IDENTIFIKASI BAKTERI a.k.a PEWARNAAN BAKTERI Apa itu pewarnaan?

Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan / Pewarnaan. Tujuan Pewarnaan? Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, maupun fungi. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam jasad. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia dapat diketahui. Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Pewarnaan? Gelas alas Harus bersih dan bebas lemak, untuk itu saat kita memegang preparat, kita pegang ujungnya karena kulit kita menghasilkan minyak. Umur biakan 18 24 jam, kecuali kuman tahan asam seperti M. Tuberculosis yang tumbuhnya sangat lambat. Kuman mengalami perubahan dalam morfologi dan strukturnya, sehingga hasil yang diperoleh kurang tepat, bila menggunakan biakan berumur lebih dari 24 jam. Kualitas zat warna Ada zat warna yang harus dibuat sesaat sebelum dipakai dan ada yang hanya dapat disimpan selama beberapa waktu. Dan ada warna yang tidak boleh terkena sinar matahari. Tebal / tipisnya sediaan Bila sediaan terlalu tebal atau tidak rata, maka penetrasi zat akan berbeda-beda. Cara Membuat Sediaan? 1. Pemeriksaan langsung

Pada pemeriksaan langsung , bakteri diperiksa dalam keadaan hidup. Kelebihan cara ini adalah cepat, mudah, dan murah namun harus diperiksa segera dan tidak dapat dibiarkan lama karena preparat akan cepat kering. Sediaan basah dilakukan dari bahan pemeriksaan langsung, menggunakan KOH untuk jamur dan NaCl untuk melihat bakteri dalam keadaan hidup. Cara ini juga dipakai untuk memeriksa gerak kuman secara mikroskopik. Ada dua cara pemeriksaan mikroskopik yang biasa dilakukan, yaitu : a. Sediaan Basah Caranya : ambil 1 ose biakan cair atau dari dari koloni yang disuspensikan pada larutan NaCl fisiologis, lalu oleskan di atas gelas objek. tutuplah biakan tersebut dengan gelas penutup yang telah diolesi vaselin pada bagian tepinya. segera periksa di bawah mikroskop dengan pembesaran 400x.

b. Tetes Gantung Caranya : gunakan gelas objek cekung dan satu gelas penutup. tiap ujung gelas penutup diberi vaselin. lalu letakkan 1 ose suspensi bakteri ditengah-tengah gelas penutup. gelas objek cekung ditutupkan (ditelungkupkan) di atas gelas penutup sehingga suspensi bakteri berada di antaranya. sediaan ini kemudian dipasang pada meja mikroskop dengan gelas penutup berada di atasnya (dalam keadaan terbalik) sehingga posisi suspensi tergantung 2. Pemeriksaan Umum Suspensi kuman, yaitu satu tetes air garam faal diatas gelas alas ditambah biakan kuman, disebar setipis mungkin sehingga membentuk lingkaran dengan diameter kirakira 1cm. Sediaan dibiarkan mengering di udara atau dapat dipercepat

pengeringannya dengan menghangatkan diatas api, kemudian direkat / difiksasi dengan melewatkan diatas api 3x dan siap untuk diwarnai. Macam-Macam Pewarnaan? 1. Pewarnaan Negatif (Background Staining)

Tujuan Mempelajari penggunaan prosedur pewarnaan negatif untuk mengamati

morfologi organisme yang sukar diwarnai oleh pewarna sederhana. Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang. Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti Spirochaeta. Cara pewarnaan negatif Sediaan hapus Teteskan Emersi Lihat di mikroskop Siapkan 2 objek glass yang bersih dan bebas lemak. Letakkan setetes(kira-kira diameter 3 mm) tinta pada ujung kanan gelas benda pertama. Ambil bikan murni dengan menggunakan jarum ose secara aseptic dan campurkan dengan tinta india tadi. Gelas benda lainnya (gelas benda kedua) membentuk sudut 450 terhadap gelas benda pertama sehingga cairan memenuhi area kontak lalu dorong dengan cepat gelas benda kedua kea rah ujung kiri gelas benda kedua tipis merata. Kering udarakan dan jangan di fiksasi. Amatai preparat dengan perbesaran kuat dengan menggunakan minyak imersi.

Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang).

Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina. Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin. Pewarna asam memiliki negatif charge kromogen, tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada permukaan bakteri. Oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang berwarna. 2. Pewarnaan Sederhana Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen / air fukhsin). Tujuan : Hanya untuk melihat bentuk sel. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif).

Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan

adalah : biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsin - karbol (5 detik). 3. Pewarnaan Differensial a. Pewarnaan Gram Pewarnaan Gram (+) Positif Pewarnaan Gram () Negatif Pewarnaan Gram (+) Positif Pewarnaan Gram () Negatif

Tujuan: Untuk mengamati bentuk sel dan membedakan garam negatif dan gram positif

Dasar teori: Pewarnaan gram merupakan pewarnaan difrensial karena dapat di gunakan untuk membedakan antara bakteri gram negatif dan gram positif. Pewarnaan ini sering di gunakan untuk identifikasi dan klasifikasi bakteri. Komposisi dinding sel bakteri gram positif berbeda dengan bakteri gram negatif sehingga hasil pewarnaan gram akan berbeda.

Pewarnaan gram membutuhkan : Gram A (cat kristal violet sebagai cat utama), Gram B (lugol iodin sebagai mordan), Gram C (etanol : aseton = 1 : 1 sebagai peluntur), dan Gram D (cat safranin sebagai cat penutup).

Hasil reaksi pewarnaan Gram, yaitu : Bakteri Gram Positif akan berwarna Violet, sedangkan Bakteri Gram Negatif akan berwarna Merah.

Hasil pengamatan : Providensia (gram negatif)

Bacillus (gram positif)

Faktor-faktor yang mempengaruhi hasil pengecatan gram: Fiksasi Jika telalu lama maka dinding sel pecah sehingga yang harusnya gram positif akan seperti gram negatif. Smear terlalu tebal Gram negatif akan menjadi seperti gram positif. Waktu pengecatan tidak tepat Jika gram C terlalu lama maka gram (+) akan seperti gram (-). Konsentrasi reagen Gram A terlalu encer Konsentrasi peluntur Semua alkohol Semua aseton Umur bakteri = = terlalu lambat terlalu cepat = Gram (+) Gram (-)

Terlalu tua, autolisi = Gram (+) Gram (-) Medium Asam Basa Nutrisi Jika kekurangan Gram (+) Gram (-) = = Gram (+) Gram (-) Gram (-) Gram (+)

PERBEDAAN

GRAM (biru)

POSTIF GRAM (merah) Tipis 11-22% Larut

NEGATIF

Kadar peptidoglikan Kadar lipid Resistensi KOH) Kepekaan terhadap iodium Toksin yang dibentuk Resistensi terhadap tellurit Sifat tahan asam Kepekaan terhadap penisilin Kepekaan terhadap streptomisin terhadap alkali

Tebal 1-4 % (1% Tidak larut

Lebih peka Eksotoksin Lebih tahan Ada yang tahan asam Labih peka Tidak peka

Kurang peka Endotksin Lebih peka Tidak ada Kurang peka Peka

b. Pewarnaan Tahan Asam Pewarnaan ini adalah segolongan bakteri yang sulit diwarnai, tetapi sekali diwarnai sulit dihapus. Dinding sel bakteri tahan asam terdiri dari peptidogikan, arabinogalaktan, dan lipid, dimana 50% dari lipid ini terdiri dari asam nikolat. Bakteri ini dimasukkan kedalam golongan mikrobacterium yang sebagian besar bersifat satprofit, dikenal juga golongan atipik , sebagian kecil pathogen bagi manusia yaitu Mycrobaterrium tuberculosis dan Mycrobacterium leprae. Bakteri genus mycobacterium dan beberapa spesies nocardia pada dinding selnya mengandung banyak zat lipoid (lemak) sehingga bersifat permiable dengan pewarnaan biasa. Bakteri tersebut bersifat tahan asam (+) terhadapa pewarnaan tahan asam. Pewarnaan tahan asam dapat digunakan untuk membantu menegakkan diagnosa tuberkulosis. Dari pewarnaan BTA dapat dibedakan 2, yaitu golongan bakteri tahan asam yang akan tetap mengikat zat pewarnaan primer (karbofuksin) dan tidak akan dilepas pada pencucian alkoholm asam, serta tidak akan mengikat zat warna sekunder ( metilen blue), sedangkan bakteri tidak tahan asam akan melepaskan zat warna primer pada pencucian alcohol asam dan akan mengikat zat warna sekunder.

Ada beberapa cara mewarnai bakteri tahan asam yaitu, menurut Ziehl-Neelseen, menurut Tan Thiam Hok (1957) yang disebut juga pewarnaan Kinyoun Gabelt, serta pewarnaan dengan AURAMEN-PHENOL FLUORCHROME. Pewarnaan Ziehl-Neelsen Cara Pewarnaan : Pewarnaan tahan asam menggunakan larutan : o Ziehl-Neelsen A (cat karbol fuchsin), o Ziehl-Neelsen B (alkohol asam :HCL 3% dalam metanol 95%), dan o Ziehl-Neelsen C (cat biru metilen). Buat sediaan dari sputum dengan cara, bersihkan kaca benda hingga bebas dari lemak, bakar ose hingga pijar dan tunggu dingin sejenak, ambil sputum dengan ose kemudian oleskan diatas kaca benda hingga didapat usapan yang rata dan tipis, tunggu dan keringkan dan difiksasi diatas api. Ose setelah digunakan dibakar lagi hingga pajar. Tuangi sediaan dengan karbol fuksin hingga tergenang, kemudian panaskan diatas api kecil sampai keluar asap lalu tunggu selama 5 menit Cuci dengan air mengalir Celupkan kedalam H2SO4 selama 2 detik untuk kuman M. Leprae. Celukan kedalam alcohol 60% sehingga tidak ada lagi zat warna merah yang larut. Tuangi preparat dengan methylen blue selama 1-2 menit. Cuci dengan air mengalir keringkan tetesi minyal imaersi dan amati dengan mikroskop pembesaran 10 X 100 Pewarnaan Kinyoun Gabbet atau Tan Thiam Hok Buat sediaan sputum dan rekatkan. Sediaan dituangi larutan Kinyoun dan dibiarkan selama 3 menit. Dicuci dengan air mengalir. Preparat dituangi larutan Gabbet dan dibiarkan selama 1 menit. Cuci dengan air mengalir lalu amati dengan mikroskop dengan pembesaran 10 X 100

Hasil pengamatan :

Hasil pewarnaan : Bakteri tahan asam akan berwarna merah, dan Bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru. Perbandingan antara Ziehl Neelsen & Kinyoun-Gabbet Dimana pada Kinyoun-Gabbet adalah : Pada zat warna primer / utama, kuman tidak diberikan jeda/ruang untuk dapat memproses BTA mengambil warna merah. Kemudian Kinyoun-Gabbet komposisi zat warna fenol kembali pada posisi semula/dingin/ membeku (walaupun pada proses pembuatan reagen Kinyoun, Fenol dipanaskan terlebih dahulu) sehingga zat warna tidak cepat meresap masuk ke dinding bakteri, sehingga pada saat pembuangan dan pembilasan dengan air mengalir itulah bakterinya belum sepenuhnya merah. Pada zat warna pembanding / kedua, tidak dapat menghasilkan latar yang bagus oleh karena zat warna primer belum terlalu bersih pada proses pencucian sehingga menimbulkan penimpaan/bertumpuk (merah ditambah biru menghasilkan warna ungu). Dan pada komposisi zat warna antara methylen blue dan alkohol absolut juga asam sulfatnya tidak pisah, sehingga tidak memberikan ketegasan antara zat warna primer dan zat warna pembandingnya. Dari penjabaran diatas tentang Kinyoun-Gabbet tersebut di atas bila dibandingkan dengan perbedaan kedua metode, maka Ziehl Neelsen secara pewarnaan lebih baik, walaupun

tidak memberikan pengaruh yang signifikan pada hasil kuman yang diperoleh dari pewarnaan Kinyoun-Gabbet. Kelemahan dan Kelebihan Pewarnaan Kinyoun-Gabbet antara lain adalah: latar belakang berwarna ungu dan buram, basil kurang merah, lekosit ungu, reagen jarang dijumpai karena itu mahal harganya, komposisi dari fenol kristal/bubuk murni dan pada saat pembuatan reagen sebelum proses homogenisasi zat warna primer denagn carbol fuchsin dipanaskan/dilelehkan pada penangas atau autoclaf, dan terakhir pada proses pewarnaan lebih mudah, cepat dan praktis. Adapun kelemahan dan kelebihan Ziehl Neelsen yakni: latar belakang berwarna biru terang, basil merah jelas, reagen terjangkau dan mudah didapat, fenol diencerkan 5% dan tidak dipanaskan karena pemanasan dilakukan pada proses pewarnaan sedian zat warna utama maka dari itu agak lama waktu yang dibutuhkan. 4. Pewarnaan Khusus (Special Staining) Flagel Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel. Kapsul Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang. Yang berwana biru gelap. Ada beberapa metode pengecatan kapsul, diantaranya : 1. Metode Buri Yang dipakai : Nigrosin, Methilene Blue. 2. Metode Hiss Yang dipakai : Basic Fucsin (dengan pencuci alcohol). 3. Metode Welch Yang dipakai : Carbol Fuchsin (dengan pencuci NaCl).

4. Metode Antony Yang dipakai : Cristal violet (dengan pencuci CuSO4). Tujuan : Untuk mengetahui adanya kapsul pada bakteri Hasil Pengamatandan Cara Kerja :

Spora Spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan teknik pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling banyak digunakan. Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspores, perlu dilakukan pemanasan supaya cat malachite hijau bisa masuk ke dalam spora, seperti halnya pada pewarnaan Basil Tahan Asam dimana cat carbol fuschsin harus dipanaskan untuk bisa menembus lapisan lilin asam mycolic dari Mycobacterium.

Prinsip kerja : Spora kuman mempunyai dinding yang tebal sehingga diperlukan pemanasan agar pori-pori membesar zat warna fuchsin dapat masuk, dengan pencucian pori-pori kembali mengecil menyebabkan zat warna fuchsin tidak dapat dilepas walaupun dilunturkan dengan asam alkohol, sedangkan pada badan bakteri warna fuchsin dilepaskan dan mengambil warna biru dari methylen blue. Cara Kerja : Dibuat suspensi kuman, ditambah dengan carbol fuchsin sama banyak. Dipanaskan selama 6 menit pada api kecil atau pada pemangas air 80C selama 10 menit. Dibuat sediaan dan dikeringkan. Dimasukkan kedalam H2SO4 1% selama 2 detik. Dimasukkan kedalam alkohol sehingga tidak ada lagi warna merah mengalir. Sediaan dicuci dengan air. Diwarnai dengan methylen blue selama 1 menit kemudian dicuci dan dikeringkan. Diperiksa dibawah mikroskop.