PERBANDINGAN PENGUKURAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DARI EKSTRAK ETANOL DAN MINYAK ATSIRI LEMPUYANG GAJAH

GERILDA RIDWINA

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

PERBANDINGAN PENGUKURAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DARI EKSTRAK ETANOL DAN MINYAK ATSIRI LEMPUYANG GAJAH

GERILDA RIDWINA

Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

ABSTRAK
GERILDA RIDWINA. Perbandingan Metode Pengukuran Aktivitas Antioksidan dari Ekstrak Etanol dan Minyak Atsiri Lempuyang Gajah. Dibimbing oleh LATIFAH KOSIM DARUSMAN dan ELLY SURADIKUSUMAH. Penelusuran potensi antioksidan dari tanaman obat seperti lempuyang gajah telah banyak dilakukan. Berbagai metode pengukuran aktivitas antioksidan dapat digunakan untuk mengamatinya. Upaya membandingkan metode tersebut dilakukan agar diketahui hasil terbaik untuk mengukur aktivitas antioksidan dari ekstrak etanol (EE) dan minyak atsirinya (MA). Penelitian diawali dengan penentuan kadar air simplisia lempuyang gajah, pembuatan EE dan MA secara Soxhlet dan distilasi-air, dan uji fitokimia simplisia dan EE. Aktivitas antioksidan ekstrak selanjutnya diukur aktivitas antioksidannya menggunakan metode feritiosianat (FTC), difenilpikrilhidrazil (DPPH), dan reduksi serium (CR). Hasil pengukuran dibandingkan dengan uji statistik, yaitu uji F dan t. Simplisia mempunyai kadar air 12.48%. Rendemen EE dan MA yang dihasilkan berturut-turut 5.69% dan 5.15% (b/b). Flavonoid, saponin, tanin, dan kuinon terdapat dalam simplisia dan EE, sedangkan triterpenoid hanya terdapat dalam simplisia. MA memiliki aktivitas tertinggi diikuti -tokoferol dan yang terendah, EE pada metode FTC. -Tokoferol memiliki aktivitas antioksidan tertinggi, diikuti oleh EE dan yang terendah, MA pada metode CR dan DPPH. Uji t perbandingan ketiga metode berbeda nyata. Aktivitas antioksidan MA, baik diukur menggunakan FTC dan CR karena ketelitian yang tinggi. Metode reduksi serium dapat dipilih untuk pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak etanol karena hasil uji F tidak berbeda nyata, cukup teliti, dan lebih murah dibandingkan dengan metode FTC dan DPPH.

ABSTRACT GERILDA RIDWINA. Antioxidant Activity Measurement Methods Comparison for Ethanol Extract and Essential Oil of Lempuyang Gajah. Supervised by LATIFAH KOSIM DARUSMAN dan ELLY SURADIKUSUMAH. Numerous exploration of medicinal plants like lempuyang gajah had been carried out. Its antioxidant activity could be measured by several methods. The result from one method to other methods could be different, therefore method comparison is needed to determine the best method in measuring ethanol extract (EE) and essential oil (EO) of lempuyang gajah. The research was started with determination of moisture content, followed with Soxhlet and water-distillation, and phytochemical screening of simplicia and EE. The extract was measured by ferithyocyanate (FTC), dyphenylpicrylhidrazyl (DPPH) and cerium reduction (CR) methods. The results were compared with statistical analysis, F test and t test. The simplicia had moisture content of 12.48%. The yield of EE and EO were 5.69% and 5.15% (w/w), respectively. Flavonoid, saphonin, tannin, and quinone were contained in simplicia and EE but triterpene was only in simplicia. EO showed the highest antioxidant activity followed by -tocopherol and the lowest was EE in FTC method. -Tocopherol showed the highest antioxidant activity followed by EE and the lowest was EO in DPPH and CR methods. Significantly different results were given for all t test. FTC was sufficient in measuring EO and CR because its good precision. CR could be choosed for measuring EE because it F test result was not significantly different, good precision, and lower cost than FTC and DPPH methods.

Judul Nama NIM

: Perbandingan Metode Pengukuran Aktivitas Antioksidan dari Ekstrak Etanol dan Minyak Atsiri Lempuyang Gajah : Gerilda Ridwina : G44203052

Menyetujui: Pembimbing I, Pembimbing II,

Prof. Dr. Ir. Latifah K Darusman, MS NIP 130 536 681

Ir. Elly Suradikusumah, MS NIP 130 350 043

Mengetahui: Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor

Dr. drh. Hasim, DEA NIP 131 578 806

Tanggal Lulus :

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 10 Juni 1985 dari pasangan Ridwan Bochari dan Lutfiah Lucyana. Penulis merupakan anak kedua dari tiga bersaudara. Penulis lulus dari SMU Negeri 35 Jakarta tahun 2003 dan melanjutkan pendidikan di Institut Pertanian Bogor (IPB) pada tahun yang sama melalui jalur USMI pada Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam dengan minat pada Laboratorium Kimia Analitik. Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif di organisasi kemahasiwaan Ikatan Mahasiswa Kimia (Imasika) periode kepengurusan 2003/2004 pada Departemen Chemistry English Club dan menjadi juara pertama English Quiz for Scientist, FMIPA, IPB, pada tahun 2005. Penulis juga aktif dalam bidang akademis sebagai ketua tim penelitian PKMP-Dikti 2006 berjudul Metode Cepat untuk Kuantifikasi Kadar Kurkuminoid pada Temulawak, Kunyit, dan Sediaan Herbal Komersial secara Spektrofotometri Derivatif Vis, serta mengikuti praktik lapangan di PT Unilever Indonesia, Pabrik NSD Cikarang, Bekasi, menghasilkan karya ilmiah berjudul Analisis Pengendalian Kualitas Berat Produk dengan Metode Pengendalian Proses Statistikal (SPC) pada tahun 2006. Penulis juga menjadi asisten praktikum untuk mata kuliah Biologi Dasar S1 dan Kimia TPB S1 pada tahun ajaran 2005/2006; Kimia Analitik I S1, Pemeliharaan dan Pengoperasian Alat D3, Kimia Analitik II S1, Kimia Analitik Dasar D3, dan Spektroskopi II D3 pada tahun ajaran 2006/2007. Kimia Dasar D3 dan Kimia TPB S1 pada alih tahun ajaran 2007/2008. Kimia Dasar D3, Spektroskopi I D3, dan Kimia Bahan Alam D3 pada semester gasal tahun 2007/2008.

PRAKATA Syukur Alhamdulillah kepada Allah SWT atas kekuatan dan cahaya rahmat-Nya yang selalu menerangi setiap jejak langkah penulis menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul Perbandingan Metode Pengukuran Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol dan Minyak Atsiri Lempuyang Gajah. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juni sampai dengan November 2005 bertempat di Laboratorium Kimia Analitik, Kimia Organik, Kimia Diploma IPB, dan Pusat Studi Biofarmaka. Adanya karya ilmiah ini selalu lekat dengan bantuan berbagai pihak. Penulis menghaturkan terimakasih dan penghargaan kepada Prof. Dr. Ir. Latifah K Darusman, MS dan Ir. Elly Suradikusumah, MS, selaku pembimbing yang telah menyirami penulis dengan ilmu dan pengarahan. Terima kasih juga dianugrahkan kepada bagian Kimia Analitik Departemen Kimia IPB dan Pusat Studi Biofarmaka atas bantuan sebagian besar dari dana penelitian ini. Terimakasih atas bantuan para laboran (khususnya Bpk. Eman Ibu Nunung, dan Bpk. Sobur), staf Kimia Analitik dan Organik, dan staf Pusat Studi Biofarmaka IPB selama penelitian berlangsung; Budi Arifin, S.Si, Dr. dr. Irma Suprapto, MS, Betty M Soebrata, M.si, Prof. Suminar, Dra. Sri Mulijani, MS, dan Sri Winarni, M.Si atas masukannya yang berharga; Staf Departemen Kimia (khususnya Bpk. Heri dan Bpk. Didi); dan Yayasan Supersemar atas bantuan beasiswanya. Ucapan terimakasih yang tak terhingga untuk ibu, ayah, kakak Gervi & Intan, adik Geraldi, atas doa, cinta, juga dukungan moril & materil; Jeffry Dumanauw dengan canda, dan kasih sayangnya kepada penulis. Terimakasih juga kepada teman seperjuangan Chia dan Halil, sahabatku Rahma, Erika, Huri, Ema, Ismail, yance, mario, dan Kimia 40, serta keluarga M20. Akhir kata, semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.

Bogor, Januari 2008

Gerilda Ridwina

DAFTAR ISI
Halaman DAFTAR GAMBAR .................................................................................................. vii DAFTAR LAMPIRAN............................................................................................... vii PENDAHULUAN ..................................................................................................... 1 TINJAUAN PUSTAKA Lempuyang Gajah ....................................................................................... Minyak Atsiri ............................................................................................... Distilasi minyak atsiri ....................................................................... Minyak atsiri lempuyang gajah......................................................... Antioksidan................................................................................................... Penggolongan antioksidan ................................................................ Uji Aktivitas Antioksidan............................................................................. Metode FTC...................................................................................... Metode DPPH ................................................................................... Metode CR........................................................................................ 1 1 2 2 2 2 3 3 3 4

BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat ............................................................................................ 4 Metode......................................................................................................... 4 HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi dan Fitokimia................................................................................ Uji Aktivitas Antioksidan Menurut Metode FTC......................................... Uji Aktivitas Antioksidan Menurut Metode DPPH...................................... Uji Aktivitas Antioksidan Menurut Metode CR........................................... Perbandingan Metode Pengukuran Aktivitas antioksidan............................ 5 5 6 7 8

SIMPULAN DAN SARAN Simpulan...................................................................................................... 10 Saran ............................................................................................................ 10 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................. 10 LAMPIRAN................................................................................................................ 12

DAFTAR GAMBAR
Halaman 1 2 3 4 5 Tanaman lempuyang gajah ............................................................................ 1 Radas distilasi-air minyak atsiri lempuyang gajah ........................................ 2 Aktivitas antioksidan dengan metode FTC.................................................... 5 Aktivitas antioksidan dengan metode DPPH ................................................. 7 Aktivitas antioksidan dengan metode CR...................................................... 8

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman 1 2 3 4 5 6 Diagram alir penelitian. ................................................................................. 13 Penetapan kadar air, ekstraksi, dan metode uji fitokimia............................... 14 Data kadar air, rendemen, dan uji fitokimia lempuyang gajah. ..................... 16 Data persen inhibisi, penangkapan radikal, dan kapasitas reduksi.. .............. 17 Data spektrum absorbans dan pH Ce(IV) sulfat.. .......................................... 20 Data uji banding metode pengukuran aktivitas antioksidan.. ........................ 21

PENDAHULUAN
Ketertarikan terhadap senyawa penangkap radikal bebas (antioksidan) yang terkandung dalam tanaman rempah yang sering digunakan pada pengobatan tradisional meningkat, karena secara alami dapat mencegah penyakit, meningkatkan kesehatan, atau merupakan substansi anti penuaan. Radikal bebas merupakan spesies tidak stabil yang memiliki elektron tidak berpasangan sehingga untuk mencapai kestabilannya, spesies ini mencari pasangan elektron pada makromolekul hayati seperti protein, lemak, dan DNA (Benson 1990). Proses ini mengakibatkan perusakan sel manusia di bawah kondisi tekanan oksidatif, dan jumlah radikal bebas yang berlebihan mengakibatkan kerusakan sel secara langsung, gangguan membran, metabolisme, dan fungsi gen (Oski 1980). Salah satu tanaman rempah, yang dikenal sebagai lempuyang gajah (Zingiber zerumbet) di Indonesia, sejak lama digunakan sebagai obat tradisional, terutama akar atau rizomanya, untuk mengobati sakit perut, sakit kepala, dan mengurangi rasa pegal. Rimpang ini diketahui mengandung alkaloid, saponin, flavonoid, dan polifenol di samping minyak atsiri, telah dimanfaatkan sebagai antiinflamasi, antiulserasi, antioksidan, dan antimikroba (Somchit & Shukriyah 2005). Penelitian mengenai aktivitas antioksidan dari ekstrak metanol dan minyak atsiri lempuyang gajah telah dilakukan sebelumnya. Dyatmiko (2005) membandingkan aktivitas antioksidan kedua ekstrak tersebut menggunakan metode difenilpikrilhidrazil (DPPH) dan bioaktivitas antiperoksida lipid dalam sistem homogenat hepar dan kultur hepatosit tikus. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak metanol memiliki aktivitas lebih tinggi daripada minyak atsiri pada ketiga metode uji dan konsentrasi aktif bahan uji berturut-turut dari yang terbesar adalah sistem kultur hepatosit tikus, homogenat hati tikus, dan DPPH. Beragamnya senyawa, matriks, dan kandungan senyawa fitokimia yang kompleks pada ekstrak tumbuhan mengakibatkan aktivitas antioksidan dari ekstrak etanol dan minyak atsiri lempuyang gajah penting untuk diperiksa dengan lebih dari satu macam metode. Metode yang dipilih pada penelitian ini ialah pengukuran aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH, feritiosianat (FTC), dan reduksi serium (CR). Uji banding ketiga metode tersebut penting agar aktivitas tiap sampel berdasarkan reaksinya terhadap

masing-masing pereaksi dapat diamati. Upaya membandingkan metode tersebut dilakukan agar diketahui hasil terbaik untuk mengukur aktivitas antioksidan dari ekstrak etanol dan minyak atsirinya. Profil aktivitas tiap sampel yang didapatkan dari ketiga metode dibandingkan untuk melihat potensi antioksidannya terhadap radikal bebas, berturutturut berdasarkan parameter penghambatan peroksidasi lemak, penangkapan radikal bebas, dan kapasitas reduksi antioksidan.

TINJAUAN PUSTAKA
Lempuyang Gajah Lempuyang gajah yang dikenal sebagai Zingiber zerumbet di Indonesia termasuk ke dalam divisi Spermatophyta, subdivisi Angiospermae, kelas Monocotyledonae, ordo Zingiberales, famili Zingibereceae, genus Zingiber, dan spesies zerumbet. Bagian dari tumbuhan ini adalah daun, batang, bunga, dan rizoma (Gambar 1). Bagian yang paling sering dimanfaatkan adalah rizoma. Bagian rizoma inilah yang digunakan pada penelitian ini. Rizoma lempuyang gajah memiliki kandungan metabolit sekunder seperti alkaloid, saponin, flavonoid, polifenol, dan terpenoid yang kaya dalam kandungan minyak atsiri.

Gambar 1 Tanaman lempuyang gajah. Minyak Atsiri Minyak atsiri adalah komponen minyak yang mudah menguap dan diperoleh dari tanaman dengan cara penyulingan uap (Guenther 1988). Minyak atsiri dapat dihasilkan dari setiap bagian tanaman seperti daun, bunga, buah, biji, batang, kulit, dan akar. Komponen minyak atsiri digolongkan menjadi 4 kelompok besar yang dominan menentukan sifat minyak atsiri, yaitu terpena yang berhubungan dengan isoprena dan iso-

pentena, senyawa berantai lurus yang tidak mengandung rantai cabang, turunan benzena, dan bermacam-macam senyawa kimia lainnya. Beberapa senyawa mengandung nitrogen dan belerang. Distilasi Minyak Atsiri Distilasi adalah proses pemurnian atau pemisahan cairan dengan penguapan kemudian uapnya dikondensasikan (Atkins 1999). Distilasi minyak atsiri adalah ekstraksi minyak atsiri dari tanaman penghasil minyak atsiri dengan bantuan uap air (Guenther 1988). Uap yang dihasilkan selanjutnya dikondensasi sehingga menjadi cairan berair dan minyak atsiri yang selanjutnya dapat dipisahkan karena keduanya memisah menjadi dua fase pada wadah penampung kondensat, yaitu fase air dan fase minyak. Metode distilasi minyak atsiri terbagi menjadi distilasi air, distilasi air dan uap, dan distilasi uap (Risfaheri et al. 1997). Distilasiair dapat disebut perebusan karena sampel dan air dipanaskan dalam satu wadah. Cara ini cukup praktis dan cocok untuk sampel yang berbentuk bubuk (akar, kulit, dan kayu) (Guenther 1988). Radas distilasi-air minyak atsiri lempuyang gajah dapat dilihat pada Gambar 2.

minyak atsiri dengan air dapat jenuh oleh minyak, terutama minyak yang bersifat larut dalam air, misalnya senyawa feniletil alkohol. Minyak Atsiri Lempuyang Gajah Minyak atsiri dari rizoma lempuyang gajah telah menjadi subjek beberapa kajian di beberapa negara Asia. Isolasi dan penentuan struktur minyak zerumbon telah dilakukan di India. Kandungan zerumbon yang tinggi (59%) ditemukan di Fiji, persentase ini lebih besar daripada di India. Hal ini menunjukkan bahwa lokasi penanaman mempengaruhi kom-ponen penyusun minyak atsiri pada rizoma, daun, dan bunga lempuyang gajah (Chane-Ming et al. 2003). Minyak atsiri lempuyang gajah didapatkan dengan berbagai cara, yaitu ekstraksi atau distilasi. Antioksidan Antioksidan merupakan zat yang mampu memperlambat atau mencegah proses oksidasi (Schuler 1990). Halliwel (1995) menyebutkan bahwa antioksidan adalah zat yang secara nyata mampu memperlambat atau menghambat oksidasi zat yang mudah teroksidasi meskipun dalam konsentrasi rendah. Antioksidan juga sesuai didefinisikan sebagai senyawa-senyawa yang melindungi sel dari efek berbahaya radikal bebas oksigen reaktif jika berkaitan dengan penyakit. Antioksidan lainnya banyak ditemukan dalam bahan pangan, antara lain vitamin E, vitamin C, dan karotenoid. Penggolongan Antioksidan Ada dua macam antioksidan berdasarkan sumbernya, yaitu antioksidan alami yang berasal dari tumbuhan dan antioksidan sintetik. Antioksidan alami biasanya lebih diminati, karena tingkat keamanan yang lebih baik dan manfaatnya yang luas di bidang makanan, kesehatan, dan kosmetik. Berdasarkan cara kerjanya, antioksidan dibedakan menjadi antioksidan primer yang dapat bereaksi dengan radikal bebas atau mengubahnya menjadi produk yang stabil, serta antioksidan sekunder atau antioksidan preventif yang dapat mengurangi laju awal reaksi rantai (Gordon 1994). Mekanisme kerja antioksidan selular menurut Ong et al. (1995) antara lain, antioksidan yang berinteraksi langsung dengan oksidan, radikal bebas, atau oksigen tunggal; mencegah pembentukan jenis oksigen reaktif; mengubah jenis oksigen reaktif menjadi kurang toksik; mencegah ke-

Gambar 2 Radas distilasi-air minyak atsiri lempuyang gajah. Metode distilasi-air memungkinkan bahan yang akan disuling kontak langsung dengan air mendidih. Bahan juga dapat bergerak bebas dalam air mendidih. Beberapa peristiwa dapat terjadi selama hidrodistilasi, misalnya difusi minyak atsiri dan air panas melalui membran tanaman (hidrodifusi), hidrolisis beberapa komponen minyak atsiri, dan dekomposisi yang biasanya disebabkan oleh panas (Guenther 1988) Air berfungsi untuk menambah kecepatan penguapan minyak. Hal ini membuat sistem penyulingan dengan air lebih unggul daripada penyulingan uap. Umumnya sebagian besar minyak atsiri sedikit larut dalam air. Hal ini penting pada distilasi-air karena campuran

mampuan oksigen reaktif; dan memperbaiki kerusakan yang timbul. Uji Aktivitas Antioksidan Uji aktivitas antioksidan dilakukan pada sampel yang diduga memiliki bioaktivitas sebagai antioksidan, dan dapat dilakukan dengan beberapa metode uji. Metode uji yang dipilih untuk melihat aktivitas antioksidan lempuyang gajah, yaitu metode DPPH, metode FTC, dan metode CR. Ketiga metode tersebut menggunakan spektrofotometer ultraviolet-tampak (UV-Vis): metode pengukuran yang didasarkan pada penyerapan sinar ultraviolet atau sinar tampak pada panjang gelombang tertentu. Metode FTC Pengukuran aktivitas antioksidan menggunakan metode FTC. Metode ini didasarkan pada kemampuan senyawa antioksidan dalam menghambat terbentuknya radikal yang reaktif. Pembentukan radikal bebas disebabkan oleh oksidasi asam linoleat. Oksidasi lipid sering disebut autooksidasi karena reaksi tetap berlangsung walaupun tidak ada zat pengoksidasi. Reaksi terbagi menjadi tiga tahap yaitu inisiasi, propagasi, dan terminasi (Wong 1989). Inisiasi adalah pembentukan radikal bebas akibat reaksi antara inisiator (I) dan asam lemak bebas. Tahap propagasi dengan cepat menghasilkan radikal peroksida (ROO), hidroperoksida (ROOH), dan radikal asam lemak (R). Selanjutnya adalah tahap terminasi, yaitu tahap akhir oksidasi yang ditandai dengan terbentuknya produk-produk non-radikal seperti aldehida, keton, alkohol, dan asam-asam dengan ciri-ciri beraroma tengik (Winarno 1989). Hasil oksidasi asam linoleat adalah senyawa malonaldehida dan radikal peroksida yang reaktif. Radikal bebas yang terbentuk akan berubah menjadi senyawa karbonil, yaitu aldehida dan keton. Oksidasi asam linoleat membentuk malonaldehida merupakan indikasi adanya oksidasi lemak (Fardiaz 1996). Selain itu, asam linoleat yang mengalami kerusakan akan menghasilkan senyawaan peroksida yang sangat reaktif dan bersifat radikal bebas. Penambahan antioksidan menyebabkan oksidasi asam linoleat terhenti (Schulz 1985). Mekanisme reaksi peroksidasi lemak (Benson 1990) ditunjukkan sebagai berikut: RH + I R + H + I Inisiasi

R + O2 ROO ROO + RH ROOH + R ROO + ROO ROOR + O2 R + R RR ROO + R ROOR

Propagasi

Terminasi

Aktivitas antioksidan yang ditentukan dengan metode FTC membutuhkan suatu kontrol positif, pembanding ini biasanya merupakan senyawa yang telah diketahui sifat antioksidannya, seperti vitamin C, butil hidroksi toluena (BHT), atau tokoferol. Oksidasi asam linoleat dalam kondisi bufer yang diinkubasi pada suhu 37 C menggunakan FeCl2 dan amonium tiosianat sebagai pereaksi. Oksidator dapat mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ sehingga menghasilkan warna merah darah yang menyerap sinar tampak pada panjang gelombang 500 nm. Intensitas warna dinyatakan sebagai nilai absorbans dengan pengukuran menggunakan spektrofotometer. Peroksida lemak meningkatkan bilangan oksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ yang kemudian bereaksi dengan ligan SCN- membentuk kompleks bewarna merah darah [Fe(SCN)6]3:
-C=C-C-CO-O -C-CO-O Fe3+ + 6SCN+ Fe2+ + 2H+ -C-COH OH + Fe3+

Me Metode DPPH Perubahan warna ungu DPPH menjadi ungu kemerahan dimanfaatkan untuk mengetahui aktivitas senyawa antioksidan. Metode ini menggunakan kontrol positif sebagai pembanding untuk mengetahui aktivitas antioksidan sampel. Kontrol positif ini dapat berupa tokoferol, BHT, dan vitamin C. Uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH menggunakan 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) sebagai radikal bebas. Prinsipnya adalah reaksi penangkapan hidrogen oleh DPPH dari senyawa antioksidan, misalnya troloks, yang mengubahnya menjadi 1,1difenil-2-pikrilhidrazin (Ohtani et al. 2000). Reaksi penangkapan hidrogen dari senyawa antioksidan (troloks) oleh DPPH ditunjukkan sebagai berikut:

[Fe (SCN)6]3(merah darah)

minyak atsiri rizoma lempuyang gajah meliputi uji aktivitas antioksidannya dengan metode DPPH, metode FTC, dan metode CR. Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode FTC (Kikuzaki & Nakatani 1993) Ekstrak etanol dan minyak atsiri lempuyang gajah dan -tokoferol diuji aktivitas antioksidannya dalam emulsi. Sebanyak 1 ml ekstrak etanol lempuyang gajah dilarutkan dalam emulsi 1 ml asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.5%, 1 ml bufer fosfat 0.1 M pH 7.4, dan 1 ml air bebas ion. Bahan yang telah dicampurkan secara berurutan kemudian diinkubasi pada suhu 37 C, lalu diambil sebanyak 50 l, ditambahkan 6 ml etanol 75%, 50 l amonium tiosianat 30%, dan 3 menit sebelum diukur serapannya, ditambahkan FeCl24H2O mM dalam HCl 3.5%. Serapan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 500 nm. Daya penghambatan oksidasi asam linoleat, yang dinyatakan dengan persen inhibisi, memiliki perhitungan sebagai berikut: % inhibisi = Ao-AI Ao 100%

Metode CR Larutan Ce(IV) sulfat yang diberikan pada sampel akan menyerang senyawa antioksidan. Senyawa antioksidan dapat berperan sebagai pemindah elektron, maka perusakan struktur oleh elektron reaktif yang berasal dari oksidator kuat seperti Ce(IV) tidak terjadi. Metode ini berdasarkan spektrofotometri yang pengukurannya dilakukan pada panjang gelombang 320 nm. Panjang gelombang ini digunakan untuk mengukur Ce(IV) yang tidak bereaksi dengan kuersetin dan senyawa flavonoid lain. Kapasitas reduksi Ce(IV) pada sampel yang diukur konsentrasi dan pH larutan yang sesuai membuat Ce(IV) hanya mengoksidasi antioksidan, dan bukan senyawa organik lain yang mungkin teroksidasi (Ozyurt et al. 2005). Hal ini membuat penentuan panjang gelombang maksimum dan nilai pH larutan penting untuk diketahui dan dijaga selama pengukuran agar tidak terjadi pergeseran panjang gelombang selama pengukuran.

Ao = absorbans blanko AI = absorbans sampel Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH (Ohtani et al. 2000) Sebanyak 1 ml ekstrak etanol dan minyak atsiri lempuyang gajah dan -tokoferol ditambahkan 4 ml metanol dan larutan DPPH 1 mM dalam metanol sebanyak 1 ml. Campuran kemudian dikocok dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 C. Setelah 30 menit, serapannya diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 515 nm. Kemampuan antioksidan dinyatakan dengan persen penangkapan radikal: % penangkapan radikal = Ao = absorbans blanko AI = absorbans sampel Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode Reduksi Serium (Ozyurt et al. 2005) Ao-AI Ao 100%

BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan adalah ekstrak etanol dan minyak atsiri lempuyang gajah, asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%, buffer fosfat 0.1 M pH 7.4, air bebas ion, etanol 75%, amonium tiosianat 30%, FeCl24H2O 20 mM dalam HCL 3.5%, H2SO4 98% larutan DPPH 1 mM dalam metanol, larutan Ce(IV) sulfat tetrahidrat, etanol 70%, dan -tokoferol. Alat-alat yang digunakan adalah spektrofotometer UV-Vis, penguap vakum, oven, inkubator, pH-meter, radas distilasi-air, dan alat-alat kaca. Metode Diagram alir penelitian ini dapat dilihat secara garis besar pada Lampiran 1. Analisis yang dilakukan pada ekstrak etanol dan

Sebanyak 1 ml larutan Ce(IV) sulfat 210-3 M ditambahkan ke dalam 1 ml ekstrak etanol dan minyak atsiri lempuyang gajah dan -tokoferol, campuran kemudian diencerkan hingga 10 ml dengan air bebas ion. Setelah dikocok beberapa menit, campuran larutan dibiarkan selama 30 menit pada suhu kamar. Absorbans dari campuran reaksi diukur pada 320 nm dengan air bebas ion sebagai blanko. Dengan cara yang sama, 1 ml ekstrak etanol dan minyak atsiri lempuyang gajah direaksikan dengan 1 ml larutan Ce(IV) sulfat 210-3 M kemudian diencerkan hingga 10 ml untuk ditentukan aktivitas antioksidannya. Kemampuan antioksidan dinyatakan dengan persen kapasitas reduksi, dengan perhitungan sebagai berikut: % kapasitas reduksi = Ao = absorbans blanko AI = absorbans sampel HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi dan Fitokimia Simplisia lempuyang gajah dibuat dari rizoma segar. Kulit rizoma dikupas secara hati-hati agar tidak mengurangi kandungan minyak atsiri yang terdapat di dalamnya. Selsel yang mengandung minyak atsiri terdapat di bawah jaringan kulit sehingga bila pengupasan tidak dilakukan secara benar, selsel tersebut dapat terbuang atau rusak (Risfaheri et al. 1997). Rimpang basah yang telah dikupas selanjutnya dikeringkan dan ditentukan kadar airnya (Lampiran 2). Rerata kadar air simplisia didapatkan sebesar 12.48% (Lampiran 3). Pengeringan merupakan proses pengurangan kadar air sampai batas terbaik, yaitu 8-10%, karena pada tingkat kadar air tersebut, sampel terhindar dari pencemaran yang disebabkan oleh jamur, bakteri dan insekstisida (Hernani & Mulyono 1997). Pengeringan hanya dilakukan di suhu kamar agar senyawa-senyawa yang mudah menguap akan teruapkan lebih sedikit daripada jika menggunakan suhu tinggi. Minyak atsiri terdiri dari persenyawaan kimia yang mudah menguap, termasuk golongan hidrokarbon asiklik dan siklik serta turunan hidrokarbon yang telah mengikat oksigen, maka pengeringannya lebih baik dilakukan pada suhu yang rendah (Guenther 1988) Ao-AI Ao 100%

Ekstraksi lempuyang gajah dengan etanol 70% secara Soxhlet dan distilasi minyak atsiri dilakukan dengan metode yang terdapat pada Lampiran 2 menghasilkan rendemen berturutturut sebesar 5.69%. dan 5.15% berdasarkan bobot sampel kering. Hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa sampel mengandung flavonoid, triterpenoid, saponin, tanin, dan kuinon (Lampiran 3). Hasil soxhletasi dengan pelarut etanol 70% menunjukkan hasil yang sama dengan kandungan fitokimia sampel kecuali tidak terdapat lagi triterpenoid dalam ekstrak. Triterpenoid adalah senyawa yang kerangka karbonnya berasal dari enam satuan isoprena dan secara biosintesik diturunkan dari hidrokarbon C30 asiklik (Harborne 1987). Struktur ini mengakibatkan triterpenoid lebih bersifat lipofili sehingga menurunkan interaksinya dengan pelarut etanol 70%, dan karena itu, tidak terekstraksi. Aktivitas Antioksidan Menurut Metode FTC Hasil pengukuran persen inhibisi ekstrak etanol dan minyak atsiri lempuyang gajah dan -tokoferol sebagai kontrol positif memperlihatkan bahwa kenaikan konsentrasi tokoferol, akan memperbesar kemampuannya menghambat oksidasi asam linoleat dalam masa inkubasi 24 jam pada suhu 37 C (Gambar 3).
14 12 10 % Inhibis i 8 6 4 2 0 100 Konsentrasi (ppm) 200

Tokoferol

Ekstrak etanol

Minyak atsiri

Gambar 3 Aktivitas antioksidan ekstrak etanol dan minyak atsiri lempuyang gajah, dan tokoferol dengan metode FTC. Suatu senyawa antioksidan akan mencegah terjadinya oksidasi senyawa yang mudah sekali teroksidasi seperti lemak, minyak, asam lemak, dan anggota lipid lainnya (Schulz 1985). Radikal bebas dapat terbentuk dari oksidasi asam linoleat akibat proses inkubasi pada suhu 37 C. Hal ini

membuat asam lemak akan berubah menjadi lemak peroksida yang selanjutnya mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+. Kation besi yang mengalami kenaikan bilangan oksidasi akan bereaksi spesifik dengan amonium tiosianat membentuk warna merah darah. Kemampuan antioksidan menghambat oksidasi ditunjukkan dengan sedikitnya Fe2+ yang teroksidasi oleh peroksida asam linoleat menjadi Fe3+. Hal ini akan menurunkan nilai absorbans hasil pengukuran spektrofotometer pada panjang gelombang 500 nm. -Tokoferol pada konsentrasi 100 dan 200 ppm mampu menghambat oksidasi lemak sebesar 5.72% dan 7.48% (Lampiran 4). Vitamin E berfungsi sebagai pemutus rantai peroksidasi lemak dengan menyumbangkan ion hidrogen ke dalam reaksi sehingga menurunkan kadar lemak peroksida darah (Hariyatmi 2004). Mekanisme kerja vitamin E dalam mendonorkan ion hidrogen untuk mengurangi asam linoleat yang teroksidasi akibat pemanasan (Frankel 1998). Ozgur et al. (2005) menentukan aktivitas antioksidan -tokoferol, menggunakan asam linoleat (berdasarkan metode penentuan karoten-asam linoleat dari Dapkevicius et al. 1998). Hasil dari penelitian tersebut, yaitu pada konsentrasi 2000 ppm, -tokoferol menunjukkan persen inhibisi sebesar 96.6%. -Tokoferol secara teoritis, dapat menunjukkan aktivitas yang tinggi menurut metode FTC karena sifatnya yang larut dalam lemak (Dewick 1995) sehingga memungkinkannya untuk mencegah peroksidasi asam linoleat dengan persen inhibisi yang tinggi, namun metode FTC pada penelitian ini menunjukkan hasil yang kurang sesuai. Hal ini dapat dikarenakan kondisi asam linoleat yang kurang murni pada saat digunakan. Ekstrak etanol konsentrasi 100 dan 200 ppm mampu menghambat peroksidasi asam linoleat berturut-turut sebesar 2.03% dan 3.33% (Lampiran 4). Autooksidasi lipid yang merupakan reaksi beruntun radikal bebas dihambat oleh substansi yang mampu mendeaktivasi radikal bebas dengan menghentikan reaksinya pada tahap terminasi. Ekstrak etanol lempuyang gajah menurut uji fitokimia pada penelitian ini memberikan hasil positif untuk keberadaan flavonoid (senyawa fenolik), kuinon, tanin, dan saponin. Metabolit sekunder yang terekstraksi dengan etanol 70% memberikan aktivitas antioksidan yang lebih rendah dibandingkan dengan -tokoferol dan minyak atsiri. Substansi fenolik yang terdapat dalam ekstrak, terutama turunan pirokatekol, hidro-

kuinon, dan fenol tersubtitusi para atau orto bereaksi dengan radikal bebas lipid membentuk radikal antioksidan bebas yang cenderung stabil dan tidak lagi mampu menginisiasi autooksidasi lipid (Wong 1989). Minyak atsiri memberikan nilai penghambatan oksidasi asam linoleat terbesar dibandingkan dengan -tokoferol dan ekstrak etanol. Konsentrasi 100 ppm dan 200 ppm mampu menghambat peroksidasi asam linoleat sebesar 6.92% dan 10.32% (Lampiran 4). Keberadaan antioksidan membuat oksidasi lemak berjalan dengan lambat. Keadaan ini akan proporsional dengan jumlah antioksidan yang ada (Wong 1989). Aktivitas Antioksidan Menurut Metode DPPH Aktivitas pemulungan radikal bebas DPPH oleh antioksidan menunjukkan bahwa -tokoferol memiliki aktivitas antioksidan tertinggi dibandingkan dengan ekstrak etanol dan minyak atsiri. Kemampuan penangkapan radikal DPPH oleh suatu antioksidan dinyatakan dengan nilai persen penangkapan radikal. Nilai yang semakin tinggi menunjukkan bahwa sampel senyawa yang diduga memang berpotensi sebagai antioksidan. Pembentukan 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil ditandai dengan memudarnya warna ungu pekat pada DPPH menjadi kuning. Kurva hubungan antara konsentrasi dan persen penangkapan radikal tokoferol pada menunjukkan absorbans yang konstan mulai dari tokoferol dengan konsentrasi 100 ppm (Gambar 4). Warna kuning sudah terbentuk pada konsentrasi tersebut sampai dengan 1000 ppm. Hal ini menunjukkan bahwa tokoferol memang memiliki kemampuan menangkap radikal bebas yang potensial. Blois (1958 dalam Hanani et al. 2005) menyatakan bahwa suatu ekstrak dianggap memiliki aktivitas antioksidan yang kuat apabila memilki IC50 (inhibition concentration 50) kurang dari 200 ppm. Ozgur et al. (2005) menentukan aktivitas antioksidan -tokoferol, menggunakan DPPH (berdasarkan metode penentuan Burits &Bucar 2000 dan Cuendet et al. 1997). Hasil dari penelitian tersebut, tokoferol menunjukkan nilai IC50 sebesar 6.50 ppm. Fungsi -tokoferol sebagai antioksidan menyumbang atom H pada radikal bebas sehingga spesies yang reaktif ini menjadi stabil, dan fungsi ini bekerja baik pada metode DPPH. -Tokoferol pada konsentrasi 100 ppm saja telah menangkap radikal DPPH

sebanyak 95.01% (Lampiran 4). Persentase penang-kapan radikal hampir mendekati 100%. Ekstrak etanol memiliki kemampuan menangkap radikal bebas DPPH yang semakin besar dengan meningkatnya konsentrasi ekstrak (kurva logaritmik pada Gambar 4). Uji fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak ini mengandung senyawa flavonoid. Flavonoid memiliki atom H yang dapat ditangkap oleh radikal DPPH. Flavonoid merupakan antioksidan jenis pengikat logam yang mampu mengikat oksidator seperti Fe3+ dan Cu2+. Ekstrak etanol bukan antioksidan kuat seperti tokoferol, karena pada konsentrasi 200 ppm, persen penangkapan radikalnya hanya mencapai 11.30% (Lampiran 4). Kurva hubungan antara konsentrasi dan persen penangkapan radikal minyak atsiri menunjukkan kurva logaritma yang hampir datar (Gambar 4). Hal ini berarti, tidak ada ke-naikan kemampuan menangkap radikal bebas yang signifikan dengan penambahan konsen-trasi ekstrak. Pola kurva yang hampir datar menunjukkan minyak atsiri tidak potensial sebagai antioksidan berdasarkan metode DPPH. Hal ini diperkuat oleh nilai R2 yang sangat rendah, yaitu 0.5645 dibandingkan dengan tokoferol dan ekstrak etanol, berturut-turut 0.7821 dan 0.7055 (Gambar 4).

seskuiterpena. Monoterpena sederhana tersebar luas dan cenderung merupakan bagian dari kebanyakan minyak atsiri (Harborne 1987). Zat inilah yang menyebabkan wangi harum yang khas pada rizoma lempuyang gajah. Aktivitas Antioksidan Menurut Metode Reduksi Serium Mekanisme kerja metode ini ialah dengan mereaksikan Ce(IV) yang merupakan oksidator kuat untuk mengoksidasi senyawa antioksidan. Spektrofotometri digunakan untuk penentuan kapasitas antioksidan yang murah, peka, dan dapat diaplikasikan untuk berbagai jenis sampel (Ozyurt et al. 2005). Kapasitas antioksidan diukur berdasarkan total fenol pada sampel tumbuhan. Fenol yang terkandung di dalam sampel dioksidasi oleh serium bervalensi empat (tetravalen). Suatu sampel dikatakan berpotensi sebagai antioksidan apabila serapannya pada sinar UV semakin menurun, karena Ce(IV) yang tidak tereduksi akan menyerap sinar UV yang berasal dari sumber radiasi pada spektrofotometer. Kemampuan serium mereduksi suatu antioksidan dinyatakan dengan nilai persen kapasitas reduksi. Persentase reduksi yang semakin tinggi menunjukkan bahwa senyawa yang diduga memang berpotensi sebagai antioksidan. Pengukuran ini dilakukan pada panjang gelombang 320 nm, yaitu panjang gelombang ketika Ce(IV) memberikan serapan maksimum (Lampiran 5). Selain penentuan panjang gelombang maksimum, dilakukan juga pengukuran pH dari larutan Ce(IV) sulfat. Hal ini berguna agar keasaman larutan pada panjang gelombang diketahui dan dapat dijaga konstan, karena perubahan nilai pH selama pengukuran, menimbulkan terjadinya pergeseran panjang gelombang. pH Larutan Ce(IV) sulfat dengan konsentrasi 210-3 M dari hasil pengukuran adalah 0.51 (Lampiran 5). Konsentrasi dan pH larutan yang sesuai membuat Ce(IV) hanya mengoksidasi antioksidan, dan bukan senyawa organik lain yang mungkin teroksidasi (Ozyurt et al. 2005). -Tokoferol memiliki kapasitas reduksi tertinggi dibandingkan dengan ekstrak etanol dan minyak atsiri lempuyang gajah. Hal ini ditunjukkan dengan kurva kapasitas reduksinya yang berada di atas kurva kapasitas reduksi ekstrak etanol maupun minyak atsiri (Gambar 5). Minyak atsiri memperlihatkan kurva kapasitas reduksi yang tidak sesuai dengan pola kurva senyawa antioksidan. Hal

100 % Penangk apan radik al y = 15.486ln(x) + 2.9324 R 2 = 0.7821 80

60 y = 7.509ln(x) - 21.196 R 2 = 0.7055

40

20

y = 2.0928ln(x) - 6.9901 R 2 = 0.5645

0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 Konsentrasi (ppm) Tokoferol Log. (Tokoferol) Ekstrak etanol Log. (Ekstrak etanol) Minyak atsiri Log. (Minyak atsiri)

Gambar 4 Aktivitas antioksidan ekstrak etanol dan minyak atsiri lempuyang gajah, dan tokoferol dengan metode DPPH. Kurva yang semakin melengkung akan memberikan nilai R2 yang semakin besar, dan hal ini menunjukkan potensi sebagai antioksidan yang semakin besar pada suatu sampel. Metabolit sekunder dari lempuyang gajah yang terkandung pada minyak atsirinya sebagian besar adalah monoterpena dan

ini juga ditegaskan dengan nilai R2 tokoferol, ekstrak etanol, dan minyak atsiri yang nilainya berturut-turut 0.8596, 0.9124, dan 0.0926 (Gambar 5).
100 y = 18.613ln(x) - 48.85 R 2 = 0.8596 % Kapas itas reduk s i 80 y = 16.739ln(x) - 43.971 R 2 = 0.9124 y = -5.9308ln(x) + 93.921 R 2 = 0.0926

60

40

20

0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 Konsentrasi (ppm) Ekstrak etanol Log. (Ekstrak etanol)

Tokoferol Log. (Tokoferol)

Minyak atsiri Log. (Minyak atsiri)

Gambar 5 Aktivitas antioksidan ekstrak etanol dan minyak atsiri lempuyang gajah, dan tokoferol dengan metode reduksi serium. Nilai R2 yang semakin tinggi, menunjukkan bahwa sampel semakin mengikuti pola senyawa antioksidan yang berbentuk logaritmik, yaitu terjadi kenaikan kapasitas reduksi dengan bertambahnya konsentrasi antioksidan pada konsentrasi tertentu menjadi konstan. Perbandingan Metode Pengukuran Aktivitas Antioksidan Ekstrak metanol rimpang lempuyang gajah mempunyai aktivitas antioksidan yang lebih besar dari minyak atsirinya pada metode DPPH dan bioaktivitas antiperoksida lipid dalam sistem homogenat hepar dan kultur hepatosit tikus berdasarkan penelitian Dyatmiko (2005). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol memiliki aktivitas yang lebih besar dari minyak atsiri pada metode DPPH dan CR dan lebih kecil dari minyak atsiri pada metode FTC. Hasil antiperoksida lipid FTC pada penelitian ini tidak sesuai dengan hasil pengukuran Dyatmiko yang menggunakan media homogenat hati dan kultur hepatosit tikus. Hal ini dapat dikarenakan perbedaan kondisi percobaan, mekipun keduanya menggunakan parameter penghambatan peroksidasi lemak oleh antioksidan. Konsentrasi aktif bahan uji berturut-turut dari yang terbesar adalah pada sistem hepatosit tikus, homogenat hati tikus, dan DPPH, hal ini menunjukkan bahwa metode DPPH lebih peka dibandingkan dengan kedua

metode lainnya dalam mengukur aktivitas antioksidan ekstrak metanol dan minyak atsiri lempuyang gajah menurut Dyatmiko (2005). Penelitian ini menunjukkan hasil yang sesuai dengan penelitian Dyatmiko, karena ekstrak etanol memiliki nilai persen penangkapan radikal yang lebih besar pada metode DPPH, daripada persen inhibisi pada metode FTC (Lampiran 6). Namun, hasil kurang sesuai pada minyak atsiri, karena nilai persen inhibisinya lebih besar pada metode FTC, daripada persen penangkapan radikal pada metode DPPH (Lampiran 6). Penentuan aktivitas antioksidan ekstrak tumbuhan yang dilakukan dengan metode yang berbeda memberikan hasil yang acak, sulit untuk dibandingkan, dan terkadang menimbulkan ketidakcocokan (Koleva et al. 2002). Pengukuran aktivitas antioksidan tokoferol, ekstrak etanol, dan minyak atsiri lempuyang gajah dalam penelitian ini menggunakan tiga metode, yaitu metode FTC, DPPH, dan CR. Penelitian ini menggunakan uji statistik, yaitu uji F dan t, digunakan untuk membandingkan ketiga metode tersebut. -Tokoferol dipilih sebagai kontrol positif pada setiap metode uji karena menurut Lehninger (1990) dan Dutta-Roy et al. (1994), inilah bentuk vitamin E yang paling aktif, berdasarkan penelitian pada mencit dan anak ayam. Kelipofiliannya membuat antioksidan ini sangat sesuai apabila diukur dengan metode FTC. -Tokoferol yang digunakan pada penelitian ini merupakan senyawa dengan kemurnian 98%. Hasil uji F -tokoferol pada Tabel 1 menunjukkan perbandingan FTC-DPPH memiliki nilai p yang lebih besar dari (0.05), yaitu 0.08. Hal ini berarti kedua metode tersebut tidak berbeda nyata. Nilai p yang lebih rendah dari , terjadi pada perbandingan FTC-CR dan DPPH-CR untuk -tokoferol, yaitu 0.02 dan 8.7610-5. Hal tersebut menunjukkan bahwa keragamannya berbeda nyata. Hasil uji t ketiga perbandingan yang memiliki nilai p yang kurang dari 0.05, yang menunjukkan bahwa nilai rataannya berbeda nyata (Tabel 1). -Tokoferol menunjukkan aktivitas antioksidan pada ketiga metode karena senyawa ini memiliki atom H yang dapat ditangkap oleh radikal bebas DPPH, mereduksi serium, dan keliofiliannya memudahkannya berinteraksi kuat dengan asam linoleat sehingga dapat mencegah oksidasi dari asam linoleat. Nilai simpangan baku relatif (SBR) pengukuran tokoferol dengan metode FTC, DPPH, dan CR berturut-turut adalah 4.60,

0.13, dan 2.98 (Lampiran 6). Hal ini menunjukkan pengukurannya berturut-turut cukup teliti, sangat teliti, dan cukup teliti. SBR berguna sebagai parameter presisi atau ketelitian. Presisi merupakan ukuran kedekatan suatu hasil pengukuran yang satu dengan yang lainnya (SAC-SINGLAS 2002). Nilai aktivitas antioksidan pada FTC, DPPH, dan CR dianggap berdekatan antarulangan. Hal ini berdasarkan ketentuan AOAC (1998) bahwa suatu nilai pengukuran pada metode dan kondisi yang sama dianggap sangat teliti apabila SBR dibawah 1%, teliti untuk 1-2%, sedang atau cukup teliti untuk 2-5%, dan tidak teliti untuk di atas 5%. Hasil uji F ekstrak etanol pada Tabel 1 menunjukkan bahwa keragaman aktivitas antioksidan tidak berbeda nyata antara ketiga metode. Hal ini ditunjukkan dengan nilai p yang lebih tinggi dari (0.05), yaitu 0.82, 0.57, dan 0.43. Nilai rataan yang berbeda nyata terjadi pada hasil uji t, karena nilai p pada ketiga perbandingan kurang dari 0.05 (Tabel 1). Metode reduksi serium dapat menggantikan metode DPPH untuk ekstrak etanol, meskipun pada kedua metode, ekstrak etanol terlihat berpotensi sebagai antioksidan dan keragamannya berbeda nyata. Hal ini karena rataan dari kedua pengukuran berbeda nyata. Kandungan senyawa fenolik (terutama flavonoid) membuat ekstrak etanol memberikan hasil yang baik pada pengukuran dengan metode CR dan DPPH. Kemampuannya menangkap radikal DPPH dan mereduksi Ce(IV) dikarenakan atom H yang dimilikinya. Aktivitas antioksidanya yang rendah pada metode FTC dapat disebabkan kehidrofiliannya sehingga sulit untuk menyatu dengan asam linoleat. Hal ini membuatnya sulit untuk menghambat oksidasi asam linoleat. Nilai SBR untuk pengukuran ekstrak etanol dengan metode FTC, DPPH, dan reduksi serium berturut-turut adalah 6.70, 2.23, dan 0.32 (Lampiran 6). Disimpulkan bahwa nilai aktivitas antioksidan berturutturut adalah tidak teliti, cukup teliti, dan sangat teliti. Minyak atsiri yang mengandung terpenoid dan persenyawaan lainnya membuat ekstrak ini lipofili sehingga baik apabila diukur menggunakan metode FTC. Minyak atsiri memiliki atom hidrogen pada strukturnya yang memungkinkan untuk menangkap radikal pada DPPH dan mengalami oksidasi akibat oksidator kuat seperti Ce(IV) sulfat. Hasil uji F pada Tabel 1 menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan

minyak atsiri tidak berbeda nyata pada perbandingan FTC-DPPH dan FTC-CR, dan berbeda nyata untuk DPPH-CR. Hal ini ditunjukkan dengan nilai p yang lebih rendah dari (0.05), yaitu 0.035. Nilai yang berbeda nyata terjadi pada hasil uji t karena nilai p pada perbandingan FTC-DPPH, FTC-CR, dan DPPH-CR, seluruhnya berada di bawah nilai 0.05 (Tabel 1). Tabel 1 Data uji F dan uji t perbandingan metode p Sampel Metode Fhit thit -Tokoferol FTC-DPPH 0.08 1.3810-10 FTC-CR 0.02 1.2810-7 -5 1.5210-7 DPPH-CR 8.7610 Ekstrak etanol FTC-DPPH FTC-CR DPPH-CR FTC-DPPH FTC-CR DPPH-CR 0.82 0.57 0.43 0.35 0.19 0.04 2.0010-6 3.7510-10 9.4210-10 2.6710-7 5.9410-10 4.9710-11

Minyak atsiri

Sebagian konstituen minyak atsiri yang sifatnya tidak stabil membuatnya mudah terdegradasi oleh asam (Guenther 1988). Hal ini membuat aktivitas antioksidannya berbeda dari metode DPPH dan FTC karena pada metode CR pereaksinya mengandung asam sulfat pekat. Nilai SBR dari metode FTC, DPPH, dan reduksi serium berturut-turut adalah 2.03, 8.41,dan 0.50 (Lampiran 6). Disimpulkan bahwa nilai aktivitas antioksidan berturutturut cukup teliti, tidak teliti, dan sangat teliti. Pengulangan pada penelitian ini dilakukan sebanyak lima kali. Dalam batas tertentu, penggunaan satuan-satuan percobaan yang kurang homogen atau teknik-teknik yang masih kurang teliti dapat diatasi dengan menambah jumlah ulangan (Gaspersz 1991). Hal ini akan memberikan suatu populasi yang baru dengan galat percobaan yang besar. Pengulangan dilakukan untuk meningkatkan ketelitian, mengurangi panjang selang kepercayaan, dan meningkatkan kuasa uji statistika.

SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Rendemen EE dan MA yang dihasilkan berturut-turut 5.69% dan 5.15%. Flavonoid, saponin, tanin dan kuinon terdapat dalam simplisia dan ekstrak etanol, sedangkan triterpenoid hanya terdapat dalam simplisia. MA memiliki aktivitas tertinggi diikuti tokoferol dan yang terendah, EE pada metode FTC. -Tokoferol memiliki aktivitas antioksidan tertinggi, diikuti oleh EE dan yang terendah, MA pada metode CR dan DPPH. Uji t perbandingan ketiga metode berbeda nyata. Aktivitas antioksidan MA, baik diukur menggunakan FTC dan CR ketelitian yang tinggi. Metode reduksi serium dapat dipilih untuk pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak etanol karena hasil uji F tidak berbeda nyata, dan cukup teliti. Saran Analisis kandungan ekstrak etanol dan minyak atsiri diperlukan untuk mengetahui jenis senyawa yang paling berperan sebagai antioksidan dalam suatu metode uji sehingga dapat diketahui spesifikasi metode uji aktivitas antioksidan yang paling sesuai. Metode FTC baik digunakan untuk pengukuran aktivitas antioksidan minyak atsiri. Metode reduksi serium dapat dipilih untuk pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak etanol karena cukup teliti dan lebih murah dibandingkan dengan metode FTC dan DPPH.

Zingiber zerumbet Smith from Reunion Island. http://www.JEOR.net. [1 Des 2006]. Dewick PM. 1995. Medicinal Natural Products: a Biosythetic Approach. New York: John Wiley & Sons. Dutta-Roy AK et al. 1994. Vitamin E requirements, transport, and metabolism: role of a-tocopherol-binding protein. J Nut Biochem 5:562-570. Dyatmiko W. 2005. Aktivitas penangkapan radikal bebas dalam sistem molekuler dan seluler sari air rimpang tanaman obat. http://www.unair.ac.id. [1 Des 2006] Fardiaz D. 1996. Manfaat Antioksidan dan Bahan Pengawet dalam Makanan. Bogor: Fateta Institut Pertanian Bogor. Frankel EN. 1998. Lipid Oxidation. California: The Oily Press Dundee. Gaspersz V. 1991. Metode Perancangan Percobaan. Bandung: Armico. Gordon I. 1994. Functional Food, Food Design, Pharmafood. New York: Champman and Hall. Guenther E. 1988. Minyak Atsiri. Jakarta: Direktorat Perguruan Tinggi.. Halliwel B, Aeschbach R., Lolinger J, Auroma O I. 1995. Toxicology. J Food Chem 33: 601. Hanani E, Munim A, Sekarini S. 2005. Identifikasi senyawa antioksidan dalam spons Callyspongia sp dari kepulauan seribu. http://www.farmasi.ui.ac.id. [15 Feb 2007]. Harborne JB. 1987. Bandung: ITB Pr. Metode Fitokimia.

DAFTAR PUSTAKA [AOAC]. Association of Official Analytical Chemistry. 1998. AOAC Verified Methods Program. Maryland: AOAC International. Atkins PW. 1999. Kimia Fisik Jilid I. Jakarta: Erlangga. Benson EE. 1990. Free Radical Damage in Stored Plant Germplasms. Rome: International Board for Plant Genetic Resources. Chane-Ming J, Robert V, Chalcat JC. 2003. Chemical composition of the essential oil from rhizomes, leaves, and flowers of

Hariyatmi. 2004. Kemampuan vitamin E sebagai antioksidan terhadap radikal bebas pada lanjut usia. J MIPA 14:52-60. Hernani, Mulyono E. 1997. Pengolahan dan Penganekaragaman Hasil. Monograf No.3 Jahe. Bogor, Balitro. Kiendrebeogo M et al. 2005. Acute toxicity and antioxidant property of Striga

hermonthica (Del.) Bent (Scrophulariaceae). J Biotech 4:919-922. Kikuzaki H, Nakatani B. 1993. Antioxidant effect of some ginger constituent. J Food Science 58:1407-1410 Koleva II et al. 2002. Screening plant extracts for antioxidant activity: a comparative study on three testing methods. J Phytochem Anal 13:18-17. Lehninger AL. 1990. Dasar-dasar Biokimia Jilid 1. Thenawidjaja M, penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari Principles of Biochemistry. Ohtani II et al. 2000. New antioxidant from the African medicinal herb Thonginia sanguinea. J Nat Prod 63:676-679. Ong ASH, Niki E, Packer L. 1995. Nutrition, Lipids, and Desease. Illinois: AOCS Champaign Pr. Oski FA. 1980. Vitamin E-A radical defense. J Med 303:454-455. Ozgur E et al. 2005. The in vitro antioxidative prpperties of the essential oil and methanol extract of Satureja spicigera Boiss and Satureja cuneifolia ten http://www.Elsevier.com. [11 Des 2006]. Ozyurt D et al. 2005. Determination of total antioxidant capacity by a new spectrophotometric method based on Ce(IV) reducing capacity measurement. http://www.Elsevier.com. [11 Des 2006]. Risfaheri, Supriatna A, Laksmanahardja. 1997. Rancang Bangun Alat Pascapanen. Monograf No.3 Jahe. Bogor, Balitro. [SAC-SINGLAS]. Singapore Accreditation Council-Singapore Laboratory Accreditation Scheme. 2002. Method Validation for Chemical Testing. Singapore: Spring Singapore. Schuler P. 1990. Natural Antioxidant Exploited Commercially. Di dalam: Food Antioxidants. Hudson BJF, editor. New York: Elsevier Applied Science. Schulz H. 1985. Oxydation of Fatty Acids. Di dalam: Biochemistry of Lipid and

Membranes. Vance DE, Vance JE, editor. California: The Benjamin-Cummings Publishing Company, Inc. Somchit M N, Shukriyah M H. 2003. Antiinflamatory property of ethanol and water extracts of Zingiber zerumbet Smith.[terhubungberkala].http://www.Indianpharmacology.net. [1 Des 2006] Winarno FG. 1989 .Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia. Wong D. 1989. Mechanism and Theory in Food Chemistry. New York: Van Nostrand Reinhold.

LAMPIRAN

Lampiran 1 Diagram alir penelitian

Simplisia Lempuyang Gajah

Uji Fitokimia dan Kadar Air

Distilasi-air

Soxhletasi

Minyak Atsiri

Ekstrak Etanol

Uji Fitokimia

Uji Aktivitas Antioksidan

FTC

DPPH

RS

Lampiran 2 Penetapan kadar air, ekstraksi, dan uji fitokimia simplisia lempuyang gajah Penetapan kadar air Cawan dikeringkan pada suhu 105 C selama 30 menit. Setelah didinginkan sebentar pada suhu kamar, dimasukkan dalam eksikator kemudian ditimbang. Sebanyak 1 g sampel dimasukkan ke dalam cawan yang telah diketahui bobotnya kemudian dikeringkan pada suhu 105 C sampai bobot konstan. Cawan dikeluarkan dari oven lalu didinginkan sebentar pada suhu kamar dan dimasukkan ke dalam eksikator. Bobot bahan sebelum dan setelah dikeringkan dinyatakan sebagai a dan b dikeringkan. Pengulangan dilakukan sebanyak enam kali. Kadar air dapat dihitung dengan persamaan berikut: Kadar air (%) =

a b 100% a

Ektraksi Lempuyang gajah (a) Ekstraksi dengan etanol 70% secara Soxhlet Sebanyak 30 g sampel ditimbang dan 210 ml etanol 70% dimasukkan ke dalam labu Soxhlet. Bobot sampel yang telah ditimbang, dikoreksi dengan nilai kadar air. Ekstraksi menggunakan Soxhlet dilakukan selama 6 jam. Pengulangan dilakukan sebanyak tiga kali. Hasil ekstraksi disaring menggunakan kertas Whatman lalu dipekatkan menggunakan penguap putar. Ekstrak disimpan dalam wadah gelap di refrigerator. Rendemen ekstraksi dinyatakan sebagai: Rendemen (%) =

bobot ekstrak bobot sampel terkoreksi

100%

(b) Distilasi-air minyak atsiri Sebanyak 150 gram sampel dan 700 ml air dimasukkan ke dalam labu distilasi 1000 ml. Pemanasan dilakukan di atas api bunsen selama 2 jam. Uap minyak atsiri dan air yang melalui kondensor akan kembali menjadi cairan yang ditampung pada Erlenmeyer. Hasil ekstraksi dinyatakan dalam persen rendemen. Metode uji fitokimia Alkaloid Sebanyak 2 gram sampel yang akan dianalisis diekstraksi dengan sedikit kloroform, kemudian ditambahkan 10 ml kloroform-amoniak lalu disaring. Filtrat hasil penyaringan ditambahkan beberapa tetes H2SO4 2 M, kemudian dikocok hingga terbentuk dua lapisan. Lapisan asam (tak berwarna) dipipet ke dalam tabung reaksi yang lain, kemudian larutan dibagi menjadi tiga, masing-masing larutan diuji dengan beberapa tetes pereaksi Dragendorf, Mayer, dan Wagner. Uji positif apabila dihasilkan endapan berwarna jingga (Dragendorf), putih kekuningan (Mayer), dan cokelat (Wagner). Flavonoid atau senyawa fenolik Sebanyak 1 gram sampel dididihkan dalam 100 ml air suling selama 5 menit laludisaring. Filtrat diambil sebanyak 10 ml ke dalam tabung reaksi. Ditambahkan 2 ml alkohol klorhidrat (HCl 37% dan etanol 95% 1:1), 0.5 mg serbuk Mg, dan terakhir ditambahkan 2 ml amil alkohol. Uji positif apabila dihasilkan warna kuning, jingga atau merah pada lapisan amil alkoholnya.

Lanjutan lampiran 2 Steroid atau triterpenoid Sebanyak 2 g sampel yang akan dianalisis diekstraksi dengan sejumlah etanol sampai terendam keseluruhannya. Sampel kemudian dipanaskan sampai mendidih dan disaring. Filtrat diuapkan dan pada residu ditambahkan dietil eter. Fraksi dietil eter diberi pereaksi Liebermann-Buchard (3 tetes anhidrida asetat + 1 tetes H2SO4). Uji positif untuk steroid bila dihasilkan warna kehijauan dan uji positif triterpenoid apabila dihasilkan warna kemerahan atau ungu. Saponin dan tanin Sebanyak 2-4 gram contoh diekstraksi dengan air suling kemudian dididihkan. Campuran disaring, dan filtrat dibagi ke dalam dua tabung reaksi. Bagian pertama, digunakan untuk uji saponin. Filtrat didiamkan sampai agak dingin, kemudian dikocok kuat sampai timbul busa. Busa yang stabil dalam waktu 10 menit menunjukkan keberadaan saponin. Bagian kedua, uji tanin: filtrat ditambahkan FeCl3 1%, terbentuknya warna hijau, biru, atau hitam menunjukkan filtrat positif mengandung tanin. Kuinon Sampel diekstraksi dengan eter, jika sampel yang diuji terekstraksi dalam eter kemungkinan senyawa tersebut adalah kuinon. Selanjutnya jika ekstrak eter ini diekstraksi dengan kembali dengan NaOH 5% warnanya hilang, dan jika ditambahkan asam klorida encer sampai bereaksi asam warna semula timbul kembali, maka zat yang dimaksud tergolong dalam kelompok kuinon.

Lampiran 3 Data kadar air, rendemen, dan uji fitokimia lempuyang gajah (a) Kadar air Ulangan 1 2 3 4 5 6 a (g) 1.0540 1.0367 1.0221 1.0054 1.0095 1.0078 b (g) 0.9182 0.9069 0.8951 0.8784 0.8810 0.8900 Rerata Kadar air (%) 12.88 12.52 12.43 12.63 12.73 11.69 12.48%

(b) Rendemen Ekstraksi dengan etanol 70% secara Soxhlet Ulangan Bobot sampel (g) Bobot hasil ekstraksi (g) 1 26.3228 1.6620 2 26.3083 1.5058 3 26.2177 1.3181 Rerata Ekstraksi minyak atsiri dengan distilasi air Bobot sampel Volume distilat Densitas minyak (g) (ml) (g/ml) 130.4904 8.00 0.8400 (c) Uji fitokimia simplisia dan ekstrak etanol lempuyang gajah Metabolit sekunder Alkaloid Flavonoid Triterpenoid Steroid Saponin Tanin kuinon Lempuyang gajah Simplisia Ekstrak etanol + + + + + + + + + Rendemen (%) 6.31 5.72 5.03 5.69% Bobot minyak (g) 6.7200 Rendemen (% b/b) 5.15

Keterangan: (+) dan (-) untuk hasil uji yang positif dan negatif

Lampiran 4 Data persen inhibisi, penangkapan radikal, dan kapasitas reduksi sampel dengan metode FTC, DPPH, dan reduksi serium Metode FTC Data persen inhibisi oleh -tokoferol Absorbans Konsentrasi Blanko Tokoferol 100 0.6014 0.5650 200 0.6014 0.5543 Data persen inhibisi oleh ekstrak etanol Absorbans Konsentrasi Blanko Ekstrak etanol 100 0.6014 0.5890 200 0.6014 0.5814 Data persen inhibisi oleh minyak atsiri Absorbans Konsentrasi Blanko Minyak atsiri 100 0.6014 0.5598 200 0.6014 0.5393 Contoh perhitungan: % inhibisi =

% Inhibisi 5.72 7.48

% Inhibisi 2.03 3.33

% Inhibisi 6.92 10.32

0.6014 0.5650 100% = 5.72% 0.6014

Metode DPPH Hubungan konsentrasi (ppm) dan persen penangkapan radikal (%) disajikan dengan kurva aktivitas antioksidan pada Gambar 4. Penggunaan persamaan logaritma berdasarkan penelitian dari Kienderbeogo et al. (2005) tentang aktivitas antioksidan.
Data persen penangkapan radikal oleh - t okoferol Absorbans Konsentrasi % Penangkapan radikal Blanko Tokoferol 10 1.8718 1.3882 25.84 50 1.8718 0.7230 61.37 100 1.8718 0.0934 95.01 200 1.8718 0.0950 94.92 300 1.8718 0.0960 94.87 500 1.8718 0.0964 94.85 1000 1.8718 0.0970 94.82

Lanjutan lampiran 4 Data persen penangkapan radikal oleh ekstrak etanol Absorbans Konsentrasi % Penangkapan radikal Blanko Ekstrak etanol 10 2.1960 2.1112 2.86 50 2.1960 2.0592 6.23 100 2.1960 2.0190 8.06 200 2.1960 1.9478 11.30 300 2.1960 1.8518 15.67 500 2.1960 1.6536 27.70 1000 2.1960 1.2422 43.43 Data persen penangkapan radikal oleh minyak atsiri Absorbans Konsentrasi % penangkapan radikal Blanko Minyak atsiri 10 2.0790 2.0658 0.63 50 2.0790 2.0586 0.98 100 2.0790 2.0732 0.28 200 2.0790 2.0487 1.50 300 2.0790 2.0114 3.25 500 2.0790 1.9726 5.12 1000 2.0790 1.8208 12.42 Contoh perhitungan: % penangkapan radikal =

1.8718 1.3882 100% = 25.84% 1.8718

Metode reduksi serium Hubungan konsentrasi (ppm) dan persen kapasitas reduksi (%) disajikan dengan kurva aktivitas antioksidan pada Gambar 5. Penggunaan persamaan logaritma berdasarkan penelitian dari Kienderbeogo et al. (2005) tentang aktivitas antioksidan.
Data persen kapasitas reduksi oleh -tokoferol Absorbans Konsentrasi % Kapasitas reduksi Blanko Tokoferol 10 0.6837 0.6167 9.80 50 0.6837 0.5970 12.68 100 0.6837 0.5470 19.99 200 0.6837 0.3785 44.64 300 0.6837 0.2767 59.53 500 0.6837 0.1723 74.80 1000 0.6837 0.0887 87.03

Lanjutan lampiran 4 Data persen kapasitas reduksi oleh ekstrak etanol Absorbans Konsentrasi Blanko Ekstrak etanol 10 0.6863 0.6617 50 0.6863 0.6023 100 0.6863 0.5456 200 0.6863 0.3336 300 0.6863 0.3183 500 0.6863 0.2540 1000 0.6863 0.1867

% Kapasitas reduksi 3.58 12.24 20.50 51.39 53.62 62.99 72.80

Data persen kapasitas reduksi oleh minyak atsiri Absorbans Konsentrasi % Kapasitas reduksi Blanko Minyak atsiri 10 0.6580 0.3757 42.92 50 0.6580 0.0505 92.33 100 0.6580 0.0624 90.27 200 0.6580 0.0822 87.51 300 0.6580 0.1613 75.49 500 0.6580 0.3383 48.59 1000 0.6580 0.5385 13.16 Contoh perhitungan: %kapasitas reduksi =

0.6837 0.6167 100% = 9.80% 0.6837

Lampiran 5 Spektrum absorbsi dan pH Ce(IV) sulfat Spektrum absorbsi

Absorbans 0.7

0.65 0.6 0.55 0.5 250

320
Panjang gelombang (nm)

pH larutan Konsentrasi = 210-3 M Suhu = 25 C pH = 0.51

Lampiran 6 Data uji banding metode pengukuran antioksidan Sampel -tokoferol Ulangan 1 2 3 4 5 N= Rerata = SB = SBR = Uji F FTC FTC DPPH Uji t FTC FTC DPPH DPPH CR CR DPPH CR CR FTC 7.05 7.22 7.55 7.88 7.72 5 7.48 0.34 4.60 DPPH 95.03 95.03 94.82 94.98 94.76 5 94.92 0.13 0.13 p 0.077 0.023 8.7610-5 p 1.3810-10 1.2810-7 1.5210-7 CR 43.25 43.34 44.70 45.88 46.03 5 44.64 1.33 2.98

N : jumlah sampel SB : simpangan baku SBR : simpangan baku relatif

Lanjutan lampiran 6 Sampel ekstrak etanol Ulangan 1 2 3 4 5 N= Rerata = SB = SBR = Uji F FTC FTC DPPH Uji t FTC FTC DPPH DPPH CR CR DPPH CR CR FTC 3.56 3.56 3.23 3.23 3.06 5 3.33 0.22 6.70 DPPH 11.11 11.16 11.66 11.11 11.48 5 11.30 0.25 2.23 p 0.818 0.571 0.429 p 2.0010-6 3.7510-10 9.4210-10 CR 51.33 51.48 51.19 51.33 51.62 5 51.39 0.16 0.32

N : jumlah sampel SB : simpangan baku SBR : simpangan baku relatif

Lanjutan lampiran 6 Sampel minyak atsiri Ulangan 1 2 3 4 5 N= Rerata = SB = SBR = Uji F FTC FTC DPPH Uji t FTC FTC DPPH DPPH CR CR DPPH CR CR FTC 10.04 10.38 10.21 10.38 10.60 5 10.32 0.21 2.03 DPPH 1.59 1.64 1.39 1.54 1.35 5 1.50 0.13 8.41 p 0.350 0.188 0.035 p 2.6710-7 5.9410-10 4.9710-11 CR 87.99 87.84 86.93 87.54 87.23 5 87.51 0.43 0.50

N : jumlah sampel SB : simpangan baku SBR : simpangan baku relatif