Stiudiu de Caz Privind Acidul Folic Si A Derivatilor.

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.
Studiu de caz privind acidul folic si derivatii sai
INTRODUCERE Acidul folic i derivaii si prezint un larg interes n biologie i medicin datorit funciilor coenzimatice ndeplinite n organism ntr-o serie de reacii de importan vital. Acidul folic particip la formarea timinei i a bazelor purinice din ADN, deci deine un rol fundamental n creterea i reproducerea celular. Folat-coenzimele sunt derivai ai acidului tetrahidrofolic, acestea reprezentnd forme biologic active ale acidului folic. De aici deriv importana special a reducerii acidului folic i mai ales aceea a transformrii acidului dihidrofolic n acid tetrahidrofolic, proces ce se desfoar n organism sub aciunea enzimei dihidrofolatreductaz. Aceast enzim cheie a metabolismului folailor a constituit obiectul unor numeroase studii biochimice i histoenzimologice. Ea reprezint cu cea mai mare probabilitate, receptorul molecular al analogilor acidului folic, explicnd marea eficacitate a unora dintre aceste substane ca ageni citotoxici i n consecin, aplicabilitatea lor n terapia cancerului. Dat fiind rolul derivailor acidului folic n biosinteza acizilor nucleici i a proteinelor, de un interes deosebit a beneficiat n aceast lucrare studiul implicaiior acidului folic n diferite situaii fiziologice (sarcin, copil n cretere) sau patologice (neoplasme, n particular leucemii, anemie megaloblastic, boli cronice exfoliative ale pielii). De asemenea, n lucrarea de fa s-a urmrit o reactualizare privind noile date aprute n literatura de specialitate n legtur cu aceast tem: nouti referitoare la mecanismul absorbiei, transportului i utilizrii folailor, la carena de folai i malformaiile congenitale, la mecanismul de aciune al medicamentelor antiinflamatoare nesteroidiene (AINS). De-a lungul ultimilor ani s-au fcut multe studii n ceea ce privete incidena malnutriiei la btrni (n special la pacienii vrstnici spitalizai pe perioade mai mari, ct i la persoane care se hrnesc cu conserve). Cteva studii au indicat o inciden crescut a malnutriiei la persoanele trecute de 65 de ani. Malnutriia a fost evaluat att prin parametrii antropometrici ct i biochimici
Pagina 2 din 58
(incluznd nivelul seric de acid folic). De asemenea a fost observat o inciden crescut a anemiei la aceti pacieni, anemie datorat unui deficit de folai. Mai mult, n ultimii ani hiperhomocisteinemia a fost propus ca factor independent de risc pentru boala arterial coronarian. De vreme ce deficitul de acid folic este o cauz important de hiperhomocisteinemie n populaia general, scderea hiperhomocisteinemiei printr-un tratament simplu i eficace cu acid folic poate scdea incidena bolii arteriale coronariene. innd cont de informaiile menionate anterior am ales s studiez n partea experimental variaia concentraiei de acid folic din omogenate tisulare, n funcie de vrst i organ (ca factori independeni). Determinrile le-am fcut pe obolani mprii n trei grupe de vrst: tineri, aduli i vrstnici i concentraiile de acid folic au fost msurate din omogenatele tisulare din ficat, creier, rinichi, splin. Problema variaiei acidului folic cu vrsta este de importan nu att individual, ct social, indicnd oportunitatea unei suplimentri sistematice puin costisitoare i lipsit de riscuri (cel puin la cei ce prezint manifestri clinice). Abordarea acestei teme se impunea cu att mai mult cu ct la noi n ar exist puine studii referitoare la acest subiect, iar n articolele de specialitate din ntreaga lume este menionat tot mai frecvent.
ACIDUL FOLIC I DERIVAII SI 1.1. Scurt istoric Primele observaii cu privire la existena unui nou factor alimentar, cu aciune vitaminic, s-au semnalat n perioada anilor 1931-1932, cnd s-a constatat c leucopenia i granulocitopenia maimuelor poate fi vindecat cu ajutorul unui extract obinut din drojdia de bere. n 1931, L.Wills i B.S.Lond extrag din drojdia de bere un factor antianemic activ pe maimu, numit vitamina M (M=monky). Tot n 1931, L.Wills, aflat n India, remarc efectul favorabil al unui extract din ficat i drojdii asupra anemiei macrocitare tropicale, concluzionnd c aceast afeciune trebuie s fie cauzat de lipsa unui factor nutritiv, a unei deficiene alimentare.
Pagina 3 din 58
n 1938, P.Day, W.C.Langeston, W.Y.Darby constat c extractul din drojdia de bere este activ i asupra puilor de gin, stimulnd creterea acestora. A fost numit factor de cretere pentru pui sau Factor U. A.G.Hogan i E.M.Parrott reuesc s descopere n extractele din ficat un factor antianemic pentru puii de gin, cruia i dau numele de Vitamina Bc(c=chick, pui de gin). n perioada 1939-1940, E.E.Snell i W.H.Peterson obin din ficat un factor de cretere pentru Lactobacillus casei, izolat prin adsorbie pe crbune activ (norit) i eluare cu alcool amoniacal i l denumesc factor L.Caseisau norit-eluat-factor. n 1941, H.K.Mitchell, E.E.Snell, R.J.Williams reuesc s izoleze din frunzele de spanac acidul folic (folium=frunz), care stimuleaz creterea la Streptococcus lactis i manifest proprieti vitaminice la animale. Ulterior s-a constatat c factorii nutritivi obtinui de diferii cercettori din drojdie, ficat, spanac, microorganisme, fac parte din aceeai grup i s-a propus denumirea lor generic de acizi folici. Termenul de folai este utilizat s desemneze toi membrii familiei acizilor folici i a derivailor acestora, inclusiv compuii n care acidul folic este legat de unul sau mai multe resturi de molecule de acid L-glutamic. Stabilirea structurii chimice a acidului folic a fost efectuat de E.L.Wittle, B.L.ODell, J.E.Vandenbelt, J.J.Pfiffner, n 1945, confirmat n acelai an prin sinteza de R.B.Angir i colab., care menioneaz c n componena acidului folic intr i unii pigmeni pteridinici izolai anterior din aripile fluturilor precum i acidul p-amino-benzoic. n 1962, C.Herbert consum mai multe luni o diet deficitar n folai i stabilete simptomele care apar n starea carenial. Totodat stabilete necesitile de folai pentru oamenii aduli. Ulterior au fost identificai, n 1973, de ctre W.S.Osborne-White i R.M.Smith numeroi factori nutritivi nrudii (aproximativ 28) din ficatul de oaie i obolan, dintre care o importan deosebit o prezint acizii folinici n reaciile de transformilare. n 1991, G.Wald stabilete efectul favorabil al acidului folic n tratarea unor afeciuni neuropsihice. n 1992, Butterworth raporteaz c dozele mari de acid folic ajunse n snge reduc riscul apariiei cancerului cervical la femeile infectate cu papilloma virusul uman. n 1993 Serviciul de Sntate Public din S.U.A. hotrte ca toate femeile s consume zilnic 0,4 miligrame de folai pentru a reduce riscul apariiei unor malformaii i afeciuni cancerigene.
Pagina 4 din 58
1.2. Grupul acizilor folici Grupul generic al acizilor folici este constituit dintr-un complex de vitamine B, care din punct de vedere chimic sunt corelate cu acidul pteroilglutamic, au aciune hematopoetic i leucopoetic, dar se deosebesc ntre ele prin aciunea specific pe care o au asupra diferitelor microorganisme i specii de animale. Aparin acestui grup: acidul folic, acidul folinic, acidul tetrahidrofolic, acidul dihidrofolic, vitamina Bc-conjugat, vitaminele M, U, R etc. Acidul folinic se mai numete i citrovorum factor deoarece este indispensabil culturilor de Leuconostoc citrovorum. Vitamina M este un factor nutritiv care vindec anemia nutriional la maimu, de unde i deriv i numele. Vitamina Bc-conjugat vindec anemia macrocitar a puilor de gin i este esenial pentru creterea microorganismelor Lactobacillus casei L. i Streptococcus faecalis R. Dintre ali factori nutriionali corelai cu grupa acidului folic menionai de diferii cercettori fac parte factorul U, factorul R, factorul S, vitaminele B10 si B11 etc., factori necesari creterii unor microorganisme sau vindecrii unor forme diferite de anemie la animale. Toi aceti factori se pot obine prin extracte apoase din drojdii, frunze de spanac, ficat etc., prin adsorbie pe crbune activ (norit) i apoi eluate de pe adsorbant cu diferii compui. Prin metode fizice i chimice compuii din complex pot fi separai, identificai i dozai. Acizii folici au un rol nsemnat n formarea globulelor roii i albe din snge, n prevenirea i tratarea anemiilor, sunt factori de cretere pentru numeroase organisme; deasemenea au un rol fundamental i n activarea i transportul unitilor C1 active (-CH3, -CH2OH, -C=O, HCOO-, -CH=NH etc.), n biosinteza bazelor azotate, a acizilor nucleici i a proteinelor, n metabolismul unor aminoacizi etc. 1.3. Structura acidului folic Acidul folic se numete astfel deoarece a fost izolat prima dat din frunzele plantelor (folium-frunza). Se mai numete i acid pteroilglutamic, denumire ce provine din structura sa chimic. Este identic cu vitaminele Bc, B4, M, U, R, Lactobacillus factor, precum i cu cea de Norit eluat factor, pentru c la izolarea sa din produsele naturale se folosete adsorbia pe crbune Norit (crbune activ) i eluare cu soluii amoniacale. Acidul folic are o structur complex, avnd molecula compus din trei fragmente:
Pagina 5 din 58
-un inel pteridinic pe care se gsete grefat o grupare amino n pozitia 2 i o grupare hidroxil n pozitia 4 (2-amino-4-hidroxipteridina); -un radical al acidului para-amino-benzoic (PABA); -un rest peptidic rezultat din una sau mai multe (pn la 7) molecule de acid glutamic. Primele dou componente constituie acidul pteroic. Prin adugarea la acesta a celui de-al treilea component (un rest de acid glutamic), se obine acidul pteroil-mono-glutamic (Pte-Glu), derivat la care ne referim atunci cnd folosim denumirea de acid folic.
OH
4 3
9 6 7
10
N
2
N
B
CH2 NH
H2N
N1
N8
Pteridina
Acid pteroic
CO N CH CH2 CH2 H COOH Acid p-aminoAcid glutamic benzoic
COOH
Acid folic ( pteroilglutamic )
Structura moleculara a acidului folic Structura chimic a acidului folic s-a stabilit iniial prin identificarea compuilor ce rezult din degradarea sa hidrolitic, n mediul alcalin aerob. n aceste condiii din acidul folic s-a obinut o fraciune cu funcie aminic aromatic primar, din care prin hidroliza ulterioar se elibereaz acidul paraaminobenzoic i acidul glutamic. A doua fraciune avea structur pteridinic, era fluorescent i prezenta caracter acid. Utilizarea difraciei cu raze X a facilitat stabilirea structurii cristaline a moleculei de acid folic dihidratat; acesta are o conformaie extins cu nucleu pteridinic n poziia ceto. Oxigenul de la carbonul 4 i atomul de azot 10 sunt de aceeai parte a moleculei, legndu-se de restul moleculei prin legturi de hidrogen.
Pagina 6 din 58
aranjarea intramoleculara a nucleului pteridinic
1.4. Caracterizarea compuilor din categoria folailor Folaii reprezint o mare familie de molecule naturale formate prin modificri a moleculei de acid folic, structura de baz a grupului. Derivaii naturali ai acidului folic difer ntre ei prin: -starea de oxidare a ciclului pteridinic; -natura substituienilor de la carbonul din pozitiile N5 si N10; -numrul resturilor de acid glutamic din molecul. Pteridinele au fost identificate n pigmenii aripilor fluturilor, pe baza fluorescenei intense n U.V. (Hopkins, 1889-1893) i ulterior au fost izolate o serie de pteridine (xantopterina, leucopterina, izoxantopterina). Ele sunt prezente i la microorganisme i la animale i au fost supuse unor ample cercetri care au dus la stabilirea structurii (H.Wieland, 1925), la sinteza i la elucidarea rolului lor biologic, de exemplu: cofactori i hidrolaze ca precursori ai vitaminei B12; n biosinteza i/sau ca elemente structurale a acizilor folici i folinici. Pteridina are o structur biciclic fiind format dintr-un nucleu pirimidinic (A) i unul piramizinic (B). Pteridina contribuie la formarea pterinei (2-amino-4-hidroxi-6-metil-pteridina). Pterina mpreun cu acidul para-amino-benzoic formeaz acidul pteroic (Pte). Prin ataarea la acidul pteroic a unui rest de acid glutamic (Glu) se obine acidul pteroilmonoglutamic (Pte-Glu), respectiv acidul folic. Prin adugarea unor noi resturi de acid glutamic la acidul folic prin legturi , se pot obine diopterina (Pte-Glu2), teropterina (Pte-Glu3), vitamina Bc conjugat (Pte-Glu7).
Pagina 7 din 58
4 3
OH
6 7
A
N
1
B
N
8
N H2N N
N N
CH3
Pteridina
Pterina (2 -amino-4-hidroxi-6-metilpteridina)
Structura pteridinei si a pterinei
Pagina 8 din 58
COOH CO NH CH (CH2)2 COOH
OH
4 3N
9 6 7
(CH2)2
10
CH2 NH
B
N8
CO N CH H COOH
H2N 2 N1
Diopterina(Pte-Glu2)
COOH CO NH CH (CH2)2 CO NH COOH CH (CH2)2 COOH
OH
4 3N
9 6 7
(CH2)2
10
CH2 NH
B
N8
CO N CH H COOH
H2N 2 N1
Teropterina(Pte-Glu ) 3
COOH CO NH CH (CH2)2 COOH

6
OH
4 3N
9 6 7
(CH2)2
10
CH2 NH
CO
B
N8
N CH H COOH
H2N 2 N1
Vitamina Bc - conjugata (Pte-Glu7) Structura unor compusi pteroidici si folici
Pagina 9 din 58
OH N H2N N
CH2 N
10
A
N
B
N
CH3
(CH2)2 CO N CH H COOH
COOH
Acidul-N10-metil-folic
OH N H2N N
CH2 N
C H
10
A
N
B
N
COOH
O Acidul-N10-formil-folic
10
OH N H2N N
CH2 NH
COOH
A
N
B
N
Acidul pteroic (Pte)
OH N H2N N
CH2 N
10
COOH
A
N
B
N
CH3
Acid-N10-metil-pteroic (Rhizopterina)
OH N H2N N
CH2 N
H
10
COOH O
A
N
B
N
Acid-N10-formil-pteroic (Factor SLR)
Structura unor compusi pteroidici si folici
Pagina 10 din 58
OH
N N N N
OH
OH
N H2N N
N N
CH OH
CH OH
CH3
H2N
Xantopterina
Biopterina
Structura xantopterinei si a biopterinei Acidul pteroic nu prezint activitate de cretere asupra L.casei i nici antianemic. Acidul N10-formil-pteroic (Rhizopterina-izolat din Risopus nigrigans) are activitate limitat de cretere asupra microorganismelor, dar, prezint proprieti antianemice. A fost obinut din diferite produse biologice. Are substituit un radical formil la N10 al acidului folic. Este de zece ori mai activ dect acidul folic asupra creterii microorganismelor L.casei i Str.faecalis R. Diopterina se gsete sub form de acid pteroil-L-glutamil--glutamic i sub form de acid pteroil--glutamil-glutamic. Primul acid este eficace n tratarea anemiei macrocitare la om i atenueaz la canceroi simptomele dureroase. Teropterina sau acidul pteroilglutamic se mai numete i factor de cretere. Este utilizat n tratamentul tumorilor maligne. Rizopterina este un factor de cretere pentru Streptococcus faecalis R (SLR), dar nu are aciune asupra Lactobacillus casei i nici asupra anemiei puilor de gin. Este un derivat al acidului pteroic. S-a obinut prin sintez din acid pteroic i acid folic. S-a izolat din lichidul de fermentare de la Rhizopus nigricans. Vitamina Bc conjugat sau acidul pteroilhexaglutamic are 7 resturi de acid glutamic substituite la acidul pteroic. Reprezint forma predominant sub care se gsete acidul folic n esuturi. Vitamina Bc conjugat nu are o aciune direct asupra anemiei macrocitare la om i nici nu stimuleaz creterea la L.casei i Streptococcus lactis R. Prezint aciune curativ n anemia puilor de gin. Sub aciunea unei enzime hepatice numit vitamina-Bc conjugaza, vitamina Bc conjugat elibereaz acidul pteroil glutamic activ. Vitamina Bc conjugat este forma cea mai rspndit sub care se gsete acidul folic n alimentele naturale. Ea este eficient n tratarea anemiei macrocitare i la maimu. Enzima vitamin Bc conjugaza are aciune carboxipeptidazic a fost iniial izolat din ficat, iar ulterior i din rinichi de porc, pancreas (pui de gin), de la gte i din materiale vegetale
Pagina 11 din 58
(cartofi, migdale). Microorganismele nu conin aceast enzim i de aceea nu pot utiliza vitamina Bc conjugat. 1.5. Derivaii metabolic activi Acidul folic este inactiv ca atare n cadrul metabolismului celular, formele metabolic active fiind constituite din compuii rezultai din: Reducerea acidului folic n poziiile 5, 6, 7, 8 rezultnd acid dihidrofolic i acid tetrahidrofolic. Carbonul asimetric din poziia 6 confer moleculei FH4 stereospecificitate pentru diferite funcii metabolice i mai ales permite trecerea n formele dihidro, n schimb, se pare c gruparea NH2 din poziia 2 a nucleului pteridinic deine rolul fundamental n coordonarea moleculei de folat cu funcie de coenzim. Reducerea acidului folic n acid tetrahidrofolic se realizeaz n dou etape succesive; nti se obine acidul dihidrofolic (FH2) i apoi acidul tetrahidrofolic (FH4), sub aciunea enzimei dihidrofolatreductaza.
Pagina 12 din 58
OH N H2N N N N CH2 NH CO N CH CH2 H COOH

Acid folic DHFR CH2 COOH
OH N H2N N
H N
CH2 NH
CO N CH CH2 H COOH
Acid dihidrofolic DHFR
CH2
COOH
OH N H2N N
H N N H
CH2 NH
CO N CH CH2 H COOH
CH2
COOH
Acid tetrahidrofolic
Reducerea acidului folic sub actiunea dihidrofolatreductazei Acidul dihidrofolic se poate prepara prin reducerea catalitic cu oxid de platin sau paladiu n mediu alcalin sau prin reducerea cu hidrosulfit de sodiu la pH=6, n prezena acidului ascorbic. Sunt posibili trei izomeri ai acidului dihidrofolic: 5, 6 H2 Pt. Glu. ; 7, 8 H2 Pt. Glu. ; 5, 8 H2 Pt. Glu. ; dintre care numai acidul 7, 8 dihidrofolic (acid dihidrofolic standard) s-a izolat i este stabil. Acidul dihidrofolic este uor degradat prin expunerea la aer sau sub aciunea bazelor. Degradarea sa este favorizat de EDTA n timp ce acidul ascorbic i tiolic l protejeaz.
Pagina 13 din 58
Spectrul de absorbie al acidului dihidrofolic la pH neutru prezint dou maxime la lungimea de und de 282 nm, precum i la 310 nm. Spre deosebire de acidul folic care nu este fluorescent, derivaii si n forma redus posed spectre de absorbie carecteristice n UV. Acidul tetrahidrofolic (FH4) este acidul folic redus n poziiile 5, 6, 7, 8. Poate fi stabilizat n mediul acid (de exemplu n acid ascorbic 0,2-0,5% sau cu compui ce conin grupri tiolice cum ar fi mercaptoetanolul n soluie 0,2-1 M). Oxidarea cu aer produce o amin diazotabil (acid para aminobenzoilglutamic). Spectrul de absorbie al acidului tetrahidrofolic prezint dou maxime, la lungimea de und de 298 nm, iar n absena agenilor reductori maximul de absorbie variaz ntre limitele 270-298 nm.
Spectrul de absorbie al derivailor acidului folic la diferite pH-uri Compusul Folat Dihidrofolat Tetrahidrofolat N5 formil FH4 N5, N10 metenil FH4 N10 formimino FH4 N5, N10 metilen FH4 N5 metil FH4 Maximul de absorbie la diferite pH-uri (n nm) Acid Neutru Bazic 292 280 257 282 282, 310 283 272 270, 298 282 348 x x xx 258 255 292 293 297 290 -
Valoarea nu este cunoscut; x compusul se transform n N10 formil FH4 n soluie neutr sau bazic; xx compusul se transform n N5, N10 metenil FH4 n soluie acid. B. Substituirea de grupri monocarbonate n poziiile N5 sau N5, N10 sau N10. Mai jos sunt reprezentate structurile celor mai importani derivai ai acidului folic, metabolic activi: N5 metil FH4: N5 formil FH4; N5, N10 metilen FH4; N5, N10 metilenil FH4. Structura general a derivailor N5substituii n care R poate fi: -CH3 n N5 metil FH4; -CHO n N5 formil FH4; -CH = NH n N5 formimino FH4 este prezentat mai jos
Pagina 14 din 58
Structura generala a derivatilor acidului folic N5 - substituiti COOH

10
OH
5
CH2 N
9
N H2N N
CH2
CO N CH H CH2
CH2 COOH
NH
Acidul N5N10 metilen tetrahidrofolic Modificarea numrului reziduurilor de acid glutamic din molecul. Resturile de acid glutamic sunt condensate ntre ele ntrun mod special (gruparea COOH din poziia a unui rest se leag de gruparea NH2 a altui rest de acid glutamic. Mai des ntlnite sunt formele n care n = 3 (acid pteroiltriglutamic) i n = 5 (acid pteroilpentaglutamic) n celule animale i n = 7 (acid pteroilheptaglutamic) la plante.
OH N H2N N
H N
CH2 NH
CO
NH CH
CH2
CH2
COOH n
COOH N
acid p-aminobenzoic
2-amino, 4-hidroxi 6-metil pteridina
poliglutamic
Structura pteroilpoliglutamatilor
1. 6. Proprieti fizice i chimice ale acidului folic 1. 6. 1. Proprieti fizice Acidul folic este o substan solid, cristalin de culoare galben, greu solubil n ap (0.16mg/100ml), piridin, n fenol, n metanol, n acid acetic glacial i insolubil n cloroform, benzen, eter i aceton. Ca sare de sodiu este solubil n ap. Este optic activ dextrogir (+) 16,
Pagina 15 din 58
iar n mediul acid la pH 4 12 este stabil, cu ionii metalelor grele formeaz compui compleci (cu Fe
3+
rou, Cu2+ verde, Co2+ galben), iar n mediul bazic formeaz sruri cu
metalele alcalinopmntoase. Acidul folic se descompune sub influena luminii i a razelor UV, rezultnd acid pteridoxamin 6 carboxilic i ali compui provenii din catena lateral. Spectrul su de absorbie n ultraviolet este asemntor cu cel al xantopterinei. Acidul folic se prezint sub form de plcue galbene, lenticulare, subiri, birefringente, cu punct de topire la 250C. Prin autoclavare 30min, pierde 70% din activitate la pH = 1. La 100C, sub aciunea acizilor se descompune n acid p aminobenzoil glutamic i partea pteridinic modificat. Solubilitatea acidului folic n ap poate fi msurat prin nclzire la 75C sau prin adugare de glicocol. Soluiile neutre sunt mai stabile, iar cele alcaline se oxideaz cu uurin. Este incompatibil cu substane oxidante sau reductoare deoarece se degradeaz. Cu Ca2+ formeaz o sare insolubil, iar n soluie alcoolic este incompatibil cu clorhidrai, FeSO4, preparate acide, siropuri acide, gume i mucilagii vegetale. Este inactivat de acidul ascorbic, acidul nicotinic, vitaminele B1, B2, sulfamide, etc.
1. 6. 2. Proprieti chimice Dintre proprietiile chimice ale acidului folic menionm posibilitatea reducerii ciclului pteridinic n derivai di i tetrahidrofolici; ataarea la o serie de enzime prin intermediul gruprii NH2 din poziia 2 (legturi peptidice); transportul de uniti monocarbonate n poziiile N5, N10; atomul de carbon din poziia 6 confer stereospecificitate moleculei.
2.FOLAII N NATUR I N ORGANISM 2.1. Rspndire n natur Acidul folic i derivaii si au o larg rspndire n alimente. Se gsesc n cantitate mare n ficatul animalelor, n frunzele plantelor superioare, n special n spanac, n mazre, germeni de gru, drojdii, sfecl, lmi i n unele microorganisme. Coninutul substanelor pteroilglutamice din plantule de porumb este de 11,5g/g, iar n frunzele mature de 6-7 g/g. n ierburi, coninutul acidului folic variaz ntre 3-7,5 g/g.
Pagina 16 din 58
Cele mai mari cantiti de acid folic i de folai se gsesc n regnul animal. n ficatul de bou se gsesc 290 g%, n ficatul de pui se gsesc 370 g%, iar n cel de porc 220 g%. Cerealele conin n medie 35 g%, iar dintre fructe lmile 80 g%, bananele 30 g%, portocalele 33 g%. Legumele au un coninut mai redus, fiind cuprins ntre 8 i 25 g%. O bun parte din acidul folic este sintetizat de flora intestinal fapt ce ngreuneaz stabilirea necesitilor pentru om i animale. Acidul folic se gsete n cantiti variabile n toate alimentele uzuale. Ficatul i muchii mamiferelor sunt sursele cele mai bogate, dar i sursele vegetale constituie un aport nsemnat. Laptele de vac conine cantiti mici de acid folic. n timpul preparrii alimentelor o parte din folai se distrug, dar n acelai timp se elibereaz cele aflate n complexe inactive sau sub form conjugat. Cele mai multe forme de folai nu au stabilitate mare n alimente. Frunzele proaspete pot pierde prin uscare la temperatura camerii pn la 70% din activitatea folailor n decurs de 3 zile. Cantiti mari de folai se pierd n timpul extragerii, la prepararea hranei n soluii apoase i prin fierbere. Uneori pierderile totale se ridic pn la 85 - 90%.
2. 2. Necesarul de folai al organismului uman Cantitatea de acid folic total dintr-o diet normal variaz ntre 50 2000 mg zilnic. Necesarul minim de acid folic este de 50 g /zi, dar aceast valoare poate crete n anumite stri fiziologice (sarcin, pubertate) sau patologice (neoplazii, dermatoze cronice, etc.) Comisia F. A. O.- O. M. S. recomand urmtoarele valori pentru aportul zilnic de acid folic: 60 g/zi pentru sugari, 100 g/zi de la 1 12 ani, 200 g/zi ntre 13 19 ani i peste 200 g/zi pentru adult. Folaii existeni n natur sunt conjugai cu mai multe molecule de acid glutamic, acidul pteroilmonoglutamic negsindu-se ca atare n vreo surs natural; lanul acid poliglutamic fiind ncrcat cu o sarcin electric negativ, mpiedic absorbia vitaminei ca atare. Pentru a fi absorbii, poliglutamaii alimentari trebuie s fie hidrolizai la monoglutamai. Aceast hidroliz are loc la nivelul jejunului proximal, sub aciunea unei conjugaze (cel mai probabil intraenterocitar) pH-dependent i zinc-dependent. Dup aceea monoglutamaii rezultai vor fi absorbii printr-un mecanism activ facilitat de glucoz.
Pagina 17 din 58
Aceast absorbie poate fi ns pasiv pentru doze crescute de folai. n cursul transportului lor intraenterocitar monoglutamaii sunt metilai i apoi redui la dihidro- i tetrahidrofolai sub aciunea dihidrofolatreductazei. La individul normal, aproximativ 80% din acidul folic administrat oral este absorbit, indiferent de doza administrat. La o doz mai mic de 200g /zi, excreia urinar este minor sau absent. n schimb, la doze mai mari, aceasta poate deveni considerabil, i anume: 6% pentru 1mg/zi; 10% pentru 2mg/zi; 50% pentru 50mg/zi, pn la 80% pentru 15mg/zi. Sngele conine aproximativ 1mg% folai, cea mai mare parte (90%) aflndu-se n eritrocite, la nivelul crora predomin pteroilglutamotetrahidrofolaii. Exist proteine ce leag folaii n plasm, dar rolul lor este nc neclar. Folaii plasmatici se afl sub form de monoglutamat (N5-metil-tetrahidrofolat) i sunt transportai n celule printr-un carrier care este specific pentru formele reduse (FH4). Odat ajuns n celul, folatul trece n forma poliglutamat dup pierderea gruprii N5-CH3 ntr-o reacie de transfer a gruprii metil. Forma poliglutamat pare a fi forma n care celulele rein i depoziteaz folaii. n organism folaii sunt depozitai n toate esuturile, dar cu precdere la nivelul rinichilor, pancreasului i mai ales ficatului. Rezervele normale de folai sunt estimate ntre 520mg, din care jumtate n ficat; innd seama de necesarul zilnic minim de folai (50g), reiese faptul c rezervele organismului permit meninerea unei hematopoeze normale timp de 2-4 luni. Totui, n caz de cretere important a necesitilor (stri septice, traumatisme grave), timpul scurs pn la apariia manifestrilor hematologice i mai ales a trombopeniei, poate fi mai scurt (15 zile sau mai puin). Pierderea folailor se produce prin descuamarea zilnic a celulelor epiteliale din piele i tractul intestinal, ca i prin bil, urin, transpiraie i saliv. Rata pierderii este de doar 12% din totalul rezervelor hepatice, dar valoarea ei este de 10 ori mai mare dect a vitaminei B12 deoarece cantitatea minim de folai necesar a fi absorbit zilnic este de 100 de ori mai mare dect cea a vitaminei B12, iar turn-over-ul folailor este mult mai mare, simptomele deficienei de folai se dezvolt mult mai rapid dect cele ale vitaminei B12. Deficitul va fi totui aparent doar dup cteva luni de la apariia tulburrii primare de aport, absorbie sau utilizare. 2.3.Manifestrile clinice ale deficitului de folai n organism
Pagina 18 din 58
Manifestrile clinice ale deficitului de folai implic celulele din esuturile cu rat de multiplicare rapid, i mai ales sngele i mucoasa intestinal. Manifestrile neurologice ce apar n cadrul deficitului de vitamina B12 (deosebit de grave prin potenialul lor de ireversibilitate) sunt mai puin frecvente. Manifestrile hematologice constau n primul rnd n anemie megaloblastic, datorat unei eritropoeze ineficiente. Sinteza de ADN anormal (prin ncorporarea de d-UTP n locul d-TTP) duce la hematopoez de tip megaloblastic, asincronism de maturaie nucleo-citoplasmatic (nucleii sunt mai puin maturi dect era de ateptat, cromatina nuclear este dispersat). n mduva osoas apar mitoze anormale, hipercelularitate, metamielocite gigante i scderea raportului mieloido/eritrocitar. Precursorii anormali sunt distrui prematur n mduva osoas, rezultnd anemie prin eritropoez ineficient, bilirubin indirect crescut i hemosiderin normal sau crescut. n sngele periferic se identific hematii macrocitare (VEM > de 1003), hemoglobin sczut sau chiar normal fa de numrul de eritrocite sczut (datorit VEM crescut, acesta fiind i motivul pentru care valori mici ale hemoglobinei sunt bine suportate de ctre aceti pacieni); frotiul sanguin arat o marcat anizocitoz, poikilocitoz i macrocitoz. n ceea ce privete celelalte serii celulare sanguine, modificrile sunt mai rare, dar i mai precoce: numrul leucocitelor i al plachetelor poate fi sczut, iar apariia PMN hipersegmentate (mai mult de 6 lobuli) n periferie este cvasipatognomonic pentru anemie megaloblastic. Pe frotiul de mduv osoas se observ, deasemenea, precursori anormali ca mrime i morfologie i pentru seria granulocitar, iar clinic se poate constata un sindrom hemoragipar sau o scdere a imunitii celulare. Valorile plasmatice ale folailor sunt sczute (normal 6-20ng/ml), dar aceste valori pot reflecta variaii recente n aportul dietetic. Msurarea folailor eritrocitari este n acest sens o msurtoare cu grad crescut de precizie, nefiind supus acestor fluctuaii. Frecvent deficitul de folai este asociat cu deficitul de B12 (evideniat prin testul Schilling). Clinic, anemia se manifest prin slbiciune, ameeli, palpitaii, angor, insuficien cardiac, tahicardie. Culoarea tegumentelor este palid, cu nuan subicteric, rareori apare purpura (datorit trombocitopeniei), iar uneori splina i ficatul pot fi uor mrite. A doua mare categorie de simptome sunt cele digestive, reflectnd afectarea proliferrii epiteliului intestinal (ce are un turn-over rapid) n cadrul deficitului de folai.
Pagina 19 din 58
Pacienii prezint o limb zmeurie (roie, lucioas, depapilat, dureroas), anorexie (cu uoar scdere n greutate), diaree, steatoree, etc. Manifestrile neurologice i psihice includ cel mai frecvent un tablou de polinevrit senzitivo-motorie (mai rar sindrom piramidal), se mai poate observa un sindrom depresiv, anxietate, demen sau psihoz. Diagnosticul impune cercetarea frotiului periferic (PMN hipersegmentate, anemie macrocitar normocrom aregenerativ), a frotiului de mduv osoas (hematopoez megaloblastic), a nivelului de folai plasmatic (mai puin concludent) sau eritrocitar (se mai pot folosi testul de supresie prin deoxiuridin, excreia urinar de formiminoglutamat n exces) i excluderea unui deficit de B12 (test Schilling normal). Diagnosticul etiologic presupune o anamnez amnunit cu privire la diet i explorarea funciei intestinului subire. 2.4. Tratamentul deficitului de folai Tratamentul deficitului de folai este un tratament de substituie, pe toat durata vieii (sau pn la excluderea cauzei primare). Folaii sunt utilizai n scop terapeutic sub form de: acid pteroilglutamic (acid folic) administrat oral (1cp = 5mg) acid N5-formil-tetrahidrofolic (acid folinic) sub form de soluie pentru injectare parenteral, dar la fel de eficace i pe cale oral. O doz de 50-100g/zi permite obinerea unui rspuns hematologic, dar doze mai importante, de ordinul a 1mg/zi timp de 2-3 sptmni sunt necesare pentru a corecta rezervele organismului. Aceast doz, administrat pe cale oral, este suficient chiar i n caz de malabsorbie.
3. METABOLISMUL FOLAILOR 3.1. Extragere, sinteza i biosinteza folailor Acidul folic se poate obine n stare cristalin din diferite surse naturale (ficat, spanac, drojdii, cojile cerealelor,etc) prin extracie cu ap la pH 3, adsorbie pe crbune activ (norit), eluie cu soluie amoniacal 2,8%, purificat prin readsorbie pe crbune, eluare cu anilin i
Pagina 20 din 58
precipitare cu acetat de plumb, AgNO3, acid picric, baritin, etc. n prezent se realizeaz iniial inactivarea enzimelor, care distrug cofactorii naturali prin nclzirea rapid a materialului la 95C, n prezen de tampon ascorbat sau amestec cu uree 6M si cloroform. Cromatografierea extractului se face pe coloane cu schimbtori de ioni i separare prin eluare n gradient de concentraie cu soluii amoniacale sau de anilin. Prin sintez acidul folic se obine prin condensarea acidului p-aminobenzoil-L (-)glutamic, cu aldehida 2,3-dibrompropionic i cu compusul 2,4,5-triamino-6hidroxipiridinclorhidrat n prezen de NaOH, O2 i acetal. Schema sintezei acidului folic
Br HOOC (CH2)2 CH NHCO NH2 + CH2 CH C O H H2N Br + N N OH
COOH
Acid p-aminobenzoil-L(-)-glutamic
Aldehida 2,36-hidroxi-2,4,5-triamin dibromoproprionica pirimidin clorhidrat
NH2 . 2HCl NH2
+ 4 NaOH 1/2 O2
Acid folic + 2 NaCl + 2NaBr + H2O
n produsele naturale acidul folic se gsete n stare liber n cantitate relativ redus, deoarece se gsete n cantitate mai mare sub form de compui chimici diferii, unii cu mai multe resturi de acid glutamic, care au ns aceeai importan nutritiv pentru organismele vii. Prin experiene in vitro s-a observat c prin adugarea de acid folic pe seciunile hepatice din mediul de reacie, n prezena acidului ascorbic, se obine acidul folinic, care este un derivat formilat al acidului formic. Acidul folinic obinut prin sintez este de dou ori mai puin activ dect cel natural, deoarece prin sintez se obin 2 stereoizomeri din care numai unul este activ. Acidul folinic (N-5-COH-FH4) se obine in vitro prin formilarea i hidrogenarea sa la temperatur ridicat, n prezena acidului ascorbic, iar in vivo sub aciunea piridinnucleotidreductazei i a vitaminei C, se formeaz iniial acidul dihidrofolic (FH2), care prin hidrogenare trece n acidul folinic. Mecanismul biosintezei acidului folic la om nu este destul de bine cunoscut. Pn n prezent s-au efectuat cercetri n acest domeniu pe microorganisme i pe animale, cu ajutorul
Pagina 21 din 58
unor inhibitori. Acidul folinic este sintetizat de majoritatea bacteriilor intestinale. Biosinteza acidului folic este stimulat de acidul ascorbic. Experimental s-a dovedit c unele microorganisme sunt capabile s biosintetizeze acidul folic din precursori mai simpli, prin reacii de condensare, sub aciunea unor enzime. Astfel, extractele celulare de E. coli, realizeaz biosinteza acidului folic din acid glutamic, acid p-aminobenzoic i 2-amino-4-hidroxipteridin-6-carboxialdehida, iar extractele de Lactobacillus arabinosus sunt capabile s utilizeze ca i compui pteridinici 2-amino-4hidroxi-6 hidroximetilpteridina i 2-amino-4-hidroxi-6-carboxildehidropteridina n prezena ATP i a ionilor de Mg2+. Biosinteza acidului folic se realizeaz mai repede dac compusii pteridinici conin acidul pirofosforic la C-9. n experienele efectuate cu Mycobacterium avium s-a observat c n prezena ATP, HS-CoA i acidului p-aminobenzoic se formeaz un derivat adenilic monofosforic al acidului p-aminobenzoic, care reacioneaz cu acidul glutamic i formeaz compusul paminobenzoilglutamic. Prin unirea acestui produs cu pterina se formeaz acidul folic. Schema biosintezei acidului folic la Mycobacterium avium
O
H2N COOH + ATP
- P-P
H2N
AMP
+ HSCoA - AMP
Acid p-aminobenzoic
COOH O
H2N
Acid p-aminobenzoiladenilmonofosforic
COOH (CH2)2
(CH2)2
SCoA + NH2
CH
- HSCoA
H2N
CONH
CH COOH
Acid p-aminobenzoil - SCoA
COOH
Acid glutamic
Acid p-aminobenzoilglutamic
OH
+
H2N
N N
Pterina
N N
CH3
Acid folic
Pagina 22 din 58
Extractele de Clostridium striklandii au transformat acidul folic n acid dihidrofolic, iar din ficatul puilor de gin s-a izolat un sistem enzimatic capabil s transforme acidul dihidrofolic n acid tetrahidrofolic.
OH N H2N N N N
NADP+
OH N N
NADP+
OH
NADPH +H
R CH2
NADPH +H
N N
H N N H
R H CH2
H2N
Acidul folic
Acidul dihidrofolic
N H
H2N
Acidul tetrahidrofolic
Transformarea acidului folic in acizii dihidrofolic si tetrahidrofolic Transformarea acidului folic n acid folinic s-a pus in eviden att la animale, ct i la microorganisme n prezena ATP, FAD, Mg2+, acid ascorbic i a unor enzime specifice. n ficatul puilor de gin s-a identificat o enzim care n prezena ATP si Mg 2+ realizeaz transformarea acidului N-5-tetrahidrofolic n acid N-10-tetrahidrofolic.
Acid N-5-tetrahidrofolic
ATP
Mg2+
Acid N-10-tetrahidrofolic + ADP + P
3.2. Absorbie, excreie i necesiti Acidul folic n stare liber, ca acid pteroilmonoglutamic este uor i rapid absorbit de organism n cantiti de pn la 15-20mg/zi. Absorbia are loc mai ales incepnd din partea proximal a intestinului subire i continu, pe toat lungimea sa, cu un consum de energie, cu implicarea unor procese active (energodependente) pentru cantiti fiziologice mici. Dozele mari sunt absorbite mai ales prin difuzie pasiv. n multe produse alimentare acidul folic se prezint predominant sub forme poliglutamate. Din aceti derivai acidul folic este absorbit numai dup o deconjugare prealabil a acestor compui. n tubul digestiv i n rinichi, s-a pus n eviden existena unor sisteme enzimatice hidrolizante (conjugaze) care scindeaz complexele acidului folic. Absorbia acidului folic poate fi perturbat i micorat
Pagina 23 din 58
de diferii compui cum sunt: difenilhidrantoina, pirimidine, cicloserine, etanol, glicocol, serina, homocisteina i metionina. Se consider c acidul folic, precum i derivaii acestora, sunt convertii n mucoasa intestinal sub aciunea unor acidfolicreductaze n derivai metilici (CH3-FH4), forme sub care trec n sngele venei porte i apoi la ficat. Din totalul de aproximativ 70mg acizi folici i folinici existeni la oamenii aduli, aproximativ 30-40% se gsesc n ficat (5-15g/g), de unde prin circulaia sanguin se aprovizioneaz toate organele i esuturile. Imediat dup absorbie i parial chiar n timpul absorbiei, acidul folic este convertit n diferii compui metabolici activi cum sunt: acid N-5-formil-tetrahidrofolic (f5FH4); acid N-10-formil-tetrahidrofolic (f10FH4); acid N-5-formimino-tetrahidrofolic (fiFH4); acid N-5, 10-metenil-tetrahidrofolic (f5-10FH4); acid N-5-metil-tetrahidrofolic (m5FH4). n toi aceti derivai apare ca structur de baz acidul tetrahidrofolic (FH4), care joac rolul unei coenzime de acceptor si transportor al unei uniti C1. Acidul folic este transportat n organism sub form de CH3-FH3 legat de proteine transportoare, avnd n snge o concentraie de 300ng/ml. Folaii se gsesc n cantitate mai mare n eritrocite, cu variaii normale ntre 160-640ng/ml de eritrocite. Coninutul folailor din eritrocite, se menine relativ constant i reflect gradul de aprovizionare a ntregului organism cu aceti compui. Cantitatea de folai din snge scade n bolile de cancer (leucemii), carena folinic i anemie pernicioas, n ciroza alcoolic, anemii gravidice, etc. Plasma sanguin conine 5-20ng/l, iar eritrocitele conin cantiti de 30 de ori mai mari de folai. n snge i esuturi, acizii folici sufer procese de interconversiune i de catabolizare. Acidul folic se transform mai ales n derivai tetrahidrofolici. n eritrocite acidul folic prin metabolizare d natere la acid p-aminobenzoilglutamic i la un derivat aldehidic al pterinei. n ficat, acidul folinic se degradeaz n compui similari, reacia fiind activat de acidul glutamic i inhibat de acidul ascorbic. Tot la nivelul ficatului se transform acidul folic n acid N-10-formil-folinic. Eliminarea folailor i a metaboliilor acestora se face n cantitate mai mare prin fecale, aproximativ 200-500g/zi la omul adult, cuprinznd aproximativ 20% din cantitatea ingerat i partea neabsorbit produs de flora intestinal.
Pagina 24 din 58
Excreia prin urin este mic, aproximativ 2-5 g/zi, dar crete prin administrarea de doze orale, dup saturarea organismului cu folai. Eliminarea folailor prin urin reprezint sub 1% din cantitatea acestora n organism. Dac se administreaz intravenos doze mici de acid folic (1g/kg corp), aproximativ 90% din cantitatea administrat este distribuit din fluxul sanguin n tot corpul n decurs de 3 minute, iar aproximativ 2% se elimin prin urin. Dac ns se mresc dozele pn la 150g/kg corp, pn la 90% din cantitatea administrat se elimin prin urin, n decurs de 612 ore, sub form de acid folic sau derivai apropiai sub aspect structural. La o diet normal, corespunztoare la o ingestie de 600 g de acid folic pe zi, cantitatea acestui acid din organism se apreciaz a fi ntre 6-10mg, cantitate suficient pentru trei sau patru luni, dac este blocat absorbia. O alt cale de eliminare a acidului folic este cea cutanat. Prin transpiraie se elimin cantiti destul de nsemnate de folai, precum i prin bil. 3.3. Rol i activitate biochimic Acizii folici, sub form de acizi tetrahidrofolici, reprezint coenzimele unor sisteme enzimatice, implicate n activarea i transportul unor fragmente monocarbonice (C1) sub form de hidroximetil (-CH2OH), formil (-COH), formiat (HOOC-), metil (-CH3), formimino (CH=NH), care iau parte la reacii deosebit de importante pentru organism. Formele coenzimatice active, care poart fragmente sau radicali cu un atom de carbon, sunt derivai ai acidului tetrahidrofolic (FH4) din care fac parte: acid N-5-formil-tetrahidrofolic (N-5-COH-FH4); acid N-10-formil-tetrahidrofolic (N-10-FH4); acid N-5, 10-metenil-tetrahidrofolic (N-5,N-10=CH-FH4); acid N-5, 10-metenil-tetrahidrofolic (N-5,N-10-CH2-FH4); acid N-5-metil-tetrahidrofolic (N-5-CH3-FH4).
Pagina 25 din 58
H C
OH N H2N N
CH2 N
A
N
B
N
COOH
Acidul-N10-formiltetrahidrofolic COOH
10
OH
5
CH N
+
9
N H2N N
CH2
CO N CH H CH2
CH2 COOH
NH
Acid N5, N10- meteniltetrahidrofolic
OH
5
CH2 N
9
COOH
10
N H2N N
CH2
CO N CH H CH2
CH2 COOH
NH
Acid N5, N10- metilentetrahidrofolic Derivati coenzimatici ai acidului tetrahidrofolic Derivaii coenzimatici ai acidului tetrahidrofolic se pot obine pe dou ci principale: -tratarea direct a aldehidei formice sau a acidului formic cu acid tetrahidrofolic (FH4); -transferul direct al acestor uniti pe FH4. Ca substane donatoare de uniti C1, cele mai active sunt serina, histidina, xantina, metionina, colina, betaine, nicotina, timina, acidul glutamic etc. Ca acceptori de grupri C1 funcioneaz glicocolul, colamina, nornicotina, uracilul, homocisteina, gliconamidoribozida, acidul folic etc. O OH H C O H
+ FH4 + ATP
Pagina 26 din 58
10
CHO
FH4
+ FH4
5,N CH2
FH4
Existena acidului N-5-formil-tetrahidrofolic, care este inert, sub aspect coenzimatic nu constituie un balast pentru organism deoarece poate fi uor transformat pe cale enzimatic n acid N-10-metenil-tetrahidrofolic, iar acesta cu apa d acidul N-10-formilterahidrofolic care este cel mai activ metabolit. Acidul N-10-formil-tetrahidrofolic se poate forma i prin reacia direct dintre
ADP+P
Acid N-5-tetrahidrofolic FH
4
+ATP
+ H
Mg2+ O C
Acid N5, N10 -metenil-tetrahidrofolic

+ ATP
+H2 O
Acid N-10-formil-FH4 Acid N-10-formil-tetrahidrofolic H
aldehida formic i FH4: Reacia este catalizat de formiltetrafolatsintetaza, care a fost izolat din ficatul de porumbel i din diferite microorganisme. Fragmentele monocarbonice sunt, sub aspect metabolic, interconvertibile, deoarece pot trece reciproc una n alta, sub aciunea unor sisteme enzimatice de tipul hidroximetildehidrogenazei n prezen de NADP+i NAD+. Transportul fragmentelor C1 de la o substan la alta se realizeaz de acidul tetrahidrofolic i derivaii si menionai anterior.
NADPH + H+ NADH + H+ +O
- H2O
CH2OH
Hidroximetil
NADP+
C
NADP+
O H
NAD+
O OH
Formil
NAD+
Formiat NADH + H+
CH2 H2N CH
NADPH +
OH
H+
+ FH4
CH2
NH2
COOH
Glicocol
+ Acid N5 , N10 -metilen-tetrahidrofolic
COOH
Serina
Dintre reaciile chimice la care iau parte coenzimele tetrahidrofolice, face parte i transformarea serinei n glicocol n prezena piridoxalfosfatului (PALP):
Din histidin, se obine ca produs intermediar acidul formiminoglutamic care transfer radicalul formimino pe FH4 cu formare de acid N-5-formimino-tetrahidrofolic.
Pagina 27 din 58
COOH Histidina
Catabolizare incompleta
COOH CH NH
+ FH4
HC
NH
(CH2)2 H2N CH COOH

Acid glutamic
(CH2)2 COOH
Acid formiminoglutamic
+ Acid N5-formimino-tetrahidrofolic Acidul N-5-formimino-tetrahidrofolic (N-5-fi-FH4), sub aciunea unei
ciclodezaminaze, formeaz acidul N-5,N-10-metilenil-tetrahidrofolic (N-5,N-10=CH-FH4). Acelai mecanism de reacie se produce i la transformarea xantinei n formiminoglicocol. Glicocolul, printr-o reacie de transaminare, formeaz acid glicoxalic, care cedeaz gruparea formil acidului glutamic, n prezen de NAD+ cu formare de acid N-formilglutamic.
COOH C O
COOH
H COOH
+
H2N
(CH2)2 C COOH
+ NAD+
(CH2)2 CH NH C
+ O + CO 2 + NADPH + H
Acid glioxalic
COOH
Acid formilglutamic
Acid glutamic
Acidul formilglutamic cedeaz radicalul formil acidului FH4 i se formeaz acidul folinic, care este mai puin activ. Acesta n prezena ATP se transform n acidul N-10formil-tetrahidrofolic.
COOH (CH2)2 CH NH C O H
COOH
+ FH4
H2N
(CH2)2 C COOH
+ Acid N-formil-tetrahidrofolic
COOH
Acid formilglutamic
Acid glutamic
Pagina 28 din 58
ATP
Mg2+
Acid N-10-formil-tetrahidrofolic
Coenzimele folinice, care au fixate uniti C1, se comport ca donori n reaciile care necesit acceptarea fragmentelor CH2OH, -CHO, -CH=NH, HCOO-, -CH3. n funcie de felul compuilor care se sintetizeaz n urma transferului de uniti C1, particip la reacie una sau alta din formele active. n reaciile cu cedare de radicali formil vor funciona ca donori acizii N-10-formilFH4 i N-5, N-10=CH-FH4. Ca donori de grupri CH2-OH este mai activ acidul N-5, N-10CH2-FH4, iar ca donori de radicali CH3 funcioneaz acidul N-5-CH2-FH4 i uneori acidul N-5,N-10-CH2-FH4. Acceptorii de grupri C1 active sunt mai numeroi n procesul de biosintez a bazelor i a nucleotidelor purinice, n biosinteza colinei, betainei, nicotinei, etc. n procesul de biosintez a bazelor purinice sunt cedate dou grupri formil, localizate la C-2 si C-8 al nucleului purinic. Dintre compuii intermediari care se formeaz n procesul de biosintez a bazelor purinice, n urma primirii unor unitai C1 active fac parte : -formilglicinamidoribozida(FGAR) -formilaminoimidazolcarboxiamidribozida(FAICAR) Datorit participrii coenzimelor folinice n biosinteza nucleotidelor purinice, ce iau parte la formarea acizilor nucleici, rezult rolul important pe care l au acizii folici n procesele de cretere i reproducere celular. Acidul N-5,N-10-metilen-FH4 are un rol nsemnat n biosinteza ADN, deoarece se comport ca o coenzim n reacia de transformare a uracilului n nucleozide i nucleotide n timin. Ea doneaz un radical metil la 2-deoxiuridin-nucleotide (sau nucleozide) i acestea se transform n 2-deoxitimidin-nucleotide, respectiv nucleozide. Transformarea uracilului n timin se face n molecula nucleotidelor (nucleozidelor), care reprezint crmizile de baz n biosinteza acidului deoxiribonucleic. n cazul biosintezei metioninei se realizeaz transferul gruprii metil de la N5-CH3-FH4 la homocistein.
CH2 CH2 H2N CH COOH

Homocisteina
SH + N-5-CH3 FH4 H2N
CH2 CH2 CH COOH
CH3 + FH4
Metionina
Pagina 29 din 58
n procesul de biosintez a metioninei se produce neogeneza grupei metil i nu transferul acesteia de la ali donori. Metionina are rol nsemnat n formarea colinfosfolipidelor deoarece grupele metil din colin provin din metionina activat (Sadenozilmetionina). Dintre reaciile la care particip N-10-formil-FH4 si N-10-CH2OH-FH4,e important trasformarea betainei n serin.
COOH
+
- CH3
COOH CH2 N CH3 CH3
+ [O]
COOH CH2 N CH3 CH2OH
CH2
(CH3)3
Betaina
Dimetilglicina
Hidroximetilsarcozina
FH4CH2OH FH4
COOH CH2 NH
Sarcozina
COOH CH3 + [O] CH2 NH CH2OH
Hidroximetilglicocol
FH4-CH2OH FH4
COOH CH2 NH2

FH4-CH2OH
FH4
CH2 H2N CH COOH

Serina
OH
Glicocol FH4
FH4-CH2OH
Ultima reacie este reversibil fapt important deoarece serina se poate transforma n glicocol, constituind o important surs de fragmente CH2OH. Exist date experimentale care dovedesc c timina poate substitui acidul folic n stimularea creterii unor microorganisme (Str. faecalis), iar efectul optim al acidului folic asupra acestor microorganisme se obine cnd se administreaz mpreun cu vitamina B12. Datorit acestor corelaii se consider c acidul folic funcioneaz direct sau indirect ca o coenzim n biosinteza timinei. Unele microorganisme transform uor uracilul n timin sau citozin, dar pentru biosinteza timinei au nevoie de acid folic. n prezena formiatului marcat cu 14C, acesta se regsete n atomul de carbon al gruprii metil din timin.
Pagina 30 din 58
Acidul N-5-formil-tetrahidrofolic, pe lng transformarea glicocolului n serin, i a homocisteinei n timin, contribuie activ la transformarea uracilului n timin i a metioninei n creatin precum i la biosinteza inelelor porfirinice. Prin administrarea de formiat marcat cu 14C se regsete n hem, numai la animalele tratate cu acid folic, nu i la cele aflate n caren de folai. Acidul folic stimuleaz activitatea colinesterazei, a crei diminuare ar duce la o cretere a acetilcolinei, cu influen negativ asupra hematopoezei, dar inhib activitatea tirozinazei i a xantinoxidazei. Acidul tetrahidrofolic stimuleaz biosinteza nucleelor porfirinice i a nucleoproteidelor. La maimue cu deficiene de acid folic, coninutul nucleoproteidelor scade n mod accentuat, iar situaia se redreseaz prin administrare de acid folic. Acidul folic este un factor important pentru creterea animalelor tinere i pentru microorganisme. Este utilizat tot mai mult n lupta mpotriva cancerului. Asigur funcionarea optim a sistemului nervos. A manifestat efecte antiteratogene la animalele tratate cu pirimetamin.
4. PERTURBAREA METABOLISMULUI FOLAILOR LA OM 4.1. Cauze ce duc la scderea acidului folic n organism Cauzele ce duc la scderea acidului folic n organism sunt multiple, implicnd aportul de acid folic, necesitile metabolice crescute (sarcin, anemie cronic hemolitic, neoplasm), malabsorbia (sprue, medicamente-fenitoina, barbiturice, etanol) sau interferarea cilor metabolice (inhibitori DHFR-Metotrexat, etanolul) i altele. Deficitul de aport dietetic de acid folic este mai frecvent ntlnit dect deficitul de vitamin B12. Dintre categoriile mai frecvent afectate fac parte btrnii cu aport alimentar nediversificat (conserve, regimul tea and toast) i ocazional adolescenii- alcoolicii i toxicomanii. n cazul alcoolicilor sursa lor principal o constituie buturile alcoolice, acestea avnd coninut de acid folic sczut (berea, vinul) sau practic nul (buturile distilate). n alcoolismul cronic se cumuleaz aportul sczut cu scderea utilizrii acidului folic. Necesitile metabolice crescute de folai apar att n condiii fiziologice (sarcin, perioadele de cretere n copilrie i adolescen) precum i n condiiile patologice de
Pagina 31 din 58
cretere a ratei de multiplicare a esuturilor cu turn-over crescut (mucoasa intestinal, mduva osoas). Astfel, n timpul sarcinii necesarul zilnic de acid folic este crescut de cteva ori fa de normal, iar deficitul de acid folic este de 3 ori mai frecvent la multipare fa de primipare. Pentru un organism sntos i o diet raional, echilibrat, necesitile suplimentare nu constituie un impediment. Anemia ce apare in timpul sarcinii este rezultatul unui consum crescut de acid folic pe fondul unor factori favorizani ca: alimentaie deficitar, ignorana, etc. Important de reinut este c anemia poate fi anterioar sarcinii i o agraveaz prin necesitile crescute; existnd cazuri n care anemia din perioada iniial a sarcinii se datoreaz unor deficiene alimentare sau menometroragiilor. Cauza principal a deficienei de folai n sarcin este reprezentat de creterea sintezei de ARN, ADN asociat cu dezvoltarea ftului, placentei i uterului, precum i cu expansiunea masei eritrocitare a mamei. Pot interveni i ali factori precum: anorexia, reducerea absorbiei de folai i creterea necesarului favorizat de infeciile urinare frecvente. Gemelaritatea accentueaz nevoile de acid folic, determinnd creterea de aproximativ 5 ori a posibilitii de apariie a deficienei de acid folic n ultimul trimestru al sarcinii. Lipsa acidului folic, necesar pentru sinteza ADN, determin tulburri de maturaie i multiplicare celular, cu repercursiuni asupra produsului de concepie, mergnd de la malformaii ale tubului neural, pna la avort. Rolul acidului folic n etiologia defectului de tub neural precum i metodele de profilaxie ale acestor malformaii prin suplimentarea dietei femeii gravide sunt foarte importante. n condiii patologice, necesitile de acid folic cresc cel mai frecvent datorit unei eritropoeze foarte active (de ex. anemia hemolitic cronic). Malabsorbia poate duce la un deficit de acid folic n condiiile unui aport de folai normal; ea are drept cauz afeciuni ale intestinului (sprue tropical, enteropatia glutenic etc.), alcoolismul cronic sau medicamente ce acioneaz probabil pe aceast cale (fenitoina, barbiturice). Interferarea cilor metabolice ale acidului folic se datoreaz alcoolului, unor rare deficite enzimatice (DHFR) sau cel mai frecvent inhibitorilor DHFR (Metrotrexat). n celulele n care aceti inhibitori de DHFR se acumuleaz este mpiedicat transformarea deoxiuridinmonofosfat (dUMP) n deoxitimidinmonofosfat (dTMP) i drept consecin are loc fosforilarea dUMP ce va fi inserat n lanurile de ADN ntr-o proporie ce va depsi cantitativ capacitatea sistemelor ce recunosc, excizeaz i repar eroarea, rezultnd astfel false lanuri de ADN ce explic eritropoeza megaloblastic.
Pagina 32 din 58
I II
aport inadecvat necesiti crescute
dieta neechilibrat(alcoolici, adolesceni, copii n cretere) 1.sarcina 2.copilrie 3.neoplasm 4.eritropoez crescut(anemie hemolitic cronic) 5.boli cronice exfoliative ale pielii 6.hemodializ 1.sprue tropical 2.enteropatie glutenic 3.medicamente:fenitoina, barbiturice 1.inhibitori DHFR(Metotrexat) 2.etanol 3.rare deficite enzimatice (DHFR)
III
malabsorbtia
IV
interferarea cilor metabolice
Cauzele deficitului de folati 4.2. Folaii i sarcina; profilaxia malformaiilor fetale prin administrarea acidului folic Datorit rolului fundamental al folailor n replicarea celular, s-a stabilit pentru prima oar n 1964, de ctre Hibbard c deficitul de folai, cunoscut deja ca fiind rspunztor de hematopoeza anormal, ar putea induce modificri i asupra produsului de concepie i a placentei, putnd (mai ales dac apare la nceputul gestaiei) da avorturi spontane sau malformaii. n ultimul timp, interesul cercettorilor a fost focalizat mai ales spre relaia deficit de acid folic malformaii ale tubului neural (prima asociere n acest sens a fost facut de Hibbard, 1965, cnd 66% dintre mamele cu produs de concepie afectat au avut concentraii crescute de acid forminoglutamic n urin). Un studiu prospectiv privind nivelul folailor eritrocitari la gravide n primul trimestru de sarcin a artat o inciden semnificativ crescut a malformaiilor la gravidele cu nivel al folailor eritrocitari redus (<130g/ml). Problema efectului protector al administrrii preventive a acidului folic a fost obiectul unui amplu program de cercetare administrat n Marea Britanie n 1983 i finalizat n 1991 (MRC Vitamin Study Group 1991); astfel, una din patru femei avnd n antecedente o sarcin afectat din aceast cauz a primit 4 mg acid folic timp de minimum 12 sptmni naintea concepiei i n timpul primelor 3 luni de sarcin. Riscul apariiei malformaiilor de tub neural
Pagina 33 din 58
la produsul de concepie a fost semnificativ mai mic la gravidele ce au primit acid folic fa de lotul martor. Confirmarea efectului protector al suplimentrii folailor n profilaxia recurenei malformaiilor de tub neural susine utilitatea administrrii de folai la femeile ce aparin unei grupe de risc (din punct de vedere al apariiei malformaiilor neurale fetale) i pune problema extinderii administrii profilactice a folailor la toate femeile gravide. Un mare numr de femei gravide au un aport dietetic de folai sub valorile recomandate (300g de folai/zi), dar numai o mic parte din acestea vor avea un produs de concepie normal; oricum pn n prezent este imposibil determinarea cert a apartenenei gravidei la o grup de risc crescut din acest punct de vedere, fcnd foarte greu o profilaxie intit. Cele trei mari direcii ale strategiei privind profilaxia deficitului de folai i a consecinelor acestuia, sunt: educaia general privind dieta (cu o atenie special privind grupurile cu cerine crescute: utilizatorii de medicamente citotoxice, sindroame de malabsorbie, tulburri metabolice), suplimentare a alimentelor cu acid folic i administrarea suplimentar de acid folic la toate femeile ce vor deveni gravide n scurt timp. Din punct de vedere al avizului privind dieta, se recomand consumul crescut de legume proaspete, spanac, fulgi de porumb, lapte (de exemplu o sup de spanac conine aproximativ 125 g, o porie de fulgi de porumb cu un pahar de lapte 80 g). Astfel, se combate ipoteza c deficitul de acid folic s-ar datora exclusiv unui statut socio-economic sczut, accentul fiind pus pe alimentele populare i nici foarte scumpe. Orientarea populaiei pe baza unui aviz dietetic a specialistului este extrem de deficitar, att n perioada antenatal, ct i n coli i n rndurile adolescenilor. Suplimentarea artificial cu folai a alimentelor comerciale disponibile pune problema libertii de opiune i a posibilelor reacii adverse, precum neuropatia datorat unui exces de acid folic la vrstnici. Alimentele alese trebuie s fie consumate cu precdere de ctre populaia int, iar nivelul suplimentrii trebuie s fie cel minim protector (pentru a evita aportul excesiv de acid folic); cele mai frecvente alimente mbogite n folai sunt pinea (exist deja pine suplimentat cu coninut n folai 120g/100 grame), iar fulgii de porumb sunt fortificai la 250 g/100g (75g/porie medie); aceste evaluri aparin Expert Advisory Group i sunt valabile pentru produse alimentare in Marea Britanie. Problema suplimentrii acidului folic la femeile gravide se pune mai ales pentru marea mas a populaiei, ntruct numrul restrns al celor cu risc crescut va beneficia
Pagina 34 din 58
probabil de consult i tratament adecvat. Din nefericire, n general concepia nu este planificat i numai un numr restrns de cupluri se vor prezenta la un consult prenatal. Multe studii au recomandat folosirea dozelor farmacologice de acid folic (4mg/zi) n scop profilactic, dar grija unei supradozri a ridicat problema folosirii unor doze fiziologice (0,5mg/zi) pentru profilaxia general antenatal. Astfel, dei nu se cunosc posibilele reacii adverse ale acidului folic asupra femeilor n perioada de fertilitate, se recomand doze mici pentru mamele cu risc mic i doze mari (4mg/zi) pentru femeile cu risc crescut. n orice caz, suplimentarea trebuie nceput cu trei luni naintea concepiei i continuat primele 8-12 sptmni de sarcin. Un efect protector, dar de intensitate mai mic, poate fi obinut i dac suplimentarea este nceput mai tarziu, chiar la nceputul gestaiei. n concluzie, dozele sugerate au fost stabilite empiric i nu se tie dac efectul protector al folailor mpotriva apariiei malformaiilor este la fel de cert ca i cel mpotriva recurenei lor. Dei nu s-au evideniat nc reaciile adverse pentru doze mari, ele pot aprea abia dup muli ani, aa cum a fost cazul unor posibile efecte teratogene ale vitaminei A (1990). Strategia cea mai corect ar consta n evitarea administrrii dozelor farmacologice dac nu exist o justificare clar. Punerea la punct a unui protocol de screening prenatal privind femeile cu risc crescut ar putea reorienta ntreaga strategie profilactic i poate fi obiectul unor cercetri ulterioare la noi n ar. 4.3. Acidul folic, inta terapiei anticanceroase Terapia antineoplazic depete n vechime vrsta de 50 de ani. Dac nainte de 1940 cuvntul cancer aprea n indexul tratatelor de farmacologie doar accidental, astzi chimioterapia reprezint o piatr de temelie n terapia cancerului. Principalul progres al ultimilor ani nu const n lrgirea numrului de ageni antineoplazici descoperii, ci n dezvoltarea conceptual a terapeuticii. Aceasta const n: stabilirea unor regimuri terapeutice mai eficace prin administrarea simultan a diverse medicamente, incluznd ageni antineoplazici i stimulatori ai rspunsului biologic; nelegerea mecanismelor de aciune ale medicamentelor, lucru care duce la prevenirea sau micorarea efectelor toxice; aprofundarea mecanismelor de rezisten la terapie; creterea ntrebuinrii terapiei adjuvante (prevenirea recidivelor i distrugerea micrometastazelor, dup radioterapie i/sau chirurgie) i neoadjuvante (administrarea nainte de radioterapie sau chimioterapie sau chirurgie pentru
Pagina 35 din 58
scderea masei tumorale); lrgirea cunotinelor despre iniierea tumoral, diseminarea, implantarea i creterea metastazelor. Antimetaboliii sunt substane proiectate ca inhibitori competitivi ai reaciilor enzimatice ale metabolismului intermediar, sau cu analogi inactivi ai substraturilor reaciilor specifice. Majoritatea sunt specifici doar n timpul anumitor faze ale ciclului celular. Antimetaboliii nu sunt administrai obinuit ca medicatie unic, datorit specificitii de faz i a faptului c afecteaz sinteza macromolecular n puncte multiple. Acidul folic reprezint o int atractiv pentru chimioterapia antitumoral, datorit rolului su esenial n sinteza precursorilor ADN. Formele reduse de acid folic (tetrahidrofolai) sunt necesare pentru sinteza purinelor i a timidilatului. N10-formil-FH4 i N5, N10-metenil-FH4 contribuie cu o grupare monocarbonat la sinteza acidului inozinic, precursorul adenilatului (AMP) i guanilatului (GMP). ntr-o alt cale metabolic important, N5, N10-metilen-FH4 asigur o grupare metil i doi atomi de hidrogen pentru sinteza timidilatului (dTMP) din deoxiuridilat. Farber i colab. au propus c analogii acidului folic pot inhiba proliferarea celulelor maligne, o ipotez care a fost confirmat de testele iniiale, cu aminopterin (acid 2,4 diamino 4 dezoxifolic), n 1948. Acest compus a fost nlocuit mai trziu cu derivatul su N10 metilat, metotrexatul (MTX). Antifolaii ocup un loc important n terapia antineoplazic; acetia au produs prima remisie temporar a leucemiei (Farber et al. 1948) i prima vindecare a unei tumori solide, coriocarcinomul (Hertz, 1963). Procentajul crescut de remisiuni complete ale coriocarcinomului a impulsionat cercetarea n domeniul chimioterapiei. Interesul pentru antifolai a crescut semnificativ dup introducerea terapiei cu doze mari combinate cu leucovorin (acid folinic, factor C), care scade efectul toxic al metotrexatului. Folosirea dozelor crescute de MTX a extins utilitatea acestuia la tumori ca sarcomul osteogenic, tumori ce nu rspund la doze mici. MTX este folosit i n terapia psoriazisului, o boal nonneoplazic caracterizat prin proliferare rapid, anormal a celulelor epidermoide (McDonald 1981). n plus, antifolaii sunt inhibitori puternici ai reactivitii imune mediate celular, avnd i rol de ageni imunosupresori ce se folosesc n transplantele de organe, n tratamentul artritei reumatoide i n granulomatoza Wegener (Jackson 1984, Chabner et al. 1985). Metotrexatul (ametopterina) a fost primul antimetabolit care a primit recunoatere clinic, ca medicament eficace, cu toxicitate acceptabil. n ultimii 20 de ani au fost testai clinic noi compui antifolai, cum ar fi diaminopirimidinele i chinazolinele. Cel mai recent dintre acestea este trimetrexatul, un antifolat chinazolinic lipofil, care ocolete obligativitatea din cazul folailor i a metotrexatului de a folosi transportul activ. Trimetrexatul are activitate
Pagina 36 din 58
puternic antiparazitar i efecte antineoplazice, testate nc n ambele specialiti. Un alt folat din ce n ce mai interesant este 10-EDAM (10-etil-5-diazo-aminopterina), un inhibitor potent al dihidrofolat reductazei, care posed transport i poliglutamare mbuntite fa de metotrexat. Trimetrexatul i 10-EDAM au demonstrat o activitate antitumoral n tratamentul carcinoamelor de intestin, plmn. MTX face parte din clasa drogurilor specifice pentru ciclul celular faza S (CCS), alturi de toi ceilali antimetabolii. n general, drogurile CCS s-au dovedit eficace mpotriva malignitilor hematologice i a altor tumori n care prolifereaz o proporie relativ crescut de celule. O problem major a chimioterapiei anticanceroase este rezistena la drog. Unele tipuri tumorale, cum ar fi cancerul colonic sau cancerul pulmonar prezint o rezisten primar, adica o lips de rspuns la prima expunere la drog. Rezistena dobndit se dezvolt n diferite tipuri de tumori iniial sensibile la tratament. Experimental, se poate observa apariia unei rezistene specifice pentru un anumit drog, care apare datorit fenomenului de amplificare genic. Alteori se observ un fenotip cu rezisten multipl, dup expunerea la un singur agent. Acesta este frecvent asociat cu creterea expresiei genei MDR 1 pentru o glicoprotein membranar (glicoproteina-P), implicnd efluxul medicamentului. Aceast protein transportoare, care apare att n celule normale ct i n celule tumorale, folosete energia ATP pentru evacuarea multor molecule strine, nefiind limitat doar la agenii antineoplazici. Un alt mecanism de rezisten multipl implic modificri calitative i cantitative n topoizomeraza II, enzima care repar leziunile produse n ADN de medicamentele antineoplazice. Principalele mecanisme de rezisten cunoscute sunt: transportul deficitar al MTX n celule (Assaraf & Shimke 1987); producia de forme de DHFR alterat, care are afinitate sczut pentru inhibitor (Thill et colab. 1988); creterea concentraiei intracelulare a DHFR; scderea abilitii de a sintetiza poliglutamai de MTX; scderea activitii timidilat-sintetazei (Curt 1985).
Pagina 37 din 58
NH2 N H2N N
N
COOH
CH2 N
R
CO N CH H CH2
CH2
Aminopterina R= - H Metotrexat R= - CH 3
COOH
NH2 N H2N N
N
Cl
COOH
CH2 N CH3
Cl
CO N CH H CH2
CH2
Diclormetotrexat
COOH
NH2 N H2N N
N
COOCH2CH3
CH2 N CH3
CO N CH H CH2
CH2
Dietilesterul metotrexatului
COOCH2CH3
NH2 N H2N N
Cl
Cl 2,4-Diamino 5(3',4' diclorfenil) 6 metilpirimidina - DDMP Analogi ai folatilor de interes clinic

Pagina 38 din 58
Structura chimica a unor analogi structurali ai folatilor 4.4. Mecanisme de aciune i rezisten Activitatea antitumoral a analogilor de folai este rezultatul substituiei unei grupri amino cu una hidroxil n poziia 4 a inelului pteridinic, schimbare care transform molecula de folat din substrat, ntr-un inhibitor ce se leag strns de enzima cheie a metabolismului folic intracelular, dihidrofolatreductaza (DHFR). Pentru a ntelege aciunea metotrexatului i a altor antifolai, este necesar s se determine rolul determinant al DHFR n metabolismul folailor. Derivaii acidului folic sunt coenzime active doar n forma complet redus de tetrahidrofolai. n reacia timidilat sintetazei (TS), acidul N5, N10 metilen FH4 este convertit la DHF. Acest cofactor inactiv devine apoi substrat pentru DHFR, care transfer doi atomi de hidrogen de la cofactorul NADPH la DHF pentru a forma FH4. n celulele cu ritm crescut a sintezei de timidilat, inhibiia DHFR cu MTX sau analogi similari duce la acumularea de cofactori folat n form inactiv, de DHF, ceea ce are ca rezultat inhibiia sintezei purinelor i timidilatului. Astfel, citotoxicitatea MTX-ului este determinat de perturbarea sintezei de novo a purinelor i a sintezei timidilatului, iar importana relativ a fiecrui efect variaz la diferitele tipuri de celule cultivate in vitro i, probabil, la celulele normale i maligne in vivo. Borsa i Whitmore au demonstrat c citotoxicitatea MTX-ului fa de limfocite de oarece poate fi crescut prin administrarea de purine, probabil datorit creterii efectului antitimidilat al MTX. Totui, n modelele de limfom L5178, MTX a avut un efect antipurinic letal. n general, ntreruperea sintezei de novo a purinelor apare n prezena unor nivele crescute de timidilat sintaz i se produce prin consumarea rezervelor de folai redui necesare sintezei acestora. Deoarece legarea strns de DHFR i depleia consecutiv a folailor redui sunt eseniale pentru mecanismul de aciune a MTX, activitatea timidilat sintazei moduleaz citotoxicitatea MTX. Inhibiia timidilat sintazei (prin administrarea Fpirimidinelor i reducerea rezervelor de dUMP) scade turnover-ul folailor redui i reduce citotoxicitatea MTX. Importana activitii timidilat sintazei n determinarea citotoxicitii MTX a fost confirmat recent de Tattetersall i colaboratorii, care au investigat capacitatea timidinei de a proteja culturi de celule mamare mpotriva unei doze letale de MTX. Cnd a fost administrat cu dou ore naintea MTX, timidina a protejat ambele linii celulare, normale i maligne. Msurarea rezervelor intracelulare de nucleotide a demonstrat c timidina realizeaz o depleie a rezervei de dUMP (prin inhibiia cu TTP a dCMP deaminazei) i
Pagina 39 din 58
ncetinete reacia timidilat sintazei, conservnd astfel folaii redui i pstrnd sinteza de novo a purinelor. MTX-ul poliglutamat are un efect inhibitor puternic i direct asupra timidilat sintazei i a enzimelor sintezei purinelor; prin aceste efecte inhibitorii pot contribui direct la citotoxicitatea drogului. Evenimentele care conduc la aciunea citotoxic a MTX, ncepnd cu transformarea membranelor celulare, transformarea n derivai poliglutamai, legarea de DHFR, deleia folailor redui intracelulari i inhibiia sintezei ADN constituie pai importani n determinarea rspunsului la tratament i a toxicitii acestui medicament.
4.5.Transportul transmembranar Traversarea de ctre antifolai a membranelor celulare a fost studiat cu mult atenie datorit legturii dintre anomaliile de transport i rezisten. Studiile clasice ale lui Goldman i colab. au stabilit c MTX intr n celule pe baza unui proces activ sensibil la temperatur, dependent probabil de o protein transmembranar. Influxul poate fi observat i n vezicule membranare izolate. Aportul celular de folai se produce prin cel puin dou mecanisme independente: folaii redui sunt internalizai printr-un sistem carrier (RFC-reduced folate carrier) cu afinitate redus (Km=1-5M) prin transport anionic, ntlnit n majoritatea celulelor, iar acidul folic i 5-metil-FH4 intr n celul n complex cu o protein membranar care leag folatul (FBP folate binding protein). FBP leag folaii cu afinitate crescut (K d de ordinul nM) i apoi i elibereaz n citoplasm printr-un proces de endocitoz mediat de receptori. Se pare c FBP acioneaz la concentraii sczute de folai (<50 nM) iar carrierul la concentraii normale sau crescute. Macromoleculele care leag folaii au fost izolate din membranele unor celule de mamifere, dar nu li s-a dovedit vreun rol n transport. Mecanismul transportor al MTX n celulele leucemice murinice i umane este deasemenea utilizat de folaii redui naturali, incluznd agentul de salvare 5-formil-FH4 (leucovorina). MTX i folaii redui concureaz, deci, pentru a intra n celul. n plus, printr-un proces cunoscut sub numele de heteroschimb, MTX intracelular liber este forat s ias din celule atunci cnd intr n celule cantiti crescute FH4 extracelular. Gena RFC e localizat distal, pe braul lung al cromozomului 21. Afinitatea carrierului pentru MTX se situeaz ntre 1M-6M pentru diverse linii de celule tumorale (murine
Pagina 40 din 58
i umane), n timp ce afinitatea celulelor epiteliale intestinale este oarecum mai sczut Km=87 M. Acest afinitate mai mare a carrier-ului celulelor tumorale este considerat ca fiind explicaia persistenei mai ndelungate a MTX liber intracelular i poate contribui la selectivitatea aciunii antifolailor mpotriva tumorilor, fa de celulele normale. Acumularea MTX n celulele tumorale poate fi influenat de ali ageni antitumorali, incluznd medicamente frecvent utilizate ca antifolai n terapiile combinate. Vincristina crete MTX intracelular, inhibnd efectul medicamentului. Concentraia vincristinei necesar pentru a produce acest efect (10M) nu este uor obinut n timpul chimioterapiei clinice, care produce frecvent niveluri sanguine maxime ale vincristinei mai mici de 0,1M. Influxul MTX este inhibat de ouabain, glucocorticoizi i cefalotin, n timp ce acumularea este crescut de probenecid, prin inhibarea efluxului. Nici una dintre aceste interacii nu a dovedit c afecteaz chimio terapia clinic. Faza proliferativ sau cinetic a celulelor influeneaz puternic procesul de transport. Celulele leucemice murinice rapid proliferative au o vitez de preluare a MTX de 3 ori mai mare i o vitez de eflux a drogului cu 50% mai mic dect o au celulele n faza staionar de cretere. Aceste modificri cresc nivelele MTX intracelular de 5-6 ori. Dependena transportului de ritmul de cretere poate contribui la creterea citotoxicitii MTX pentru celulele care se divid rapid, dar i mrirea necesarului de folai redui n fazele de cretere rapid pentru a contribui la aceasta. n continuare la procesul de transport activ cu afinitate crescut, descris mai sus, un al doilea mecanism de intrare apare la concentraii crescute ale drogului (peste 20M). Acest al doilea proces poate fi difuzie pasiv, sau un proces realizat pentru un carrier specific. Alte aspecte ale acestui proces de transport sunt lipsa competiiei dintre MTX i FH4 pentru intrare, precum i absena heteroschimbului dintre MTX si FH 4. Mecanismul de intrare explic abilitatea celulelor rezistente la transport de a prelua drogul la concentraii extracelulare crescute i reprezint o motivaie raional a utilizrii dozelor crescute de MTX n chimioterapie. Un studiu recent a lui Henderson i Zeveny a evideniat doar o singur cale de influx cu afinitate crescut pentru concentraii de pn la 50M, dar trei sisteme de eflux pentru MTX. Cel mai important dintre acestea pare s fie acelai care mediaz i influxul de MTX. A doua cale a fost caracterizat prin sensibilitatea la bromosulfonftalein, n timp ce a treia a fost insensibil la aceast substan i la inhibitori competitivi ai MTX. Contribuia acestor componente la eflux poate fi modificat n funcie de prezena extracelular a anionilor glucozei, sau a inhibitorilor metabolici. Acumularea i persistena drogului n tumori fa de esutul normal determin n mod clar durata sa de aciune n teritorii specifice. Au fost observate nivele maxime intracelulare mai mari i o
Pagina 41 din 58
persisten mai ndelungat a drogului n celulele leucemice ale murinelor, sensibile la MTX, fa de epiteliul intestinal, n timp ce linia celular sarcomatoas 180 rezistent, a acumulat concentraii mai sczute de drog, a avut perioade mai scurte ale inhibiiei sintezei ADN i a fost neafectat n experimentele chimioterapice. Analiza specific in vitro a ratelor de preluare a medicamentului de ctre celulele leucemice a evideniat o relaie pozitiv similar ntre rspunsul la medicament i transport. Exist diferene semnificative ale caracteristicelor de transport ntre diveri antifolai. Antifolaii chinazolinici au o rat de eflux mai crescut. Aceste diferene se coreleaz cu acumularea intracelular mai mare a chinazolinelor i aminopterinei fa de MTX, dup doze echimolare n vivo. Importana transportului MTX n determinarea rspunsului clinic este nesigur. Alte mecanisme de rezisten, n special creterea concentraiei de DHFR ca urmare a amplificaiei genice, au fost observate n tumori umane i murinice expuse la creteri treptate ale concentraiei drogului in vitro care poate fi un mecanism la fel de important i n practica clinic. nelegerea rezistenei la antifolai la nivel clinic rmne incomplet. Au fost propuse noi investigaii, cu scopul de a ocoli rezistena cauzat de deficiena de transport. Antifolaii liposolubili, cum sunt esterii de MTX, diaminopirimidinele, triazinaii i trimetrexatul au o excelent activitate antitumoral n culturile de celule n tratamentul experimental al tumorilor la roztoare i ar trebui s penetreze celulele deficiente n transport. Dibutilester-MTX are deasemenea proprietatea neobinuit de a inhiba ncorporarea timidinei n ADN, aparent datorit inhibiiei transportului nucleozidelor. Diesterii MTX sunt rapid hidrolizai la compusul de baz n plasma de oarece, dar sunt mai stabili n plasma maimuei, cinelui i omului; cnd sunt inhibate n aceste plasme dibutilesterii sunt convertii la derivai i monobutilici, fiind inhibitori stabili i eficace ai DHFR. Proprietile de transport ale monobutilesterilor nu au fost nc definite. Conjugaii de MTX i polilizin, care sunt toxici pentru culturile de celule ovariene de hamsteri cu transport eficient, ofer i posibilitatea de a ocoli rezistena la transport. Deoarece conjugatul polilizin-MTX nu inhib direct DHFR i toxicitatea sa poate fi anulat prin administrarea simultan de leucovorin, este probabil c i compusul suport liza intracelular, cu eliberarea antifolatului. Shen i colab. au postulat c conjugatul intr n celul prin pinocitoz i prin liza enzimatic ce apare n lizozomi. Astfel, conjugatul polilizin-MTX este transportat printr-un sistem carrier independent. Tiamin pirofosfatul, care inhib transportul MTX, protejeaz fibroblatii de oarece de toxicitatea MTX, dar nu de aceea a polilizin-MTX. Dei acidul folic este capabil s salveze celulele hepatom Reuber H35 de citotoxicitatea MTX, este incapabil
Pagina 42 din 58
s salveze o murin rezistent la transport de efectele polilizin-MTX, probabil deoarece, ca i MTX, acidul folic este incapabil s intre n celulele rezistente la transport. O alt ncercare de a depi rezistena la transport este ncapsularea MTX n vezicule fosfolipidice bistrat, numite lizozomi. Aceste plachete microscopice ce conin medicament pot, teoretic, transporta MTX la suprafaa celular, unde intrarea poate fi fcut prin pinocitoz, sau prin contopirea membranelor celulare i lipozomice. Lasserman i colab. au reuit s ndrepte lipozomi cu purttori de haptene, coninnd MTX, spre celulele mielomatoase murinice care exprimau pe suprafaa lor imunoglobuline cu afinitate pentru haptene. Dei lipozomii localizau celule int mielomatoase cu acuratee nu a fost observat nici o inhibiie a ncorporrii deoxiuridinei, deoarece coninutul veziculelor nu a putut intra n celul. Dei rezultate ncurajatoare cu lipozomi ncrcai cu MTX au fost raportate pe modele animale, majoritatea dovezilor sugereaz c mbuntirea supravieuirii provine de la ntrzierea nespecific a clearence- lui plasmatic i nu din transportul selectiv al medicamentului la tumora. O excepie posibil a acestei concluzii este tehnica de ncapsulare a MTX in lipozomi termolabili. Dac tumora este apoi inclzit, eliberarea preferenial a MTX apare la sediul tumorii, ducnd la o activitate terapeutic mbuntit.
NH2 N H2N N
N
COOH
CH2 N
CH3
CO N CH H CH2
CH2 O C COOH
N CH H CH2
COOH
MTX - aspartat Legarea reziduurilor de aspartat la MTX prin legturi - peptidice Un alt experiment a fost folosit de Heath i colab., folosind MTX- aspartat, coninut n lipozomi nvelii n anticorpii specifici antitumorali. Acest analog de MTX are capacitate limitat de a traversa membrana celular i este de 200 de ori mai puin toxic dect MTX, datorit transportului deficitar. Citotoxicitatea a aprut doar prrin eliberarea intracelular a
Pagina 43 din 58
drogului via lipozomi mbrcai cu anticorpi specifici pentru fibroblati murinici L 929. n mod ideal, va fi nevoie de identificarea unor antigene tumorale umane comune n scopul de a face acest experiment util din punct de vedere clinic. 4.6. Legarea metotrexatului la dihidrofolatreductaz Caracteristicile fizice ale legrii NADPH i a MTX de DHFR au fost stabilite prin studii cristalografice cu raze X i prin determinarea secvenelor de aminoacizi ale enzimelor naturale i ale celor modificate chimic. Au fost studiate enzime bacteriene i de la mamifere; secvenele de aminoacizi posednd similitudini puternice n poziiile implicate n legarea cofactorilor sau a inhibitorilor. n general, MTX este legat printr-o poriune lung, hidrofob, format din izoleucina-7 (sau leucina-7), alanina-9, leucina-31, fenilalanina-34 i alte reziduuri. Dou interacii mai importante particip la potenarea legrii 4-amino-antifolailor: oxigenul carbonilic al izoleucinei-7 realizeaz o legtur de hidrogen cu gruparea 4aminei ; gruparea carboxil a aspartatului-30 (sau glutamatului-30) protoneaz atomul N al MTX, dar nu i pe cel al substratului fiziologic (FH 4). n plus, substratul fiziologic pare s se lege de enzim ntr-o configuraie rsturnat, n comparaie cu inhibitorul. n prezena NADPH-ului n exces, afinitatea de legare a MTX de reductaz a fost estimat ntre 1nM i 1pM. Aceast afinitate este crescut de pH-ul acid, potenat de ionii de K+ i oxidarea gruprilor sulfhidril ale enzimei. n condiiile unui pH sczut, a excesului de NADPH i a unei afiniti sczute a inhibitorului fa de enzim, legarea este stoechiometric, ceea ce inseamn c fiecare molecul de MTX va lega o molecul de enzim. Complexul enzim-NADPH-inhibitor este extrem de stabil, supravieuind electroforezei n gel i filtrrii n gel. NADH are deasemenea capacitatea de a aciona ca i cosubstrat pentru DHFR n locul NADPH, pentru reducerea folatului i a dihidrofolatului. Spre deosebire de NADPH, NADH nu asigur legarea MTX de DHFR. Importana raportului dintre NADH i NADPH n determinarea rspunsului la MTX rmne s fie stabilit. Legarea MTX la reductaza izolat de la Streptococcus faecium genereaz lent un complex cu un Ki al inhibitorului de 58 pM. Procesul a fost denumit inhibiie strns legat i lent. Ali analogi de folai, incluznd diaminopirimidinele, trimetroprimul i aminopterina urmeaz acelai proces cinetic, de legare strns i lent, n timp ce pteridinele ce nu au
Pagina 44 din 58
gruparea acid amino benzoic se comport ca inhibitorii competitivi clasici ai enzimei. Cinetica a fost evaluat folosind i modele de simulare . n terapeutic, MTX acioneaz ca un inhibitor cu legare strns, dar reversibil. n condiiile unor concentraii crescute de substrat competitiv i la un pH normal, este necesar un exces considerabil de MTX liber pentru realizarea unei inhibiii complete a enzimei. n culturile de celule i n sisteme acelulare, 3H-MTX (MTX marcat cu 3H) legat de enzim poate fi deplasat de pe aceasta prin expunere la noi doze de drog, fenomen ce indic o disociere lent, dar stabil a MTX de pe enzim. Acest disociere lent este considerabil mai rapid dect cea calculat n experimente cu enzim pur n prezena unui exces de NADPH. Motivul acestei diferene este nc neclar, dar poate fi rezultatul diferenelor din mediul ionic, de legare prin complexe cu afinitate sczut a drogului cu DHFR i NADP+, sau doar cu enzima. Deci este necesar un exces de drog liber, nelegat, pentru a menine inhibiia total a DHFR i a sista sinteza timidilatului. De exemplu, dac se incubeaz celule tumorale cu cantiti crescute de MTX pentru a permite titrarea total a enzimei i apoi se scoate drogul nelegat din soluie, sinteza timidilatului va rencepe imediat n ciuda persistenei MTX intracelular legat de enzim.
5. REZULTATE EXPERIMENTALE n studiul prezent am folosit o metod spectrofotometric pentru a determina concentraia de acid folic din omogenate tisulare din diferite organe (ficat, rinichi, creier, splin) la obolanii albi; acest studiu a fost realizat n scopul aflrii variaiei concentraiei de acid folic n funcie de: vrst; organ. Pentru curba de etalonare am folosit: metoda biuretului pentru determinarea proteinelor celulare; reactivul naftiletilendiamin pentru determinarea acidului folic. Concentraiile acidului folic n funcie de vrst i de organ le-am estimat prin metoda descris de Lowry (Lowry, 1951), cu ajutorul acidului fosfomolibdenowolframic. Determinarea concentraiei de acid folic la obolani
Pagina 45 din 58
5.1. Material i metod Animale i diet Pentru studiu s-au folosit trei grupuri de obolani albi, de sex masculin, fiecare grup constnd n cinci obolani de vrst i greuti apropiate, astfel: 1)-primul grup: obolani tineri, cu vrsta mai mic de ase luni i greutate mai mic de 50 de grame; 2)-al doilea grup: obolani aduli, cu vrste cuprinse ntre ase luni i un an i greutate cuprins ntre 100 grame i 125 grame; 3)-al treilea grup: obolani btrni, cu vrste n jur de un an sau chiar mai mult i greutate mai mare de 125 grame. Toi obolanii au fost supui la aceeai diet. Prepararea omogenatelor tisulare Toate operaiunile de preparare a omogenatelor tisulare pentru investigaii biochimice se fac la 0-4 C. Sticlria de lucru, eprubetele i cupele de centrifug, soluiile de splare i mediile de omogenizare au fost pstrate la ghea i au fost reci n momentul ntrebuinrii. Animalele de laborator au fost decapitate i apoi supuse exsanguinrii. S-au izolat organele necesare experimentului: ficat, rinichi, creier i splin, iar apoi sau presat uor pe hrtie de filtru, pentru a ndeprta sngele. S-au cntrit foarte repede. Fiecare organ a fost splat de cteva ori (ntr-un pahar Berzelius meninut n ghea) cu soluie rece de NaCl 0,15M pn ce lichidul de splare a rmas limpede. Apoi, cu o foarfec s-a mrunit bine organul i s-a splat cu NaCl 0,15M, pna ce soluia de splare a rmas limpede. Pentru omogenizare 5 ml de soluie de NaCl 0,15M au fost adugai pe gramul de esut (cu scopul de a obine un omogenat de concentraie 10%). esuturile uor poterabile (ficat i creier) au fost omogenizate la 1500rpm, timp de 2 minute, ntr-un omogenizator de sticl tip Potter-Elvehjem. esuturile mai dure (rinichi i splin) au necesitat o omogenizare cu o durat mai crescut. Omogenatele obinute s-au centrifugat la 700 g timp de 10 minute (dup o prealabil echilibrare). Sunt sedimentai: -nucleii; -celulele ntregi; -debriurile celulare; -hematiile.
Pagina 46 din 58
Supernatantul se decanteaz i se pstreaza n ghea pentru alte determinri biochimice. Pentru a putea compara i interpreta rezultatele determinrilor biochimice pe omogenate, materialul biologic s-a standardizat n dou moduri: -prin raportare la greutatea produsului la nceputul determinrii (standard de preparare); -prin raportare la coninutul proteic al omogenatului. Standard de preparare Iniial organul sau fragmentul de organ se cntrete. n funcie de greutatea sa se realizeaz omogenate de 10-20%, diverse soluii de omogenizare. Standardizarea se obine preparnd totdeauna omogenate de aceeai concentraie. Raportarea la coninutul proteic Este metoda de standardizare cea mai utilizat. Metoda de determinare a proteinelor celulare folosit pentru standardizare (metoda biuretului) -sensibilitate de 0,25-10mg/ml omogenat Principiu: Proteinele celulare dau cu reactivul biuret un derivat de culoare albastr caracteristic, a crei intesitate este direct proportional cu concentraia proteinelor din prob. Reactivi: 1.reactivul biuret; 2.NaOH 10%. Reactivul biuret se prepar astfel: -tartrat de sodiu i potasiu 9g; -CuSO45H2O 3g; -KI-5g; Se dizolv i se aduce la 1000ml cu NaOH 0,2N.
Pagina 47 din 58
Reactivul preparat corect este de culoare albastr. Se pstreaz timp nelimitat. Dac reactivul este contaminat cu alte substane apare un precipitat rocat i nu se mai folosete. Tehnica Deoarece omogenatele tisulare nu sunt soluii limpezi, ele prezint o anumit turbiditate, dnd cu reactivul biuret un efect secundar ce interfer cu reacia de culoare. Se face pentru fiecare determinare i un martor de turbiditate. Martor de culoare 2 ml apa distilat 1 ml NaOH-10% 3 ml reactiv biuret Martor de turbiditate 1,8 ml apa distilat 0,2 ml omogenat 1 ml NaOH-10% 3 ml apa distilat Proba 1,8 ml apa distilat 0,2 ml omogenat 1 ml NaOH-10% 3 ml reactiv biuret
Se agit bine. Se las n repaus 30 de minute la temperatura camerei, dup care se citete extincia la lungimea de und de 540 nm, cu grosimea stratului de 10 nm. Se citete extincia probei fa de cea a martorului de culoare , iar extincia martorului de turbiditate fa de cea a apei distilate. Calculul cantitii de proteine se face prin raportarea valorii corespunztoare diferenei dintre cele dou mrimi la o curb etalon. Curba etalon -se prepar o soluie standard de albumin seric de bou; -se pregtete o scar de diluii de concentraii cunoscute cuprinse ntre 0,25-60 mg/ml ; -se respect pentru fiecare diluie protocolul prezentat n tabelul anterior ; -se reprezint grafic modul de variaie a extinciei n funcie de concentraia soluiei de proteine
Concentraie (mg/ml) 60 30
Extincie (p/c-t/H2O)* 0,617 0,320

Pagina 48 din 58
15 0,166 7,5 0,090 3,75 0,042 1,875 0,024 0,9375 0,012 0,46875 0,006 0,234375 0,003 *)-extincia probei fa de cea a martorului de culoare minus extincia martorului de turbiditate fa de cea a apei distilate
5.2.Determinarea coninutului n acid folic Reactivi -fosfat dibazic de potasiu soluie 3%; -permanganat de sodiu 0,4%; -azotit de sodiu soluie 2%; -acid clorhidric soluie 5N; -acid sulfamic soluie 5%; -diclorhidrat de N (1-naftil) etilendiamina NED soluie 0,1%.
Tehnica Proba Martor de turbiditate Martor de culoare 2,5 ml KmnO4 0,5 ml KMnO4 0,5 ml NaNO2 0,5 ml HCls O,5 ml acid sulfamic 0,5 ml NED
2,5 ml omogenat 2,5 ml omogenat 0,5 ml KMnO4 0,5 ml ap Se las 2-3 minute 0,5 ml NaNO2 0,5 ml NaNO2 0,5 ml HCl 0,5 ml HCl Se agit puternic i se las 2 minute O,5 ml acid sulfamic O,5 ml acid sulfamic Se agit puternic pn la ndeprtarea NO2 0,5 ml NED 0,5 ml NED
Pagina 49 din 58
Se citete extincia probei fa de cea a martorului de culoare i a martorului de turbiditate fa de cea a apei distilate dup 10 minute la lungimea de und 530 nm n cuv de 10 mm. Calculul cantitii de acid folic se face prin raportarea valorii corespunztoare diferenei dintre cele dou mrimi la o curb etalon. Curba etalon: -se prepar o soluie standard de acid folic; -se pregtete o scar de diluii cu concentraii cunoscute cuprinse ntre 1,2023-130 g/ml; -se respect pentru fiecare diluie protocolul prezentat n tabelul anterior; -se reprezint grafic modul de variaie al extinciei n funcie de concentraia soluiei de acid folic. Concentraie Extincie Extincie
g/ml p/t* p/c t/H2O 130 1,226 1,2648 108,33 1,0508 1,0728 86,66 0,8756 0,8555 65 0,6198 0,565 43,33 0,3585 0,2905 21,66 0,2758 0,1766 10,83 0,1555 0,0718 7,22 0,1394 0,0431 3,61 0,1180 0,0303 *)extincia probei fa de cea a martorului de turbiditate **)-extincia probei fa de cea a martorului de culoare minus extincia martorului de turbiditate fa de a apei distilate.
Msurarea cantitilor de acid folic din omogenatele tisulare Concentraiile de acid folic au fost estimate prin metoda NED (N-1-naftiletilen diamina), o metod de baz, spectrofotometric. Aceast metod se folosete ca tehnic de dozare n industria farmaceutic (Atanasiu i colab., 1989)
Pagina 50 din 58
Reactivi -_monofosfat de potasiu 3%; permanganat de potasiu 0,4% ; NaNO2 -2% acid hidrocloric 5%; acid sulfamic 5% NED-0,1%
Tehnica
Proba 2,5 ml omogenat 0,5 ml KMnO4 Se las 2-3 minute 0,5 ml HCl 0,5 ml NaNO2 Se agit i se las 2 min 0,5 ml acid sulfamic
Martor de culoare 2,5 ml K2HPO4 0,5 ml KMnO4
0,5 ml HCl 0,5 ml NaNO2
0,5 ml acid sulfamic
Se agit pn cnd N2 este complet nlturat 0,5 ml NED Se las 10 minute 0,5 ml NED
Se citete extincia fa de martorul de culoare la lungimea de und de 530 de nm; concentraia de acid folic corespunztoare acestei extincii s-a calculat prin raportarea la curba standard (prin metoda expus anterior).
Pagina 51 din 58
Rezultatele obinute s-au exprimat att n funcie de greutatea iniial a organului (g de acid folic/g de esut), ct i n funcie de concentraia de proteine din omogenat (g de acid folic/mg de proteine). Msurarea concentraiei de proteine din omogenat Concentraia de proteine a fost calculat prin metoda descris de Lowry (Lowry, 1951), metod bazat pe acidul fosfomolibdenowolframic (reactivul Folin-Ciocalteu). Reactivi Reactivul A: - 4g NaOH; -10g sare Seignette; -ap distilat pn la 1000ml; Reactivul B: -5g CuSO45 H2O; -ap distilat pn la 1000 ml; Reactivul C: -25 ml reactiv A + 0,5 ml reactiv B; Reactivul D: -acid fosfomolibdenowolframic. Tehnica Peste 20 l de omogenat se adaug 180 l de ap distilat, iar apoi se adaug 5ml reactiv C i 0,5ml reactiv Folin-Cioclteu; ntregul amestec a fost agitat i dup aceea lsat timp de 30 de minute. Extincia s-a citit la o lungime de und de 660 nm, fa de un martor ce coninea 20l de ap distilat n loc de 20l de omogenat. Rezultatele au fost deasemenea raportate la o curb etalon, curb construit pe baza unor concentraii proteice cunoscute (prin metoda descris anterior).
Pagina 52 din 58
OH N H2N N N N CH2 NH CO N CH CH2 H COOH CH2 COOH
KMnO4
OH N N N N COOH
PRODUSI
H2N
2-amino-4-hidroxi-6-carboxipteridina U.V.
OH N H2N N N N
- CO2
2-amino-4-hidroxipteridina 1/2 O2
OH OH N N H2N HO N N
N N N N
Isoxanthopterina
OH OH
HCl 5N 2,4,7-trihidroxipteridina HNO2

OH H3NO3S N N
CHO COOH Acid glioxilic
HO
HO N N OH NH2 N
+ 2,4,7-trihidroxipteridina NH2 OH 2,4-dihidroxi-5,6-diaminopirimidina NaftiletilenPagina 53 din 58 diamina Compus violet
5.3.Rezultate i discuii Variaia concentraiei de acid folic: n funcie de vrst i organ
Acid folic Concentraie (valoare eroare)
Proteine Concentraie (valoareeroare)
Organ
Grupa de vrst
g de acid folic/g de esut
g de acid folic/mg de proteine
mg de protein/ml omogenat
tnr Ficat adult
431,484,76
25,741,76
2,800,99
322,073,36
30,121,12
2,710,43
btrn
195,522,83
18,542,55
2,110,33
tnr Rinichi adult
333,138,08
27,936,54
2,130,41
208,574,54
20,373,88
1,250,13
btrn
227,312,03
46,739,07
1,130,13
tnr Creier
336,369,23
29,041,43
2,060,72
Pagina 54 din 58
adult
110,483,17
27,812,87
1,610,33
btrn
27,082,31
7,442,77
1,230,27
tnr
120,731,68
20,033,88
1,070,04
Pagina 55 din 58
450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 Tineri Adulti Batrani Splin adult 109,039,74 17,082,53 1,130,17 Ficat 431.8 322.07 195.52 Rinichi 333.13 208.57 227.31 Creier 336.36 110.48 27.08 Splina 120.73 109.03 91.53
btrn 50 45 40 Variaia concentaiei 35de acid 30 grupe de vrst 25 n gAF/g de esut 20 15 10 5 0 Ficat Tineri Adulti Batrani 25.74 30.12 18.54
91,533,83
6,411,74
1,250,28
folic
pe
exprimat
Rinichi 27.93
Pagina 20.37 56 din 58
Creier 29.04 27.81 7.44
Splina 20.03 17.08 6.41
46.73
Variaia concentaiei de acid folic pe grupe de vrst exprimat n gAF/mg prot.
450 400 350 300 250 200 150 100 50 0

Ficat Rinichi Creier Splina
Tineri 431.48 333.13 333.36 120.73
Adulti 322.07 208.57 110.48 109.03
Batrani 195.52 227.31 91.53 27.08
Variatia concentratiei de acid folic pe grupe de varsta exprimata in g AF/g de tesut Variaia concentraiei de acid folic pe grupe de vrst Din studiul grafic al variaiei concentraiei de acid folic pe grupe de vrst (exprimat n g de AF/g de esut) s-a observat o scdere gradat de la tineri spre aduli i spre btrni, cu excepia concentraiilor de acid folic din omogenatul din rinichi. n acest caz particular concentraia de acid folic scade de la tineri la aduli, ca apoi s creasc paradoxal la obolanii btrni. Sunt dou posibile explicaii prentru aceste variaii neateptate. prezena unei concentraii crescute de folai n omogenatul de rinichi la tineri; prezena unei concentraii sczute de proteine n acest omogenat. Dintre aceste dou ipoteze ultima este mai plauzibila. Aceast ipotez s-a justificat prin corelarea cu valorile calculate a concentraiilor proteinelor din omogenatul de rinichi de la tineri i de la aduli.
Pagina 57 din 58
n ceea ce privete concentraiile de acid folic din creier nu are valoare faptul c s-a obinut o scdere a concentraiilor de acid folic (de aproximativ trei ordine de mrime) de la tineri spre aduli. Variaiile concentraiilor de acid folic n funcie de organ: Din toate tipurile de reprezentri grafice, pe grupe de vrst, rezult faptul c indiferent de modalitatea de exprimare a acidului folic (g acid folic/g de esut sau g acid folic/ mg de proteine) nivelul cel mai crescut de folai s-a obinut n omogenatul de ficat; aceste rezultate sunt n concordan cu studiile histologice fcute anterior (Onicescu i colab., 1979) i cu nivelul activitii metabolice din ficat (implicnd metabolismul hepatic a unei singure uniti carbonice). S au obinut cantiti mult mai mari de acid folic n ficat i rinichi, fa de valorile corespunztoare din splin i creier.
50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
Ficat Rinichi Creier Splina
Tineri 25.74 27.93 29.04 20.03
Adulti 30.12 20.37 27.81 17.08
Batrani 18.54 46.73 7.44 6.41
Variaiile concetraiilor de acid folic n funcie de organ (exprimate n g AF/mg de proteine) Concluzii
Pagina 58 din 58
n acest studiu s-a dovedit o inciden crescut a deficitului de acid folic la btrni, deficit cauzat n principal de malnutriie. Este necesar o evaluare ulterioar pentru a demonstra rolul patogenic a deficitului de acid folic n diferite sindroame clinice la btrni (ca de exemplu deficite imunologice i neuropsihiatrice). Tabloul clinic nespecific al malnutriiei la btrni (care este adesea greit diagnosticat) nsoit de deficien de folai induc homocisteinemia i se asociaz cu un risc crescut cardiovascular. Aceste observaii sunt argumente n favoarea urmtoarelor concluzii: strii nutriionale a btrnilor trebuie s i se acorde o mai mare importan dect unui diagnostic de rutin soluia este suplimentarea de acid folic la btrni (mcar la pacienii cu risc de a dezvolta o deficien de acid folic, la pacieni instituionalizai la geriatrie, la pacienii ce consum mncare conservat etc.); aceast soluie este att sigur ct i ieftin (singura reacie advers a fost observat la epileptici).
Pagina 59 din 58

Stiudiu de Caz Privind Acidul Folic Si A Derivatilor.

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Stiudiu de Caz Privind Acidul Folic Si A Derivatilor.

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

Studiu de caz privind acidul folic si derivatii sai

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

CO N CH CH2 CH2 H COOH Acid p-aminoAcid glutamic benzoic

Acid folic ( pteroilglutamic )

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

aranjarea intramoleculara a nucleului pteridinic

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

Structura pteridinei si a pterinei

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

COOH CO NH CH (CH2)2 COOH

COOH CO NH CH (CH2)2 COOH

Vitamina Bc - conjugata (Pte-Glu7) Structura unor compusi pteroidici si folici

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

Acid-N10-formil-pteroic (Factor SLR)

Structura unor compusi pteroidici si folici

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

OH N H2N N N N CH2 NH CO N CH CH2 H COOH

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

Structura generala a derivatilor acidului folic N5 - substituiti COOH

2-amino, 4-hidroxi 6-metil pteridina

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

Aldehida 2,36-hidroxi-2,4,5-triamin dibromoproprionica pirimidin clorhidrat

NH2 . 2HCl NH2

Acid folic + 2 NaCl + 2NaBr + H2O

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

Acid p-aminobenzoil - SCoA

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

Acid N-10-tetrahidrofolic + ADP + P

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

Acid N5, N10- meteniltetrahidrofolic

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

Acid N5, N10 -metenil-tetrahidrofolic

Acid N-10-formil-FH4 Acid N-10-formil-tetrahidrofolic H

+ Acid N5 , N10 -metilen-tetrahidrofolic

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

(CH2)2 H2N CH COOH

+ Acid N5-formimino-tetrahidrofolic Acidul N-5-formimino-tetrahidrofolic (N-5-fi-FH4), sub aciunea unei

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

CH2 CH2 H2N CH COOH

SH + N-5-CH3 FH4 H2N

CH2 CH2 CH COOH

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

COOH CH2 N CH3 CH3

COOH CH2 N CH3 CH2OH

COOH CH3 + [O] CH2 NH CH2OH

COOH CH2 NH2

CH2 H2N CH COOH

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.