IDENTIFIKASI SPESIES MIKROORGANI

SME SAMPEL

I.

Tujuan Mahasiswa dapat menggunakan teknik pewarnaan, pengkulturan, dan uji biokimia yang telah didapat sebelumnya untuk menentukan spesies kultur bakteri yang belum diketahui

II.

Dasar teori Dalam biologi, sistem tata nama binomial merupakan sistem formal penamaan organisme yang dikenalkan oleh Carl Linnaeus, maka sejak saat itu nama ilmiah suatu makhluk hidup terdiri atas dua nama atau kata yaitu kata pertama menunjukan genus (penulisannya diawali dengan huruf kapital) dan kata kedua menunjukan nama spesiesnya, misal Staphylococcus epidermidis, nama Staphylococcus merupakan nama genus, sedangkan epidermidis merupakan nama spesies. Spesies berasal dari bahasa Latin species yang merupakan tingkatan dalam
1

taksonomi yang terkecil (tingkatan terendah dalam tingkat taksonomi), biasanya digunakan untuk mengklasifikasi organisme baik yang hidup maupun organisme yang fosil. (sumber dari: anonim. Binomial Nomenclatrure. http://www.absolute astronomy.com /topics/Binomial_nomenclature). Metode identifikasi dapat digunakan juga sampai mengetahui spesies dari suatu bakteri. Penggunakan kunci dikotomi akan sangat membantu praktikan sehingga tidak perlu melakukan semua uji untuk dapat mengetahui spesies dari sampel bakteri yang tidak diketahui. Dikotomi adalah pembagian organisme sesuai karakteristik yang muncul pada suatu kelompok dan karakteristik tersebut tidak ditemukan pada kelompok yang lain. Dikotomi sebagai bagian proses identifikasi spesies (kunci dikotomi) merupakan sekelompok pertanyaan berkesinambungan (series of question) dimana tiap lajur panah merupakan set dari karakteristik organisme yang ujungnya atau akhir menunjukkan pada spesies tertentu. (sumber dari: anonim. Dichotomy. http://www.absoluteastronomy.com/topics/Dichotomy) Identifikasi spesies mikroorganisme tidak seperti identifikasi genus, dimana praktikan diharuskan mengkultur mikroorganisme pada semua media uji. Pada identifikasi spesies, langkah awal yang dilakukan adalah dengan pewarnaan gram dan dilanjutkan dengan uji biokimia.

PEWARNAAN GRAM Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Pewarnaan gram bakteri berfungsi untuk mengetahui jenis gram (positif yang ditandai dengan warna biru-ungu atau negatif yang ditandai dengan warna merah) dan bentuk dari sel bakteri.

Gb 1. Perbedaan dinding sel bakteri Gram Positif dengan Gram Negatif

Metode pewarnaan gram membutuhkan 4 jenis larutan atau reagen, antara lain: kristal gentian violet (Gram I), iod (GramII), etanol 96% (GramIII), dan safranin (Gram IV). (sumber dari: anonim. Gram staining. http://www.absoluteastronomy.com/topics/Gram_staining). Prinsip dasar dari metode pewarnaan gram adalah harus dilakukan adalah fiksasi, fiksasi berfungsi untuk membunuh dan melekatkan bakteri pada kaca objek sehingga pewarnaan dapat dilakukan dengan baik. Setelah itu baru dilanjutkan dengan penambahan senyawasenyawa pewarna. Reagen pertama yang digunakan disebut warna dasar yaitu karbol gentian violet. Pewarna ini akan menempel pada lapisanpoeptidoglikan gram positif dan LPS pada gram negative. Reagen kedua untuk memperkuat penempelan warna pada

membran sel bakteri yaitu pewarna lugol. Sedangkan raegen ke 3 yaitu etanol absolute digunakan untuk mencuci warna (decolorizing agent). Lunturnya tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bakteri gram negative yang mempunyai LPS warnanya akan luntur karena lemak larut dalam alkohol, dan sedangkan warna

pada dinding sel bakteri gram positif tidak luntur karena warna sudah terikat pada dinding sel. Dengan kata lain, pemberian etanol memiliki 2 fungsi yaitu pada gram positif alkohol mengakibatkan peptidoglikan terdehidrasi sehingga ukuran porinya mengecil. Ini mengakibatkan kristal violet tidak dapat keluar dari sitoplasma. Sedangkan pada gram negatif alkohol mencuci dinding sel dan meninggalkan lubang kecil pada peptidoglikan. Ini mengakibakan kristal violet tercuci keluar dan sel menjadi tidak berwarna. Reagen yang terakhir adalah warna pembanding yaitu fuchsin, pewarna tandingan ini akan masuk ke dinding sel bakteri gram negatif. Sehingga didapat perbedaan warna antara gram negative dan gram positif dari warna yang terlihat. Dari hasil yang didapat, bakteri dapat diamati bentuk , ukuran, dan jenis gram bakteri. Berikut ini adalah skema dari pewarnaan gram.

Gb 2. Pewarnaan Gram Bakteri Gram Positif dan Negatif

Setelah pewarnaan gram selesai kita lakukan, kita lakukan pengamatan di mikroskop untuk melihat bentuk dan jenis bakteri. Bentuk bakteri sendiri ada bermacam-macam antara lain cocci (bulat), bacilli (batang),vibrio (koma), coccobaccil, dan masih banyak lagi.

Dari berbagai bentuk tersebut, bentuk paling umum yang dimiliki oleh sebagian besar bakteri adalah bentuk cocci dan bacilli. Setelah kita mengetahui bentuk dan jenis gram bakteri (gram positif atau negatif), kita dapat melakukan berbagai uji biokimia yang jalurnya telah ditentukan berdasarkan kunci dikotomi. Kita ikuti uji apa yang harus dilakukan setelah kita ketahui bentuk dan jenis gramnya, tiap bakteri dengan bentuk dan jenis gram yang berbeda akan melalui jalur uji yang berbeda. Dari hasil uji tersebut kita bisa menentukan lagi uji apa yang harus kita lakukan selanjutnya,hal itu terus kita lakukan hingga akhirnya kita dapat menentukan spesies bakteri sampel kita. Berikut ini adalah kunci dikotomi untuk penentuan spesies bakteri gram positif dan negatif :

a. Indol Media ini biasanya digunakan dalam indetifikasi yang cepat. Hasil uji indol yang diperoleh negatif karena tidak terbentuk lapisan

(cincin) berwarna merah muda pada permukaan biakan, artinya bakteri ini tidak membentuk indol dari

tryptopan sebagai sumber carbon, yang dapat diketahui dengan menambahkan larutan kovacs. Asam amino triptofan merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian protein(Anonim, 2008)
O CH2 CH C NH2 N H triptofan indol OH triptofanase H2O N H HO asam piruvat O

H3C

C C

+
O

NH 3 amoniak

H3C C N H N(CH3)2 indol

+
N H N H N(CH3)2

H2O

p-dimetil amino benzaldehida (reagen kovac)

rosindol (berwarna merah)

b.

MR-VP 1. Uji MR Hasilnya positif, terjadi perubahan warna menjadi merah setelah ditambahkan methyl red. Artinya, bakteri ini mengahasilkan asam campuran (metilen glikon) dari proses fermentasi glukosa yang

terkandung dalam medium MR-VP. Terbentuknya asam campuran pada media akan menurunkan pH sampai 5,0 atau kurang, oleh karena itu bila indikator metil ditambahkan pada biakan tersebut dengan pH seredndah itu maka indikator tersebut menjkadi merah. Hal ini menandakan bahwa bakteri ini peragi asam campuran(Anonim, 2008)

2.

Uji VP Hasilnya negatif, karena tidak terbentuk warna merah pada

medium setelah ditambahkan -napthol dan KOH, artinya hasil akhir fermentasi bakteri ini bukan asetil metil karbinol (asetolin) (Anonim, 2008)

c.

SIM Hasil yang diperoleh pada uji ini adalah positif, hal ini terlihat adanya penyebaran yang berwarna putih seperti akar disekitar inokulasi. Hal ini dari

menunjukan

adanya

pergerakan

bakteri yang diinokulasikan, yang berarti bahwa bakteri ini memiliki flagella. Dari uji juga terlihat ada warna hitam, yang berarti bakteri ini menghasilkan Hidrogen Sulfit (H2S) (Anonim, 2008)

10

d.

Simmons Citrate Hasil uji sitrat yang diperoleh negatif, yang ditandai dengan tidak terjadinya perubahan warna. Artinya bakteri ini tidak mempunyai enzim sitrat permiase yaitu enzim spesifik yang membawa sitrat ke dalam sel(Anonim, 2008)

e.

TSIA Pada uji TSIA warna media slant berubah menjadi merah karena bakteri bersifat basa ini menandakan bahwa bakteri ini tidak

memfermentasi laktosa dan sukrosa(Anonim, 2008) Pembentukan gas positif ini hasil dari fermentasi H2 dan Co2 dapat dilihat dari pecahnya dan terangkatnya agar. Pembentukan H2S positif ditandai dengan adanya endapan berwarna hitam, endapan ini terbentuk karena bakteri mampu mendesulfurasi asam amino dan methion

11

yang akan menghasilkan H2S, dan H2S akan bereaksi dengan Fe++ yang terdapat pada media dan menghasilkan endapan hitam(Anonim, 2008) Pada media daerah butt media berubah berwarna kuning ini menandakan bakteri memfermentasi glukosa. Media ini biasanya digunakan untuk membedakan Salmonella dan Shigella dengan bakteri Gram negatif bentuk batang lainnya bedasarkan pola fermentasi penghasil hydrogen sulfide. Untuk pengamatan pola-pola pengunaan karbohidrat. TSIA agar mengadung laktosa dan sukrosa dalam konsentrasi 1%, glukosa 0,1% dan phenol red sebagai indicator yang menyebabkan perubahan warna dari merah orange menjadi kuning dalam suasana asam. TSIA juga mengandung natrium trisulfat, yaitu suatu substrat untuk penghasil H2S, ferro sulfat menghasilkan FeS (precipitat), bewarna hitam untuk membedakan bakteri H2S dengan bakteri-bakterinya(Anonim, 2008)

f.

Uji gula-gula(Glukosa, Laktosa, Sukrosa dan Manitol)

Uji ini dilakukan untuk mengindetifikasi bakteri yang mampu memfermentasikan karbohidrat. Pada uji gula-gula hanya terjadi perubahan warna pada media glukosa yang berubah menjadi warna kuning, artinya bakteri ini membentuk asam dari fermentasi glukosa. Pada
12

media glukosa juga terbentuk gelembung pada tabung durham yang diletakan terbalik didalam tabung media, artinya hasil fermentasi berbentuk gas(Anonim, 2008)

g. Uji Urease Urease merupakan salah satu bentuk enzim yang berperan dalam proses perkecambahan. Enzim urease memiliki substrat spesifik yaitu urea. Enzim ini dapat mengkatalis reaksi pemecahan urea yang bersifat patogen dalam sel tumbuhan menjadi amonia dan CO2. Urease ditemukan terutama dalam kuantitas besar pada jackbean dan kedelai juga terdapat pada beberapa jaringan hewan dan pencernaan mikroorganisme. Urease ditemukan pada berbagai macam organisme seperti bakteri, jamur dan tumbuhan tingkat tinggi. Urease pada lingkungan berperan dalam jalur sistem transportasi nitrogen. (NH2)2CO CO2 + 2NH3

Reaksi enzimatis yang melibatkan enzim urease tergolong ke dalam reaksi hidrolisa dimana aktivitasnya dipengaruhi oleh adanya air. Uji urease atau uji hidrolisis urea digunakan untuk mengidentifikasi kelompok Proteus dari patogen-patogen gram negatif lainnya. Salah satu ciri khas Proteus ialah kemampuannya menghasilkan enzim urease yang dapat melepaskan amoniak dari molekul urea. Ciri ini tidak dimiliki oleh bakteri lain yang mungkin dikelirukan dengan Proteus. Medium yang digunakan dalam uji ini adalah kaldu urea yang merupakan larutan ekstrak khamir dan urea yang diberi larutan penyangga. Medium tersebut juga mengandung merah fenol sebagai indikator pH. Bila mikroba yang diidentifikasi menghasilkan urease, maka amonia yang dilepaskan ke dalam medium akan menaikan pH. Bila pH menjadi makin

13

tinggi maka merah fenol akan berubah warna dari kuning menjadi merah keunguan (Hadioetomo, 1985).

h. Uji Reduksi Nitrat Dalam keadaan kekurangan oksigen atau pada mikroorganisme yang bersifat anaerob dan tidak memiliki enzim sitokrom oksidase (sitokrom aa3), maka mikroorganisme akan menggunakan molekul bukan oksigen sebagai akseptor elektron terakhir. Nitrat (NO3-) digunakan oleh mikroorganisme tertentu sebagai akseptor elektron terakhir dengan cara mereduksi nitrat menjadi nitrit (NO2-). Beberapa mikroorganisme mereduksikan nitrit menjadi gas nitrogen (N2). NO3- + 2e- + 2 H+ 2NO2- + 7e- + 8 H+ NO2- + H2O N2(g) + 4 H2O

Kemampuan mereduksi nitrat dapat digunakan sebagai ciri dalam identifikasi bakteri Escherichia coli dan Pseudomonas aeruginosa mampu menggunakan nitrat sebagai akseptor elektron terakhir. E. coli

mereduksikan nitrat menjadi nitrit sedangkan P. aeruginosa mampu mereduksikannnya lebih lanjut menjadi N2. Sebaliknya Straphylococcus epidermis tidak dapat menggunakan nitrat sebagai akseptor elektron terakhir.

14

Uji nitrat dilakukan dengan menumbuhkan mikroorganisme dalam kaldu nutrien yang mengandung 0,5 % KNO3 dan dilengkapi tabung Durham. Setelah masa inkubasi, diamati pembentukan gas dalam tabung Durham dan keberadaan nitrit dalam media biakan. Gas yang terperangkap dalam tabung Durham merupakan campuran gas N2 dan CO2. Gas N2 berasal dari penguraian sempurna nitrat sedangkan CO2 merupakan produk respirasi anaerobik. Keberadaan nitrit dalam media dapat diuji dengan penambahan asam sulfanilat dan -naftilamin yang akan bereaksi dengan nitrit yang ditunjukkan dengan perubahan warna media menjadi merah atau merah muda (Lay, 1994).

i. Uji Katalase Beberapa bakteri yang memiliki flavoprotein dapat mereduksi O2 dengan menghasilkan hidrogen peroksida (H2O2) atau superoksida (O2-). Kedua bahan ini merupakan bahan yang toksik dan menghancurkan kompenen sel dengan sangat cepat. Bakteri harus dapat mempertahankan diri seperti dengan produksi O2 atau akan terbunuh. Beberapa bakteri dapat memproduksi enzim yang dapat mengkatalisis superoksids yaitu peroksida dismutase, dan juga katalase atau peroksidase yang dapat mendekstruksi hidrogen peroksida.Katalase adalah enzim yang mengkatalisasikan penguraian hydrogen peroksida (H2O2) menjadi air dan O2. Hidrogen peroksida terbentuk sewaktu metabolisme aerob, sehingga
15

mikroorganisme yang tumbuh dalam lingkungan aerob dapat menguarikan zat toksik tersebut.Uji katalase ini dilakukan untuk mengidentifikasi kelompok bakteri bentuk kokkus, dalam membedakan Staphylococcus dan Streptococcus. Dimana kelompok streptococcus bersifat katalase negative dan Staphylococcus bersifat katalase positif. Penentuan adanya katalase ini terlihat dari pembentukan gelembung udara di sekitar koloni setelah ditambahkan larutan H2O2 3%. Reaksi kimiawi yang dikatalisasikan oleh enzim terlihat sebagai berikut :

superoksida 2 O2 + 2H+ Dismutase O2 + H2O2

Katalase H2O2 Peroksidase H2O + O2(gelembung udara)

j. Uji Litmus Milk Media yang dipakai dalam uji ini adalah litmus milk yaitu media yang terdiri dari 2 komponen utama yaitu susu dan litmus. Litmus milk adalah medium berbasis susu untuk membedakan spesies antar bakteri. Laktosa,

16

litmus dan kasein terkandung dalam medium yang dapat dimetabolisme oleh tipe bakteri yang berbeda. Penambahan litmus lebih mengarah pada perubahan pH berlaku sebagai oksidasi dan reduksi indikator. Tes sendiri menunjukan ketika bakteri dapat menfermentasikan laktosa, mereduksi litmus, membentuk gas, membentuk gumpalan atau memulai peptonisasi. Jadi uji ini bertujuan untuk melihat kemampuan bakteri dalam menggunakan komponenkomponen yang terdapat pada susu, misalnya laktosa, protein susu (kasein), lacto-albumin, dan lactoglobulin. Dan untuk mendeteksi perubahan digunakan indikator litmus. Bakteri-bakteri yang mampu menggunakan laktosa sebagai sumber karbon, berarti mempunyai enzim galaktosidase yang dapat memecah molekul laktosa menjadi glukosa. Proses berikutnya adalah fermentasi karbohirat yang akan menghasilkan asam sebagai produk akhirnya. Oleh karena adanya asam maka akan mengakibatkan perubahan warna litmus dari ungu menjadi merah muda. Perubahan warna litmus ini akan terjadi disekitar pH 4. Fermentasi biasanya diikuti juga dengan pembentukan gas. Gas yang terbentuk umumnya adalah gas hidrogen dan gas karbondioksida. Pembentukan gas ini dapat menyebabkan muncul retakan pada curd yang terbentuk. Selain mendekteksi peristiwa diatas, uji litmus milk dapat digunakan untuk menguji kemampuan bakteri dalam mereduksi litmus. Litmus ini tereduksi akibat adanya peranan litmus sebagai akseptor electron dalam proses metabolisme bakteri tersebut. Pereduksian litmus ini akan mengubah warna media dari ungu menjadi putih susu. Aktivitas biokimia bakteri dapat menghasilkan dua jenis curd, yaitu acid curd dan rennet curd bergantung pada mekanisme pembentukannya. Acid curd terbentuk karena adanya asam organik pada media dan dapat menyebabkan presipitasi berupa calcium caseinate dari kasein susu membentuk gumpalan yang tidak dapat larut. Gumpalan yang

terbentuk keras dan tidak dapat berpindah dari dinding tabung walaupun tabung dimiringkan. Sedangkan rennet curd, diproduksi oleh beberapa

17

organisme yang mampu memproduksi renin, suatu enzim yang bekerja pada kasein dan membentuk paracasein yang dengan keberadaan ion kalsium akan diubah menjadi calcium paracaseinate dan membentuk gumpalan lembut dan bersifat semi-solid. Apabila tabung digoyangkan, maka gumpalan akan ikut bergerak. Bagian lain dari susu yang dapat digunakan adalah protein susu. Beberapa bakteri dapat menghasilkan enzim proteolisis yang dapat memecah protein menjadi asam amino dan hal itu dapat dilihat dari media yang menjadi jernih kecoklatan. Proses pemecahan ini akan

mengakibatkan pelepasan amonia yang akan meningkatkan kebasaan dari media. Naiknya nilai pH ini akan menimbulkan pita berwarna ungu tua pada bagian atasmedia. Kegunaan lainnya, uji litmus milk juga dapat digunakan untuk menguji kemampuan bakteri dalam mendegradasi kasein. Degradasi dari kasein menjadi rantai polipeptida yang lebih pendek ini diikuti dengan pelepasan produk akhir yang bersifat basa yang mengakibatkan perubahan warna litmus dari ungu menjadi biru tua.

18

III.

Alat dan Bahan

Alat : Spiritus Jarum Ose Tabung Reaksi Objek Glass Beaker Glass Erlenmeyer Cawan Petri Pengaduk

Bahan Kultur Kultur yang digunakan berupa bakteri yang diberi kode dan merupakan kultur murni yang ditumbuhkan pada trypticase soy agar slant.

Media Trypticase Soy Agar (TSA) Phenol red lactose broths Phenol red glucose broths Simmons citrate agar SIM Litmus Milk broth NB-KNO3

Reagen Crystal violet Grams iodine Ethanol 96% Fuschin Reagen Kovacs Solution A dan B Bubuk Zn

19

IV.

Cara Kerja

Pewarnaan Gram 1. Menyiapkan kaca obyek bebas lemak, meneteskan NaCl pada kaca obyek lalu dengan jarum ose bakteri diambil dari biakan padat dan diletakkan pada tetesan NaCl. Lalu dibiarkan mengering diudara. 2. Setelah itu dilakukan fiksasi untuk melekatkan olesan bakteri pada kaca obyek dengan cara melewatkan olesan yang telah kering di atas api spiritus beberapa kali (bagian yang ada olesan bakteri menghadap atas). 3. Lalu olesan bakteri diberikan dengan beberapa tetes larutan karbol gentian violet (gram I), lalu dibiarkan selama 3 menit dan dibilas dengan air. 4. Lalu olesan bakteri diberikan dengan larutan lugol (gram II) beberapa tetes, lalu dibiarkan selama 1 menit dan dibilas dengan air. 5. Setelah itu dicuci dengan larutan gram III (alkohol 96%) dengan memiringkan preparat kemudian ditetesi pelan-pelan dengan gram III hingga tidak ada pewarna yang terlunturkan dan dibilas dengan air. 6. Setelah itu preparat ditetesi dengan larutan fuchsin (gram IV) beberapa tetes. Didiamkan selama 3 menit. 7. Preparat dibilas dengan air dan dikeringkan di udara atau dengan menyerap kelebihan air dengan tissue. 8. Preparat dilihat di mikroskop dengan perbesaran 1000 X. 9. Mencatat warna dan morfologi sel bakteri

Uji Biokimia (Sesuaikan dengan Skema Identifikasi Spesies) 1. Menginokulasi sampel pada trypticase soy agar slant 2. Gunakan kultur yang didapat untuk berbagai uji biokimia. Phenol Red Laktose Broth Mengambil 1 ose kultur sampel secara aseptis, setelah itu ditanam pada media cair dan diinkubasi pada suhu 37C selama 24-27 jam. Phenol Red Glucose Broth Mengambil 1 ose kultur sampel secara aseptis, setelah itu ditanam pada media cair dan diinkubasi pada suhu 37C selama 24-27 jam.
20

 SIM Agar Deep Tube Mengambil 1 ose kultur sampel secara aseptis, setelah itu ditanam pada media padat dengan menusukkan ose dan diinkubasi pada suhu 37C selama 24-27 jam. o Setelah itu ditambahkan reagen Kovacs beberapa tetes dan diamati. NB-KNO3 Mengambil 1 ose kultur sampel secara aseptis, setelah itu ditanam pada media cair dan diinkubasi pada suhu 37C selama 24-27 jam. o Tambahkan solution A dan B beberapa tetes dan amati. Bila media tidak berubah warna menjadi merah, tambahkan serbuk Zn dan amati. Simmons Citrate Agar Slant Mengambil 1 ose kultur sampel secara aseptis, setelah itu ditanam pada media padat dengan menggores zig-zag pada permukaan media dan diinkubasi pada suhu 37C selama 24-27 jam. Litmus Milk Mengambil 1 ose kultur sampel secara aseptis, setelah itu ditanam pada media cair dan diinkubasi pada suhu 37C selama 24-27 jam.

21

V.

Hasil Percobaan 1. Bakteri A

22

2. Bakteri B

23

VI.

Pembahasan

Pada percobaan kali ini bertujuan untuk menentukan spesies dari masing-masing sampel yang didapatkan. Ada 2 sampel yang diuji. Berikut pembahasan untuk masing-masing bakteri uji :

1. Bakteri A Uji pertama untuk penentuan spesies adalah dengan pewarnaan gram. Bakteri A setelah diuji pewarnaan gram, menunjukkan hasil gram negatif. Gram negatif tampak dari warna pink dan bentuk sel yang basil. Setelah melalui tahap pewarnaan gram, pada tabel skema identifikasi bahwa langkah pengidentifikasian yang selanjutnya adalah pengulturan sampel pada lactose broth. Dari hasil pengamatan terlihat bahwa tidak terdapat perubahan warna pada broth dan tidak terbentuk gelembung udara. Uji ini menunjukkan bahwa bakteri sampel A tidak dapat memfermentasikan laktosa sehingga sampel dinyatakan negatif pada uji ini. Untuk teknik identifikasi selanjutnya didasarkan pada lactose broth negatif yang mengarah pada uji glukosa. Pada uji glukosa ini, bakteri A dikulturkan pada broth yang mengandung glukosa dan menunjukkan hasil yang negatif Hasil uji glukosa menunjukkan hasil yang negatif, selanjutnya, sesuai dengan tabel identifikasi yang ada, maka uji dilanjutkan dengan uji reduksi nitrat. Uji nitrat dilakukan dengan menumbuhkan mikroorganisme dalam kaldu nutrien yang

mengandung 0,5 % KNO3 dan dilengkapi tabung Durham. Setelah masa inkubasi, diamati pembentukan gas dalam tabung Durham dan keberadaan nitrit dalam media biakan. Gas yang terperangkap dalam tabung Durham merupakan campuran gas N2 dan CO2. Gas N2 berasal dari penguraian sempurna nitrat sedangkan CO2

24

merupakan produk respirasi anaerobik. Keberadaan nitrit dalam media diuji dengan penambahan asam sulfanilat dan -naftilamin yang akan bereaksi dengan nitrit yang menunjukkan perubahan warna media menjadi merah atau merah muda. Sehingga dari Uji tersebut dinyatakan positif. Langkah identifikasi yang terakhir adalah dengan uji litmus milk. Uji ini dilakukan dengan menginokulasi bakteri dalam media litmus milk. Pada uji yang dilakukan ditunjukkan dengan perubahan warna media menjadi ungu lebih muda dan terbentuk rennert curd. Ini dikarenakan adanya perubahan pH yang terjadi pada media dan curd terbentuk karena bakteri mampu

memproduksi renin, suatu enzim yang bekerja pada kasein dan membentuk paracasein yang dengan keberadaan ion kalsium akan diubah menjadi calcium paracaseinate dan membentuk gumpalan lembut dan bersifat semi-solid. Selain itu curd yang terbentuk retak karena produksi gas hidrogen dan karbondioksida. Dari semua hasil pengujian yang dilakukan diatas, maka dapat diketahui spesies bakteri bersangkutan. Berdasarkan skema identifikasi spesies, dilihat dari jalur-jalur pengujian yang dilakukan, dapat diketahui dan disimpulkan bahwa bakteri A merupakan Pseudomonas Aeruginosa.

2. Bakteri B Pengidentifikasian bakteri B diawali dengan pewarnaan gram. Hasil dari pewarnaan gram menunjukkan apakah bakteri uji termasuk dalam strain negatif ataupun positif. Dari hasil percobaan, didapatkan bahwa bakteri B merupakan bakteri gram negatif dengan bentuk sel basil. Hasil ditunjukkan oleh gambar dibawah ini. Uji yang dilakukan selanjutnya adalah uji lactose. Bakteri B diinokulasikan dalam media phenol red lactose broth. Uji lactose positif ditunjukkan dengan adanya perubahan warna media dari

25

merah menjadi kuning yang menandakan terbentuknya gas, dan terbentuk gelembung gas pada tabung Durham. Hasil dari uji lactose ditunjukkan oleh gambar di bawah ini. Langkah identifikasi dilanjutkan dengan uji indol pada media SIM. Uji ini untuk mengetahui apakah bakteri dapat mendegradasi triptofan dan membentuk indol. Setelah bakteri diinokulasi pada media dan diinkubasi, perlu penambahan reagen Kovac untuk mengetahui perubahan warna media menjadi merah ataupun terbentuknya cicin merah. Bakteri B menunjukkan hasil yang negatif untuk uji ini. Hasil ditunjukkan oleh gambar di bawah ini. Yang seharusnya hasil dari uji ini positif. Kesalahan ini dapat disebabkan oleh SIM yang rusak karena yang digunakan adalah SIM yang sudah cair yang seharusya menggunakan SIM yang baik. Selain itu, faktor kurang lamanya waktu untuk inokulasi dapat menjadi salah satu alasan hasil negatif. Karena inokulum masih beradaptasi dengan media. Penyebab yang ketiga bisa karena tidak ada inokulum yang tertanam pada media agar SIM karena kesalahan dalam pengambilan inokulum. Pengujian lebih lanjut dilakukan dengan uji citrate. Uji ini dilakukan untuk mengetahui apakah bakteri ini mempunyai enzim sitrat permiase yaitu enzim spesifik yang membawa sitrat ke dalam sel produksi . Hasil uji sitrat yang diperoleh negatif, yang ditandai dengan tidak terjadinya perubahan warna. Artinya asam dari bakteri bersangkutan tinggi atau tidak. Dari hasil percobaan yang dilakukan dapat disimpulkan spesies dari bakteri B. Berdasarkan skema identifikasi spesies, alur-alur percobaan yang dilakukan menunjukkan bahwa bakteri B merupakan Escherichia Coli.

26

VII.

Kesimpulan Spesies bakteri dapat dianalisa berdasarkan kekhasan morfologi dan fisiologi. Kekhasan ini dapat dianalisa melalui uji pewarnaan Gram (morfologi) dan uji Biokimia (fisiologi). Penentuan spesies bakteri dilakukan dengan mengikuti alur skema identifikasi spesies. Setiap melakukan 1 uji dan didapatkan hasilnya, langkah untuk identifikasi berikutnya sesuai dengan yang tertera pada skema sampai mendapatkan spesies dari bakteri uji. Hasil analisa menunjukkan bahwa bakteri A adalah, bakteri B adalah Escherichia coli.

VIII. Daftar Pustaka Aiyer PV. 2005. Amylases and their applications. African Journal of Biotechnology. 4: 1251529. Liu Q. 2005. Understanding Starch and Their Role in Foods. Taylor & Francis Group, LLC. Sale BS. 1961. Fundamental Principles of Bacteriology. Mc. Graw Hill Book Company, Inc. Poedjiadi A. 1994. Dasar dasar Biokimia. Penerbit Universitas Indonesia. Reddy NS, Nimmagadda A & Rao KR. 2003. An overview of themicrobial -Amylase family. African Journal of

Biotechnology. 2: 645648. Palmer T. 1985. Understanding Enzyme. Ellishorwood Publisher. Benson HJ. 1994. Microbiological applications. Win C. Brown Publication.

27

LAMPIRAN

Lampiran 1 (Hasil Pewarnaan Gram)

Gambar 1.1 Bakteri A Lampiran 2 (Hasil Uji Biokimia) Hasil Sampel A

Gambar 1.2 Bakteri B

Hasil Sampel B

Gambar 2.1a Media Phenol Red Lactose Broth

Gambar 2.1b Media Phenol Red Lactose Broth

Gambar 2.2a Media Phenol Red Glucose Broth

Gambar 2.2b Media SIM Agar Deep Tube

28

Gambar 2.3a Media NB-KNO3

Gambar 2.3b Media SCA slant

Gambar 2.4a Media Litmus Milk

29