Proprietatile proteinelor

I.3.1. Proprietati fizice Solubilitatea proteinelor este extrem de diferita si depinde de structura acestora. n general, proteinele fibrilare sunt insolubile n apa. Celelalte proteine prezinta grade diferite de solubilitate, aceasta proprietate stnd la baza unor metode de separare si purificare preliminara. Unele proteine sunt usor solubile n apa, altele sunt solubile n apa si n diferiti solventi organici, alte proteine se solubilizeaza doar n solutii saline de diferite concentratii etc. Datorita prezentei unei multitudini de grupe functionale libere ionizabile n structura macromoleculelor 11511f524l proteice (COO, NH3+, S etc.), solutiile proteinelor prezinta un caracter amfoter. Pe aceasta proprietate se bazeaza si rolul de sistem tampon pe care proteinele solubilizate n diferite lichide biologice l ndeplinesc alaturi de sistemul tampon carbonat-bicarbonat, sistemul tampon al aminoacizilor, al hemoglobinei si altele. Ca si n cazul aminoacizilor, datorita prezentei grupelor functionale ionizate n moleculele proteinelor, acestea se caracterizeaza prin valori bine determinare ale punctului lor izoelectric (sau pH izoelectric pI sau pHi) care se defineste ca fiind acea valoare de pH la care ncarcarea electrica globala a moleculei este nula. Acest parametru fizico-chimic prezinta o importanta practica deosebita, el stnd la baza metodelor electroforetice de separare si determinare a diferitelor fractiuni proteice din lichidele biologice. Valorile punctelor izoelectrice ale proteinelor oscileaza ntre limite foarte largi si nu depind de masa lor moleculara (tabelul II). n structura tuturor proteinelor solubile aflate n mediu apos pot ioniza grupele NH2 terminale si grupele COOH terminale. n afara de acestea, exista 7 aminoacizi ale caror resturi pot ioniza chiar si atunci cnd se situeaza n interiorul catenelor polipeptidice. Tabelul II. Principalele constante fizico-chimice ale unor proteine native Proteina Actina Adrenocorticotropina porcina Albumina serica bovina Albumina serica umana Antitoxina difterica b-Amilaza din cartof Chimotripsinogenul bovin Enolaza Feritina Masa moleculara (Da) 70.000 4.500 66.500 65.000 160.000 152.000 25.400 67.000 480.000 Constanta de sedimentare (S) 4,0 4,4 4,3 7,0 8,9 2,54 5,6 pI 4,8 7,0 4,7 5,2 9,5

Fibrinogenul uman Fumaraza Hemocianina (Helix pomatia) Hemoglobina umana Insulina bovina Lactalbumina Lizozim (din oul de gaina) Mioglobina (casalot) Ovalbumina Papaina Pepsina Ribonucleaza bovina Tiroglobulina ovina Toxina difterica Tripsinogenul bovin

450.000 194.000 9.000.000 64.500 5,733 17.400 14.600 17.300 44.000 20.900 35.000 13.700 669.000 72.000 23.700 I.3.2. Proprietati chimice

9,0 8,5 103,0 4,5 1,2 1,9 1,9 2,04 3,6 2,4 3,3 1,64 19,2 4,6 2,5

4,7 6,8 5,6 11,0 7,0 4,6 8,7 1,1 9,45 4,5 4,1 9,3

Hidroliza proteinelor si peptidelor naturale. Analiza compozitiei n aminoacizi a unei proteine native sau a unei peptide naturale este deosebit de importanta pentru studiul structurii chimice a acestora. Totodata, ea pune multe probleme printre care, cea mai importanta o constituie puritatea materialului folosit pentru analiza. Acest material nu trebuie sa fie impurificat cu substante cu masa moleculara mica (saruri utilizate la purificare, lipide, glucide, ioni metalici etc.). Gruparile prostetice ale heteroproteinelor se separa de componentele proteice nainte de a se trece la hidroliza acestora din urma. n functie de modul de realizare, hidroliza peptidelor si proteinelor este de mai multe tipuri. 1. Hidroliza acida. Proteina supusa analizei este liofilizata si redizolvata n solutie de HCl 5,7 N la care se adauga cteva picaturi de fenol 5%. n fiola n care a fost realizat amestecul de hidroliza se introduce azot sau se creeaza vid pentru a prentmpina oxidarea, dupa care se ncalzeste pe baia de apa la 40C timp de 30 de secunde sub agitare usoara, pentru ndepartarea completa a oxigenului. Se realizeaza apoi hidroliza la 105 110C n fiola din sticla termorezistenta timp de 24 72 de ore dupa care fiola se raceste, iar acidul este ndepartat la rotavapor. Reziduul obtinut se redizolva ntr-un volum minim de apa bidistilata si se evapora din nou la sec. Pentru determinarea calitativa si cantitativa a aminoacizilor n hidrolizatul obtinut se folosesc analizoare automate de aminoacizi, cu nregistrare automata care furnizeaza direct datele necesare

calcularii continutului procentual al fiecarui aminoacid prezent n proteina analizata. De regula, pentru obtinerea unor rezultate ct mai exacte, se folosesc 0,4 0,5 mg de proteina nativa. Hidroliza acida a proteinelor se poate realiza si cu alti acizi. Rezultate bune se obtin de exemplu si cu acid performic. Acesta se obtine amestecnd 9 volume acid formic 80% cu un volum de H2O2 30%. Amestecul se agita si se lasa n repaus 30 minute la +4C. Indiferent de agentul folosit si de precautia de a nlatura oxigenul, hidroliza acida a proteinelor si peptidelor este ntotdeauna nsotita de oxidarea unor aminoacizi. Astfel, cisteina si cistina trec usor n acid cistic, metionina trece n metionin-sulfona, tirozina si triptofanul sunt complet distruse, iar treonina si serina se oxideaza n proportie de 5 10%. Pentru evitarea acestor fenomene secundare, se recomanda realizarea unei hidrolize acide partiale, adica hidroliza la intervale de timp diferite de 24, 48 si 72 de ore. 2. Hidroliza cu bromcian sau iodacetamida. Aceasta metoda se bazeaza pe faptul ca n mediu acid, bromcianul (BrCN) sau iodacetamida (ICH2 CO NH2) scindeaza specific legaturile peptidice formate de metionina rezultnd lactona homoserineI Scindarile cu ajutorul bromcianului si iodacetamidei dau posibilitatea obtinerii unor fragmente polipeptidice mai scurte ce pot fi ulterior analizate prin alte metode. 3. Hidroliza secventiala ncepnd cu extremitatea N-terminala. Aceasta poarta numele de metoda Edman de degradare a proteinelor si foloseste ca reactiv fenil-tioizocianatul. Proteina de analizat se dizolva ntr-o solutie tampon adecvata dupa care se trateaza cu fenil-tioizocianat n prezenta de acid trifluoracetic si n absenta totala a oxigenului. Derivatii aminoacizilor N-terminali rezultati se identifica apoi prin cromatografie n strat subtire. 4. Hidroliza secventiala ncepnd cu extremitatea C-terminala. Aceasta metoda utilizeaza carboxipeptidazele, enzime capabile sa hidrolizeze succesiv cte un aminoacid de la capatul C-terminal. Dupa fiecare etapa, aminoacizii sunt separati prin dializa si determinati calitativ si cantitativ. 5. Hidrazinoliza este o alta metoda de determinare a aminoacidului C-terminal. n prezenta hidrazinei, toate legaturile peptidice sunt rupte si toti aminoacizii, cu exceptia aminoacidului C-terminal, trec n hidrazide. Aminoacidul C-terminal se poate apoi identifica, fie cu ajutorul reactivului 2,4dinitrofluorbenzenic, fie cu ajutorul clorurii de dansil. Cei doi derivati ai dinitrobenzenului (a si b) au solubilitati diferite si pot fi separati din amestec prin diferite procedee de extractie bazate pe diferenta de solubilitate. 6. Hidroliza enzimatica nespecifica. Acest tip de scindare hidrolitica se realizeaza n conditii blnde de reactie. n principiu, orice proteina sau polipeptida poate fi scindata complet n prezenta enzimelor proteolitice din clasa hidrolazelor. Din punct de vedere practic nsa, acest procedeu este foarte laborios. n primul rnd, hidroliza enzimatica completa nu se poate realiza cu o singura enzima ci cu un set de mai multe enzime alese n functie de natura proteinei analizate. 7. Hidroliza enzimatica la pH acid. Acest procedeu este utilizat n cazul proteinelor ce se denatureaza la pH acid. Proteina de analizat este mai nti supusa denaturarii cu o solutie de guanidina sau de uree, urmata de dializa la pH acid. La proteina astfel denaturata se adauga apoi pepsina, subtilizina, aminopeptidaza si prolidaza. Uneori, n functie de natura proteinei analizate, se nlocuieste subtilizina, care este o proteinaza de origine microbiana, cu papaina extrasa din arborele Carica papaya.

Hidrolizatul obtinut este liofilizat, redizolvat n acid acetic 5% si liofilizat din nou. Gradul de hidroliza enzimatica la pH acid este controlat permanent analiznd hidrolizatul prin cromatografie sau electroforeza. 8. Hidroliza enzimatica la temperaturi moderate se realizeaza n prezenta papainei, leucinaminopeptidazei si prolidazei. Proteina este denaturata prin ncalzire timp de 3 minute la 95C, iar dupa racire se tamponeaza la pH = 5,2. Hidroliza se realizeaza apoi timp de 18 24 de ore la 40C, iar hidrolizatul obtinut se analizeaza prin metode specifice. 9. Hidroliza enzimatica specifica. Aceasta metoda consta n utilizarea unor preparate pure de tripsina si chimotripsina, enzime ce hidrolizeaza specific legaturile peptidice formate de anumiti aminoacizi. Tripsina de exemplu, hidrolizeaza legaturile peptidice formate de resturile de lizina si arginina, iar chimotripsina pe cele realizate de leucina, fenilalanina si tirozina.