Fungal Geliimde Apoptoz

Konak-Patojen ve Antagonistik Etkileimlerde Apoptoz

Bir fungal patojenin bir konaa saldrs araclyla indklenen srelerde programl hcre lmnn ve zellikle apoptozun nemli bir rol oynamaktadr. Konaknn yantlarndan bir tanesi de oksidatif stres diye adlandrlan reaktif oksijen trlerinin (ROS) yksek seviyelerde retimidir. Oksidatif stres patojende ve/veya konakta apoptozu indkleyebilir.

 Hayvan patojenleri enfeksiyon oluturmak iin farkl bileikler ile genellikle konak hcrenin lm yolaklarn hedefler veya basklar. Programl hcre lmnn tetiklenmesi baarl bir enfeksiyon geliiminin kritik bir basamadr. Patojen ile konak etkileiminde apoptozun rolnn anlalmas iin Aspergillus fumigatus patojeni bir rnek olarak verilebilir. Fungal ataa erken evrelerdeki yant spor germinasyonuna kar ynledirilen bir oksidatif stresin indklenmesidir. Bu yol ile apoptotik yolak tetiklenebilicei deneyler ile ortaya konmutur.

 0.1 mM hidrojen peroksit uygulanm A. fumigatus kltrlerinde; fosfatidilserinin (PS) salnm ve DNA fragmentasyonunu ieren klasik apoptoz iaretleri gsterir. Oksidatif stres srasnda Arabidopsis thalianada karlatrmal ROS seviyeleri llmtr ve hidrojen peroksitin 0.025 mM gibi yksek seviyelerde olduu bulunmutur. Aspergillus fumigatus da hidrojen peroksit ile tetiklenen apoptoz, sikloheksimid protein sentez inhibitrlerinin eklenmesiyle tamamen durdurulabilir.

 A. fumigatus tarafndan retilen bir nonribozomal peptid olan gliotoksin apoptotik zellikler sergilemektedir. gliZ (gliotoksin retiminin bir transkripsiyon reglatr) delesyonlu A. fumigatusun spernatnn polimorfonklear lkosit kltrlerinin apoptotik hcre tetiklenmesini, yabani tiplerin spernatantlarnn etkilerine gre nemli derecede dk olduu bulunmutur.

 Hayvan konaklar zerinde baarl bir enfeksiyon kurulmas, immn hcreler tarafndan salnan reaktif oksijen trleri ile salanan lmden kamak byk lde patojenin yeteneine baldr. Dahas kurduu enfeksiyonu srdrmek iin bu patojen, ntrofiller gibi zellikle patojeni ldrebilecek hcrelerde de apoptozu tetikleyebilme yeteneiyle kazan elde edebilir. Yani enfeksiyon oluumu aka apoptoz direnci ve apoptozu tetikleyebilme yetenei arasndaki dengeye dayanr.

 Bitki-patojen etkileimlerinde apoptozun rol farkldr. Bir patojen tarafndan saldrlan bitkide prensipte iki farkl durum gzlenebilir. Birinci durumda patojen saldrs srasnda ortaya kan maddeleri tanyabilen bitkilerde hipersensitive yant olarak adlandrlan savunma reaksiyonu tetiklenir Bu reaksiyon ile bitkinin enfekte olmu blmlerinde programl hcre lm balatlr. Bu cevap hastalk direnci olarak sonulanr.

 Sistem bir oksidatif stres yaratr ve bu durum sadece hcre lmn tetiklemek iin gerekli deildir ayn zamanda patojene saldr iin sinyal olarak da grevi vardr. Hastalk direncini bu ekilde ifade edemeyen bitkilerde ise aksine patojen bir enfeksiyon kurar ve byle duyarl bir etkileim ayn zamanda konak hcre lmne de baldr. zellikle bitkiler ve mantarlar aras etkileimlerde konakta programl hcre lmnn tetiklenmesi ak ekilde patojen bymesini desteklemektedir.

 Reaktif oksijen trleri sadece bitkiler tarafndan salnabilen ve patojene kar ynlendirilen maddeler deildir. Buna bir rnek Fusarium oxysporum patojeni ile enfeksiyon sonras domates tarafndan retilen bir glikosid olan -tomatindir. Bu madde mantarlarda etkili ekilde hcre lmn tetikler. Bu srece DNA fragmentasyonu, mitokondriyal membranlar aras depolarizasyon ve ROS birikimi elik eder. FoF1-ATPaz inhibitr olan oligomisin, protein sentez inhibitr olan sikloheksimid ya da kaspaz inhibitr olan D-VAD-fmk uygulamalar apoptozu engeller.

 Hcre lmnn bu eidi bu yzden sadece de novo protein sentezine bal deildir ayn zamanda mitokondriyal baml sinyalleme ve enerji metabolizmasn da ierir. Bu verilere dayanarak bu tip bir etkileimde apoptoza gitmeye kar fungal dirente bir art olmas patojenin kona enfekte etme yeteneini de arttrr. Aslnda bu durum bitki patojeni Colletotrichum gloeosporioidesde antiapoptotik BCL-2 proteinini kodlayan genin bulunmas ile kantlanmtr.

 Konak-patojen etkileimlerindeki rol dnda PCD antagonistik etkileimleri (rnein ayn substrat zerinde byyen dier trler ile olan besinsel yar) de tetiklemektedir. Byle bir yarta apoptotik sreleri tetikleyen maddelerin salnm byk bir seici avantaj salar. Penicillium chrysogenum tarafndan retilen antifungal protein olan PAF bu maddelere bir rnektir. PAF, A. nidulansda etkili ekilde apoptozisi tetikler ve bu srece plazma membrannn hiperpolarizasyonu, PS salnm ve DNA zincir krklarnn birikimi elik eder.

 Bu antifungal peptid rnlerden olan ne PAF ne de AFP memeli hcreleri zerinde zararl etkiler gstermez. Bu yzden bu antifungal proteinler insan patojenik mantarlarna kar gelitirilen terapiler iin umut veren adaylardr. Dahas dier antifungal bileiklerin iinde PAF, tarmsal rnlerin hasat sonras nemli patojenleri olan zygomycetes snfnn pek ok yesinin de bymesini inhibe edebilecek zelliktedir.

 yi analiz edilmi dier bir apoptoz tetikleyici ajan ise farnesoldr ve bu molekl Candida albicans tarafndan retilir. Farnesol yksek hcre younluunda birikir, bylece mayadan hifal bymeye gei nlenir. Yaplan son almada antagonistik etkileimlerde de farnesoln seici bir avantaj salad aa karlmtr . C. albicans ve A. nidulansn birlikte kltrnde farnesol baml byme bozukluklar ve nklear younlama, DNA zincir krklarnn birikimi, PS salnm ve reaktif oksijen trleri retiminde art gibi apoptozun karakteristik zellikleri gsterilmitir.

 A. nidulansda farnesol tarafndan tetiklenen apoptoz poli(ADPriboz)polimeraz (PARP) uyarr. Apoptozun farnesol baml tetiklenmesi sadece A. nidulans ile snrl deildir ayn durum fitopatojen Fusarium graminearumda da gzlenmektedir. Byyen hiflere 100-300 M farnesol uygulamas hcrelerde nklear younlamaya, DNA zincir krklarna ve yksek ROS seviyelerine yol amaktadr.

 2005 ylnda yaplan bir alma, S. cerevisiae toksinleri K1 ve K28 ile Zygosaccharomyces bailiinin toksini zigosinin orta dozlarnn duyarl S. cerevisiae rklarnda ROS retimini ve mayada bilinen tek metakaspaz olan YCA1 aracl apoptozu tetikledii gstermitir. Ayn etkiler P. acaciae toksini pPac1-2 iin de geerlidir. S. cerevisiaenin bu toksin ile muamelesi DNA zincir krklar, PS salnm ve ROS oluumu eliinde hcre lm ile sonulanr.

 fungal reme srasnda sadece birka alma bu intihar programnn rolne iaret eder. Mayada seksel remenin ilk basama, kar eleme tipine sahip partnerin yzeyindeki reseptr tarafndan alglanan eleme tipini tayan partnerce salglanan feromonun tannmasdr. Kar eleme tipine sahip iki hcrenin birlemesini ieren sonraki admdaki bozulmalar mitokondri baml apoptotik hcre lmn tetikler. Bu srece ROS retimi ve DNA krlmas elik eder.

Fungal reme Srasnda Apoptoz

 Seksel reme ve apoptoz olaylarnn mekanizmal balants kromatinin yeniden modellenmesi ile byk lde balantl gzkmektedir. Apoptoz srasndaki nklear DNA fragmentasyonu STE20 kinaz tarafndan katalizlenen histon H2Bnin 10. serin aminoasitinin fosforilasyonu ile kesin olarak balantldr. lgin ekilde ayn histon modifikasyonu, diploid hcrelerin oluumundan seksel remenin sonraki basama olan mayoz srasnda da gzlenmektedir. H2B mutantlarnda Ser10un srekli fosforilasyonunu meydana gelir ve bymede iddetli azalma gsterir. hidrojen peroksit uygulanm yaayan yabani tip hcrelerde benzer hcresel morfoloji sergilemektedir.

 Apoptoz srasnda kromatin youn bir hale gelir. Bu younlama hcre lmne sebep olur. Sitolojik analizler mayoz srasndaki kromatin younlamasnn duraan bir olay olmadn gstermitir. zellikle mayozun profaz 1 evresinde kromatin ksalmi ve genilemi zeminler arasnda kresel ekilde dner. Bylelikle bu tip dngnn apoptozu inhibe ettii grlmektedir. Fakat feromon ile indklenen hcre lmnde apoptozun roln aratran daha fazla sayda yeni almaya gereksinim vardr.

 Bir aratrma da maya hcreleri feromon konsantrasyonunun etkisi aratrlmtr. Sonulara gre yksek feromon konsantrasyonlar hzl hcre lmn tetiklemektedir. Bu olay kalsiyuma bamsz hcre lmn tevik edecek FIG1 transmembran proteininin varln gerektirmektedir. Daha dk konsantrasyonlardaki feromon miktarlar ise hcre duvarnn ykmna dayal olan hcre lmn tetiklemektedir. Ayrca, ilgin bir ekilde lme maruz kalan hcrelerde apoptoz iaretlerinin birka gzlenmemektedir.

 Aseksel remede apoptotik srelerin roln ne srmektedir. A. nidulansn konidiospor reten kltrlerinin fungal ekstraktlarnn kullanmyla in vitro PARP ykm kantlanmtr. Bu kltrlerde PARP miktar artmtr. Bu gen ifadesinin kontrol konidiospor geliimi iin esastr. nk Parp geninin ar ekspirasyonu konidiospor geliiminde bozukluklara yol amaktadr. Sonu olarak ilgili mutantlarn spor saylarnda 104 kat bir azalma bulunmutur. Fakat u an iin PARP proteininin bu etkisinin apoptotik sreler sebebiyle mi yoksa bu enzimin dolayl bir rol sonucu olarak m gerekletii ak deildir.

 remedeki rolnn yannda apoptoz ve otofaji ayn trlerin farkl izolatlar arasnda fungal non-self-tannmada da nemli rol oynar. Genetik olarak uyumayan iki hifin fzyonundan sonra heterokaryon uyumazl olarak adlandrlan bir hcre lm reaksiyonu tetiklenir. Neurospora crassada bu reaksiyon apoptozun karakteristik zelliklerini sergiler.

Fungal mrn Kontrolnde Apoptozun Rol

Apoptozun nlenmesi yaam sresini uzatan etkiye sahiptir. Bu balant iin bir rnek, insan Bcl-2 geninin eksprese olduu duraan fazda maya hcrelerinin canll artar. Dier bir rnek ise zaman bal olarak yalanm maya kltrlerinde DNA fragmentasyonu, PS salnm ve kromatin younlamas gibi apoptozun karakteristik iaretlerini sergilediidir. Bu iaretler devaml byyen kltrlerde gzlenemez. Oksidatif strese kar tolerans dzenleyici bir anahtar olan Yap1 geninin overekspresyonunun gzlenmesiyle daha fazla basklanan zamana bal yalanmadaki apoptoz bozukluklar, duraan kltrlerde transgenik rklarn hayatta kalmalarnda arta sebep olmaktadr.

 Podospora anserina gibi baka fungal yalanma modellerinde de yalanmada apoptozun etkisi zerine veriler rapor edilmitir. Bu srecin kltrlerin aktif bymesi srasnda gerekletii ve genetik materyalin replikasyonuna bal olduu iin replikatif yalanmann bir tipini de temsil eder. P. anserinada yalanma, kat medyum zerinde kltr bymesinin analizi ile makroskopik olarak kolayca izlenebilir. Genetik zemine ve kltr koullarna bal olarak yabani tip kltrlerin mr 2 ya da 4 haftadr. Bu mantarlarda yaam sresinin kontrolnde eitli molekler yolaklar grevlidir.

 Dierleri arasnda ise solunum tipi, mitokondriyal DNA stabilitesi, besinsel snrlama, bakr metabolizmas, mitokondrial protein alm ve mitokondriyal dinamikler vardr. P. anserinada apoptotik mekanizmalar aydnlatan son aratrmalar bu mekanizmalarn yaam sresinin kontrolnde de var olduunu gstermitir. ki metakaspaz kodlayan PaMca1 ve PaMca2 genlerindeki delesyon yaam sresinde artla sonulanr. Bu durum bu mantarlarda apoptozun senesensin son evresinde tetiklendiini dorular.

 PaMca1 bir delesyonunun en belirgin etkisi yaam sresinde iki buuk kat arta neden olmasdr. PaMca1 delesyonlu dikkat ekici biimde rklarn 15 gnlk kltr protoplastlarnn hidrojen peroksit uygulanmasndan sonra yabani tip rk protoplastlarna gre daha yksek derecede canllk sergiler. Ajanlarla tetiklenen apoptoziste metekaspazlarn apoptotik hcre lm ve fungal senesenste grev ald PaMca1 delesyonu ile tespit edilmitir.

 . P. anserinann iki metakaspazndan biri, zellikle PaMCA1, senesens srasnda apoptotik hcre lmne yol amak amacyla aktive olur. Yalanan miselyumda yksek seviyelerde hidrojen peroksit retilebilir. Reaktif oksijen trlerinin bu eidi P. anserinada PS salnmn tetikler. PaMCA1in reaktif oksijen trleriyle (ROS) aktive olduu gzkmektedir. PaMca1 delesyonlu rklar azalm ROS seviyeleri ile deil daha ziyade ROSlara yantn azalmas ve apoptoz tetiklenmesindeki azalma ile karakterize edilir Bu hipotez sadece deleyonlu rklarn yaam srelerinin uzamasyla deil ayn zamanda yalanm miselyumdaki bir metakaspaz baml peptidaz aktivitesinin gsterilmesiyle de desteklenir.

 Yalanmada ve yaam sresinin kontrolnde apoptozun etkisinin daha iyi anlalmas iin zmlenmesi gereken nemli konulardan biri de apoptoz tetiklenmesinde yer alan hcre ii sinyal yolaklarnn aydnlatlmasdr. Mayalarda aktin sito-iskelet hareketleri nemli bir rol oynar. Yalanm hcrelerde, aktinde deneysel olarak indklenebilen spesifik mutasyonlarn oluturulmasyla ya da aktini stabilize eden ilalarn kullanmyla aktin yapm/ykmnda bir d gzlenmitir. Aktin donatan proteini (SCP1) kodlayan Scp1 geninin delesyonu araclyla oluan aktin yapm/ykmnda bir art, blnen ve blnmeyen maya hcrelerinin yaam srelerinde uzamaya neden olur.

 Aktin hareketlerinin rol nemli reglatr bir yolak olan Ras-cAMP sinyalleme sistemiyle balantldr. Srekli Ras-cAMP aktivasyonu mitondriyel bozukluklarn ve oksidatif stresin yok edilmesini bozar ve yaam sresini azaltr. Ras-cAMP sinyalleme ve aktin arasndaki bir balant iki aktin reglatr proteini olan SLA1 ve END3ten yoksun maya mutantlarnn fenotipi ile salanmtr.

 Bu rklarn zellikleri Ras-cAMP sinyallemenin srekli olduu rklardaki zelliklere benzer. lgili mutantlar artm ROS retimi, mitokondriyal disfonksiyon ve azalm yaam ile karakterize edilir. lgin ekilde bu rklarn ROS seviyeleri ve yaam mrleri, Ras-cAMP yolann negatif reglatr olan Pde1 geninin overekspresyonu ile yabani tip zelliklerine dndrlebilir.

 Son zamanlarda oksidatif stres ve aktin sito-iskelet arasndaki bir balant OYE2 ve OYE3 maya yal sar enzimlerinin analizi ile elde edilmitir. OYE2 aktin ile etkileiminde kantlanmtr. Oye2 geninin neredeyse tam knockdown (gen ekspresyonunu basklama) edilmesi sitoiskelet sisteminde bozulmalarla sonulanmtr. stelik Oye2nin ve glutatyon oksidoredktaz GLR1 kodlayan genin e zamanl delesyonu gl ekilde morfolojik bozukluklar arttrmtr. Bu durum OYE2 proteininin oksidatif hasardan aktinleri koruduunu dndrr. Bu bulgulara dayanarak OYE proteinlerinin ROS retimi, aktin sito-iskeleti ve hcre lm ile balantl sinyal alarnn bir yesi olduu dnlebilir.

 Salkl hcresel durumlara katk salayc nemli dier bir ey ise apoptoz ile balants olan mitokondri dinamikleridir. Bu sonu, S. cerevisiae ve P. anserinada manipule edilen blnme mekanizmalar ve mitokondriyal fzyonu ieren aratrmalardan karlmtr. Mitokondriyal blnme faktrlerini (mayada DNM1 ve FIS1; P. anseinada DNM1) kodlayan genlerdeki delasyonlar yalanmay geciktirir ve organizmalarn yaam dngleri iindeki salkl periyodlar arttrr. Yabani tip rklarn yalanma sresince mitokondriler as yaplarn noktasal ekillere deitirirler. Fakat bu deiiklik sadece bu mantarlarn yaamlarnn ok ge bir periyodunda olur.

 Apoptotik yolaklar dier molekler ve hcresel yolaklar ile balantldr. Fakat bu balant iin u an ulalabilen bilgiler olduka paral ve kesinlikten daha ok resmedicidir. Dier balantlar arasnda zellikle sitoiskelet rolnn, mitokondriyal dinamiklerin, ROS retimini ve/veya yok edilmesini salayan yolaklarn apoptotik srele balantsn aydnlatmak ok nemli olacaktr.

 Teekkrler