MICROBIOLOGIA AMBIENTAL GUI DE PRCTIQUES (10 Hores) PROFESSOR TUTOR: Rosa Carb Moliner Objectius: - Aprendre a treballar en un laboratori

de microbiologia - Familiaritzar-se amb les tcniques bsiques de microbiologia destacant la importncia de: lallament, el recompte, la determinaci de grups (marcadors microbians) i la identificaci microbiana. Primera sessi (4 h) 1- normes de seguretat especfiques del laboratori de microbiologia 2- funcionament i s daparells (autoclau, cabina flux laminar, lupa ...), material (nansa sembra, pipeta, placa Petri, ..). 3- conceptes: neteja, desinfecci i esterilitzaci. 4- preparaci de medis de cultiu: a) lquids i slids, b) generals, selectius i diferencials i c) definits i complexes 5- allament i recompte de microorganismes: a. dilucions i sembra en massa (per abocament) b. esgotament en placa c. filtraci a travs de membrana Segona sessi (3 h) 1- observaci de las plaques sembrades en la sessi anterior (dilucions i sembra en massa, esgotament i filtraci ) 2- tincions microscpiques: tinci gram de les colnies crescudes 3- tinci despores 4- proves bioqumiques didentificaci de microorganismes (enterobacteriacies) Tercera sessi (3h) 1- lectura de les proves bioqumiques didentificaci 2- preparacions microscpiques de fongs, llevats i protozous 3- recompte amb la cmara compta cel.lules. NORMES BSIQUES EN EL LABORATORI DE MICROBIOLOGIA. En el laboratori de microbiologia shan de seguir unes normes estrictes dhigiene i seguretat per evitar que es doni contaminaci creuada; sha devitar que microorganismes procedents de lambient o del mateix manipulador contaminin el nostre cultiu o al revs. En el laboratori s necessari portar bata de treball; aquesta ser dus exclusiu per aquest laboratori. Abans diniciar i tamb al finalitzar el treball de microbiologia s necessari rentar-se les mans. No sha de menjar ni beure dins del laboratori. La taula

de treball ha destar neta i ordenada des de linici de la prctica fins al final (abrics, bosses, objectes personalshan destar allunyats del lloc de treball) Respecte a les precaucions a nivell operatori o prctic, s necessari: 1. Utilitzar sempre material estril. 2. Treballar sempre prop de la flama, en un espai delimitat per un radi duns 15 centmetres al voltant del bunsen. La segona opci s treballar en cabina de flux laminar. 3. Las nanses de sembra reutilitzables es flamegen sempre fins arribar al roig viu abans i desprs de ser utilitzades (s necessari tenir la precauci desperar uns segons a que es refredin abans dusar-la) 4. Les plaques petri, suport de pipetes estrils i altre material que es vulgui preservar de qualsevol contaminaci sols sobrir al costat de la flama i el temps necessari per la seva manipulaci. 5. Les pipetes estrils no es toquen mai per la punta, i un cop utilitzades, es deixen en soluci desinfectant (sab, llexiu...); mai s deixen sobre la taula de treball (evitar contaminaci de la taula, i possibilitat de contaminaci del mateix usuari). 6. Per sembrar microorganismes procedents dun tub dassaig a un altre, es procedeix mantenint el tub lleugerament inclinat per sense que el lquid toqui el tap. Es treu el tap al costat de la flama, i el tap saguanta amb el dit petit de la ma amb la que sha obert el tub. Es flameja la boca del tub i sintrodueix la nansa esterilitzada (o pipeta estril) sagafa mostra i es passa al segon tub. Abans dobrir el segon tub, es flameja la boca del primer y es tapa. 7. Para sembrar microorganismes de placa a placa, saconsella i vertir la posici de les plaques i n manipular, al costat de la flama, sols la base de la placa. 8. s necessari etiquetar adequadament el material (tubs, plaques) 9. Lespai de la taula on es realitzen les sembres sha de netejar i desinfectar abans i desprs de treballar. MEDIS DE CULTIU. Constitueixen el suport en el que es fan crixer els microorganismes en el laboratori. Els medis de cultiu contenen tots els nutrients per el seu creixement i multiplicaci. Les necessitats nutritives dels diferents microorganismes varien, per tant, son necessaris diferents medis de cultiu en funci dels microorganismes. Els medis de cultiu es classifiquen en medis generals, selectius i diferencials. Utilitzem els primers quan volem que creixin la majoria de microorganismes. Els medis generals contenen tots els nutrients necessaris (font carboni, energia, fsfor, ....) per si un microorganisme s mol exigent pel que fa a nutrici, aleshores no creix. Utilitzem els medis selectius quan es vol seleccionar un o un grup del total de microorganismes presents en una soluci. Aquests medis acostumen a portar una substncia inhibidora de creixement del grup que no ens interessa. I els medis diferencial, sutilitzen quan es vol posar en evidncia la presncia de ms dun grup de microorganismes. Saprofiten comportaments bioqumics diferents per diferenciar-los. En el moment de preparar el medi de cultiu s important diferenciar si el medi s slid (cont agar u altre gelificant) o lquid. La majoria de medis de cultiu es comercialitzen tant deshidratats com preparats per al seu s immediat. Els medis deshidratats shan de rehidratar amb aigua destillada seguint les

instruccions de la casa comercial. Un cop rehidratats sha desterilitzar seguint la relaci de temps temperatura indicats. PREPARACIONS MICROSCPIQUES PREPARACIONS HUMIDES - collocar amb la nansa de sembra o amb una micropipeta una suspensi de microorganismes en un portaobjectes net i desengreixat (si el microorganisme est en un medi slid, afegir primer una gota daigua destillada en el porta, desprs els microorganismes i mesclar) - ? obrir la suspensi de microorganismes amb el cubreobjetes (vigilar que no quedi aire). C - Observar al microscopi (per contrastar millor la preparaci es pot afegir algun colorant com blau de metil en comptes daigua destillada). PREPARACIONS FIXADES . Tinci Gram (Tinci diferencial) - Amb una nansa de sembra dipositar damunt un portaobjectes una gota de suspensi de material a examinar. Si s un microorganisme que est en un medi slid, es posa una gota d'aigua destillada en el centre del portaobjectes i desprs s'agafa una mica de colnia i es remena. - ? estn suaument la suspensi de microorganismes fins a ocupar una superfcie d'uns 2 cn2 S aproximadament. - Fixar la preparaci, agafant el portaobjectes amb les pinces i passant-lo per la flama del Bunsen. Un sobre-escalfament destrueix les estructures cellulars i inutilitza la preparaci. - Tenyir amb Cristall Violeta durant 1,30 minuts. - ? etejar amb aigua destillada N - ? obrir el frotis amb Lugol durant 1 minut. C - ? etejar amb aigua destillada N - Decolorar amb alcohol fins que les gotes que caiguin siguin transparents - ? etejar amb aigua N - ? enyir amb safranina durant 1 minut. T - ? etejar amb aigua. N - ? ssecar la preparaci. A - ? bservar al microscopi. O Els microorganismes Gram positius apareixen blau-violeta, mentre que els Gram negatius s'observen de color vermell o rosat. . Tinci amb blau de metil - ? eguir els passos de la tinci anterior fins a la fixaci. S - ? obrir la preparaci amb blau de metil durant 4 minuts. C - Netejar amb aigua destillada. - ? ssecar la preparaci A - ? bservar al microscopi O

. Tinci d'endospores - ? ixar els microorganismes F - ? obrir la preparaci amb Verd de malaquita (soluci saturada) C - ? scalfar fins que es desprenguin vapors (repetir-ho dues vegades ms) E - ? entar amb aigua R - ? obrir la preparaci amb safranina durant 1 minut C - ? entar amb aigua i assecar R - Observar al microscopi. Les espores quedaran tenyides de color verd, mentre que les cpsules de color rosat. TCNIQUES DE SEMBRA MTODE DESGOTAMENT EN PLACA. Aquesta tcnica de sembra permet allar microorganismes. No permet fer recomptes. Amb la nansa flamejada i refredada, sagafa una suspensi de microorganismes duna mostra problema i es deixa en un extrem de la placa i es barreja en el mateix extrem (si els microorganismes estan en medi slid, es posa una gota daigua destillada estril en un extrem de la placa de petri i desprs sagafen els microorganismes). A partir de la gota de microorganismes que hem deixat en un extrem de la placa es tiren lnies paralleles entre elles que tenen com a objectiu estendre la gota dun extrem de la placa a laltra. Les lnies es tiren sempre en una mateixa direcci. Tamb s important ocupar noms una part de la placa (1/3 o part de la placa). Sesterilitza la nansa i a partir de les lnies que sacaben de traar, es tiren unes segones lnies paralleles entre elles i perpendiculars a les primeres. Es torna a esterilitzar la nansa i es fa una tercera srie de lnies seguint les indicacions anteriors. DILUCIONS I SEMBRA EN MASSA Aquesta tcnica permet allar i realitzar un recompte del nombre de microorganismes presents en una suspensi (aigua, aliment, sl ...). Si sestima que la mostra est molt contaminada, es realitzen primer dilucions decimals (optatiu) en una soluci salina estril. Posteriorment se sembra un volum conegut de les dilucions en una placa de petri. Safegeix el medi de cultiu, es barreja b i es deixa incubar a lestufa el temps i temperatura adequats. Posteriorment es fa la lectura de les colnies crescudes. En el moment de la sembra, les cllules hauran quedat atrapades en el medi de cultiu, si aquestes poden crixer, cada cllula es dividir en dues, aquestes dues en quatre....de manera que finalment podrem visualitzar una colnia (conjunt de cllules que procedeixen duna nica cllula). les colnies estaran separades fsicament, per tant shauran allat els microorganismes, a ms, si es compten el nombre de colnies crescudes i es multiplica al suma per la diluci realitzada podrem saber el nombre de microorganismes presents en la soluci inicial. FILTRACI A TRAVS DE MEMBRANA Aquesta tcnica sutilitza sobretot per realitzar recomptes de poblaci a partir de mostres poc contaminades i lquides (aigua). Per aix es filtra la mostra problema a travs dun filtre de membrana

que retingui els microorganismes. Sacostumen a utilitzar filtres de 0,45 de dimetre de porus. Un cop realitzada la filtraci, sagafa la membrana filtrant amb les pinces estrils i es diposita dins duna placa petri que contingui el medi de cultiu adequat. Sincuba el temps i la temperatura adequades i es compten les colnies crescudes que sexpressen en relaci al volum filtrat. CMARA DE RECOMTE (NEUBAUER) La cmara de recompte sutilitza bsicament per comptar el nombre de cllules eucariotes (llevats ..) present en una suspensi. Si no es fa cap tinci, el recompte s total (cllules vives ms cllules mortes), per si es tenyeix prviament amb blau de metil es poden diferenciar les cllules vives de les mortes. Sutilitzen en mostres contaminades. Les cmares de recompte sn portes que tenen una excavaci drea coneguda. Lrea presenta uns quadrats per facilitar el recompte. Per realitzar el recompte sintrodueix una suspensi de microorganismes en la depressi de la cmara i sobserva al microscopi. Un cop enfocat es compten les cllules presents. Si es realitza una tinci amb blau de metil (o un altre colorant de comportament similar podem diferenciar cllules vives i cllules mortes. IDENTIFICACI BIOQUMICA DE MICROORGANISMES Les proves bioqumiques a realitzar varien en funci dels microorganismes. Aix, en funci del microorganisme que creiem que tenim es realitzen proves especfiques del grup al qual pensem que pertany el microorganisme (famlia, gnere ...); els resultats de les proves que sobtenen ens donen el que es coneix amb el nom del perfil bioqumic que es compara amb un llistat de perfils bioqumics corresponents a espcies identificades i conegudes. La coincidncia de perfils ens indica que es tracta de la mateixa espcie. Com sha dit, existeixen una amplia varietat de proves a realitzar. Per exemple, en la identificaci de les bactries lctiques es fan, entre altres, proves de fermentaci de carbohidrats ja que aquestes bactries es caracteritzen per la seva capacitat de fermentar-ne molts. Per aix, es preparen diferents medis de cultiu que es diferencien noms pel sucre present. Se sembra la soca a identificar, sincuba i sobserva si creix o no creix en el medi assajat, etc. En el mercat es comercialitzen diferents kits per identificar diferents microorganismes (bactries lctiques, estafilococs, enterobactericies etc.). Els kits venen acompanyats de les instruccions ds que varien en funci de cada un. s imprescindible alhora didentificar un microorganisme treballar en cultiu pur.