Bioloki fakultet Univerziteta u Beogradu

Teorijski model interakcije izmeu Ca2+ kalmodulina i kinaze lakog lanca miozina
Seminarski rad

Predmet Sistemska biofizika

Profesor

Beograd

Uvod

Kompleks koji obuhvata Ca2+, kalmodulin I kinazu lakog lanca miozina ( MLCK ) ima vanu ulogu u procesu kontrakcije glatkih miia. Kontraktilni aparat glatkih miinih elija ine tanki filamenti , kao i miosinski molekuli koji nisu stalo organizovani u debele filamente. Pored aktinskih filamenata u izgradnji tankih filamenata uestvuju i molekuli tropomiozina koji se oko aktinskog filamenta zavojiasto savijaju. Ovako organizovanom tankom flamentu pridrueni su i molekuli kaldesmona. Kaldesmon je filamentozni protein koji na aktinskom filamentu blokira mesta vezivanja miosina. Sam proces kontrakcije poinje kada se povea koncentracija Ca2+ u citosolu. Joni Ca2+ prevashodno potiu iz kalveola i iz vanelijske sredine a njihov ulazak obezbeuju kanali za prolaz jona kalcijuma koji odlikuju plazminu membranu. Joni kalcijuma se vezuju za etiri mesta na kalmodulinu formirajui kompleks Ca2+- kalmodulin ( Ca4CaM), zatim taj kompleks dovodi do aktivacije kinaze lakog lanca miozina koja fosforilie jedan od lakih miozinskih lanaca u nivou glave miosinskog molekula. to se molekula miosina tie, u neaktivnom stanju njihov repni region je savijen a ispravlja se tek u aktivnom stanju. Rep aktiviranog miosinskog molekula se ispravlja i tako dolazi do privremenog formiranja debelog filamenta. S druge strane, fosforilovanje kaldesmona dovodi do njegovog odvajanja od tankog filamenta i deblokiranja aktinskog molekula za koji se vezuje glava miosinskog molekula. Potom sledi klizanje tankog filamenta. Smanjenje koncentracije nivoa kalcijuma u citoplazmi i kalveolama dovodi do odvajanja Ca2+ od kalmodulina, inaktivacije kinaze lakog lanca miosina, uvrtanja njegovog repnog regiona i relaksacije. Prema eksperimentalnim rezultatima, aktivnost MLCK odreuje brzinu i nivo fosforilacije lakog lanca miozina, to rezultira veom brzinom kontrakcije usled poveanja brzine ciklinog stvaranja aktinsko-miozinskih mostova.

Na osnovu novih eksperimentalih rezultata utvren je jo jedan model koji pokazuje na koji nain dolazi do vezivanja Ca2+ za kalmodulin pri njegovoj niskoj koncentraciji u citosolu. Kada se kalmodulin vee za MLCK stvara se kompleks CaMMLCK. Stvaranjem ovog kompleksa raste afinitet za vezivanje Ca2+ na dva vezujua mesta na C-terminusu na kalmodulinu. I moe da doe do stvaranja Ca2CaM. Meutim, ni jedan od ova dva kompleksa ne moe aktivirati MLCK. Aktivacija MLCK se se javlja samo pri dovoljno visokim koncentracijama Ca2+ kada su pored vezujuih mesta na C-terminusu saturisana i vezivna mesta na N-terminusu. I kada se Ca2+ vee za sva etiri mesta dolazi do konformacione promene na MLCK pri emu se ona aktivira. U modelu se detaljno obrauje kinetika ema interakcije izmeu Ca2+, CaM i MLCK, uzimajui u obzir razliita vezivna mesta za Ca 2+ na kalmodulinu na njegovim C i N-terminusima, kao i vezivno mesto za MLCK. Glavni cilj ovako detaljno predstavljenog modela je da se teorijski predvidi koncentracija ativne forme MLCK u zavisnosti od koncentracije Ca2+. Kinetika ema pokazuje kako razliiti parametri utiu na pojedine korake u reakciji, a samim tim i kako utiu na aktivnu formu MLCK. Vrednosti veine parametara su bazirani na eksperimentalnim rezultatima. Variranje parametra K2, koji predstavlja konstantu disocijacije MLCK sa Ca4CaM, daje nam jasan uvid o aktivnosti MLCK.

Model i njegove karakteristike

Za analizu interakcija izmeu Ca2+, CaM i MLCK korien je teorijski pristup.

Slika 1. Kinetika ema interakcija izmeu Ca2+, CaM i MLCK

Na slici 1. predstavljena je kinetika ema modela u obliku kocke na osnovu koje je izveden matematiki model. U subskriptu se nalaze tri vezivna mesta na kalmodulinu : N i C koji vezuju dva Ca2+ i M koje vezuje MLCK. Prazna crta (_) u subskriptu oznaava da je vezivno mesto na CaM prazno a odgovarajue slovo da je popunjeno. Na primer CaM_CM oznaava Ca2CaMMLCK kompleks sa dva Ca2+ jona vezana za terminus kalmodulina. Konstante ki i k
-i

(i=1-12), su ON i OFF brzinske konstante, koje se odnose

na izgradnju molekula (ON) i na disocijaciju (OFF). S obzirom na to da na kalmodulinu postoje tri nezavisna vezivna mesta i svaki od njih moe da bude u popunjen ili prazan, postoje 23 =8 razliitih komleksa. U emi na slici svaki od ovih komleksa je postavljen u teme kocke i povezan sa tri susedna kompleksa pomou dvosmernih reakcija du ivica kocke. Na osnovu ovoga se zakljuuje da postoji ukupno 12 razliitih reakcija i 24 konstante. Matematiki model ima devet promenljivih - stanja CaM-a su predstavljena sa osam promenljivih, koncentracija slobodnog MLCK je deveta, a [Ca2+ ] je uzeta u obzir kao parametar. Broj diferencijalnih jednaina prvog reda je sveden na sedam (od 3-9), a jednaine 1 i 2 predstavljaju koncentracije CaM i MLCK. Diferencijalne jednaine prvog reda su jednaine za brzine pojedinanih reakcija.

[CaM] = [CaMtot] - ( [CaMNC_] + [CaM_CM] + [CaM_C_] +[CaM_M] + [CaMN_] +[CaMN_M]+ [CaMNCM] ) (1)

[M] = [Mtot] - ( [CaM_CM] + [CaM_M] +[CaMN_M]+ [CaMNCM] )

(2)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

(9)

Stabilno stanje sistemskih promenljivih pri razliitim koncentracijama Ca2+ nalazi se integracijom dinamikog sistema pri emu su za poetne uslove uzete relacije [CaM_] = [CaMtot]. Model uzima u obzir vezivanje dva jona Ca2+ za CaM. Prema tome ON brzinska konstanta se definie kao ki = k_i /ki2 gde je k_i OFF brzinska konstanta, a ki konsanta disocijacije. Eksperimentalna ON brzinska konstanta kiapp definie se kao kiapp = k_i /ki pa se odnos izmeu ki modela i eksperimentalne vrednosti kiapp definie kao ki = kiapp/k. Vrednosti za konstante su naene u literaturi, a nepoznate vrednosti parametara su izvedene primenom Wegscheider- ovog uslova koji je primenljiv na zatvorene reakcione sisteme,i po kome je proizvod konstanti jednak jedinici.

Kj oznaava ili Kn ili Kn2, u zavisnosti od posmatrane reakcije. Ki odgovara vezivanju MLCK za CaM, a ki2 vezivanju dva Ca2+ za CaM. Za naredne obrade, radi pojednostavljenja, uvodimo smenu ki2 = ki*. Kinetika ema ukljuuje est osnovnih zatvorenih ciklusa oko svake ravne kocke. Na sve njih moe se primeniti Wegscheider- ov uslov. . Jednaine koje opisuju ovih est sistema su: 7

K1*-1 K2K3* K4-1 = 1, K3*-1 K7* K10* K6*-1 = 1,

K1*-1 K8* K12* K5*-1 = 1, K2-1 K8* K11K7*-1 = 1 K4-1 K5*K9 K6-1 = 1, K6-1 K10* K11 K12*-1 = 1

Korienjem Wegscheider- ovog uslova dobijaju se vrednosti nepoznatih K4, K5*, K9, K10* I K11. Ove vrednosti kao i poznate vrednosti za OFF brzinske konstante su zatim uvrene u jednainu i dobijene su vrednosti za ON brzinske konstante ( ki= k-i/ Ki2 ). Eksperimentalno dobijene vrednosti za OFF brzinsku i konstantu disocijacije esto variraju jer se eksperimenti esto izvode sa peptidima koji sadre jezgro CaM vezujue sekvence MLCK ili sa genetikim ininjeringom dobijenim CaM. Vrednosti parametara su uzete iz razliitih eksperimenata, a na ravnotene konstante primenjen je Wesscheider- ov uslov to dovodi do toga da promena u jednom parametru utie na bar jo jedan parametar uslova. Zbog toga direktan prenos referentnih vrednosti parametara u model podrazumeva njihovo dodatno podeavanje. Set vrednosti parametara modela predstavljeni su na tabelama 1 i 2. Podaci su dobijeni iz studije genetikih svojstava interakcije izmeu Ca2+, CaM i MLCK. i 1 3 5 6 7 8 10 12 Ki (M) 0.365 2.83 0.10 1.46 1.46 0.20 2.83 0.182 K i * (M 2) 0.133 8.00 0.010 2.14 2.14 0.040 8.00 0.0333 ki (M-2 s-1 ) 30.0 100 20 2.80 2.80 5.0 100 120 k_i [s-1] 4.00 800 0.20 6.00 6.00 0.20 800 4.00

Tabela 1. Parametri modela koji se tiu vezivanja Ca2+ za CaM

i 2 4 9 11

Ki (M) 0.001 0.060 12.8 0.054

ki (M-1 s-1 ) 1000 1000 910 840

k_i [s-1] 1 60 11700 45

Tabela 2. Parametri modela koji se tiu vezivanja MLCK za CaM

Kinetika svojstva sistema su: Afinitet MLCK za Ca2CaM nii je od afiniteta za Ca4CaM Afinitet C terminusa za Ca2+ u odsustvu MLCK je 2-4 puta vei nego afinitet N terminusa U prisustvu MLCK afinitet C terminusa je dosta manji Ca2+ se vezuje mnogo bre za N nego za C terminus Prisustvo MLCK usporava disocijaciju Ca2+ 30-50 puta U prisustvu MLCK Ca2+ disocira 15-30 puta bre sa N nego sa C terminusa Efekti MLCK na afinitet N I C terminusa za Ca2+ su otprilike isti Afinitet MLCK za slobodni CaM u poreenju sa Ca2CaM I Ca4CaM je veoma nizak U skladu sa eksperimentalnim uslovima koriene su vrednosti od 10M i 2M za totalnu koncentraciju CaM, odnosno MLCK. Ovo je u skladu sa izmerenim koncentracijama u glatkim miiima.

Rezultati i diskusija
U in vitro uslovima kvantitativno je ispitana aktivnost MLCK FRET metodom (fluorescentni rezonantni energetski transfer), gde FRET signal predstavlja meru vezivanja Ca2+/CaM za MLCK, naroito Ca4CaM-MLCK, a verovatno i Ca2CaM-MLCK kompleksa. Poto fosforilacija MLCK ima slinu zavisnost pretpostavljeno je da FRET moe biti mera njene aktivnosti. Da bi pravilno uporedili rezultate modela sa eksperimentalnim vrednostima, definiemo dve promenljive A i F koje imaju vrednosti izmeu 1 i 0.

One su definisane kao:

- definie nivo aktivne MLCK

- definie nivo MLCK u kompleksu sa Ca4CaM i Ca2CaM

Grafik 1. Vrednosti A (puna linija) i F (isprekidana linija) u zavisnosti od [Ca2+]. [CaMtot]=2M i [CaMtot]=10M. K2=1nM (konstanta disocijacije MLCK za Ca4CaM).

10

Grafik 2. Vrednosti A (puna linija) i F (isprekidana linija) u zavisnosti od [Ca2+]. K2=0.1, 1, 10nM; K4=6, 60 i 600nM; K9=1.28, 12.8 i 128M; K11=5.4, 54, i 540nM; [CaMtot]= [MLCKtot]=2M.

Na graficima 1 i 2 su poreena predvianja modela za promenljive A i F nasuprot koncentraciji Ca2+ sa Ca2+ FRET signalom ( kruii na grafiku koji su od eksperimentalne vrednosti ). Na grafiku 1 se uoava da je kriva za promenljivu F ( isprekidana linija ) uvek iznad krive za A ( puna linija ) pri [CaMtot]=2M i [CaMtot]=10M, jer je F>A. Razlika izmeu F i A na istoj vrednosti ukupnog [CaM] je znaajna, to govori u prilog prisustvu kompleksa Ca2CaM*MLCK, ve pri niskim [Ca2+]. Najvee slaganje sa eksperimentalnim podacima iz in vitro FRET eksperimenta postoji kada je [CaM tot]=2M. Vrednosti parametara u tabeli 1 i 2 i totalne koncentracije CaM i MLCK od 2M su referentne vrednosti modela. U ovoj emi parametar K2 predstavlja afinitet Ca4CaM za MLCK. U literaturi se mogu nai razliite vrednosti ovog parametra. Ravnotene konstante kao to je spomenuto, zavise od Wegscheider-ovog uslova usled ega promena vrednosti jednog parametra utie na bar jo jedan parametar. Najmanji broj parametara koji se menja usled promene K2 jesu tri parametra K4, K9, K11 .Tako desetostruko poveanje ili smanjenje K2 indukuje desetostrko poveanje ( smanjenje ) vrednosti ovih parametara.

11

Na grafiku 2. uoavamo znaajno odstupanje vrednosti F od referentnog stanja pri desetostrukom smanjenju K2, za razliku od vrednosti A, gde odstupanje nije toliko izraeno. Desetostruko poveanje parametra, rezultira u poveanju vrednosti parametra A, u odnosu na referentno stanje. Grafik 3. . Vrednosti A (puna (isprekidana linija) u zavisnosti K2=0.1, 1, 10nM; [MLCKtot]=2M; K2=1nM stanje. linija) i F od [Ca2+]. [CaMtot]= referentno

Na grafiku 3 je prikazano predvianje modela za promeljive A i F pri variranju K2, odnosno pri desetostrukom poveanju ( smanjenju ) vrednosti K2 u odnosu na referentnu vrednost ( 1nm ), a pri tom su vrednosti ostalih parametara iste. Vrednosti parametara koje su koriene u ovom modelu odnosile su se na stacionarno stanje sistema, ali u fiziolokim uslovima stanje ne mora da bude uvek stacionarno tako da variranje jednog parametra bez uticaja na druge, moe biti opravdano. Poveanje K2 ima vei uticaj na vrednosti A i F.

12

U zakljuku moe da se navede da je glavni cilj matematikog modela- teorijsko predvianje koncentracije aktivne forme MLCK u zavisnosti od Ca2+ uglavnom ispunjen. Poveanje koncentracije Ca2+ inicira vezivanje Ca2+ za etiri vezivna mesta na kalmodulinu, i samo kompleks Ca4CaM ima sposobnost da aktivira MLCK. Dalje je zakljueno da i CaM bez vezanog Ca2+ kao i CaM sa vezana 2 jona Ca2+ mogu da ineraguju sa MLCK ali ne i da je aktiviraju. Eksperimenti novijeg datuma pokazuju razliite afinitete za vezivanje Ca2+ za CaM, kada je CaM u interakciji sa MLCK, kao i razlike u disocijaciji komleksa sa Ca2+. Takoe u ovom modelu mogu da se uoe neka odstupanja od eksperimentalno dobijenih podataka, meutim ta odstupanja nisu statistiki znaajna tako da ovaj model moe da se okarakterie kao prilino dobar. On daje jedan nov pogled na ranije jednostavno razmatranje interakcija izmeu Ca2+, CaM i MLCK i time otvara vrata za nove ideje.

13

Literatura:

1. Ale Frajmut, Milan Brumen, Stefan Schuster (2005.) Theoretical model of the ineractions between Ca2+, calmodulin and miosin ligh chain kinase, FEBS Letters 43614366 2. Fiorin G., Pastore A., Karloni P., Parrinello M. Using metadynamics to understand the mehanism of calmodulin/target recognition at atomic detail. Byophus J. (2006.) 91(8):27688-77 3. Kasri NN., Torok K., Galione C., Gamham C., Callevaert G., Missiaen L., Parys JB., De Smedth H., Endogenously bound calmodulin is essential for the function of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor. J Biol Chem (2006.) 281(13):8332-8 4. Nada erban. Osnovi histologije. 5. Theoretical and experimental investigation of calcium-contraction coupling in airway smooth muscl. Availabele at URL : http://www.springerlink.com/content/j433635365t05832/? p=5ba4c9122513489fbef9d80bec733d6a&pi=0

14