shavia afegit un cid no present anteriorment com a agent acilant dels antocians sintetitzats per les cl.lules (cinnmic, ferlic). Per tal dassegurar aquestes observacions, es + va fer una determinaci mitjanant HPLC-MS en mode SIM, per localitzar els pics M corresponents als antocians amb lagent acilant. El resultat negatiu ens va confirmar que no havia tingut lloc el procs de transformaci. Tampoc va donar increment dels pics en el cas dels antocians acilats ja presents de forma natural en les cl.lules de la varietat destudi (actic, cafeic, p-cumric). En la grfica 5.4.6.3 es presenta la composici antocinica quant a antocians acilats en les diferents condicions destudi. Com es pot observar, aquesta roman inalterable malgrat laddici dagents acilants, especialment en el cas de lcid actic i lcid cumric. Noms sobserven dues variacions. La primera, un augment de la proporci dels antocians acetilats en el cas del cafeic en la condici destrs, per que no fou deguda a una sntesi neta dels mateixos sin a una disminuci en el contingut dels derivats p-cumarilats. I la segona, lincrement del contingut de peonidina-acetilglucsid en la situaci control amb cinnmic, tot i que resulta difcil establir una relaci que expliqui aquest fenomen.
100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 0 control 0 acetat 0 cumaric acetilats 0 cafeic 0 ferulic 0 cinnamic 0% C C acetat C cumaric acetilats C Cafeic C ferulic C cinnamic 20% 40% 60% 80% 100%
no acilats
p-cumarilats
no acilats
p-cumarilats
Grfica 5.4.6.3. Percentatges dels antocians acilats i no acilats en suspesnions cel.lulars de Vitis vinifera en medis suplementats amb cids
En conclusi, a diferncia de les cl.lules en suspensi daltres varietats, els cultius de Vitis vinifera sn resistents a les reaccions de biotransformaci.
257
5.4.7) Efecte de fitohormones Les fitohormones, en el seu paper de substncies reguladores del creixement, poden tamb afectar la biosntesi dantocians. La quantitat daquests factors presents en el medi i, sobretot, el ratio que sestableix entre ells, sn determinants per la morfognesi, que determina que un cultiu vagi a un estadi de dediferenciaci (com les suspensions cel.lulars) o que es decanti per la diferenciaci i organitzaci tissular del teixit. bviament, aix tamb afecta a altres caracterstiques del cultiu. El rang de combinacions hormonals i llur concentraci afecta la formaci de productes secundaris. De fet, el tipus i la concentraci de fitohormones disponibles pels cultius cel.lulars s probablement el factor ms important que influeix en el seu potencial per la sntesi de productes secundaris. Aix per exemple, el 2,4-D s una auxina sinttica inclosa en molts medis; pot estimular la divisi cel.lular i lexpansi cel.lular en molts sistemes, per tamb pot comportar una suspensi dramtica de la sntesi de productes secundaris. La utilitzaci de 2,4-D era un dels principals factors que provocava un baix rendiment en els productes secundaris en cultius cel.lulars abans del 1970. Les principals classes de factors de creixement utilitzats en els cultius vegetals sn les auxines, les citoquinines, les giberillines i lcid abscssic. En els cultius de Murashige-Skoog, habitualment, es subministren auxines (ex. cid naftalenactic) i citoquinines (ex. kinetina). Les auxines es requereixen per la inducci de la divisi cel.lular; mentre que les citoquinines tenen un paper essencial en la diferenciaci. Per tal destudiar les repercussions que pot comportar el balan hormonal en la sntesi dantocians, es va decidir treballar amb els altres dos grups de reguladors que no es trobaven originalment en el medi de cultiu. Les giberillines tenen un ampli espectre defectes fisiolgics en les plantes. Estan implicades en la floraci, el desenvolupament del fruit, el creixement, la formaci de la paret cellular, lexpansi cellular i la germinaci de les llavors.411 A ms, tamb poden potenciar lactivitat metablica cap a vies de producci de metablits secundaris en respostes relacionades amb la defensa i lestrs. Aix implica que activen la biosntesi dantocians. 412
411 412
Huttly AK; Philips, AL. (1995). Gibberellin-regulated plant genes; Physiologia Plantarum, 100:241-254 Ohlsson, AB; Berglund, T. (2001). Gibberellic acid-induced changes in glutathione meatbolism and anthcoyanin content in plat tissue; Plant, cell, tissue and organ culture 64:77-80
Lcid abscssic participa en el control de molts aspectes crucials en el creixement i desenvolupament de la planta. Redueix la divisi cellular, inhibeix el creixement promogut per les auxines i les gibberillines, i dna tolerncia a la dessecaci, entre daltres efectes. 413
En lexperiment, es va suplementar el medi amb concentracions de cada hormona (cid abscssic i cid giberl.lic) de 10 mg/l, a partir de solucions stocks dcid abscssic (ABA) (Sigma) de 1 mg/ml, i dcid giberl.lic (Sigma), de 10 mg/ml. Aquestes solucions es van esterilitzar per filtraci amb filtres de 0,22 m de porus (Millipore). Es va treballar tamb en condicions destrs nitrogenat i en condicions destrs hdric. En la segent taula es recullen els valors finals en pes fresc i producci dantocians en cada condici de cultiu.
control
4.8 g pes fresc 1.24 mg ant/g 5.2 g pes fresc 0.28 mg ant/g 5.0 g pes fresc 1.54 mg ant/g
ABA
Gibberl.lic
Estrs nitrogenat i hdric (0s)
control
Estrs hdric 0s
7.0 g pes fresc 0.134 mg ant/g
Com pot observar-se, lcid giberl.lic provoca un increment en la sntesi dantocians, mentre que lcid abscssic t un efecte diferent segons les condicions del medi: en una situaci control, produeix una major sntesi, mentre que en una situaci destrs inhibeix la sntesi de compostos fenlics.
413
Chajtir, MB. (1998). Estudio de los mecanismos implicados en la adpatacin a la reduccin de la disponibilidad de agua en Vitis vinifera; Tesi Doctoral. URV.
259
Les segents grfiques recullen la composici en antocians en les diferents condicions. a) Situaci control
Control ("C")
mv pn-pc-glu cy-pc-glu pn Acilats mv-ac-glu
cy dp pn-ac-glu cy-ac-glu mv
Control ("C") + ABA

pn-pc-glu
pt
Control ("C") + Giberl.lic

mv cy-pc-glu mv-ac-glu pn-pc-glu
cy-pc-glu pn Acilats cy dp pt cy-ac-glu pn-ac-glu mv-ac-glu
pn
Acilats
cy pn-ac-glu pt cy-ac-glu
Grfic 5.4.7.1. Composici dantocians en situaci control sota lefecte de les hormones cid gibberl.lic i cid abscssic
La situaci control (Grfic 5.4.7.1) ofereix poques variacions quant a lacci de les fitohormones. Noms s destacable que sota lefecte de lcid abscssic, hi ha un lleuger increment de la sntesi de malvidina-3-glucsid i una disminuci en els nivells dantocians acilats. b) Estrs nitrogenat
mv
Estrs nitrogenat ("0") + gibberl.lic

pn-pc-glu
pn
Acilats cy-pc-glu pt cy mv-ac-glu dp mv
Estrs nitrogenat ("0") + ABA

cy-ac-glu pn-ac-glu pn Acilats
pn-pc-glu
mv
Estrs nitrogenat ("0")

cy cy-pc-glu dp pn-pc-glu pt cy-ac-glu pn-ac-glu mv-ac-glu
pn
Acilats cy-pc-glu pt cy dp
cy-ac-glu pn-ac-glu
Grfic 5.4.7.2. Composici dantocians en situaci destrs nitrogenat sota lefecte de les hormones cid gibberl.lic i cid abscssic
La situaci destrs nitrogenat, en canvi, ofereix variacions substancials quan saplica cid abscssic (Grfic 5.4.7.2). En aquest cas, augmenta molt considerablement la quantitat de malvidina dels cultius. A ms, tamb es detecten augments de peonidina i, en menor mesura, de petunidina i delfinidina. Aquestes dues ltimes eren molt minoritries en el cultiu sense lacci de labscssic. En canvi, els nivells de cianidina disminueixen notablement. Malgrat que els nivells en antocians acilats romanen fora constants, el contingut en peonidina-p-coumarilada i acetilada esdev tamb superior que el de les corresponents cianidines acilades. En canvi, lcid giberl.lic no produeix aquestes divergncies. Lestrs nitrogenat ja tenia un efecte dincrementar els ratios dacilaci, de delfinidina, petunidina i malvidina. Per resulta clar que lcid abscssic tindria un efecte sinrgic positiu en aquest sentit, ja que potencia aquest efecte. c) Estrs hdric
Estrs hdric ("Cs")
mv pn-pc-glu pn Acilats mv-ac-glu cy mv cy-ac-glu pn pt Acilats cy pt cy-pc-glu cy-ac-glu pn-pc-glu pn Acilats cy-pc-glu mv-ac-glu cy dp pn-ac-glu cy-ac-glu mv-ac-glu pn-ac-glu cy-pc-glu
Estrs hdric ("Cs") + ABA
dp
pn-ac-glu
pn-pc-glu
Estrs hdric ("Cs") + Giberl.lic

mv
Grfic 5.4.7.3. Composici dantocians en situaci destrs hdric sota lefecte de les hormones cid gibberl.lic i cid abscssic
En una condici destrs hdric, lcid abscssic torna a produir els mateixos efectes, tot i que amb menor abast (Grfic 5.7.4.3): incrementa el contingut de malvidina i de peonidina, tot disminuint el de cianidina. Laugment s fora ms considerable si es consideren els antocians p-coumarilats. En aquestes condicions, lcid giberl.lic t un efecte similar, per no tan marcat.
261
d) Estrs hdric + Estrs nitrogenat

mv pn Acilats cy-pc-glu pt cy dp cy-ac-glu pn-ac-glu pn Acilats cy-pc-glu
Estrs nitrogenat+Estrs hdric

pn-pc-glu
Estrs nitrogenat+Estrs hdric + ABA

mv pn-pc-glu
Estrs nitrogenat+Estrs hdric + giberl.lic

mv pn Acilats cy-pc-glu cy pt dp cy-ac-glu mv-ac-glu pn-ac-glu pn-pc-glu pt
cy
cy-ac-glu
pn-ac-glu mv-ac-glu
Grfic 5.4.7.4. Composici dantocians en situaci destrs nitrogenat + estrs hdric sota lefecte de les hormones cid gibberl.lic i cid abscssic
Si es combinen els efectes de lestrs nitrogenat i lestrs hdric, es produeix un efecte equivalent al de lestrs nitrogenat sol, per en menor extensi (Grfic 5.4.7.4).
En resum, es constaten els segents efectes: Lcid giberl.lic estimula la sntesi dantocians, per t poc efecte en la composici antocinica Lcid abscssic provoca en totes les condicions una disminuci de la cianidina i un icnrement dels altres antocians. Aix t lloc en major o menor grau segons les condicions destrs del cultiu. En estrs nitrogenat s quan ms es manifesta lefecte. Si recordem el model biosinttic dels antocians, podem arribar a la conclusi que lacci de lcid abscssic est activant la transformaci de la cianidina en els altres antocians i, per tant, semblaria causar una activaci de la metiltransferasa, que provoca la conversi de cianidina en peonidina, i lacci de la flavanoid 3,5-hidroxilasa, que condueix a la sntesi de delfinidina que desemboca en la formaci de malvidina i petunidina. Aquest pas s important perqu, com ja
sha comentat, aquesta branca de la via biosinttica sembla inhibida en la suspensi cel.lular de Gamay Freaux. Per tant, el treball amb suspensions cel.lulars i lacci dhormones com lacid abscssic ofereixen valuoses perspectives de treball per estudiar ms detalladament aquesta via biosinttica.
En diversos treballs es contempla la possibilitat de canviar la composici antocinica mitjanant el control sobre les fitohormones. Aix per exemple, lequip dirigit pel Dr. Mrillon414 observa que lefecte de les auxines 2,4-diclorofenoxiactic 2,4-D i cid nafltalenactic s oposat, ja que la primera reprimeix tant el creixement com la producci dantocians, i a ms causa una disminuci dels nivells de malvidina-3-glucsid. En canvi, els treballs de Mori415 mostren que un increment dauxines i citoquinines provoca un augment de la concentraci de cianidina-3-glucsid i una disminuci de la peonidina-3-glucsid, en un efecte que estaria lligat a la inhibici de lenzim metiltransferasa. En treballs de Curtin et al., altres reguladors, com lcid jasmnic, han demostrat promoure la sntesi dantocians, amb preferncia de la peonidina 416. Tanmateix, en ocasions les fitohormones no promouen canvis significatius 417 ni en la composici ni en el contingut antocinic.
414
Krisa, S; Vitrac, X; Dcendit, A; Larronde, F; Deffieux, G; Mrillon, JM. (1999). Obtaining Vitis vinifera cell cultures producing higher amounts of malvidin-3-O- -glucoside; Biotechnology Letters, 21:497-500 415 Mori, T; Sakurai, M; Seki, M; Furusaki, S. (1994). Use of auxin and cytokinin to regulate anthocyanin production and composition in suspension cultures of strawberry cells; J Sci Food Agric 65:271-276 416 Curtin, C; Zhang, W; Franco, C. (2003). Manipulating anthocyanin composition in Vitis vinifera suspension cultures by elicitation with jasmonic acid and light irradiation. Biotechnology letters, 25(14):1131-1135 417 Kim, SH; Kim, SY. (2002). Effects of 2,4-D, BA, and sucrose on growth, production of anthocyanin, pH, and sugar content in Sheridan grape cell suspension cultures. J Plant Biotechnol, 4(2): 77-82
263
5.5. CONCLUSIONS 1. Dentre els factors que incideixen en la biosntesi dantocians in vitro, lestrs hdric i lestrs nitrogenat sn els que provoquen una major estimulaci de la biosntesi. Les situacions de carncia de nitrat en provoquen un augment espectacular, molt superior al de lestrs osmtic. 2. Lalteraci de parmetres com el pH o la mida de lincul inicial tenen una repercussi molt menor sobre el creixement i la sntesi dantocians. 3. La sacarosa s una font de carboni que ocasiona major creixement i major producci dantocians que la glucosa o la fructosa, especialment en les condicions destrs nitrogenat. 4. Les condicions destrs nitrogenat i estrs hdric alteren la composici antocinica dels cultius in vitro, promovent un increment de lacilaci i lactivaci de la branca de la delfinidina en la via biosinttica dels antocians. 5. Laddici de fitohormones com lcid abscssic pot alterar tamb la composici antocinica activant la branca de sntesi dels dertivats 5-hidroxilats. Lefecte de la fitohormona interaccionaria amb els efectes destrs. 6. No shan pogut establir reaccions de biotransformaci entre els antocians i els agents acilants. Aix suggereix que els mecanismes en Vitis i en altres cultius que permeten aquestes reaccions sn diferents.

1.
Ramachandra, S,. Ravishankar, G.A. (2002).Plant cell cultures:Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances 20 101153 2. DiCosmo, F; Misawa, M. (1995). Plant cell and tissue culture: alternatives for metabolite production. Biotechnology advances, 13 (3): 425-453 3. Wink, M. (1987). Physiology of the accumulation of secondary metabolites with special reference to alkaloids; a Cell culture and somatic cell genetics of plants, ed F Constabel i IK Vasil; Academic Press 4. Banthorpe, DK. (1988). Monoterpenes and sesquiterpenes; a Cell culture and somatic cell genetics of plants. Volume 5: Phytochemicals in plant cell cultures; Ed F. Constabel; IK Vasil; Academic Press 5. Koblitz, H. (1988). Anthraquinones; a Cell culture and somatic cell genetics of plants. Volume 5: Phytochemicals in plant cell cultures; Ed F. Constabel; IK Vasil; Academic Press 6. Yazaki, K; Yoshida, T; Okuda, T. (1991). Tannin production in cell suspension cultures of Geranium thunbergii. Phytochemistry, 30 (2): 501-503 7. Prusky, D; Hamdan, H; Ardi, R; Keen, NT. (1996). Induction of biosynthesis of epicatechin in avocado suspension cells treated with an enriched CO2 atmosphere. Physiological and molecular plant pathology, 48, 171-176 8. Funk, C; Brodelius, PE. (1992). Phenylpropanoid metabolism in suspension cultures of Vanilla planifolia Andr. IV. Induction of vanillic acid formation. Plant Physiol 99, 256-262 9. Bourgaud, F.; Gravot, A; Milesi. S:; Gontier, E. (2001). Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science 161: 839851 10. Castonguay,A; Gali, H; Perchellet, E; Gao, X; Boukharta, M; Jalbert, G; Okuda, T; Yoshida, T; Hatano, T; Perchellet, JP. (1997). Antitumorigenic and antipromoting activities of ellagic acid, ellagitannins, and oligomeric anthocyanin and procyanidin. Int. J. Oncol. 10, 367-373 11. Espin, JC; Soler-Rivas, C; Winchers, HJ; Garcia-Viguera, C. (2000). Anthcoyaninbased natural colorants: a new source of antiradical activity for foodstuff. J Agric Food Chem, 48, 1588-1592 12. Magnuson, BA. (2002).Evidence of cancer inhibition by anthocyanin-rich extracts. a I Konezak-Islam (ed.), Proceedings of the International Workshop on anthcoyanins resrearch and development in anthocyanins, Australia, p 23. 13. Konczak-Islam, I; Okuno, S.; Yoshimoto, M; Yamakawa, O. (2003); Composition of phenolics and anthocyanins in a sweet potato cell suspension culture, Biochemical Engineering Journal, 14 (3): 155-161 14. R. Filippini, R. Caniato, A. Piovan and E. M. Cappelletti . (2003). Production of anthocyanins by Catharanthus roseus, Fitoterapia, 74 (1-2), 62-67 15. Ozeki, Y. (1996). Regulation of anthocyanin synthesis in carrot suspension cultured cells; J Plant Res, 109: 343-351 16. Wei, Z; Seki, M; Furusaki,S.; Middelberg, APJ. (1998). Anthocyanin Synthesis, Growth and Nutrient Uptake in Suspension Cultures of Strawberry Cells, Journal of Fermentation and Bioengineering, 86 (1), 72-78 17. Hirasuna,T.J; Shuler, M.L.; Lackney, VK; Spanswick, R.M. (1991). Enhanced anthocyanin production in grape cell cultures, Plant Science, 78 (1): 107-120
265
18.
Meyer, J.E; Ppin, MF; Smith, M.A. (2002). Anthocyanin production from Vaccinium pahalae: limitations of the physical microenvironment. Journal of Biotechnology, 93 (1), 45-57 19. Callebaut, A.; Hendrickx, G.;. Voets, A. M; Motte, J. C.. (1990). Anthocyanins in cell cultures of Ajuga reptans. Phytochemistry, 29(7): 2153-2158 20. Zhong J, Yoshida, T. (1993). Effects of temperature on cell growth and anthocyanin production in suspension cultures of Perilla frutescens. Journal of Fermentation and Bioengineering, 76 (6), 530-531 21. Wellmann, E; Hrazdina, G; Grisebach, H; (1976) Induction of anthocyanin formation and of enzymes related to its biosynthesis by UV light in cell cultures of Haplopappus gracilis. Phytochemistry, 15(6): 913-915 22. Kakegawa, K; Hattori, E; Koike, K; and Takeda, K. (1991). Induction of anthocyanin synthesis and related enzyme activities in cell cultures of Centaurea cyanus by UV-light irradiation, Phytochemistry, 30 (7): 2271-2273 23. Hall, RD; Yeoman, MM. (1986). Temporal and spatial heterogeneity in the accumulation of anthocyanins in cell cultures of Catharanthus roseus. J Exp Botany, 37, 486-498 24. Hall, RD; Yeoman, MM. (1987). Intercellular and intercultural heterogeneity in secondary metabolite accumulation in cultures of Catharanthus roseus following cell line selection. J Exp Botany, 38(193):1391-1398 25. Marshall, Smith. MA; Lee, C; Deroles, S; Davies, KM. (2002). Differential gene expression between pigmented and non-pigmented cell culture lines of Daucus carota. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 70:91-97 26. Seitz, HU; Hinderer, W. (1988). Anthocyanins; a Cell culture and somatic cell genetics of plants. Volume 5: Phytochemicals in plant cell cultures; Ed F. Constabel; IK Vasil; Academic Press 27. Waffo, T; Decendit, A: Vercauteren, J; Deffieux, G; Mrillon, JM (1996). Trans. resveratrol-3-O- -glucoside (piceid) in cell suspension cultures of Vitis vinifera; Phytochemistry, 42(6), 1591-1593 28. Decendit, A; Gopal, K; Waffo, P; Deffieux, G; Badoc, A; Mrillon, JM. (1996). Anthocyanins, catechins, condensed tannins and piceid production in Vitis vinifera cell bioreactor cultures. Biotechnology letters, 6: 659-662 29. Waffo, P; Fauconneau, B; Dffieux, G; Huguet, F; Vercauteren, J; Mrillon, JM. (1998). Isolation, identification, and antioxidant activity of three stilbene glucosides newly extracted from Vitis vinifera cell cultures. J Nat Prod, 61: 655-657 30. Krisa, S; Waffo, P; Dcendit, A; Deffieux, G; Vercauteren, J; Mrillon, JM (1999). . Production of 13C-labelled anthocyanins by Vitis vinifera cell suspension cultures. Phytochemistry, 51: 651-656 31. Bailly, C; Cormier, F; Do, CB. (1997). Characterization and activities of S-adenosyl-Lmethionine:cyanidin 3-glucoside 3-O-methyltransferase in relation to anthocyanin accumulation in Vitis vinifera cell suspension cultures. Plant Science 122:81-89 32. Lofty, S; Fleuriet, A; Ramos, T; Macheix, JJ. (1989). Biosynthesis of phenolic compounds in Vitis vinifera cell suspension cultures: study on hydroxycinnamoyul CoA:ligase. Plant Cell Reports, 8:93-96 33. Suzuki, N; Sakuta, M; Shimizu, S; Komamine, A. (1995). Changes in the activity of 3deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate (DAHP) synthase in suspension-cultured cells of Vitis. Physiologia Plantarum, 94: 591-596
34.
Deswarte, C; Canut, H; Klaebe, A; Roustan, JP; Fallot, J. (1996). Transport, cytoplasmatic accumulation and mechanism of action of the toxin eutypine in Vitis vinifera cells. J Plant Physiol, 149: 336-342 35. Morales, M; Bru, R; Garca-Carmona, F; Ros-Barcel, A; Pedreo, MA. (1998). Effect of dimethyl- -cyclodextrins on resveratrol metabolism in Gamay grapevine cell cultures before and after inoculation with Xylophilus ampelinus. Plant, cell, tissue and organ culture, 53:179-187 36. Cabrita, L; Fossen, T; Andersen, MO. (2000). Colour and stability of the six common anthocyanidin-3-glucosides in aqueos solutions; Food Chem. 68: 101-107 37. Xiong, L. Zhu, JK. (2002). Molecular and genetic aspects of plant responses to osmotic stress. Plant, Cell and Environment, 25: 131-139 38. Wang, HL; Lee, PD; Liu, LF; Su, JC. (1999). Effect of sorbitol induced osmotic stress on the changes of carbohydrate and free amino acid pools in sweet potato cell suspension cultures. Bot. Bull. Acad. Sin. 40:219-225 39. King, PJ; Street, HE. (1977). Growth patterns in cell cultures; a Plant tissue and cell culture; edited by HE Street; Blackwell Scientific Publications 40. Stepan-Sarkissian, G; Grey, D. (1990). Growth and determination and medium analysis a Methods in Molecular Biology. Plant Cell and Tissue Culture, vol 6; JW Pollard & JM Walker; The Humana Press 41. Cormier, F; Couture, R; Do, CB; Pham, TQ; Tong, VH. (1997). Properties of anthocyanins from grape cell culture; J. Food Science, 62 (2), 246-248 42. Do, CB; Cormier, F. (1990). Accumulation of anthocyanins enhanced by a high osmotic potential in grape (Vitis vinifera L.) cell suspensions. Plant cell Reports, 9:143-146 43. Cormier, F; Crevier, H; Do, CB. (1990) Effects of sucrose concentration on the accumulation of anthocyanins in grape (Vitis vinifera) cell suspension.. Can J Bot, 68: 18221825 44. Kakegawa, K; Suda, J; Sugiyama, M; Komamine, A. (1995). Regulation of anthocyanin biosynthesis in cell suspension cultures of Vitis in realtion to cell division. Physiologia plantarum 94:661-666 45. Tholakalabavi, A; Zwiazek, J; Thorpe, T (1997). Osmotically-stressed poplar cell . cultures: anthocyanin accumulation, deaminase activity, and solute composition. J. Plant Physiol, 151: 489-496 46. Mori, T; Sakurai, M. (1995). Effects of riboflavin and increased sucrose on anthocyanin production in suspended strawberry cell cultures. Plant Science 110: 147-153 47. Do, CB; Cormier, F. (1991). Effects of high ammonium concentrations on growth and anthocyanin fromation in grape (Vitis vinifera L.) cell suspension cultured in a product medium. Plant, cell, tissue and organ culture, 27:169-174 48. Mori, T; Sakurai, M. (1994). Production of anthocyanin from strawberry cell suspension cultures; Effects of sugar and nitrogen. (1994). Journal of food science, 59(3): 588-593 49. Kim, S; Kim, S. (2002): Effect of nitrogen source on cell growth and anthocyanin production in callus and cell suspension cultures of Sheridan grapes. J Plant Biotechnology, 42:83-89 50. Keller, M; Hrazdina, G. (1998). Interaction of nitrogen availability during bloom and light intensity during veraison. II. Effects on anthocyanin and phenolic development during grape ripening. Am J Enol and Vitic, 49(3): 341-349
267
51.
Zhang, W; Furusaki, S (1997). Regulation of anthocyanin synthesis in suspension . cultures of strawbeery cell by pH; Biotechnology Leters, 19 (11), 1057-1061 52. Suzuki, M. (1995). Enhancement of anthocyanin accumulation by high osmotic stress and low pH in grape cells (Vitis hybrids); J. Plant. Physiol. 147, 152-155 53. Jardin, B; Tom, R; Chavarie, C; Rho, D; Archambault, J. (1995). Stimulated indole alkaloid release from Catharanthus roseus immobilized cultures. Initial studies; J Biotechnol 21: 43-62 54. Ho CH; Shanks, JV. (1992). Effects of initial medium pH on growth and metabolism of C. Roseus hairy root cultures. Biotechnol. Letteers, 14: 959-964 55. Morgan, JA; Barney, CS; Penn, AH; Shanks, JV. (2000). Effects of buffered media upon growth and alkaloid production of Catharanthus roseus hairy roots; Appl Microbiol Biotechnol, 53: 262-265 56. Saenz LA; Maldonado, IE; Moreno, O; Ciau, R; Lopez, M; Oropeza, C; Loyola, VM. (1993). Effect of the medium pH on the release of secondary metabolites from roots of Datura stramonium. Appl Biochem Biotechnol 38:257-267 57. Cormier, F; Do, CB; Moresoli, C. (1992). Anthocyanin release from grape (Vitis vinifera L.) cell suspension. Biotechnol Letters, 14(11): 1029-1034 58. Su, WW; Lei, F. (1993). Rosmarinic acid production in perfused Anchusa officinalis culture: effect of inoculum size; Biotechnology letters, 15, 1035-1038 59. Zhong, JJ; Toshida, T, (1995). High-density cultivation of Perilla frutescens cell suspensions for anthocyanin production: Effects of sucrose concentration and inoculum size; Enzyme Microb. Technol., 17: 1073-1079 60. Mori, T; Sakurai, M; Shigeta, J; Yoshida, K; Kondo, T. (1993). Formation of anthocyanins from cell cultured from different parts of strawberry plants. Journal of Food Science, 58(4): 788-792 61. Fowler, MW; Stepan-Sarkissian, G. (1985). Carbohydrate source, biomass productivity and natural product yield in cell suspension cultures; a Primary and seconsary metabolism o f plant cell cultures, KH Neumann, W Barz & E Reinhard, Ed Springer-Verlag 62. Novo,MT; Beltran, G; Torija, MJ; Poblet, M; Rozs, N; Guillamn, JM; Mas, A; . (2003). Changes in wine yeast storage carbohydrate levels during preadaptation, rehydration and low temperature fermentations; Int.J. Food Microbiology 86: 153-161 63. Zhang, W; Seki, M; Furusaki, S; Middelberg, AP. (1998). Anthocyanin synthesis, growth and nutrient uptake in suspension cultures of strawberry cells. Journal of Fermentation and Bioengineering, 86(1): 72-78 64. Ppin, MF; Archambault, J; Chavarie, C; Cormier, F. (1995). Growth kinetics of Vitis vinifera cell suspension cultures: I. Shake Flask Cultures; Biotechnology and bioengineering, 47: 131-138 65. Guardiola, J; Iborra, JL; Cnovas, M. (1995). A model taht links growth and secondary metabolite production in plant cell suspension cultures. Biotechnology and Bioengineering, 46: 291-297 66. Prez, FJ; Meza, P; Berti, M; Pinto, M. (2000). Effect of carbon source and sucrose concentration on growth and hexose accumulation of grape berries cultured in vitro. Plant, cell, tissue and organ culture, 61:37-40 67. Ruffner, HP; Adler, S; Rast, DM (1990). Soluble and wall associated forms of invertase in Vitis vinifera L.. Phytochemistry 29:2083-2086
68.
Narayan, MS; Venkataraman, LV. (2002). Effect of sugar and nitrogen on the production of anthocyanin in cultured carrot (Daucus carota) cells, J Food Science, 67(1):84-86 69. Nagarajan, RP; Keshavarz, E; Gerson, DF. (1989). Optimization of anthocyanin yield in a mutated carrot cell line (Daucus carota) and its implications in large scale production. J. Ferment. Bioeng 68:102-106 70. Schluepmann, H; Pellny, T; van Dijken, A; Smeekens, S; Paul, M. (2003). Trehalose-6phosphate is indispensable for carbohydrate utilization and growth in Arabidopsis thaliana. Plant Biology, 100(11): 6849-6854 71. Crowe, JH; Crowe, LM; Oliver, AE; Tsvetkova, N; Wolkers, W; Tablin, F (2001). . The trehalose myth revisited: introduction to a symposium on stabilization of cells in the dry state. Cryobiology, 43: 89-105 72. Springob, K; Nakajima, J; Yamakazi, M; Saito, K (2003). Recent advances in the . biosynthesis and accumulation of anthocyanins. Nat Prod Rep, 20: 288-303 73. Conn, S; Zhang, W; Franco, C. (2003). Anthocyanic vacuolar inclusions (AVIs) selectively bind acylated anthocyanins in Vitis vinifera L. (grapevine) suspension culture. Biotechnology Letters, 25:835-839 74. Nakamura, M; Seki, M; Furusaki, S. (1998). Enhanced anthocyanin methylation by growth limitation in strawberry suspension culture; Enzyme Miucrob. Technol., 22, 404-408 75. Sakurai, M; Mori, T; Seki, M; Furusaki, S. (1996). Changes of anthocyanin composition by conditioned medium and cell inoculum size using strawberry suspension culture. Biotechnology letters, 18(10): 1149-1154 76. Dougall, DK; Baker, DC; Gakh, EG; Redus, MA; Whittemore, NA. (1998). Anthocyanins from wild carrot suspension cultures acylated with supplied carboxylic acids. Carbohydrate research, 310:177-189 77. Plata, N; Konczak-Islam, I; Jayram, S; McClelland, K; Woolford, T; Franks, P. (2003) Effect of methyl jasmonate and p-coumaric acid on anthocyanin composition in a sweet potato cell suspension culture. Biochemical Engineering Journal, 14: 171-177 78. Huttly AK; Philips, AL; Gibberellin-regulated plant genes. (1995) Physiologia Plantarum, 100:241-254. 79. Ohlsson, AB; Berglund, T; Gibberellic acid-induced changes in glutathione meatbolism and anthcoyanin content in plat tissue; Plant, cell, tissue and organ culture 64:77-80, 2001 80. Chajtir, MB . (1998) Estudio de los mecanismos implicados en la adpatacin a la reduccin de la disponibilidad de agua en Vitis vinifera; Tesi Doctoral. URV. 81. Krisa, S; Vitrac, X; Dcendit, A; Larronde, F; Deffieux, G; Mrillon, JM. (1999). Obtaining Vitis vinifera cell cultures producing higher amounts of malvidin-3-O- -glucoside; Biotechnology Letters, 21:497-500 82. Mori, T; Sakurai, M; Seki, M; Furusaki, S. (1994). Use of auxin and cytokinin to regulate anthocyanin production and composition in suspension cultures of strawberry cells; J Sci Food Agric 65:271-276 83. Curtin, C; Zhang, W; Franco, C. (2003). Manipulating anthocyanin composition in Vitis vinifera suspension cultures by elicitation with jasmonic acid and light irradiation. Biotechnology letters, 25(14):1131-1135 84. Kim, SH; Kim, SY. (2002). Effects of 2,4-D, BA, and sucrose on growth, production of anthocyanin, pH, and sugar content in Sheridan grape cell suspension cultures. J Plant Biotechnol, 4(2): 77-82
269
Captol 6. Activitat in vitro de la fenilalanina amonio liasa
6.1. INTRODUCCI
1. PAL La fenilalanina amonio liasa (PAL) (E.C.4.3.1.5.) catalitza la desaminaci no oxidativa de la L-fenilalanina per donar cid trans-cinnmic (figura 6.1). Aquest s el primer pas de la biosntesi de lesquelet fenilpropanoide que genera els compostos fenlics en les plantes superiors.418
Hs Hr
PAL
COO
-
Hr
+ NH4 +
COO H
-
NH 3
Figura 6.1. Reacci de desaminaci de la fenilalanina per donar cid cinnmic i amoni, catalitzada per lenzim fenilalanina amonio liasa (PAL)
La PAL s, doncs, un enzim implicat en la biosntesi de precursors dels flavonoides. Posteriorment, a partir de lcid cinnmic es genera lcid p-cumric, que sactiva en forma de 4-cumaroil-CoA per, en una reacci de condensaci amb 3 molcules de malonil-coA catalitzada per lenzim calcona sintasa, generar la molcula de calcona, a partir de la qual es generen els compostos flavonoides. La via principal de la biosntesi de flavonoids va ser deduda fa 20 anys utilitzant dades destudis qumico-gentics i destudis amb precursors marcats radioactivament (figura 6.2).419 Els enzims implicats en la biosntesi de flavonoides es classifiquen en 3 grups generals: * enzims implicats en la biosntesi de precursors. Ex. PAL * enzims implicats en la sntesi de les classes de flavonoides. Ex. calcona isomerasa * enzims responsables de la modificaci de flavonoides. Ex. glicosiltransferases
418 419
Camm, EL; Towers, GHN. (1973). Phenylalanine ammonia lyase, Phytochemistry, 12:961-973 Lister; Lancaster; Walker (1996).Developmental changes in enzymes of flavonoid biosynthesis in the skins of red and green apple cultivars, J Sci Food Agric 71: 313-320
273
Figura 6.2. Via general fenilpropanoide
La fenilalanina amonio liasa s considerada lenzim clau relacionat amb el metabolisme secundari de les plantes, ja que dirigeix el flux dels toms de Carboni de la Fenilalanina cap a la sntesi de compostos fenlics en lloc de cap a sntesi proteica 420 i per aix es considera de manera general com un punt clau en qu es controla el flux de carboni dintre de la via.
420
Zucker, W. (1965) Induction of phenylalanine deaminase by light and its relation to chlorogenic acid synthesis in potato tuber tissue; Plant Physiology, 40 (5): 779-784
274
Els nivells dactivitat daquest enzim depenen del genotip i tamb de ledat, lestadi de desenvolupament , lrgan o el tipus de teixit. Els canvis en la seva activitat estan associats a processos de diferenciaci, xilognesi, i estadis especfics de desenvolupament dels teixits 421. La PAL ha estat caracteritzada en gran nombre de fruits, com el ram422 , la poma423, la maduixa424 o la llimona425. En tots ells, un increment en lactivitat daquest enzim es relaciona amb la formaci de compostos fenlics en la maduraci. Els patrons dels seus canvis durant el desenvolupament del fruit sn fora similars en els diversos fruits: partint duns valors relativament alts quan es comena a desenvolupar, sassoleixen uns nivells dactivitat molt baixos quan el fruit encara s verd, i els nivells incrementen durant la maduraci, en un efecte fora coincident amb lacumulaci dantocians en el ram 426,427, la poma, o la maduixa428,429. Lactivitat PAL est afectada per la llum, la temperatura, els reguladors del creixement, els inhibidors de la sntesi de RNA i de protenes430, les lesions i la nutrici mineral 431,428. Aquests factors que influencien la inducci de la PAL normalment estimulen la producci de compostos fenlics. En el ram, lactivitat disminueix amb les altes temperatures. Aix, per exemple, sobt una major activitat a 20C que a 30C.435. En alguns casos, sha vist que aquest efecte t lloc per una disminuci dels nivells de protenes inhibidores de la PAL. La llum sembla indispensable per a la sntesi dantocians, tot i que la foscor no suprimeix completament lactivitat de la PAL 435, 432. Per la seva activitat respon positivament a la llum
421 422
Jones, DH. (1984). Phenylalanine ammonia-lyase: regulation of its induction, and its role in plant development; Phytochemistry 23(7): 1349-1359 Roubelakis-Angelakis, KA; Kliewer, WM. (1985). Phenylalanine ammonia-lyase in berries of Vitis vinifera L.: extraction and possible sources of error during assaying; Am J Enol Vitic 36: 314-315 423 Faragher, JD; Brohier, RL. (1984).Anthocyanin accumulation in apples skin during ripening: Regulation by ethylene and phenylalanine ammonia-lyase Sci Hortic 22:89-96 424 Given, NK; Venis, MA; Grierson, D. (1988). Purification and properties of phenylalanine-ammonia lyase from strawberry fruit and its synthesis during ripening; J Plant Physiol 133:31-37(1988) 425 Dubery, IA; Schabort, JC. (1986). Phenylalanine ammonia lyase from Citrus sinensis: purification hydrophobic interaction chromatography and physical characterization; Biochem Int 13: 579-589 426 Kataoka, I; Kubo, Y; Sugiura, A; Tomana, T (1983). Changes in L-phenylalanine ammonia-lyase activity and anthocyanin synthesis during berry ripening of three grape cultivars; J Japan Soc Hort Sci 33, 213-220 427 Hrazdina, G; Parsons, GF; Mattick, LR. (1984). Physiological and biochemical events during development and maturation of grape berries; Am J Enol Vitic 35:220-227 (1984) 428 Lister, C; Lancaster, J. (1996). Phenylalanine ammonia lyase (PAL) activity and its realtionship to anthocyanin and flavonoid levels in New Zealand-grown apple cultivars; J Amer Soc Hort Sci 121 (2): 281-285 (1996) 429 Cheng GW; Breen, PJ. (1991).Activity of phenylalanine ammonia-lyase (PAL) and concentrations of anthocyanins and phenolics in developing strawberry fruit; J Am Soc Hortic Sci 116:865-869 430 Hahlbrock, K; Ragg, H. (1973). Light-Induced changes of enzyme activities in parsley cell suspension cultures: effects of inhibitors of RNA and protein synthesis; Archiv Biochem Biophysics 166, 41-46 431 Shye Tan; Relationships and interactions between phenylalanine ammonia-lyase, phenylalanine ammonia-lyase inactivating system, and anthocyanin in apples. (1979). J. Amer. Soc. Hort. Sci. 104(5):581-586 432 Roubelakis-Angelakis, KA; Kliewer, WM. (1986). Effects of exogenous factors on phenylalanine ammonia-lyase activity and accumulation of anthocyanins and total phenolics in grape berries; Am J Enol Vitic, 37 (4) 275-280
275
blanca433 i a la llum UV434, encara que en aquest cas sha descrit que pot establir-se una inhibici daltres enzims de la via i, per tant, no observar-se un increment en el contingut en fenlics totals.439 Els factors de creixement tamb afecten lactivitat daquest enzim. El tractament amb cid abscssic al comenament de la maduraci estimula tant lacumulaci dantocians com lactivitat PAL, mentre que lcid naftalenactic els suprimeix 435. Tamb te un efecte potenciador lcid gibberl.lic en maduixes436, encara que s un efecte depenent de la dosi; o lcid indolactic en larrel de naps i xirivies. Ms controvrsia suscita el paper de letil, ja que est generalment descrit que estimula lactivitat PAL 437, per en alguns casos no lafecta436. De fet, la sntesi detil i lactivitat PAL es desenvolupen quasi simultniament 438. El fet que ambds (PAL i etil) siguin induts en situacions destrs fa que sels consideri com a mecanismes defensius de les plantes. En aquest sentit, la PAL participa en els processos de formaci de dipsits de lignina en lesions en les plantes 439; i tamb sestimula en infeccions per microorganismes com Botrytis cinerea440.
En lmbit alimentari, la PAL no s noms important pel seu paper en la maduraci del fruit. Aquest enzim tamb pot actuar al llarg de lemmagatzematge de verdures i fruits, causant laparici de taques colorejades en els mateixos441, ja que promou la sntesi de compostos fenlics que sn desprs oxidats per les polifenol oxidases, donant coloracions marronoses. En aquestes situacions, indudes per lacci de letil, la utilitzaci duna atmosfera enriquida en CO2 sembla inhibir la seva activitat i, per tant, disminuir labast daquestes lesions 442, encara que alguns autors sostenen que la inhibici de la lesi no ve activada per la PAL, sin per altres enzims de la via443, 444, especialment les polifenol
433
Hrazdina, G; Parsons, GF. (1982). Induction of flavonoid synthesizing enzymes by light in etiolated pea (Pisum sativum cv. Midfreezer) seedlings; Plant Physiol. (1982), 506-510 434 Kakegawa, K; Hattori, E; Koike, K; Takeda, K. (1991). Induction of anthocyanin synthesis and related enzyme activities in cell cultures of centaurea cyanus by UV-light irradiation; Phytochemistry, 30 (7): 2271-2273 435 Kataoka, I; Kubo, Y; Sugiura, A; Tomana, T. (1984). Effects of temperature, cluster shading and some growth regulators on L-phenylalanine-ammonia-lyase activity and anthocyanin accumulation in black grapes; Mem Cvoll Agric Kyoto Univ, 124: 35-44 436 Montero, T; Moll, E; Martn-Cabrejas, M; Lpez-Andreu, F. (1988). Effects of gibberellic acid (GA3) on strawberry PAL and TAL enzyme activities, J Sci Food Agric ; 77: 230-234 437 Rhodes, MJC; Wooltronton, LSC;. (1971).The effect of ethylene on the respiration and on the activity of Phenylalanine ammonia lyase in swede and parsnip root tissue; Phytochem , 10:1989-1997 438 Blankenship, SM; Unrath, CR; PAL and ethylene content during maturation of red and golden delicious apples. (1988). Phytochemistry, vol 27 (4): 1001-1003 439 Ramamurthy, M; Maiti, B; Thomas, P; Madhusudan, P. (1992). High-performance liquid chromatography determination of phenolic acids in potato subers (Solanum tuberosum) during wound healing; J Agric Food Chem, 40, 569-572 440 McLeod, L; Poole, PR. (1994). Changes in enzymic activities after harvest and in early stages of Botrytis cinerea infection of kiwifruit; J Sci Food Agric, 64, 95-100 441 Dangyang,K; Saltveit, ME; (1989); Developmental control and russet spotting, phenolic enzymes, and IAA oxidase in cultivars of iceberg lettuce; J Amer Soc Hort Sci 114(3)472-477 442 Holcroft, D; Gil, M; Kader, A. (1988). Effect of carbon dioxide on anthocyanins, phenylalanine ammonia lyase and glucosyltransferase in the arils of stored pomegranates; J Amer Soc Hort Sci 123(1)136-140 443 Hamza, F; Castaigne, F; Couture, R; Makhlouf, J;. (1994). Effet dune atmosphre riche en CO2 sur la teneur en phnols et lactivit de la phnylalanine ammonia-lyase de la laitue romaine; Sciences des Aliments 14:311-320
276
oxidases, ja que en alguns casos no sobserva un increment de fenlics totals concomitant a lincrement de lactivitat PAL.
2. Expressi gnica Lactivitat dun determinat enzim, com la PAL, encara que tamb pot estar modulada per lacci dactivadors i inhibidors, depn de la concentraci denzim que shagi sintetitzat. Per a aix, s fonamental que sactivi lexpressi del gen que codifica la informaci per a sintetitzar aquest enzim. Lexpressi de la informaci gentica o expressi gnica dun gen determinat que codifica per a una protena comporta sempre un primer pas de transcripci daquest gen en una molcula de RNA missatger complementari, que desprs promour la sntesi de la protena corresponent. Figura 6.3. En estudis dexpressi gnica, sanalitza la quantitat de RNA corresponent al gen dinters sintetitzada en unes condicions determinades, ja que aix indicar la quantitat de protena dinters present en la cllula (figura 6.3).
Sembla existir una correlaci entre lacumulaci dantocians i lexpressi dels gens que codifiquen els enzims de la via dels flavonoides al llarg de la maduraci de les baies dels fruits 445. En el cas de les maduixes, sha detectat que en aquest perode hi ha una inducci de lexpressi de lactivitat de la PAL, primer enzim de la via, i del darrer, la UDP-Glc:flavanoid O-glucosiltransferasa (UFGT)446, 447. En el cas dels rams, en un estudi amb la varietat Syrah sha constatat que lexpressi dels gens de la PAL, la calcona sintasa (CHS), la calcona isomerasa (CHI), la flavanona-3hidroxilasa (F3H), la dihidroflavonol 4-reductasa (DFR), i la leucoantocianidin dioxigenasa (LDOX) a les pells ja t lloc 4 setmanes desprs de la floraci. En canvi, en aquesta etapa no es detecta el gen de la UFGT. Lexpressi de tots ells sincrementa en una inducci coordinada a les 10 setmanes de la floraci, coincidint amb la biosntesi dantocians, excepte
444
Ritenour, MA; Ahrens, MJ; Saltveit, ME. (1995). Effects of temperature on ethylene-induced phenylalanine ammonia lyase activity and russet spotting in harvested iceberg lettuce; J Amer Soc Hort Sci 120(1):84-87 445 Jaakola, L; Mtt, K; Pirttil, AM; Trrnen, R; Krenlampi, S; Hohtola, A. (2002). Expression of genes involved in anthocyanin biosynthesis in relation to anthocyanin, proanthocyanidin and flavonol levels during bilberry fruit development; Plant Phyisiology, vol 130, 729-739 446 Perkin-Veazie, P. (1995). Growth and ripening of strawberry fruit, Hortic Rev 17: 267-297
277
en el cas de la PAL, per la qual tamb sobserva un increment, per que no comena fins a la 12 setmana. Totes aquestes observacions fan pensar que el pas clau que regula la biosntesi dantocians en Vitis s lactivitat UFGT, ja que no s fins el moment de la seva activaci que es produeix la biosntesi dantocians, malgrat que la resta denzims de la via ja estiguin expressant-se. Tamb refora aquesta hiptesi el fet que no sha detectat lexpressi daquest gen en la polpa, on no es produeixen antocians. Tot aix suggereix un mecanisme de regulaci en qu participarien dos tipus de gens reguladors: uns que sexpressen abans i que regularien tots els gens excepte el de lUFGT; i uns altres que sexpressen en la maduraci i que indueixen lexpressi de tots aquest gens estructurals. Un altre possible mecanisme implicaria un gen regulador que controlaria tots els enzims excepte lUFGT i que sexpressaria contnuament, i un gen regulador que controlaria lUFGT i que noms actuaria en letapa de la maduraci.448. Aquest mecanisme regulador proposat no s universal, ja que tot i que sassembla fora amb el del nabiu445, difereix de lestablert per a altres espcies com el blat de moro449, o la petnia450, en qu sembla que la regulaci actua en una etapa anterior a la de lUFGT, concretament a nivell de la F3H i la DFR, respectivament. La PAL sembla existir de manera universal en les plantes superiors com una famlia de gens amb elevada similitud de seqncia 451, de manera que sobserva la presncia de diferents isoformes daquest enzim.452 En cultius de pastanaga, per exemple, shan establert dos gens de la PAL; per noms un dells est involucrat en la biosntesi dantocians 453, mentre que laltre sactiva en situacions destrs 454. En el julivert sen detecten quatre451, i en nabiu, dos452. Els gens de la PAL poden ser induts per la llum 451, 455, ls del.licitors fngics 456, 451, les baixes temperatures457, les lesions i lestrs amb clorur de mercuri455, situacions per a les quals tamb estava descrit un augment en la seva activitat.
447
Moyano, E; Portero-Robles, I; Medina-Escobar, N; Valpuesta, V; Muoz-Blanco, J; Caballero, JL. (1998). A fruit-specific putative dihydroflavonol 4-reductase gene is differencially expressed in strawberry during ripening process; Plant Physiol, 117: 711-716 448 Boss, PK; Davies, C; Robinson, SP. (1996).Analysis of the expression of anthocyanin pathway genes in developing Vitis vinifera L. Cv Shiraz grape berries and the implications for pathway regulation; Plant Physiol., 11:1059-1066 449 Larson, L; Genetics, precursors and enzymes in flavanoid biosynthesis in maize a The Genetics of Flavanoids, ed Styles; Unicopli. 450 Quattrocchio, F; Wing, JF; Leppen, HTC; Mol, JMN; Koes, RE;. (1993). Regulatory genes controlling anthocyanin pigmentation are functionally conserved among plant species and have distinct set of target genes; Plant cell, 5: 1497-1512 451 Lois, R; Dietrich, A; Hahlbrock, K; Schulz, W. (1989). A phenylalanine ammonia-lyase gene from parsley: structure, regulation and identification of elicitor and light repsonsive cis-acting elements; The EMBO Journal, vol 8, n6, 1641-1648 452 Kumar, A; Ellis, BE. (2001). The phenylalanine ammonia-lyase gene family in raspberry. Structure, expression and evolution; Plant Physiology, (127), 230239 453 Ozeki, Y; Takeda, J. (1994). Regulation of phenylalanine ammonia-lyase genes in carrot suspension cultured cells; Plant, cell, tissue and organ culture, 38: 221-225 454 Ozeki, Y. (1996). Regulation of anthocyanin synthesis in carrot suspension cells; J. Plant Res 109:343-351 455 Ohl, S; Hedrick, S; Chory, J; Lamb, CJ. (1990). Functional properties of a phenylalanine ammonia-lyase promoter from Arabidopsis; The Plant Cell, vol 2, 837-848 456 Melchior, F; Kindl, H. (1991).Coordinate and elicitor-dependent expression of stiblene synthase and phenylalanine ammonia-lyase genes in Vitis cv. Optima; Arch Bioch and Bioph., vol 288, n2, 552-557 457 Leyva, A; Jarillo, JA; Salinas, J; Martinez-Zapater, JM. (1995). Low temperature induces the accumulation of phenylalanine ammonia-lyase and chalcone synthase mRNAs of Arabidopsis thaliana in a light-dependent manner; Plant Phisiol, 108: 39-46
278
Existeixen diverses tcniques per analitzar lexpressi gnica. Una de les ms utilitzades per a lestudi dels enzims implicats en la biosntesi dantocians ha estat el Northern blot o hibridaci in situ del mRNA 448, 451, 453, 456, 457. En aquest cas, el RNA missatger s allat, separat mitjanant electroforesi, hibridat en una membrana i posteriorment, enfrontat a una sonda del gen dinters marcada, sigui radioactivament o amb altres agents (com la digoxigenina) que permetin la detecci i lestimaci de la quantitat dhibridaci. Aquesta tcnica presenta complicacions de tipus operatiu, i a ms resulta difcil quan sanalitzen gens especfics de cl.lules o teixits en qu labundncia del RNA missatger s baixa o quan la quantitat de material de partida s un factor limitant458. En el treball de Jaakola et al 445 la hibridaci no sefectua directament amb el RNA, ja que els antocians causen problemes en la detecci amb el seu sistema, fonamentat en la digoxigenina. Per aquest motiu efectuen la hibridaci amb el cDNA corresponent al RNA allat. En aquest punt la metodologia sassembla a una altra de les eines per determinar lexpressi gnica: la RT-PCR. La tcnica de la RT-PCR quantitativa consisteix a realitzar una retrotranscripci (RT) del RNA missatger allat, per tal dobtenir una molcula de DNA complementari (cDNA) a la seqncia del RNA, i posteriorment efectuar una amplificaci per PCR del cDNA obtingut. La quantitat de cDNA corresponent a un gen dinters dependr del seu nivell dexpressi, s a dir, del nombre de molcules de RNA que la cl.lula hagi sintetizat en les condicions destudi. En diferents nivells dexpressi gnica, sobtenen, doncs, diferents quantitats de mRNA corresponent a un gen donat. Posteriorment, la PCR especfica amplificar selectivament el cDNA corresponent al RNA del gen dinters. Per a aix s necessari que en la reacci de PCR sutilitzin uns cebadors especfics que amplifiquin noms el cDNA corresponent al gen dinters, i no daltres. Per tal de normalitzar els resultats i aix evitar incorreccions derivades duna diferent eficcia dels processos de retrotranscripci, sescull un gen de referncia que es retrotransctriu en les mateixes condicions i que desprs tamb s amplificat amb uns altres prmers especfics. Per a lelecci daquest gen de referncia existeixen diferents possibilitats, per la ms mpliament utilitzada s lelecci dun gen constitutiu, lexpressi del qual sigui independent de les condicions. Normalment sempren els gens de lactina o la tubulina com a gens de referncia, ja que es considera que la seva expressi no resulta induda ni inhibida
458
Baiges, I. (2000).Identificacin y caracterizacin de acuaporinas en Vitis (Richter-110); Tesi doctoral, Dept Bioqumica i Biotecnologia, URV
279
segons les condicions de treball. No obstant aix, cal tenir en compte que en segons quines circumstncies, lexpressi daquests gens pot deixar de ser constitutiva. Laparici de termocicladors a temps real ha perms perfeccionar la tcnica de RT-PCR quantitativa, ja que en permetre el seguiment per a cada cicle del producte de PCR format, fan possible obtenir unes acurades corbes damplificaci, a partir de les quals es pot extrapolar la concentraci inicial de cDNA del gen dinters. La tcnica de RT-PCR ha estat utilitzada en lestudi de lexpressi gnica de la PAL al gerd452, per per al nostre coneixement, no ha estat aplicada per a lestudi de lexpressi daquest enzim en Vitis.
6.2. OBJECTIUS
Lobservaci, comentada en lanterior captol, que els cultius cel.lulars sintetitzen antocians, i la descripci que en altres treballs indica que aquesta biosntesi va lligada a un increment en lactivitat de la PAL459, ens va portar a plantejar un experiment dexpressi gnica daquest enzim en Vitis vinifera. Aix implicava dos objectius: 1) Disseny duns prmers adequats que permetin lamplificaci selectiva del gen de la PAL en Vitis vinifera 2) Estudi de lexpressi gnica en condicions destrs en suspensions cel.lulars
459
Mori, T; Sakurai, M; Sakuta, M. (2001).Effects of conditioned medium on activities of PAL, CHS, DAHP synthase (DS-Co and DS-Mn) and anthocyanin production in suspension cultures of Fragaria ananassa; Plant Science 160: 355-360
280
6.3. MATERIALS I MTODES 1) Extracci de RNA total
Lobtenci dun RNA pur s primordial per tal dassegurar lxit en una anlisi dexpressi gnica. El RNA s una molcula extremadament lbil, i per aix al llarg de tot el procs sha de minimitzar el seu contacte amb les RNAses alliberades durant la ruptura de la cl.lula, aix com evitar la introducci de RNAses externes. Per a aix, totes les solucions aquoses es tracten amb dietilpirocarbonat (DEPC) (Sigma) 0.1% durant una nit, i desprs sautoclaven per tal de destruir el DEPC. Les solucions de Tris reaccionen amb el DEPC, i per tant es preparen a posteriori amb aigua prviament tractada amb DEPC. El material no metl.lic s tractat amb la soluci RNAsa Zap. El protocol dallament est adaptat de Steenkamp et al.460:
1) Shomogenitza el material pulveritzant-lo amb nitrogen lquid 2) Es pesen aproximadament 0.1 g de mostra 3) Safegeixen 500 l de tamp CTAB (3% CTAB, 1.4M NaCl, 20 mM EDTA, 1 M Tris-HCl pH=8,6; esterilitzat per filtraci) i 1 l de 2-mercaptoetanol 4) Sagita en vrtex durant 5 minuts, i sincuba a 60C durant 30 minuts, tot agitant peridicament 5) Safegeix 1 volum de cloroform: Alcohol isoamlic (24:1) 6) Sagita vigorosament durant 5 minuts 7) Es centrifuga a 10000g durant 40 minuts a temperatura ambient 8) Es transfereix el sobrenedant a un nou tub, procurant no arrossegar la interfase, i safegeixen 0.7 volums disopropanol 9) Sagita suaument per inversi el tub 10) Es centrifuga a 10000g durant 5 minuts a 4C 11) Selimina el sobrenedant 12) Es renta el precipitat amb 150 l detanol 76% fred. 13) Es centrifuga 1 minut i selimina tot letanol possible 14) Sasseca el precipitat durant 20 minuts en el Speed-Vac.
El precipitat net cont tant DNA com RNA. El segent pas seria, doncs, leliminaci del DNA de la mostra. Hi ha diferents metodologies per assolir aquest objectiu, com la precipitaci selectiva amb clorur de liti o el tractament amb DNAsa. En les nostres mostres, la presncia elevada de compostos fenlics complicava lobtenci dun RNA prou pur per tal que ambds tractaments fossin efectius. Per aquest
460
Steenkamp, J; Wiid, I; Lourens, A; van Helden, P. (1994). Imporved method for DNA extraction from Vitis vinifera. Am J Enol Vitic. 45(1):102-106
281
motiu, per tal de purificar el RNA, es va escollir la utilitzaci del kit dallament de RNA de Sigma-Roche:
15) El pellet obtingut amb la metodologia anterior es resuspen en 400 l de tamp de trencament/uni (4.5M hidroclorur de guanidina, 50 mM Tris-HCl, 30% Triton X-100, pH 6.6) 16) Es diposita la suspensi a sobre de la columna de fibra de llana de vidre i sadapta el tub col.lector 17) Es centrifuga 15 segons a 8000 g i es descarta lelut 18) Es pipeteja sobre la columna una mescla de 90 l de tamp dincubaci de la DNAsa (1M NaCl, 20 mM Tris-HCl, 10 mM MnCl2, pH 7.0) i 10 l de DNAsa I (20 KU/ml, Roche). Sincuba durant 15-25 minuts 19) Safegeixen 500 l del tamp de rentat I (5M hidroclorur de guanidina, 20 mM Tris-Hcl, 10% etanol, pH 6.6), i es centriguga durant 15 segons a 8000g 20) Es descarta lelut, safegeixen 500 l del tamp de rentat II (20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, 80% etanol, pH 7.5) i es torna a centrifugar com en el pas anterior 21) Safegeixen 200 l de tamp de rentat II i es centrifuga 2 minuts a mxima velocitat per tal deliminar tot el tamp de rentat residual 22) Selimina lelut 23) El RNA selueix amb 50-100 l daigua-DEPC, centrifugant 1 minut a 10 000 rpm.
El RNA ja est llest per a la retrotrancripci o, si es vol guardar, es conserva a 80 C.
2) Extracci de DNA
El protocol seguit s el mateix que per a lextracci de RNA, per en lloc dutilitzar el kit de Roche, es prosegueix a partir del pas 15 (obtenci del precipitat) de la manera segent:
15b) Es resuspen el precipitat en 200 l de tamp TE (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8) 16b) Safegeix 1 l de ribonucleasa A (10 mg/ml) per cada 100 l de soluci, i sincuba a 37C durant 15 minuts. El DNA es pot conservar a 20C fins la seva utilitzaci.
Tant el DNA com el RNA extrets es quantificaven a partir de la lectura dabsorbncia a 260 nm; i la puresa es comprovava en un gel dagarosa al 1% amb tinci amb bromur detidi.
282
3) Retrotranscripci Aquest pas consisteix a lobtenci del cDNA corresponent al RNA extret, en una reacci catalitzada per lenzim retrotranscriptasa o transcriptasa inversa.
1) 2) 3) Es dilueix la mostra a una concentraci inicial de RNA de 1000 ng/l amb aigua DEPC Es preparen 2 eppedorfs Afegim als eppendorfs:
A B 2,5 l de mostra 2,5 l de mostra 1 l oligo(dT) 12-18 (Gibco) 1 l aigua DEPC 8.5 l aigua DEPC 8.5 l aigua DEPC 4) Sincuben les mostres durant 10 minuts a 70C 5) Es deixen 1 minut en gel 6) A cada eppendorf safegeix: 4 l de tamp de PCR 5X (250 mM Tris-HCl, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2, pH 8.3), 1 l de dNTPS i 1l de Ditiotreiol (DTT, Gibco) 7) Sincuba 5 minuts a 42 C 8) A lependorf A safegeix 1 l de lenzim, Superscript (Gibco) 9) Saplica el segent programa al termociclador: 50 minuts a 42C, 15 minuts a 72C per aturar la reacci
4) Realitzaci de la PCR
En aquest pas samplifica el cDNA producte de la retrotranscripci mitjanant la utilitzaci de cebadors especfics, de manera que noms samplifica la regi concreta de DNA que flanqueja ambds cebadors. Es disposen en tubs eppendorfs de PCR
2,5 l de Tamp 10X 1,5 l de Mg Cl2 1 l dNTPS 10 mM 1 l de cada cebador, en concentraci 0,3 M. Es treballa amb 4 cebadors; dos corresponents al gen dinters, i dos corresponents al gen de referncia 5 l de mostra (cDNA) 13,5 l aigua bidestil.lada 0,5 l de Taq Polimerasa Condicions de termociclaci:
283
5. Realitzaci de la PCR quantitativa del DNA
El fonament de la tcnica s el mateix que el de la PCR, per en aquest cas es fa un seguiment de la reacci a temps real mitjanant la monitoritzaci del senyal de fluorescncia que emet el SYBR Green I (Applied Biosystems), un compost que sintercala especficament al DNA de doble cadena i en aquestes condicions emet fluorescncia. Per tant, el senyal ems s proporcional a la quantitat de molcules de doble cadena formades en el cicle de PCR.
Laparell que sutilitza per fer el seguiment s el Gene Amp 5700 Sequence Detection System. Es treballa amb 4 tipus de mostra: STD: estndards, preparats per amplificaci de DNA extrets de Vitis amb els cebadors especfics. La quantificaci de la concentraci sefectua a partir de la lectura dabsorbncia a 260 nm en lespectrofotmetre GeneQuant pro. UNK: mostres problemes (cDNA) NAC: mostres problema sense haver fet la reacci de retrotranscripci NTC: blancs En aquest cas, interessa que la PCR sigui especfica i doni noms un amplic, ja que la lectura de fluorescncia no s discriminant. Per tant, en cada tub de reacci noms sha de posar una parella de cebadors, de manera que noms es formar un producte damplificat: el corresponent al gen de la PAL o el corresponent al gen de la tubulina, segons quina hagi estat la parella de cebadors que shagin utilitzat en la reacci. Aix significa que es duplica el nombre de mostres respecte a les utilitzades en la reacci de PCR convencional. En linici de la reacci de PCR, el comportament sajusta a lideal, que segueix un carcter exponencial, mentre que posteriorment la reacci assoleix un estat de saturaci. Pot demostrar-se que el cicle al qual comena lamplificaci (Ct) depn de la concentraci de DNA present en la mostra. Lestabliment daquesta Ct sha de fer dintre de la primera fase exponencial, i vindr condicionada per un valor umbral de a partir del qual es considera que es produeix amplificat. La grfica que ens representa el nivell de fluorescncia respecte el nombre de cicle ens permet establir a quin cicle (Ct) sha assolit aquest valor umbral per cada mostra. Un cop determinada aquesta Ct, es pot esbrinar la concentraci del cDNA que sha amplificat a partir de la comparaci amb mostres estndards de concentraci coneguda. A partir daquests valors, es pot avaluar lexpressi gnica en diferents condicions. Per corregir
284
els errors propis del mtode, sutilitza com a factor corrector la Ct corresponent a un gen de referncia. El protocol damplificaci que es va utilitzar fou anleg al de lamplificaci per PCR:
El pas de 10 minuts a 94 C serveix per activar la Taq polimerasa Gold, que s lenzim subministrat per Applied per fer la reacci. En la majoria de protocols que utilitzen aquest aparell termociclador, en els cicles no sutiliza el pas dextensi a 72C, ja que sacostuma a treballar amb amplicons petits, que sn amplificats en poc temps, de manera que amb el que es triga en pujar i baixar les temperatures ja s ms que suficient per assegurar-ne lextensi completa. Tanmateix, en les nostres condicions de treball, un protocol daquest tipus condueix a una no amplificaci dels fragments dinters, sin a la de dmers de prmers, motiu pel qual es va adaptar el protocol de PCR, que havia mostrat xit. Pel mateix motiu es va augmentar la temperatura dhibridaci de 60 a 65C, ja que en condicions ms restrictives disminueixen les amplificacions inespecfiques.
285
6.4. RESULTATS I DISCUSSI 6.4.1. Disseny de prmers A lhora de realitzar lanlisi de lexpressi mitjanant RT-PCR, s necessari fer un disseny de prmers per tal que tingui lloc la reacci en cadena de la polimerasa. Aquest pas s crucial, ja que determinar que el cebador dissenyat es pugui unir a la cadena motllo de DNA i generar un amplic, que s el resultat de la PCR. Per altra banda, en els experiments dexpressi gnica es requereix, a ms del gen diana, un gen constitutiu o de referncia, lexpressi del qual sigui constant en qualsevol situaci de la cl.lula. En el nostre cas, vam escollir com a gen de referncia el de la tubulina. Per efectuar el disseny de prmers, es va efectuar una cerca a la base de dades dcids nucleics EMBL (European Molecular Biology Laboratory) dentrades corresponents a seqncies nucleotdiques de RNA de la PAL. Per tal dassegurar un bon disseny, es va decidir fer un multialiniament daquesta seqncia amb la daltres seqncies de PAL daltres organismes, utilitzant lalgoritme ClustalW 461 Els resultats daquest multialiniament es presenten a la figura 6.4.1. Les regions en vermell indiquen un 100% dhomologia en la seqncia de totes les espcies. Aquestes sn les zones que conv seleccionar per tal destablir-hi els cebadors. Malauradament , cap daquestes regions resulta prou llarga perqu no hi hagi cap mismatch (desaparellament). En el cas de no disposar de seqncies corresponents a lorganisme, una opci s el disseny de prmers degenerats, s a dir, una barreja de prmers en qu per cada mismatch hi hagi les 4 possibles combinacions de base nitrogenada. El problema dels prmers degenerats s que disminueix lespecificitat de la uni amb el DNA. Com que es disposava duna seqncia de RNA de PAL de Vitis, aix com dun fragment del DNA genmic, es va escollir seleccionar les regions que presentaven major homologia per a aquestes dues molcules, procurant que tamb presentessin una alta homologia amb altres seqncies, i es van dissenyar els prmers de tal manera que sanellessin en aquella zona.
461
Thompson,JD; Higgins, DG; Gibson, TJ (1994); CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignement through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice; Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680
286
Figura 6.4.1. Multialiniament de seqncies de RNA corresponents a la PAL de difernents organismes. Les fletxes indiquen el lloc on shibrida cada prmer dissenyat.
287
Convenia tamb buscar 2 regions dhibridaci, una perqu shibrids el cebador a la cadena en direcci 3-5; i laltra perqu ho fes en la cadena complementria, de sentit 5-3. La distncia entre ambds havia de ser prou gran perqu lamplic fos fcilment detectable en un gel dagarosa. Per aix es va escollir la zona entre el nucletid 400 i el 800, ja que era la que presentava un grau dhomologia entre espcies ms gran i, per altra banda, generava una mida damplic suficient. A partir daqu, es van buscar zones de 20 parells de bases (mida estndard dels cebadors utilitzats en PCR) que poguessin complir els nostres requisits. Era especialment important assegurar la hibridaci dels extrems del cebador, ja que s a partir don actua la DNA polimerasa. Els prmers escollits van ser els segents: PAL1: 5- ATT GCC ATG GCT TCC TAC TG 3 PAL2: 5- TCC TCC AAA TGC CTC AAA TC 3
Posteriorment es va avaluar mitjanant el servidor GeneWalker quin era lamplic que generaven, aix com la possible formaci de dmers de prmers (figura 6.4.2), s a dir, de productes dhibridaci entre parelles de prmers o dautoassociaci del mateix prmer. Aquestes estructures compliquen leficincia de la reacci de PCR, i s per tant necessria la seva minimitzaci.
ATTGCCATGGCTTCCTACTG | || ||| | TCCTCCAA--ATGCATCAAATC ATTGCCATGGCTT-CCTACTG || || | | | TCCTCCAAATGCCTCAAATC ATTGCCATGGCTT-CCTACTG || || | | | TCCTCCAAATGCCTCAAATC ATTGCCATGGCTTCCTACTG || || | TCCTCCAAA--TGCCTCAAATC ATTGCCATGGCTTCCTACTG || | | || TCCTCCAAATGCCTCAAATC
ATTGCCATGGCTTCCTACTG | || ||| | TCCTCCAA--ATG-CCTCAAATC
Figura 6.4.2. Estructures de dmers de prmer possibles amb els cebadors dissenyats
Els resultats oferien poques combinacions de dmers de prmers possibles, i a ms les que es generaven resultaven estructuralment complicades, de manera que es consider que la formaci daquestes estructures estaria poc afavorida i per tant, no esdevendria una limitaci del mtode.
288
Finalment, per tal dassegurar que aquesta parella de prmers eren especfics del gen de la PAL i, per tant, no hi hauria interferncies causades per lamplificaci daltres regions del genoma, es va executar el programa blastN per tal defectuar una comparaci daquestes seqncies de 20 parells de bases amb el conjunt de seqncies presents a les bases de dades462. Els resultats oferiren poca homologia amb altres seqncies que no fossin de fenilalanina amonio liases daltres organismes, motiu pel qual es conclogu que eren uns prmers suficientment especfics. Un estudi similar es va efectuar per al gen de referncia, la tubulina. En aquest cas, la seqncia de partida fou la dun fragment de mRNA de Vitis. Els prmers escollits en aquest cas foren: tub1: 5- ATG ATG TGT GCT GCT GAT CC 3 tub2: 5- TCC ACT TCC TTG GTG CTC ATC 3
462
Altschul, SF; Madden, TL; Schaeffer, AA; Zhang, J; Zhang, Z; Miller, W; Lipman, DJ (1997); Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs; Nucleic Acids Res. 25:3389-3402
289
6.4.2) Determinaci de lexpressi gnica. a) Extracci del RNA
18S 28S
La fotografia 6.4.1 mostra lelectroforesi en gel dagarosa (1.5%) de diversos extractes de RNA. La integritat del RNA missatger es suposa quan sobserven clarament les bandes corresponents al RNA ribosomal 28S i 18S. Aix significa que no hi ha hagut degradaci del RNA i, per tant, es pot procedir a la seva quantificaci i a la realitzaci de la reacci de retrotranscripci.
Fotografia 6.4.1. Extracci de RNA total. P= Marcador de pesos moleculars (DNA ladder)
En la segent taula es presenta el resultat de lextracci de RNA per a mostres corresponents a suspensions cel.lulars de Vitis vinifera corresponents al 5 dia de cultiu:
RNA ( g/ l) 0 0s C Cs 50 50 S 1.45 1.95 2.50 2.52 2.96 2.80 A 230 0.691 0.760 0.832 0.854 0.907 0.891 A 260 0.453 0.375 0.774 0.787 0.924 0.874 A 280 0.292 0.375 0.453 0.459 0.528 0.498 260/230 0.656 0.803 0.93 0.922 1.019 0.981 260/280 1.551 1.627 1.709 1.715 1.75 1.755
La mesura dabsorbncia a 260 correspon a labsorci dcids nucleics, mentre que les de 280 i 230 indiquen contaminaci de protenes (280) o de polisacrids i compostos fenlics (230). Curiosament, no resulten ser les mostres en qu inicialment hi havia ms quantitat dantocians (les corresponents a les condicions 0 i 0s) les que presenten una major contaminaci per aquests compostos. Sembla, doncs, que en el procs de purificaci seliminen en gran mesura els antocians daquestes mostres, per no sembla que succeeixi el mateix amb les situacions control (C i Cs) i dexcs de nitrogen (50 i 50s). De fet, el procs dextracci i allament de RNA total resulta poc reproduble, i per aix s necessari efectuar la quantificaci de les molcules de RNA abans de procedir a la reacci de retrotranscripci, per tal dajustar les concentracions de manera que sigui iguals.
290
b) RT-PCR
Un cop feta la retrotranscripci (RT), convenia veure si els prmers dissenyats funcionaven i amplificaven aquest cDNA obtingut. En la fotografia 6.4.2 es presenten els resultats corresponents a lamplificaci del cDNA per les mostres del 5 dia de cultiu, en les condicions anteriorment descrites:
84 pb 200 pb
Fotografia 6.4.2. Amplificats obtinguts en la reacci de RT-PCR.
Sobtenen 2 amplificats, la mida dels quals es correspon amb la mida dels fragments terics (200 i 84, respectivament) calculada a partir de les seqncies nucleotdiques de la base de dades. La banda de 200 pb correspon a lamplic generat per a la determinaci de la PAL; i el de 84 pb, al de la tubulina. A falta destudis de seqenciaci que confirmin aquests resultats, es pot sostenir que els prmers dissenyats shibriden a la cadena de DNA i lamplifiquen.
En les mostres que no han experimentat la reacci de retrotranscripci (no RT), no sobserven aquestes bandes, la qual cosa s indicadora de labsncia de DNA genmic contaminant. S que sobserven amplificats inespecfics de baixa longitud de seqncia, que podem atribuir a la formaci de dmers de primers. En casos que no hi ha cadena de DNA motllo, augmenta la probabilitat que les molcules de cebador suneixin entre elles i puguin formar aquestes estructures que, per altra banda, no es formen en presncia del DNA motllo. Abans de laparici dels termocicladors que segueixen les reacions de PCR a temps real, la tcnica descrita es feia servir per a lanlisi de lexpressi gnica. La metodologia consistia a efectuar diferents vegades la reacci de PCR, aturant-la en diferents cicles. A partir de la visualitzaci dels cids nucleics en gels delectroforesi, es podia determinar en quin cicle es formava el producte i, a partir daqu, fer una estimaci de lexpressi comparada del gen destudi en una situaci control respecte daltres situacions, utilitzant sempre un gen de referncia. Tanmateix, aquesta metodologia implica un gast elevat de mostra i una quantificaci relativament imprecisa. Per aquest motiu, es va provar defectuar la reacci de PCR en un termociclador a temps real que permets enregistrar la grfica de producte de PCR respecte el nombre de cicle.
291
c) RT-PCR a temps real La recta es va fer a partir de fragments damplic en concentracions corresponents a 10510 molcules/ ml. Es van efectuar dues rectes, una per a cada parella de prmers. La grfica 6.4.1. recull la lectura de fluorescncia enfront el cicle de PCR. Es fixa un valor llindar de fluorescncia de 0.1, que correspon a la zona de comportament exponencial de les corbes damplificaci. El punt de tall de les corbes damplificaci amb aquest valor llindar ens dna el valor de Ct de la mostra, s a dir, el n de cicle al qual es considera que ha comenat lamplificaci. Aquest nombre de cicle depn Grfica 6.4.1. Corbes damplificaci per diferents concentracions de cDNA inicial. Es representa la de la concentraci de cDNA inicial de la fluorescncia per cada cicle mostra, de manera que a una major concentraci de cDNA li correspon un menor n de cicle. La relaci linial que sestableix entre el nombre de cicle i la concentraci inicial de DNA per cadascun dels gens dinters (PAL i tubulina) es recull en les grfiques 6.4.2:
Grfica 6.4.2. Rectes de calibratge de la Ct (cicle al qual sarriba al valor umbral de fluorescncia) respecte el logaritme de la concentraci de cDNA inicial. Es presneten els valors per al gen de la PAL i per al gen de referncia.
El rang de linialitat sestableix per a unes concentracions entre 105-100 molcules de DNA/ l.
292
Per descartar la presncia damplificacions inespecfiques que alterin la determinaci, resulta til lenregistrament de les corbes de dissociaci (grfica 6.4.3). En aquest cas, el termociclador efectua, quan acaba el darrer cicle de la PCR, una calorimetria descombrat, que permet determinar si sha format un nic producte damplificaci. La calor aplicada servir per anar augmentant la temperatura de la barreja de reacci, i en el moment que sassoleixi la temperatura de dissociaci del producte amplificat, de doble cadena, salliberar el substrat fluorescent (SYBR Green), de manera que senregistrar una disminuci de la fluorescncia. La representaci de la derivada del canvi de fluorescncia respecte la temperatura ens dna una corba de dissociaci, amb un mxim corresponent a la temperatura de dissociaci de lamplic, que indica la presncia dun sol producte
Grfica 6.4.3. Corbes de dissociaci de lamplic generat mitjanant la RT-PCR. Sobt un sol mxim per cada gen destudi, cosa que suposa lexistncia dun nic producte damplificaci
damplificaci. Si en el procs de PCR haguessin tingut lloc altres amplificacions que no la del gen dinters, sapreciarien diversos pics en la corba de dissociaci. En el nostre cas, tant lamplic de la tubulina com el de la PAL tenen una temperatura de dissociaci similar, per aix no t perqu ser aix.
293
La grfica 6.4.4 recull les amplificacions registrades per les mostres corresponents al gen de tubulina. Es presenten les corbes corresponents a mostres (UNK) en qu sha efectuat la reacci de retrotranscripci i les mostres (NAC), en les quals no sha efectuat la reacci de retrotranscripci i, per tant, no haurien de donar senyal. La presncia de senyal indicaria que en el procs dextracci el RNA no hauria quedat allat del tot, i restaria contaminat amb restes de DNA genmic. Dels valors de Ct observats podem concloure que no hi ha aquesta contaminaci, ja que els valors sassimilen als Grfica 6.4.4. Corbes damplificaci de les mostres del control negatiu (NTC) i, a ms, les corbes RT, en les quals ha tingut lloc la retrotranscripci, i els blancs no RT, en qu aquesta no ha tingut lloc de dissociaci no coincideixen amb les del gen de la tubulina, sin que correspondrien a altres estructures inespecfiques, segurament dmers de primers.
Per a determinar lexpressi relativa, sinterpola en la recta de calibratge per determinar la Ct corresponent. Es calcula el quocient entre el nombre de molcules del gen dinters i el nombre de molcules del gen de referncia. Aquest valor ens indicaria els nivells dexpressi del gen dinters.
Del clcul daquest quocient, es va poder constatar que el gen dinters est poc expressat en comparaci al gen de referncia. Com es pot apreciar en la grfica 6.4.5, lamplificaci del cDNA del gen de la PAL apareix gaireb 10 cicles desprs de la de tubulina, cosa que significa unes diferncies de concentraci de lordre dun factor de 1000. Per aquesta relativament baixa expressi del gen de la PAL, i a fi de poder observar les diferncies, es va optar per allargar els cicles de PCR fins a 50.
Grfica 6.4.5. Comparaci de les corbes damplificai del gen de tubulina respecte les del gen de la PAL. Es pot apreciar una diferncia dal voltant de 10 cicles entre ambdues.
294
Posteriorment, es refereixen aquests valors a una situaci determinada. En el nostre estudi, es va triar com a aquesta condici de referncia la corresponent al medi control, en el 3r dia.
La grfica 6.4.6. recull les variacions en lexpressi. Es pot observar que el gen de la PAL sexpressa fortament en els primers moments del cultiu (el 1r dia), i s quantitativament ms important en les condicions destrs hdric (Cs, 50s). Aquesta expressi comena, doncs, amb anterioritat a lacumulaci dantocians. Cal tenir en compte que la fenilalanina amonio liasa catalitza el primer pas de la via, per posteriorment hi ha tota una srie de passos complexos abans darribar a la formaci de lantoci.
50
Expressi
40
30
20
10
0
d1 Estrs nitrogenat ("0") Control ("C") Excs nitrogenat ("50") d3 d5 d8
Estrs nitrogenat i hdric ("0s") Estrs hdric ("Cs") Excs nitrogenat + estrs hdric ("50s")
Grfica 6.4.6. Expressi relativa del gen de la PAL en diferents dies de cultiu i en diferents condicions destrs.
Aquests resultats estan dacord amb els observats en altres supensions cel.lulars. Ozeki i Takeda453 mostren un increment de lexpressi daquest gen desprs de transferir-lo a un nou medi, per diminuir a continuaci. En els darrers dies de cultiu, torna a haver-hi un increment associat a la biosntesi dantocians. A ms, els mateixos autors exposen que hi ha una estimulaci de lexpressi del gen just desprs del moment daplicar llum UV al cultiu. T el mateix efecte sobre lexpressi del gen de la PAL ls del.licitors en suspensions de Vitis456 i
295
de julivert451. Sembla, doncs, que lacci dun estrs osmtic actuaria de la mateixa manera, promovent de manera rpida lexpressi del gen de la PAL. El fet que les situacions destrs nitrogenat no promoguin una expressi de la PAL en els primers estadis resulta estrany, si es t en compte lelevada sntesi dantocians que promouen aquestes condicions. Tanmateix, en el darrer dia hi ha una forta expressi en aquestes condicions que no t lloc en les situacions sense carncia de nitrogen. Ozeki454 descriu en pastanaga la presncia de dues isoformes de la PAL, una que s la que sexpressa en produirse la transferncia a un nou medi fresc, i laltra, ms relacionada amb la sntesi dantocians, que s la que esdevindria un cop ha cessat la divisi cel.lular. Aix justificaria el manteniment del color que sobserva en les cl.lules sotmeses a estrs nitrogenat. Roman, per, la incgnita sobre com sestimula la sntesi dantocians en les primeres fases del cultiu. En aquest sentit, cal remarcar que la PAL s el primer enzim de la via, per molts daltres participen en la formaci dantocians. De fet, en alguns treballs efectuats en rams in vivo448, 445, a partir del moment del verolament, la PAL resulta molt menys expressada que la calcona sintasa, la dihidroflavonol 4-reductasa, la flavanona-3-hidroxilasa o la UDP Glc-flavonoid 3o-glucosil transferasa. Per tant, serien aquests enzims els qui determinarien la producci dantocians. Aix significa que, per comprendre b el mecanisme de sntesi dantocians, convindria ampliar el present estudi a daltres enzims de la via.
6.5. CONCLUSIONS
1. Mitjanant la metodologia de RT-PCR quantitativa a temps real, pot posar-se de manifest lexpressi gnica de lenzim fenilalanina amonio liasa (PAL) en diferents condicions. Aix, es pot observar una expressi a causa de la transferncia del medi, que resulta ms important en les condicions destrs hdric. Per altra banda, en situacions destrs nitrogenat, sobserva una sobreexpressi del gen en els darrers dies del cultiu. 2. Lexpressi daquest gen resulta relativament baixa, especialment si se la compara amb la del gen de la tubulina.
296

1.
Camm, EL; Towers, GHN. (1973). Phenylalanine ammonia lyase, Phytochemistry, 12:961-973 2. Lister, C; Lancaster, J; Walker, J (1996).Developmental changes in enzymes of flavonoid biosynthesis in the skins of red and green apple cultivars, J Sci Food Agric 71: 313-320 3. Zucker, W. (1965) Induction of phenylalanine deaminase by light and its relation to chlorogenic acid synthesis in potato tuber tissue; Plant Physiology, 40 (5): 779-784 4. Jones, DH. (1984). Phenylalanine ammonia-lyase: regulation of its induction, and its role in plant development; Phytochemistry 23(7): 1349-1359 5. Roubelakis-Angelakis, KA; Kliewer, WM. (1985). Phenylalanine ammonia-lyase in berries of Vitis vinifera L.: extraction and possible sources of error during assaying; Am J Enol Vitic 36: 314-315 6. Faragher, JD; Brohier, RL. (1984).Anthocyanin accumulation in apples skin during ripening: Regulation by ethylene and phenylalanine ammonia-lyase Sci Hortic 22:89-96 7. Given, NK; Venis, MA; Grierson, D. (1988). Purification and properties of phenylalanineammonia lyase from strawberry fruit and its synthesis during ripening; J Plant Physiol 133:3137(1988) 8. Dubery, IA; Schabort, JC. (1986). Phenylalanine ammonia lyase from Citrus sinensis: purification hydrophobic interaction chromatography and physical characterization; Biochem Int 13: 579-589 9. Kataoka, I; Kubo, Y; Sugiura, A; Tomana, T (1983). Changes in L-phenylalanine ammonia-lyase activity and anthocyanin synthesis during berry ripening of three grape cultivars; J Japan Soc Hort Sci 33, 213-220 10. Hrazdina, G; Parsons, GF; Mattick, LR. (1984). Physiological and biochemical events during development and maturation of grape berries; Am J Enol Vitic 35:220-227 (1984) 11. Lister, C; Lancaster, J. (1996). Phenylalanine ammonia lyase (PAL) activity and its realtionship to anthocyanin and flavonoid levels in New Zealand-grown apple cultivars; J Amer Soc Hort Sci 121 (2): 281-285 (1996) 12. Cheng GW; Breen, PJ. (1991).Activity of phenylalanine ammonia-lyase (PAL) and concentrations of anthocyanins and phenolics in developing strawberry fruit; J Am Soc Hortic Sci 116:865-869 13. Hahlbrock, K; Ragg, H. (1973). Light-Induced changes of enzyme activities in parsley cell suspension cultures: effects of inhibitors of RNA and protein synthesis; Archiv Biochem Biophysics 166, 41-46 14. Shye Tan. Relationships and interactions between phenylalanine ammonia-lyase, phenylalanine ammonia-lyase inactivating system, and anthocyanin in apples. (1979). J. Amer. Soc. Hort. Sci. 104(5):581-586 15. Roubelakis-Angelakis, KA; Kliewer, WM. (1986). Effects of exogenous factors on phenylalanine ammonia-lyase activity and accumulation of anthocyanins and total phenolics in grape berries; Am J Enol Vitic, 37 (4) 275-280 16. Hrazdina, G; Parsons, GF. (1982). Induction of flavonoid synthesizing enzymes by light in etiolated pea (Pisum sativum cv. Midfreezer) seedlings; Plant Physiol. (1982), 506-510 17. Kakegawa, K; Hattori, E; Koike, K; Takeda, K. (1991). Induction of anthocyanin synthesis and related enzyme activities in cell cultures of centaurea cyanus by UV-light irradiation; Phytochemistry, 30 (7): 2271-2273
297
18.
Kataoka, I; Kubo, Y; Sugiura, A; Tomana, T. (1984). Effects of temperature, cluster shading and some growth regulators on L-phenylalanine-ammonia-lyase activity and anthocyanin accumulation in black grapes; Mem Cvoll Agric Kyoto Univ, 124: 35-44 19. Montero, T; Moll, E; Martn-Cabrejas, M; Lpez-Andreu, F. (1988). Effects of gibberellic acid (GA3) on strawberry PAL and TAL enzyme activities, J Sci Food Agric ; 77: 230-234 20. Rhodes, MJC; Wooltronton, LSC. (1971).The effect of ethylene on the respiration and on the activity of Phenylalanine ammonia lyase in swede and parsnip root tissue; Phytochem , 10:1989-1997 21. Blankenship, SM; Unrath, CR. (1988)PAL and ethylene content during maturation of red and golden delicious apples. Phytochemistry, vol 27 (4): 1001-1003 22. Ramamurthy, M; Maiti, B; Thomas, P; Madhusudan, P. (1992). High-performance liquid chromatography determination of phenolic acids in potato subers (Solanum tuberosum) during wound healing; J Agric Food Chem, 40, 569-572 23. McLeod, L; Poole, PR. (1994). Changes in enzymic activities after harvest and in early stages of Botrytis cinerea infection of kiwifruit; J Sci Food Agric, 64, 95-100 24. Dangyang,K; Saltveit, ME. (1989); Developmental control and russet spotting, phenolic enzymes, and IAA oxidase in cultivars of iceberg lettuce; J Amer Soc Hort Sci 114(3)472-477 25. Holcroft, D; Gil, M; Kader, A. (1988). Effect of carbon dioxide on anthocyanins, phenylalanine ammonia lyase and glucosyltransferase in the arils of stored pomegranates; J Amer Soc Hort Sci 123(1)136-140 26. Hamza, F; Castaigne, F; Couture, R; Makhlouf, J. (1994). Effet dune atmosphre riche en CO2 sur la teneur en phnols et lactivit de la phnylalanine ammonia-lyase de la laitue romaine; Sciences des Aliments 14:311-320 27. Ritenour, MA; Ahrens, MJ; Saltveit, ME. (1995). Effects of temperature on ethyleneinduced phenylalanine ammonia lyase activity and russet spotting in harvested iceberg lettuce; J Amer Soc Hort Sci 120(1):84-87 28. Jaakola, L; Mtt, K; Pirttil, AM; Trrnen, R; Krenlampi, S; Hohtola, A. (2002). Expression of genes involved in anthocyanin biosynthesis in relation to anthocyanin, proanthocyanidin and flavonol levels during bilberry fruit development; Plant Phyisiology, vol 130, 729-739 29. Perkin-Veazie, P. (1995). Growth and ripening of strawberry fruit, Hortic Rev 17: 267-297 30. Moyano, E; Portero-Robles, I; Medina-Escobar, N; Valpuesta, V; Muoz-Blanco, J; Caballero, JL. (1998). A fruit-specific putative dihydroflavonol 4-reductase gene is differencially expressed in strawberry during ripening process; Plant Physiol, 117: 711-716 31. Boss, PK; Davies, C; Robinson, SP. (1996).Analysis of the expression of anthocyanin pathway genes in developing Vitis vinifera L. Cv Shiraz grape berries and the implications for pathway regulation; Plant Physiol., 11:1059-1066 32. Larson, L. Genetics, precursors and enzymes in flavanoid biosynthesis in maize a The Genetics of Flavanoids, ed Styles; Unicopli. 33. Quattrocchio, F; Wing, JF; Leppen, HTC; Mol, JMN; Koes, RE;. (1993). Regulatory genes controlling anthocyanin pigmentation are functionally conserved among plant species and have distinct set of target genes; Plant cell, 5: 1497-1512 34. Lois, R; Dietrich, A; Hahlbrock, K; Schulz, W. (1989). A phenylalanine ammonia-lyase gene from parsley: structure, regulation and identification of elicitor and light repsonsive cisacting elements; The EMBO Journal, vol 8, n6, 1641-1648
298
35.
Kumar, A; Ellis, BE. (2001). The phenylalanine ammonia-lyase gene family in raspberry. Structure, expression and evolution; Plant Physiology, (127), 230-239 36. Ozeki, Y; Takeda, J. (1994). Regulation of phenylalanine ammonia-lyase genes in carrot suspension cultured cells; Plant, cell, tissue and organ culture, 38: 221-225 37. Ozeki, Y. (1996). Regulation of anthocyanin synthesis in carrot suspension cells; J. Plant Res 109:343-351 38. Ohl, S; Hedrick, S; Chory, J; Lamb, CJ. (1990). Functional properties of a phenylalanine ammonia-lyase promoter from Arabidopsis; The Plant Cell, vol 2, 837-848 39. Melchior, F; Kindl, H. (1991).Coordinate and elicitor-dependent expression of stiblene synthase and phenylalanine ammonia-lyase genes in Vitis cv. Optima; Arch Bioch and Bioph., 288(2) 552-557 40. Leyva, A; Jarillo, JA; Salinas, J; Martinez-Zapater, JM. (1995). Low temperature induces the accumulation of phenylalanine ammonia-lyase and chalcone synthase mRNAs of Arabidopsis thaliana in a light-dependent manner; Plant Phisiol, 108: 39-46 41. Baiges, I. (2000).Identificacin y caracterizacin de acuaporinas en Vitis (Richter-110); Tesi doctoral, Dept Bioqumica i Biotecnologia, URV 42. Mori, T; Sakurai, M; Sakuta, M. (2001).Effects of conditioned medium on activities of PAL, CHS, DAHP synthase (DS-Co and DS-Mn) and anthocyanin production in suspension cultures of Fragaria ananassa; Plant Science 160: 355-360 43. Steenkamp, J; Wiid, I; Lourens, A; van Helden, P. (1994). Imporved method for DNA extraction from Vitis vinifera. Am J Enol Vitic. 45(1):102-106 44. Thompson,JD; Higgins, DG; Gibson, TJ (1994); CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignement through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice; Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 45. Altschul, SF; Madden, TL; Schaeffer, AA; Zhang, J; Zhang, Z; Miller, W; Lipman, DJ (1997); Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs; Nucleic Acids Res
299
CONCLUSIONS
La composici antocinica duna varietat s un carcter fenotpic fortament determinat per la varietat vinfera, de manera que pot establir-se com a diferent i caracterstica, i erigir-se com a identificador varietal. En la present tesi shan caracteritzat 8 varietats negres de Vitis vinifera a partir de la seva composici en antocians. No obstant aix, una srie de factors poden modificar en major o menor grau aquesta composici. Si ens cenyim a condicions in vitro, sha pogut constatar que en situacions en qu es promogui una inhibici del creixement, com sn la limitaci de nutrients (estrs nitrogenat), o la limitaci daport daigua (estrs hdric), saconsegueix generalment incrementar la sntesi dantocians per part de la cl.lula, i fins i tot en pot variar la composici final, promovent la reacci dacilaci sobre el residu glucosdic. En camp, efectes equivalents es manifesten segons lanyada i la climatologia, i per prctiques com la irrigaci de les vinyes. Aquelles condicions que limiten el vigor de la planta, de manera anloga al que succeeix en cultius in vitro, condueixen normalment a majors acumulacions dantocians, i a un major percentatge dacilaci dels mateixos. bviament, els estressos que es poden provocar en el camp sn molt menys drstics que en lmbit dels cultius in vitro, ja que la planta s una estructura organitzada que necessita una funcionalitat en tots els seus rgans per poder donar fruit; i per tant les variacions que es poden observar sn molt menors, i sovint no sn estadsticament significatives. De la mateixa manera que hi ha una composici antocinica varietal, tamb es pot establir aquest fenomen en referncia a les proantocianidines dels pinyols del ra m. La composici tnica del ra m s fora ms complexa que la dantocians, en el sentit abarca una major quantitat destructures. En antocians, noms estan descrits 5 antocianidinmonoglucsids i els corresponents derivats acilats. En canvi, entre les proantocianidines hi ha un gran espectre de molcules (dmers, trmers, tetrmers, polmers). En la present tesi, hem pogut analitzar levoluci al llarg de la maduraci en els pinyols els principals daquests dmers, i establir un grau de polimeritzaci mitj que augmenta segons el moment de la maduraci del ra m. Per la problemtica s encara ms complexa i variada, ja que, a diferncia dels antocians, que noms es localitzen en les pells, les proantocianidines poden tenir el seu origen en pells i pinyols, i de fet les composicions en unes parts i altres sn diferents.
Ambdues famlies de molcules juguen un paper clau en la qualitat dels vins negres; els antocians, per les seves propietats cromtiques; les proantocianidines, per
303
CONCLUSIONS
la seva tanicitat. Per aix resulten clau els rendiments que se nobtinguin en el procs de maceraci. En la present tesi hem pogut comprovar com, per a diferents varietats, lextracci dantocians s diferent. Lextracci s depenent de lestructura qumica de lantoci, i aix els mostos obtinguts en sistemes tradicionals de maceraci es revelen com a empobrits en el contingut dantocians p-cumarilats. La presncia dantocians acilats s important en els vins negres, ja que poden participar en processos de copigmentaci intramolecular, aix com en reaccions destabilitzaci del color per la formaci de noves estructures. En la tesi shan abordat aquestes temtiques mitjanant solucions model. Sha pogut constatar que els antocians acilats no presenten una major reactivitat, i de fet, aquests tipus de molcules acilades es consideren ms estables que els corresponents antocians no acilats. L eficient extracci de la malvidina-3-glucsid, fruit de ser el compost majoritari en la pell del ra m, unit a la seva relativament baixa reactivitat, implica que, en la majoria de vins elaborats amb Vitis vinifera, sigui lantoci majoritari, mentre que les concentracions de la resta dantocians van disminuint i sn sovint inapreciables. Per un menor contingut antocinic no es tradueix necessriament en una ms feble intensitat cromtica, ja que s menester que els antocians evolucionin per donar formes ms resistents a la decoloraci. Alguns daquests processos els mitjana lacetaldehid, que en proves amb vins joves ha mostrat una evoluci del color cap a tonalitats teula similars a les dels vins envellits. El propi acetaldehid pot tamb conduir a la formaci de pigments de condensaci entre els antocians i les catequines, en una reacci afavorida a pH cid. Aix condueix a una evoluci en la composici fenlica en el vi i a una conseqent evoluci del color. No sn, per, els nics processos que provoquen un canvi cromtic, ja que diversitat de molcules poden promoure efectes hipercrmics i modular la tonalitat dels vins.
A lhora dinvestigar sobre els factors que influeixen en la composici fenlica, les suspensions cel.lulars de Vitis conformen una eina til de treball, ja que constitueixen un sistema a llat i controlat de senzilla manipulaci. Per a ms, permeten lobtenci de metablits secundaris dinters, ja que es poden produir en grans quantitats de manera rpida i senzilla. Tanmateix, hem comprovat que esdev complicat daconseguir estimular aquestes cl.lules per realitzar processos de biotransformaci, ja que sembla que no sn capaces de generar noves molcules, sin doptimitzar la producci daquelles que ja sintetitzen de manera natural. Poden tamb aplicar-se en estudis bioqumics, tot i que els resultats obtinguts poden divergir respecte la situaci de la planta completa, en qu hi ha una organitzaci, una compartimentaci i una comunicaci entre teixits que modifiquen el comportament metablic de lorganisme. Aix, per exemple, en estudiar els factors enzimtics que regeixen la composici fenlica sobserva que els nivells dexpressi del gen de la fenilalanina amonio liasa, descrit com a clau en la sntesi de compostos fenlics, sn
304
CONCLUSIONS
relativament baixos en el cas dels cultius, ja que la resposta cel.lular pot ser magnificada amb poca senyal; s a dir, en aquestes condicions in vitro, un petit increment dexpressi ja pot ser suficient per produir lefecte buscat.
A continuaci sexposen les conclusions considerades ms relevants de la present tesi:
1. La composici fenlica s diferent segons la varietat, l'anyada, i el grau de maduraci del ra m. 2. Quant a la composici antocinica, en data de verema l'anlisi de components principals classifica clarament totes les varietats. El grau d'acilaci i la identitat de l'agent acilant sn les variables que ms discriminen les varietats. 3. La composici antocinica evoluciona al llarg de la maduraci: globalment hi ha un increment de l'acilaci i dels nivells de malvidina-3-glucsid. Aquest segon fet confirma els models que ubiquen la malvidina com el darrer producte antocinic format en la via. 4. L'anyada t un fort efecte en les concentracions finals dels antocians per gram de baia, encara que resulta difcil assignar un patr concret a aquest efecte. Sembla que el comportament varietal s diferent; aix, mentre en ull de llebre la sntesi d'antocians s'estimula en un any plujs, en cabernet succeeix el contrari. 5. En la nostra zona d'estudi, el reg t poc efecte tant en les concentracions finals com en la composici antocinica de les baies. Sembla, per, que la situaci de no reg condueix a unes concentracions majors. 6. Els continguts i concentracions dels flavan-3-ols i tanins dels pinyols tamb es diferencien entre varietats. 7. L evoluci d'aquests compostos al llarg de la maduraci comporta una disminuci dels monmers (catequina, epicatequina, epicatequina-3-gal.lat), una estabilitzaci dels dmers i trmers, i un increment del grau de polimeritzaci. 8. L'extracci d'antocians al llarg del procs maceratiu depn de l'estructura qumica de l'antoci i de la seva concentraci, cosa que significa que sestableixen diferents extractabilitats per varietat segons la seva composici antocinica caracterstica. Les varietats
305
CONCLUSIONS
amb majors concentracions d'antocians sn les que permeten una major velocitat d'extracci macerativa. 9. Els antocians p-cumarilats sn els que s'extreuen en menor nivell i velocitat, de manera que les seves recuperacions al final de la maceraci sn menors que les dels antocians-3monoglucsids a llats. 10. En solucions model en qu es combinen antocians, acetaldehid i catequines, hi ha una evoluci del color cap a tonalitats violcies, que impliquen la desaparici dels antocians per formar nous productes. En vins amb addici d'acetaldehid, malgrat que tamb hi ha desaparici d'antocians, el color no evoluciona a tonalitats violcies, cosa que indica que noms els vins fortament tnics poden donar aquesta evoluci del color. En cas contrari, l'evoluci del color es dirigeix a tonalitats vermell-teula, en qu tamb participen noves formes antociniques. 11. Diversos cids poden alterar l'espectre cromtic en vins joves; principalment els cids fenlics (i en especial l'cid ferlic) i tamb l'cid lctic. 12. En cultius cel.lulars, es posa de manifest l'increment de sntesi d'antocians en els casos d'estrs hdric i d'estrs nitrogenat. Aquest darrer s el que provoca majors concentracions d'antocians per pes fresc. Altres variables, com el pH, o la mida d'incul, tamb afecten, per en menor mesura. 13. En cultius cel.lulars, la composici antocinica varia tamb en les condicions amb estrs, de manera que es sintetitzen ms antocians acilats. 14. Igualment, les fitohormones poden tenir algun paper en la via biosinttica, ja que l'cid abscssic promou la sntesi de malvidina, antoci minoritari en les suspensions cel.lulars de Gamay Fraux. 15. No s'han pogut establir reaccions de biotransformaci entre els antocians i els agents acilants. Aix suggereix que els mecanismes en Vitis i en cultius en qu s s'han pogut establir aquests productes, com la pastanaga, poden ser diferents. 16. S'han dissenyat uns primers que permeten amplificar selectivament les regions del gen de la fenilalanina amonio liasa i de la tubulina en Vitis, cosa que es comprova mitjanant la reacci de RT-PCR. No obstant aix, utilitzant aquesta metodologia amb l's de termocicladors a temps real per determinar l'expressi gnica en cultius cel.lulars, es posa de manifest una baixa expressi de la PAL en totes les condicions.
306

Composición Fenólica en Variedades Tintas de V.vinífera.

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Composición Fenólica en Variedades Tintas de V.vinífera.

Uploaded by

Copyright:

Universitat Rovira i Virgili

C O M P O S I C I FEN L I C A EN V A R I E T A TS N EG R E S DE V I T I S V I N IFER A . I N FLU N C I A D E D IFEREN T S FA C T O R S

Josep Valls Fonayet

UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI DEPARTAMENT DE BIOQUMICA I BIOTECNOLOGIA FACULTAT D ENOLOGIA

COMPOSICI FENLICA EN VARIETATS NEGRES DE VITIS VINIFERA. ESTUDI DE LA INFLUNCIA

Als meus pares, i a la memria de la meva via

La sotasignant, Montse Biologia Vegetal, adscrita al Universitat Rovira i Virgili, FA CONSTAR

Dra. Montse Nadal Roquet-Jalmar Tarragona, 20 de gener de 2004

BLOC I : COMPOSICI FENLICA EN RAM Introducci general

Captol 1: Composici antocinica en les pells

1.2. Objectius 1.3. Metodologia 1.4. Resultats i discussi

1.5. Conclusions 1.6. Referncies bibliogrfiques

Captol 2: Catequines i proantocianidines en pinyols

2.2. Objectius 2.3. Materials i mtodes

2.4. Resultats i discussi

2.5. Conclusions 2.6. Referncies bibliogrfiques

3.2. Objectius 3.3. Materials i mtodes 3.4. Resultats i discussi

159 160 160

3.5. Conclusions 3.6. Referncies bibliogrfiques

Captol 4: Efecte de la composici fenlica i la seva evoluci sobre el color del vi

4.2. Objectius 4.3. Materials i mtodes 4.4. Resultats i discussi

188 189 192

4.5. Conclusions 4.6. Referncies bibliogrfiques

BLOC III: SNTESI DANTOCIANS EN CULTIUS IN VITRO

Captol 5: Influncia de diferents factors en la sntesi dantocians en cultius in vitro 221

223 226 226 227

252 255 258

5.5. Conclusions 5.6. Referncies bibliogrfiques

Captol 6. Activitat de la fenilalanina amonio liasa in vitro

6.2. Objectius 6.3. Materials i mtodes

6.4. Resultats i discussi

6.5. Conclusions 6.6. Referncies bibliogrfiques

FAO Statistical Data, 1990-2002

1. Els compostos fenlics

cids benzoics, cids cinnmics - Estilbens

- Flavonols - Antocians - Flavanols - Flavanones

Taula 1. Compostos fenlics en Vitis

Composici fenlica en ram

Figura 2. Estructura qumica dels principals cids fenlics del ram

OH OH Figura 4. Estructura del fluoroglucinol

Composici fenlica en ram

Figura 5. Estructura general i principals flavonols

O-Ramnosil OH O Figura 6. Estructura qumica dels flavanonols

Localitzaci dels compostos fenlics

Composici fenlica en ram

2. Bioqumica de maduraci del ram

Divisi cel.lular del pericarp

Dies a partir de la floraci FORMACI DE LA BAIA

Composici fenlica en ram

Composici fenlica en ram

Composici fenlica en ram

Composici fenlica en ram

Composici fenlica en ram

Composici fenlica en ram

Composici fenlica en ram

Winkler, A. (1984). Viticultura. Ed. Continental, Mxico.

Composici fenlica en ram

Urbano Terrn, P. (2002). Fitotecnia. Ingeniera de la Produccin Vegetal. Ediciones Mundi-Prensa

Hidalgo, L. (1993). Tratado de viticultura general, Ediciones Mundi-Prensa.

Moscatell gra petit

6. Carinyena 5. Garnatxa negra

1. Assaig reg Cabernet sauvignon

Cabernet sauvignon 3. Pinot noir

Composici fenlica en ram

B1-NR B1-35 B1-R B1-60

B2-R B2-NR B2-60 B2-35