BO 775

Proteomik ve Genomik

Konu: DNA METLASYONU

Hazrlayan: Sevda Ik (A0353812)

GR Prokaryot ve karyotlarda Sitozin rezidlerinin 5-C pozisyonundan enzimatik metilasyonu, DNA nn en yaygn modifikasyonudur. DNA metilasyonu memeli hcrelerindeki gen ifadesinin kontrolnde nemli rol oynayabilen epigenetik bir modifikasyondur. Bu sre DNA metiltransferaz enzimini ierir. Bu enzim S-adenosil-metionin den bir metil gubunun Sitozin rezidlerine transferini katalizler. Bylelikle Sitozin, 5-metilsitozin haline gelir ve bu modifiye baz en ok genomdaki CpG alanlarnda bulunur. Bu alanlar genomda yksek bir sklkta bulunursa CpG adacklar olarak adlandrlr. Genlerin promotor blgelerinde bulunan metillenmi CpG adacklarnn varl bu genlerin ifadelerini basklayabilir. Bu yntem 5-metilsitozinin varlnn transkripsiyon faktrlerin ya da dier DNA ya balanabilen proteinlerin balanmasn engelleyerek transkripsiyonu nlemesi yznden olabilir. DNA METLASYONU DNA metilasyonu; gen ifadesini deitirerek hcre fonksiyonlarn deitiren ve bir metil grubunun kovalent ekilde DNA metiltransferaz (DNMT) katalizinde, bir CpG dinkleotidindeki Sitozinin 5-karbonundan yapya eklenmesini ifade eden epigenetik bir olaydr. DNA Metilasyonu Nedir? Metilasyon; proteinlerin, DNA ve RNA nn seilmi blgelerine enzim vastal kimyasal modifikasyonla metil (CH3) grubunun eklenmesidir. DNA metilasyonu, insanlarda ve pek ok memelide bilinen tek doal DNA modifikasyonudur ve yalnzca Guanozin (G) tarafndan takip edilen Sitozin (C) bazn etkiler. Bylelikle, bu organizmalarda, DNA metilasyonu yalnzca CpG alanlarnda gzlenir. nsan DNA sndaki tm CpG alanlarnn % 70-80 i metillenmitir. Buna karn, bu metilasyonun ncelikli olarak grld alanlar; CpG younluunun az olduu blgeler ya da Alu elementleri gibi tekrarlayan DNA blgeleridir. Pek ok CpG adacklar (CpG younluunun fazla olduu yerler) neredeyse hi metillenmemitir.

ekil A

ekil A: Retinoblastoma gen blgesindeki CpG adacklar. Noktal izgi CpG alanlarnn istatiksel olarak beklenen skl (1/16) temsil etmekteyken, grafik ise Rb geninin ekzon ve intronlarn da ieren 180 kb lk DNA sekansndaki CpG alanlarnn sklnn istatistiksel lsn temsil etmektedir. ki CpG adacnn yeri oklarla gsterilmektedir. Yalnzca 5 ucuna en yakn CpG adac genin promotoruna rastlamaktadr.

DNA Metilasyonunun Grevi: DNA metilasyonunun grevi hala tam olarak anlalamamtr. DNA metilasyonun; gen ifadesinin kontrol, kromozomal btnln kontrol ve rekombinasyonel olaylarn kontrol rollerine sahip olduu yllardr dnlmektedir. En yeni olarak, DNA metilasyonunun; retroviral elementler, Alu lar, vs. gibi genomdaki parazitik sekanslara kar ilkin savunma mekanizmas grevini tad dnlmektedir. DNA metilasyon paternleri embriyogenezisin erken evrelerinde sfrlanr ve geliimin erken dnemleri boyunca yeniden kurulur. Bundan sonra, nispeten sabit kald dnlmektedir. Metilasyon makineleri; pek ok metiltransferaz enzimi, de-metilazlar, muhtemelen nadir grlen ncl DNA yapsyla alakal olan ve DNA metilasyonuna neden olan metilasyon merkezleri, CpG adacklarna balanarak onlar metilasyondan koruyan trans-activating proteinlerini ieren metilasyon-koruma blgelerini ierir. Klasik modele gre, ilkin olarak geliim boyunca metilasyon varl tespit edilir, DNA metilasyon paternleri sabitlenir ve daha sonra DNA metiltransferaz enziminin bakm aktivitesi srekli devam eder. DNA metiltransferaz yeni sentezlenmi ve yarmetillenmi DNA y tanr ve hzl bir ekilde onu tamamen metilenmi forma evirir. Farelerde, ilk tanmlanan DNA metiltransferaz enziminin homozigot delesyonu embriyonik adan letaldir. Buna karn ES hcreleri bu enzim olmadan da yaayabilirler. Bu gstermektedir ki, ya enzimin kendisi ya da DNA metilasyonu geliimde ok gerekli bir sretir.
3

ekil B

DNA metilasyonu bir metil grubunun DNA nn bazlarndan birine transferi anlamna gelir. Bu reaksiyon DNA metiltransferaz tarafndan katalizlenir. S-Adenozil Metionin (SAM) bir metil donor olarak kullanr. nsanlarda, normal DNA metilasyonu Sitozin bazyla snrlandrlmtr.

DNA metilasyonunun karyotlardaki gen reglasyonundaki grevi neredeyse son 20 yldr aratrlmaktadr. Gen reglasyonunun bu mekanizmas tm karyotlarda bulunmamaktadr; rnein, Saccharomyces cerevisiae llebilir 5-metil-sitozin tespit edilememitir. DNA metilasyonunun embriyonik geliimle alakas vardr (Kafri et al., 1992), genlerin farkl snflarnn srasyla aktivasyonunu ve deaktivasyonunu ieren bir yntemdir. Bu da DNA metilasyonunun en nemli grevi olan gen reglasyonudur. Memelilerde DNA metilasyonunun grevini anlamak iin fare gibi bir model sistem kullanldnda grlmtr ki, primordial germ hcreleri, embriyonik kk hcreler ve blastosit hcreleri llebilir DNA metilasyonu olmakszn normal bir ekilde geliirler. Fakat kk hcreler farllamaya balar balamaz DNA metilasyonu kusursuz geliim iin gerekli hale gelir. Paternal ya da maternal kromozomlardaki spesifik genlerden yalnz birinin ifade olmas anlamna gelen genomik imprinting de DNA metilasyonunu iermektedir (Falls et al., 1999). mprinting genleri ayrcalkl olarak ana-babasal kopyalarndan yalnzca biri tarafndan ifade olurlar. Beklide en nemli epigenetik modifikasyon memelilerdeki CpG lerin metilasyonuyla oluan imprintingdir. mprinte edilmi genler ana-babasal alellerin her birine spesifik metilasyon paternleri ile karakterize edilmitir. nsan ve faredeki en iyi karakterize edilmi imprinting genleri; paternal ifade olan inslin-benzeri byme faktr 2 geni (Igf2) ve maternal ifade olan H19 genidir. Sitozin metilasyonu ayn zamanda X-kromozomundaki spesifik genlerin inaktivasyonundan da sorumludur (Riggs and Pfeifer, 1992). DNA metilasyonunun ayn zamanda yalanma srecini de ierdii dnlmektedir (Cooney, 1993). Konak memeli hcrelerinin genomuna birletiren viral DNA nn metilasyon tarafndan inaktivasyona uratlmas, bu yntemin enfeksiyon
5

ajanlarna kar bir koruma mekanizmas olarak grev aldn gstermektedir (Schaefer et al., 1997). CpG Adacklar Nedir? DNA drt bazdan olumutur, Adenin(A), Timidin (T), Sitozin (C) ve Guanin (G). Bu demek oluyor ki 16 olas dinkleotid kombinasyonu bulunmaktadr (AA, AT, AC, AG, TT, TA, TC, TG, CC, CA, CT, CG, GG, GA, GT ve GC). Dinkleotidler bazen NpN olarak gsterilmektelerdir, burada N baz, p ise iki baz arasndaki fosfodiester ban temsil etmektedir (rnein; CpG Sitozin fosfo Guanin anlamna gelir.). Bu demek oluyor ki verilen bir DNA sekansnda herhangi bir dinkleotidin bulunma olasl 1/16 ya da ~ %6 dr. Buna karn insanlarda CpG dinkleotidi sklnn ls ok azdr, bu CG basklanmas olarak bahsedilen bir olaydr. CG basklanmas, Sitozin metilasyonunun kullanld btn genomlarda karakteristiktir ve belkide metilenmi Sitozinlerin ar derecede mutasyona urayabilirlii ile ilikilendirilebilir. GC basklanmas olay, insan genomunun bandan sonuna kadar 3003000 b uzunluundaki kk alanlar haricinde, ok belirgindir. Bu alandaki CpG lerin skl ya beklenilen deerdedir ya da beklenilenden daha fazladr. Bu alanlara CpG adacklar denilmektedir ve genomun %1 kadarnda bulunduu dnlmektedir. CpG adalarnn, CG basklanmas olayndan evrim sresince kaabilmesinin nedeni; tipik ekilde metillenmemeleridir ve bylece yukarda aklanan mutasyon basksndan kamlardr. CpG adalarnn ncelikli olarak, ifade olan genlerin 5 blgesinde bulunduklar gzlenmitir ve insan promotorlarnn % 60 ndan fazlas bu CpG adalarn iermektedir. Buna karn pek ok CpG adalar genlerin promotorlarnda bulunmamaktadr ve bunlarn nemi akla kavuturulamamtr. Bizim ncelikli ilgimiz promotorlardaki CpG adalardr nk metillendikleri zaman gen srekli sessiz hale gelir ve bu sessizlik mitoz blnmeler boyunca aktarlr. Bu sebeple CpG adacklarnn metilasyonu epigenetik (gen ifadesindeki deiikliklerin, DNA sekansyla balant gstermeksizin, hcre blnmesi boyunca bir nesilden dierine geebilmesi) bir anlamn temsil ettii dnlr. CpG Adacklarnn Metilasyonu Nedir? Yukarda anlatld gibi, CpG adacklarnn herhangi bir DNA metilasyonundan normalde yoksun olduu dnlmekte ise de bu blgeler CpG dinkleotidleri asndan ok zengindir. Bu zellikle de promotorla ilikili CpG

adacklar iin nemlidir nk ilgili genin transkripsiyonu iin metilasyonun olmad durum gereklidir. Bu kuraln iki nemli istisnas vardr: 1) inaktive X-kromozomunun zerindeki genler 2) imprint edilmi genler Her iki durumda da, promotoru ieren CpG adacklar pek ok (tamam deil) CpG alanlarndan metillenmitir ve bu metilasyon genin transkripte olmasnn basklanmasyla ilikilidir. Bu sessizlik hcre blnmesi boyunca kaltlanr ve metilasyon inhibitrleri ile muamele haricinde geri dnmsz olduu kabul edilir. Metilasyonun gen sessizlii iin gerekli olduu iki deneyle gsterilmitir. 1) DNA metilasyonunun kaybna neden olan metiltransferaz geninin homozigot delesyonu sonucunda, daha nce sessizletirilmi genlerin yeniden ifade olmas ve 2) DNA metiltransferaz inhibisyonu sonucunda, demetilasyon ve daha nce sessizletirilmi genlerin yeniden ifade olmas. CpG adacklarnn metilasyonuna (imprinte olmu genlerdeki ve Xkromozomundaki) trans-activating faktrlerinin balatc olduu dnlmektedir. Bunlar, blgesel metilasyona neden olurlar, bunu belki de DNA metiltransferazlarn adacklarn yaknna gelmesine izin vererek yaparlar. X-kromozomunda, bu balatcnn Xist geninin bir RNA rn olduu sanlmaktadr. CpG Adacklarnn Metilasyonunun Nedeni Nedir? Yalanma sreci ve kanserde CpG adacklarnn metilasyonunun nedenlerinin byk ksm hala bilinmemektedir. Bu sapkn sreci aklayan iki byk hipotez bulunmaktadr. 1) CpG adack metilasyonu, DNA replikasyonu srasnda oluan hatalarn sonucu olan rastgele bir sretir. Bu hatalar, sapm metilasyonun stn kaplamasyla ve DNA metiltransferaz aktivitesiyle, ek olarak metillenmi byme-basklayc genlerin bulunduu hcrelerin seilimiyle sabitlenir. 2) CpG adack metilasyonu rastgele hatalarla ilgili deildir. Metilasyon makinelerindeki spesifik hatalardan kaynaklanr. Sapm CpG adack metilasyonu ile ilgili olduu bilinen faktrler: - Blgesel DNA yapsndaki deiiklikler - Karsinojenlere maruz kalnmas (nikel, plutonyum gibi) - DNA-metiltransferaz aktivitesindeki art - Mikrosatellit kararszl.

DNA Metiltransferazlar: DNA metilasyonu DNA metiltransferazlar tarafndan gerekletirilen enzimatik bir modifikasyondur. Eklenmi olan metil grubu baz elemesinin kendisini etkilemez fakat metil gruplarnn dar doru knt yapmas DNAprotein etkileimlerini etkileyebilir. karyotlarda DNA metiltransferazlarn iki farkl tipi tanmlanmtr. de nova metiltransferazlar, Dnmt3a ve Dnma3b gibi, bunlar metillenmemi DNA y substrat olarak kullanr. Bakm yapan metiltransferazlar, Dnmt1 gibi, metilasyon alanlarnn replikasyonuyla oluan yar metillenmi DNA y metillerler. Bakm metilasyonu kalp DNA iplikiinin varolan metilasyon paternini yeniye sentezlenmi olana kopyalar. Bu nedenle DNA metilasyonu kaltlanabilir ve epigenetik bir iaret olarak nesiller boyunca mitotik ve mayotik hcre blnmeleriyle transfer edilir.

Gelecek Ynelimleri: DNA metilasyonu tarafndan ortaya konulan epigenetik modifikasyonlar, normal ve normal olmayan gen reglasyon srecinin anlalmasndaki nemi gittike artmaktadr. Metilasyonun neminin fark edilmesi, epigenetik deiiklikler ve transkripsiyonel kontrol arasndaki ilikinin deerlendirilmesinde yeni stratejiler ile sonulanmtr. Evrimi: Omurgasz atasal formun DNA snn tamamnn metillenmemi olduu dnlmektedir. Daha sonra, omurgallarn ortaya k ile DNA metilasyonu tm genom boyunca yaylm fakat youn metilasyondan kaynaklanan nedenlerle genlerin basklanmasndan kanmak iin genlerin promotor blgeleri bu olayn dnda kalmtr. CpG lerin deiken alkonulmalar iin aklama, metilenmi sitozinlerin metillenmemi sitozinlere gre sitozinden timine geiinin daha sk olmas yzndendir. Bu da metilenmi blgelerdeki CpG lerin kayboluunun artmasna neden olabilir iken metillenmemi blgeler modern omurgallarda CpG adacklarnn evrimine izin verebilmitir. Hastalklar:

*Kanserde, transkripsiyon balang blgesindeki normal olmayan metilasyon tmr sprasr genlerin (p16, VHL, Rb gibi) ifadesini basklayabilir. *Son zamanlarda insan hastal, genlerdeki mutasyonlarla ilikilendirilmitir. Bu ya DNA metilasyonunun kendisinden ya da metilasyon araclkl gen dzenlenmesini ierdii dnlmektedir. Rett Sendromu: Rett Sendromlu hastalarda metilasyon baml DNA-binding proteinleri kodlayan gen; MECP2 de mutasyonlar bulunmutur. ICF Sendromu: Kromozom 1, 9 ve 16 nn satellit blgelerinin hipometilasyonuyla karakterize edilmitir. Bu kromozomlarn kararszlna neden olur. Son zamanlarda, de novo DNA metiltransferaz geni DNMT3B deki mutasyonlarn bu sendromla balants olduu bulunmutur. X-baml Alfa Talasemi / Zeka Gerilii Sendromu (ATR-X): ATRX geni alfa talasemi, eitli zeka gerilikleri, fasiyal dimorfizm ve regenital anomalileri ieren bir hastalkla ilikilidir. ATRX deki mutasyonlar, rDNA dizileri ve subtelomerik tekrarlar gibi fazla miktarda tekrarlanan sekanslarn metilasyon paternlerinde deiikliklere neden olur. Bu nedenle ATRX in grevini kaybetmesi gen ifadesinin dzenlenmesinin de kaybn ierebilir. *mprinting hatalaryla alakal en iyi karakterize edilmi sendromlar; kromozom 11p zerindeki Beckwith-Wiedemann sendromu (BWS) ve kromozom 15q zerindeki Prader-Willi/Angelman sendromlardr. BWS hastalarnda tipik olarak; inslin-benzeri byme faktr 2 geninin (IGF2) bialelik ifadesi ve/veya p57KIP2 (normal olarak yalnzca maternal alelden ifade olan ve tmr basklayc olduu dnlen gen) deki mutasyonlar. *mprinting deki hatalar ayrca,kanserin pek ok eidinin geliimiyle ilikilidir. nk imprinte olmu genler grev asndan haploidtir. mprinte olmu bir tmr basklayc geni kanser hassasiyetinin artmasyla ilikili olabilir, nk basklama grevinin kayb iin yanlizca bir alelinin inaktive olmas yeterlidir. Metilasyon nhibitrleri: 5-azacitidin ve 5-aza 2-deoksisitidin gibi metilasyon inhibitrleri ile muamele kanser hcrelerinin byme hzn kaltsal bir biimde azaltabilir. DNA Metilasyonunun Deerlendirebilmesi in Metodlar: Genlerin metilasyon derecelerinin llmesinde ok eitli metodlar kullanlmaktadr: Southern blot analizi, bislfit genomik DNA dizi analizi, restriksiyon enzim-PCR, MSP ve metilasyona duyarl tek nkleotid primer extension (MS-SNuPE). Bu metodlarn bazlarnn karlatrlmas hakknda bir
10

rapor yaynlanmtr (Gonzalgo et al., 1997). Bunun tanmlad metodlardan her biri aada aklanmtr. Southern blot Southern blot, DNA metilasyon analizinde en sk kullanlan metoddur. Bu metodda; genomik DNA, ayn dizilim iin spesifik olan methylation-sensitive ve insensitive endonkleazlarla kesilir (rnein: HpaII ve MspI). Daha sonra restriksiyon fragmentleri agaroz jelde ayrlr, bir membrana trasfer edilir ve hedef DNA dizisi iin spesifik olan bir probla hibridize edilir. Otoradyografi tahmin edilen byklkteki bantlarn varln ortaya karacaktr. Bu tekniin snrlamalar ise: (1) Southern blot analizi iin gereken DNA miktardr (rnek bana 5-10 g). Bu ise zellikle tmr rnekleri kk olduu zaman engelleyicidir. (2) Tamamlanmam enzim kesimi sonular etkileyebilir, deerlendirme zorlar. Restriksiyon Enzim PCR Genomik DNA metilasyon-sensitive ve metilasyon-insensitive restriksiyon enzimleri ile kesilir ve daha sonra paralanm DNA hedef dizinin kanatlar olan primerlerle amplifiye edilir. Metilasyon-sensitive endonkleazlarn kullanm, eer hedef dizi metilenmi CpG alanlar ieriyorsa tahmin edilen bir byklkte DNA amplifikasyonunu olas hale getirir. Metilasyon-insensitive bir endonkleazn kullanm ile, hedef DNA dizisinin metilasyon durumu ne olursa olsun amplifikasyon olas olmayacaktr. Bu tekniin en byk snrlamas, enzim kesiminin tamamlanmak zorunda olmasdr. Dier snrlama ise, eer hedef blgede pek ok CpG alan varsa, bazlar metilenmi bazlar metillenmemi, elde edilen sonular yetersiz olacaktr. Bu teknik yinede hedef bir dizideki DNA metilasyonunun birincil seicisi olarak olduka faydaldr (Kane et al., 1997). Bislfit DNA Dizisi Bislft metodu, 5-metilsitozin ieren DNA dizisi iin, genlerin metilasyon derecelerinin analizi iin yeni tekniklerin gelitirilmesine olanak salamtr (Grigg and Clark, 1994). Bislfit genomik dizi analizi ilk olarak Frommer et al. (1992) tarafndan tanmlanmtr. Bu teknik genomik DNA daki tek 5-metilsitozinlerin (5-MC) bile ortaya karlmas iin mkemmel bir aratr. Metod tek iplikikli DNA daki btn Sitozin leri sodyum bislfitin Urasil e deamine etmesi temeline dayanr. Bu srada 5-MC deimeden kalr (Hayatsu et al., 1970). Daha sonra bu modifiye edilmi DNA, deitirilmi dizi iin spesifik olan bir primer seti kullanlarak PCR ile amplifiye edilir. Bu amplifikasyonda tm Urasil ler (deitirilmi Sitozin ler) Timin olarak amplifiye olurken, yalnizca 5-MC ler Sitozin olarak kalr. Amplifiye olmu fragmentlere ya direkt olarak ya da her bir molekln klonlanmasndan sonra dizi analizi yaplabilir.
11

Klonlama stretejisi alleller aras metilasyon farkllklarnn analizi iin ok kullanldr (Clark et al., 1994, 1995). Bislfit dnmnn tamamlandnn kantlanmas ok nemlidir, nk metilenmi CpG alanlarndaki Sitozinlerin bislfit muamelesine direnli olabilecei rapor edilmitir (Harrison et al., 1998). MSP MSP ilk olarak Herman et al. (1996a) tarafindan tanmlanm bir tekniktir. Bislfit muamelesi sonras metilenmi ve metillenmemi DNA arasndaki bulunan sekans farkllklarn avantaj olarak kullanr. Sitozinler Urasile deamine olur, bu Urasiller PCR srasnda Timine replike olur, PCR dan sonra amplifiye olmu DNA; metillenmemi veya metillenmi sekanslar iin spesifik olan primer ifti ile elde edilir (Herman et al., 1996a). MSP; DNA nn verilmi bir blgesindeki metilasyonun varlnn analizi iin olduka hzl ve nitel bir yntemdir. Primerlerin dikkatli seilmesi ok nemlidir nk hem metilenmi hem de metillenmemi primer iftleri ile yanl pozitif sonu elde etmek olasdr ve bu da sonular deerlendirmeyi olduka zorlatrr. Genomik DNA nn tamamlanmam bislfit modifikasyonu da metilenmi C ler iin yanl pozitif sonu verebilir. Metilasyon-Sensitive Tek Nkleotid Primer Extension Tek nkleotid primer extension analizi ilk olarak Kuppuswamy et al. (1991) tarafndan, normal olmayan allellerdeki mutasyonun tespiti iin tanmlanmtr. Gonzalgo ve Jones (1997) spesifik CpG alanlarndaki metilasyon farkllklarnn miktar iin bu metodu modifiye etmitir. DNA nn bislfit muamelesi ve hedef sekansn deitirilmi DNA iin spesifik primerlerle amplifikasyonundan sonra, bu amplifiye olmu DNA metilasyon-sensitive tek nkleotid primer extension (MS-SNuPE) iin kalp olarak kullanlabilir. Bu tek nkleotid extension reaksiyonu iin kullanlan primerler; metilasyon analizi iin birleme blgesinden yalnzca bir nkleotid ncesinden primerin sonlanaca ekilde dizayn edilir. Saflatrlm amplifiye olmu DNA ya dCTP ya da dTTP ve DNA polimeraz ile inkbe edilir. Eer hedef blge metilenmi ise; bir Sitozin nkleotid extension u srasnda birleecektir, eer blge metillenmemi ise; onun yerine Timin birleecektir. lgili Sitozin ve Timin birlemelerinin miktar hedef blgenin metilasyon durumunun belirlenmesine izin verecektir. Yukarda akland gibi primer dizayn ve DNA nn modifikasyonunun tamamlanmas bu analiz ile iyi sonular elde edilmesi amacyla nemlidir. DNA Metilasyonunun Deerlendirilmesi iin Dier Analizler Yukardaki analizler DNA metilasyon analizi iin en geni lde kullanlanlardr. COBRA analizi (Xiong and Laird, 1997) ve genomik DNA nn bislfit modifikasyonu tarafndan restriksiyon enzimleri iin yeni spesifik blgelerin yaratlmasn (Sadri and Hornsby, 1996) da ieren dier ilgin analizler hala gelitirilmektedir. Metilenmi sekanslarn ortaya karlmas iin
12

ve farkl ekillerde metilenmi genlerin klonlanmas iin (Gonzalgo et al., 1997; Huang et al., 1997; Akama et al., 1998; Ushijima et al., 1997; Toyota et al., 1999) pek ok yeni metod gelitirilmektedir.

13