BAB II TINJAUAN PUSTAKA

DNA (deoxyribonucleic acid) adalah materi genetik yang terdapat di dalam inti sel makhluk hidup. Materi itu berbentuk seperti tangga. Bukan tangga yang lurus, tetapi tangga yang berpilin. Kedua sisi tangga dihubungkan oleh anak tangga. Pada DNA, hanya ada dua jenis anak tangga, yaitu anak tangga yang dibentuk oleh pasangan basa nitrogen Adenin dan Timin (A-T) dan basa Guanin-Citosin (G-C) (Warta Medika, 2008). 2.1 Isolasi DNA 2.1.1 Definisi Isolasi DNA Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA.salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi.sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya.molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader, 1993). Isolasi DNA merupakan kegunaan DNA untuk dianalisa atau dimanipulasi yang harus diisolasi terlebih dahulu dan murni kandungannya (Wilson, Keith and John, 2010). DNA biasanya diisolasi dari sel dengan menggunakan metode yang melisiskan sel tetapi mencegah fragmentasi DNA. Langkah ini biasanya melibatkan EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) yang dalam proses tersebut akan mengikat ion magnesium (kofaktor yang dibutuhkan oleh enzim DNase). Idealnya dinding sel (jika ada) didigesti secara enzimatis (misalnya dengan enzim lisosim). Selanjutnya membran sel sebaiknya disolubilisasi dengan detergen. Jika disrupsi fisik dibutuhkan sebaiknya dilakukan seminim mungkin. Dalam proses disrupsi ini enzim nuklease yang terlepas dari komponen selular dapat mencerna asam nukleat secara efisien, sehingga kerja enzim nuklease harus dihambat. Disrupsi sel dan sebagian besar langkah selanjutnya sebaiknya dilakukan pada suhu 4 0C, menggunakan alat yang terbuat dari gelas dan larutan yang telah di-autoclave (fungsi autoclave adalah untuk menghancurkan aktivitas DNase pada alat atau larutan tersebut). Setelah melepaskan asam nukleat dari sel, RNA dapat dihilangkan

dengan penambahan RNase yang telah diterapi panas untuk menginaktivasi DNase kontaminan (RNase relatif stabil terhadap panas karena adanya ikatan disulfida yang akan menyebabkan proses renaturasi ketika didinginkan). Kontaminan mayor lainnya, yaitu protein, dihilangkan dengan dengan larutan fenol atau campuran fenol-khloroform (keduanya akan mendenaturasi protein tetapi tidak mendenaturasi asam nukleat). Setelah campuran tersebut dibuat menjadi emulsi, dilakukan pemusingan. Setelah pemusingan akan terbentuk bagian organik di bagian bawah dan bagian aqueous di bagian atas dipisahkan lapisan yang terdiri dari protein yang terdenaturasi. Cairan aqueous diambil dan dideproteinisasi beberapa kali sampai tidak ada lagi material yang terlihat pada lapisan tengah. Kemudian DNA yang sudah tidak mengandung protein ini dicampur dengan dua bagian etanol. DNA akan menjadi presipitat, terpisah dari larutan sampel tersebut. Setelah dipusingkan, pelet DNA kemudian dilarutkan kembali (Epplen dan Lubjuhn, 1998). 2.2 Macam metode isolasi DNA 1. Teknik Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Teknik pengujian polimorfisme DNA berdasarkan pada amplifikasi dari segmen-segmen DNA acak yang menggunakan primer tunggal yang sekuen nukleotidanya ditentukan secara acak. Primer tunggal ini biasanya berukuran 10 basa. PCR dilakukan pada suhu anealing yang rendah yang memungkinkan primer menempel pada beberapa lokus pada DNA. Aturan sederhana untuk primer adalah terdiri atas 1828 susunan basa dengan persentase G+C 50-60% (Subandiyah,2006). 2. Metode CTAB Menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Prasetyo, 2008). 3. Phenol:chloroform Mengunakan senyawa Phenol-choloroform-isoamyl alcohol, Metode standard untuk ekstraksi DNA,Akhir-akhir ini ditinggalkan, karena sifat toksik phenol.

4. SaltingOut menggunakan garam konsentrasi tinggi (NaCl 6 M), untuk medenaturisasi protein menggunakan Proteinase K untuk denaturasi protein. 5. Guanidine isothiocyanate Metode ini lebih cepat dibanding dua metode sebelumnya, Thiocyanate bersifat toksik, untuk lisis dinding sel , Memerlukan chloroform untuk denaturasi protein. 6. Silica Gel Silica gel dapat mengikat DNA dengan perantaraan garam/buffer tertentu (NaI), Cepat, tetapi recovery DNA kurang (Barnum 2005). 7. PCR (Polymerase Chain Reaction) Merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif (Giri, 2004). 2.3 Tahap isolasi DNA 1. Isolasi jaringan Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan. 2. Pelisisan dinding dan membran sel Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan cara penggerusan (homogenasi), sentrifugasi dengan kecepatan lebih dari 10.000 rpm atau dengan menggunakan larutan pelisis sel atau buffer ekstraksi. Inti sel harus dilisiskan, karena substansi gen yang diinginkan ada didalamnya. Penambahan larutan pelisis sel ini bertujuan untuk melisiskan sel yang tidak mengandung DNA agar sel yang mengandung inti sel dapat diisolasi atau dipisahkan dari komponen-komponen sel lainnya yang tidak berfungsi. 3. Pengekstraksian dalam larutan Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak.

4. Purifikasi Tahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil ekstrak dari zat-zat lainnya. Pada larutan tersebut kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 65C. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur. Penambahan RNAse berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh. 5. Presipitasi Tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat. Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru dengan kelarutan lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas ( Fauziah, 2010) Adapun secara umum mekanisme isolasi total DNA seluler secara konvensional adalah sebagai berikut (Corkill dan Rapey, 2008): 1) homogenisasi sel/jaringan (dalam suhu 4 0C, semua bahan dan peralatan steril) 2) lisis seluler (dengan detergen atau lisosim) 3) penambahan chelating agents: EDTA/sitrat 4) penambahan proteinase (proteinase K) 5) ekstraksi fenol (atau fenol-khloroform) 6) presipitasi alkohol (70% atau 100% etanol) 7) pelarutan kembali DNA, misalnya dengan bufer TE (Tris-EDTA) Beberapa senyawa mempunyai fungsi multipel dalam protokol ekstraksi asam nukleat. Agen chaotropic seperti GuSCN (guanidine isothiocyanate), NaI (sodium

iodide), dan LiCl (lithium chloride) memiliki kemampuan untuk menghancurkan kapsul lemak dan merusak integritas sel, denaturasi protein dan menginaktivasi nuklease. GuSCN dengan molaritas di atas 4 M dapat mempresipitasi DNA dan RNA berberat molekular tinggi. Dalam lingkungan yang tinggi garam chaotropic ini senyawa silika dapat berikatan secara spesifik dengan molekul DNA dan RNA, sedangkan lemak dan protein kontaminan hanya mempunyai afinitas yang moderat terhadap silika sehingga dapat dicuci bersih darinya. Absorbsi asam nukleat pada matriks silika meningkat pada pH asam dan konsentrasi garam yang tinggi, sehingga larutan bufer yang mengandung pH yang tinggi dan konsentrasi garam yang rendah dapat digunakan untuk mencucilepaskan asam nukleat dari matriks silika. Cara lain pemanfaatan silika dalam proses ekstraksi asam nukleat adalah dengan melakukan perubahan kimia pada matriks silika sehingga akan secara spesifik berikatan dengan protein atau polisakarida (prosesnya berkebalikan dengan penjelasan sebelumnya). Ekstraksi asam nukleat berbasis silika ini telah menjadi dasar metode ekstraksi asam nukleat kit komersial. Matriks silika dalam kit komersial tersebut dapat ditemukan dalam berbagai bentuk, seperti filter (spin column), gel (glassmilk, silica gel), suspensi (celite, plain-coarse silicate), bahkan partikel berselubung magnetik (Dynabeads). Filtrasi, sentrifugasi, atau penggunaan magnet memungkinkan pemisahan asam nukleat yang berikatan dengan silika dari kontaminasi lemak, karbohidrat dan protein melalui langkah pembilasan yang multipel. Metode ini juga mendasari pembuatan alat ekstraksi asam nukleat. Metode alternatif yang berbasis matriks silika antara lain teknik hibridisasi fragmen asam nukleat yang menggunakan probe yang didesain spesifik yang melekat pada matriks solid atau bead magnetik. Kelemahan umum dari teknik penangkapan seperti ini adalah selama proses pelekatan dan cuci-lepas, dapat terjadi fragmentasi dan hilangnya DNA target. DNA juga dapat diisolasi dari organela spesifik atau partikel virus. Untuk ekstraksi DNA semacam ini sebaiknya dilakukan isolasi organela target atau virus tersebut terlebih dahulu sebelum dilakukan ekstraksi DNA-nya karena isolasi DNA target dari campuran DNA (DNA total) relatif sulit. Jika dibutuhkan isolat DNA dengan

kemurnian

yang

tinggi,

DNA

dapat

dimurnikan

dengan density

gradient

centrifugation menggunakan CsCl (Caesium chloride) (Corkill dan Rapey, 2008). g per-ml per-cm pada panjang gelombang 260 nm. Rasio absorbsi 260/280 nm dapat digunakan untuk mengetahui adanya kontaminasi protein atau fenol (protein memiliki absorbsi maksimum pada 280 nm). Sampel DNA yang murni memiliki rasio 260/280 nm sebesar 1,8-1,9, sedangkan sampel RNA yang murni 1,9-2,0. Jika rasio tersebut di bawah 1,8 berarti ada ketidakmurnian yang signifikan yang masih tertinggal di dalam sampel. Saat ini sudah banyak dijual alat spektrofotometer otomatik yang secara otomatis mengkalkulasi rasio 260/280 nm dan kuantitas asam nukleat. Yang perlu diingat dalam penggunaan spektrofotometer adalah jangan lupa untuk selalu melakukan kalibrasi dengan larutan blank sebelum memeriksa konsentrasi asam nukleat sampel. Yang digunakan sebagai blank adalah pelarut yang digunakan untuk melarutkan asam nukleat yang diperiksa (Harisha, 2007)Untuk memeriksa integritas DNA dapat dilakukan dengan elektroforesis pada gel agarose. Secara kasar gambaran yang diperoleh dari elektroforesis pada gel agarose tersebut juga dapat digunakan untuk menaksir konsentrasi isolat DNA kita. Cara yang lebih akurat untuk mengetahui konsentrasi dan kemurnian DNA yang diperoleh adalah dengan menggunakan spektrofotometer UV. DNA untai tunggal mempunyai koefisien absorbsi 0,027, DNA untai ganda 0,02 dan RNA 0,025

2.4 Manfaat isolasi DNA Isolasi DNA diperlukan untuk analisis genetik, yang digunakan untuk tujuan ilmiah, medis, atau forensik. Para ilmuwan menggunakan DNA di sejumlah aplikasi, seperti pengenalan DNA ke dalam sel dan binatang atau tanaman, atau untuk tujuan diagnostik. Dalam obat aplikasi yang terakhir adalah yang paling umum. Di sisi lain, ilmu forensik perlu memulihkan DNA untuk identifikasi individu (bagi pemerkosa misalnya, pencuri kecil, kecelakaan, atau korban perang), penentuan ayah, dan pabrik atau identifikasi hewan (Anggie, 2011)

DAFTAR PUSTAKA

Anggie,2011.Manfaat Isolasi DNA. http://anggie-myblog.blogspot.com/2011/04/laporanisolasi-dna.html diakses tanggal 30 november 2012 Barnum, Susan R. 2005. Biotechnology an Introduction, 2nd edition. USA : Thomson Brooks/Cole. Corkill, G., Rapley, R. 2008. The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools and Techniques. In: Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed: Walker, J.M., Rapley, R. Humana Press, NJ, USA. Epplen, J.E., dan T. Lubjuhn. 1999. DNA profiling and DNA fingerprinting. Birhkhauser Verlag, Berlin. Fauziah, L. 2010. Isolasi DNA. Available on http://miss-purplepharmacy.blogspot. com/2010/01/isolasi-dna.html. Diakses tanggal 28 november 2012. Harisha, S. 2007. Biotechnology procedures and experiments handbook (An introduction to biotechnology).Infinity Science Press LLC. Hingham, MA. Canada. Mader,S.S.1993.Biology.Wm.C Brown Publishers: Lowa Prasetyo, A. 2008. Karakterisasi virus pada tanaman jarak pagar (Jatropha curcas L.). Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada. Skripsi.(Tidak Dipublikasikan) Wilson,keith and john walker,2010.Principles and Techniques of Biochemistry and molecular Biology.Cambridge University Press,New York. Warta Medika. 2008. Sidik DNA. (http://www.wartamedika.com/2008/07/sidik-dna.html). Diakses 3 Juni 2009.