Uticaj pH i temperature na enzimsku aktivnost Tehnike merenja u enzimskoj kinetici

Uticaj temperature na enzimsku aktivnost

Temperaturni optimum

Termalna stabilnost

k=Ae-Ea/RT

Temperaturni optimum enzima

+ Efekat temperature na konstantu brzine

- Efekat temperature na stabilnost preoteina (enzima)

Termalna stabilnost enzima nije isto to i temperaturni optimum enzima! Preinkubacija na razliitim T, odredjivanje rezidualne aktivnosti enzima Reverzibilnost procesa Konstanta denaturacije Zavisnost katalitike aktivnosti od T

Ac(t) = Aco e-kt Ac(t) - aktivnost enzima nakon vremena t provedenog na datoj temperaturi Aco - aktivnost enzima pre inkubiranja na datoj temperaturi

Uticaj pH na aktivnost enzima

Uticaj pH na stabilnost (_____) i aktivnost (........) enzima
Efekat pH na jonizaciju katalitiki aktivnih grupa u enzimu i/ili grupa koje vezuju supstrat

Efekat pH na denaturaciju proteina

Jonizacija jednostavnih kiselina i baza: osnovne jednaine

Jonizacija jednostavnih kiselina & baza: osnovne jednaine

L konstanta brzine, ekstikcioni koeficijent, konstanta ravnotee

Jonizacija jednostavnih kiselina & baza: osnovne jednaine

Efekti jonizacije grupa u enzimima na kinetiku

1. Mihaelis-Mentenov mehanizam

Efekti jonizacije grupa u enzimima na kinetiku

1. Mihaelis-Mentenov mehanizam

Efekti jonizacije grupa u enzimima na kinetiku

Efekti jonizacije grupa u enzimima na kinetiku

pH zavisnost kcat pH zavisnost Km pH zavisnost 1/Km pH zavisnost kcat/Km

Jonizacija jednostavnih kiselina & baza: osnovne jednaine

Sistemi sa dve jonizujue grupe

Ukoliko aktivnost enzima zavisi od jonizujueg stanja dve grupe, pri emu je jedna bazna, a druga kisela, tada je zavisnost brzine reakcije od pH oblika zvonaste krive, sa maksimumom na pH = (pKa1 + pKa2)/2

Modifikacije & odstupanje Jednostavne teorije

1. Modifikacije zbog dodatnih intermedijera
Intermedijeri na reakcionom putu

Ukoliko je EA glavna vrsta intermedijera na reakcionom putu, pH zavisnost kcat i Vmax ce dati pKa vrednosti za EA

Modifikacije & odstupanje od jednostavne teorije

1. Modifikacije zbog dodatnih intermedijera
b) Neproduktivni naini vezivanja

Neproduktivno vezivanje nece uticati na pH zavisnost konstante specifinosti

Ilustrativni primeri & eksperimentalni dokazi

1. Slobodan enzim Korak koji odredjuje brzinu se ne menja sa pH; S je nejonizujuci=> pKa = pKa slobodnog enzima

Ilustrativni primeri & eksperimentalni dokazi

Kompleks enzim-supstrat po vezivanju S, pKa aktivnog mesta se moe promeniti Jonizacija na visokom pH

Efekti temperature, polariteta rastvaraca & jonske snage na pKa grupa u enzimima & rastvoru

Velika variranja pKa u enzimima

Direktna titracija grupa u enzimima

2. Metode
NMR IR spektroskopija UV diferencijalna spektroskopija Fluorescencija Diferencijalna titracija (moe i uz denaturaciju) Hemijske modifikacije

Odredjivanje konstanti disocijacije za protein-ligand interakcije

Ekvilibrijumska dijaliza

Neekvilibrijumska dijaliza se koristi za brza odredjivanja, pri emu se odredjuje brzina difuzije kroz polupropustljivu membranu

Ekvilibrijumska gel filtracija

Primenljiva i za enzime

Ultracentrifugiranje

Filter testovi Spektroskopske metode Mikrokalorimetrija

Stehiometrijska titracija

Surface Plasmon Resonance Biosensor Odredjivanje konstanti disocijacije

Merenja individualnih konstanti brzina

Merenja individualnih konstanti brzina

Metoda stalnog protoka

Vrednosti za kcat su u opsegu 1 107 s-1

Metoda zaustavljenog protoka

Metoda zaustavljenog protoka

Metoda prekinutog protoka

Tehnika prekinutog protoka

Tehnika pulsnog prekinutog protoka

Flash fotoliza

Odgovorajui supstrati esto nisu dostupni

Za enzime koji zahtevaju ATP i GTP razvijen je supstrat tzv. caged ATP, odnosno GTP
Time scale reda ms

Relaksacione metode
Temperature jump

Konstante brzina enzimskih reakcija i procesi koji odredjuju brzinu

Enzimi koji postiu katalitiku perfekciju