V I R U S I (nastavak)

KRATAK PREGLED PRETHODNOG PREDAVANJA

Virusi su najmanji i najrasprostranjeniji mikroorganizmi. Nemaju elijsku grau va su izgraeni iskljuivo od nukleinskih kiselina i proteina. Ubrajaju se u ive organizme, jer je nukleinska kiselina u njima nosilac genetike informacije i pod njenom kontrolom virusi se reprodukuju. S obzirom da su malih dimenzija (20 300 nm), uoavaju se samo elektronskim mikroskopom. estice virusa van elije su metaboliki inertne i nazivaju se virioni i razliitih su morfologija. Obligatni su intracelularni paraziti, to znai da se mogu umnoavati jedino u eliji domainu. Tada koriste elijski metaboliki aparat za sintezu sebi slinih kopija. Jedna estica virusa moe dati i preko 1000 sebi identinih kopija kada inficira eliju domaina. U odnosu na eliju domaina, u kojoj se reprodukuju , virusi se najgrublje dele na 3 elijske grupe:

- animalne - biljne - bakterijske (bakteriofagi)

Nukleinske kiseline koje virusi mogu nositi u virionu mogu biti DNK ili RNK, ali se nikada u jednoj estici viriona ne nalaze obe nukleinske kiseline. Ove DNK ili RNK dalje mogu biti jednolanane ili dvolanane, cirkularne ili linearne. U zavisnosti od toga koju vrstu nukleinske kiseline nose, virusi se grubo dele na DNK i RNK viruse. Oko nukleinske kiseline se nalazi proteinski omota kapsid sastavljen iz subjedinica kapsomera. Kapsid sa nukleinskom kiselinom daje nukleokapsid. Kod nekih virusa oko nukleokapsida moe postojati i dodatni omota koji je obino poreklom od citoplazmatine membrane elije domaina u kojoj su ugraeni speifini virusni proteini i to najee glikoproteini. Simetrija kapsida odreuje morfologiju virusa. Tako postoje virusi sa mnogostranom simetrijom kod koje 20 jednakostraninih trouglova zaklapa prostor u kom je smetena nukleinska kiselina. Pored ove postoji i spiralna simetrija gde su kapsomere poreane oko spiralno uvijene nukleinske kiseline.Takvi virusi kod elektrinih mikroskopa izgledaju kao dui ili krai tapii. Takoe postoji i kompleksna simetrija tipina za najvei broj bakterofaga. Kod ovih virusa uoava se glava kubne simetrije, gde je smetena nukleinska kiselina, vrat spiralne simetrije, na kaju vrata obino bazalna ploa sa ili bez kukica i rep razliite duine, kontraktilan ili nekontraktilan. Ukoliko je kontraktilan, ubacivanje nukleinske kiseline u eliju je bre. Za domen Archea za sada su poznati samo DNK virusi. Najvei broj arhealnih virusa ima kompleksnu simetriju slino bakterijama. Meutim hipertermofilne arhee roda Sulfolobus, imaju neke viruse neobinih morfografija, npr. u obliku vretena koja esto grade rozete ili su spiralne simetrije u obliku tapia. Razlika izmeu virusa i bakterija je u tome to virusi nemaju elijsku grau i strukture i uglavnom u virionu nema enzima. Meutim, ponekad kod nekih virusa, postoje malobrojni enzimi spakovani u virionu. Ti enzimi su neophodni za zapoinjanje ivotnog ciklusa virusa u eliji domaina. To mogu biti DNK ili

RNK polimeraza, reverzna transkriptaza, RNK zavisna DNK polimeraza ili kod nekih bakternofaga enzim lizozim, koji se nalazi na vrhu u bazalnoj ploi i pomae ubacivanje nukleinske kiseline virusa u eliju. NOVO PREDAVANJE Rad sa virusima u laboratoriji Poto se ne vide pod svetlosnim mikroskopom (osim u retkim izuzecima) za prouavanje morfologije virusnih estica neophodan je elektronski mikroskop. Ipak rad sa virusima u laboratoriji je mogu ako se virusu obezbedi odgovarajui domain u kome virus zapoinje svoj ivotni ciklus. Jedna od metoda za priprmanje suspenzija koja se koristi kada je potrebno odrediti broj infektivnih virusnih estica u nekoj suspenziji je metoda koja podsea na indirektnu metodu za odreivanje broja novih elija bakterija u uzorku. Indirektna metoda je zasnovana na pravilu da jedna iva elija bakterije posle inkubacije daje koloniju, a prebrojavanjem kolonija na Petri olji, uz poznati volumen nanete kolonije i korienog razreenja, rauna se broj ivih elija. Kod odreivanja broja infektivnih estica virusa koristi se ista ideja. Ako se radi sa npr. bakterijama u Petri olju se istovremeno zasejavaju bakterijska kultura i suspenzija bakterofaga, posle inkubacije na bakterijskom tepihu se uoavaju prosvetljena mesta plake (analozi kolonija). Svaka plaka predstavlja rezultat ivotnog ciklusa jedne virusne estice koja posle umnoavanja u jednoj inficiranoj eliji dovodi do inficiranja liziranja okolnih elija. Zato broj plaka na bakterijskom tepihu odgovara broju infektivnih estica u suspenziji. Poto stokovi virusa sadre veliki broj virusnih estica (109,1010 ak do 1011 za 1 ml suspenzije ), taj stok se prvo (lino kao sa kulturom bakterija) razblauje, kako bi se na Petri olji posle inkubacije dobro prebrojavao broj jasno razgranienih plaka. Prave se decimalna razreenja poetne suspenzije. Pri titriranju npr. bakteriofaga, ova razreenja se prave u 102 M MgSO4 jer joni Mg 2+ pomau adsorpciju virusa na eliju domaina. Otprilike se zna koji je red veliine broja virusnih estica u poetnom stanju, koji se razblauje do razreenja iji 1ml posle inkubacije daje otprilike (najvie) 1000 plaka. Zasejavanje virusa se vri na sledei nain. Najpre se u male hematoloke epruvete stavlja odreena zapremina rastopljenog agara i to poluvrstog koji se od vrstog agara razlikuje po otprilike upola manjoj koliini agara na 1l hranljive podloge. Agar se dri u vodenom kupatilu na 450C kako se ne bi stegao. U takvu podlogu se zatim dodaje nekoliko kapi prekonone kulture osetljivih bakterija (E. coli npr.), to znai da je broj elija reda veliine 109 i 0,1 ml razreenja virsne suspenzije. Epruveta se provrti u rukama, sadraj izmea i zatim izlije na vrstu hranljivu podlogu. Staklenim tapiem se sadraj epruvete dobro rasporedi po Petri olji. Poluvrsti agar se brzo stegne i na taj nain su na podlozi imobilisane inficirane bakterijske elije. Prekononom inkubacijom se razvijaju plake po uniformnom bakterijskom tepihu, koji nastaje spajanjem kolonija usled velike koncentracije bakterija u suspenziji. Centar formiranja plake je jedna bakterijska elija koja je inficirana jednom virusnom esticom. irenje plake je omogueno inficiranjem okolnih elija od strana novonastalih virusnih partikula. Prebrojavanjem plaka odreuje se broj virusnih estica u uzorku, znajui zapreminu virusne suspenzije koja je dodata ( 0,1ml ) kao i njeno razreenje. Od vrste bakteriofaga i zavisno od toga da li se u okviru jedne vrste

radi sa divljim sojem ili nekim mutantom, dobijaju se plake razliitih morfologija. Mogu biti vrlo sitne ili krupnije, bistre ili mutne. Na analogan nain mogu se titrirati animalnii virusi. Plake se formiraju u sudovima u kojima se gaji kultura osetljivih elija. Ta kultura, ukoliko su to normalne elije, raste u jednom sloju , a na tom sloju se posle inkubacije uoavaju plake, ( mesta lize elija). Postoje i druge metode za grubo odreivanje broja animalnih virusa u nekom uzorku. Kod biljnih virusa dobija se neto slino plakama, ukoliko se suspenzija utrlja na poleinu lista biljke. U sluaju da se utrlja na lice lista, kutikula moe da sprei konktakt virusa i biljnih elija. Metode studiranja virusa se biraju u zavisnosti od cilja prouavanja, ali zajedniko za sve ove metode je da je neophodno obezbediti suspenzije virusa sa velikim brojem virusnih estica. Metoda za brojanje virusnih estica moe da slui i za dobijanje suspenzija virusa velikog titra tako to se umesto razreenije suspenzije virusa sa domainom zasejava koncentrovanija suspenzija. Posle inkubacije sve plake se spajaju, dok je bakteriolki tepih potisnut. Poluvrsti agar sa inficiranim elijama se sada pokupi sterilnim staklenim tapiem, stavlja u epruvetu za centrifugiranje i obino dodaje hloroform, kako bi se ubile bakterijske elije i kako bi se eventualne nelizirane elije razgradile oslobaajui partikule. Centrifugiranjem se odvaja agar od suspenzije u kojoj je virus. Na taj nain se mogu dobiti stokovi virusa sa npr. 1010 virusnih estica po 1ml. Dobijanje suspenzije sa velikim titrom virusa je najproblematinije za animalne viruse, dok se kod bakterofaga i biljnih virusa relativno lako dobijaju ovi stokovi. Virusi se iz jednog stoka sa visokim titrom mogu dalje preiavati centrifugiranjem na velikim brzinama pri emu se virusne estice taloe. Pod elektronskim mikroskopom se moe prouavati morfologija odreenih virusa. Iz virusne estice se moe izolovati nukleinska kiselina ili proteini za dalje prouavanje raznim biohemijskim metodama. Srodnost virusa se moe studirati imunolokim metodama. Ukoliko su srodni imae sline proteine kapsida a antitela na proteine jedne vrste virusa reagovae i sa prstenima druge, srodne vrste virusa. Postoji niz metoda za prouavanje virusa i elija domaina . IVOTNI CIKLUS VIRUSA Bez obzira da li se radi o bakteriofagima, biljnim ili animalnim virusima, neke osnovne faze ivotnog ciklusa uvek je je mogue razlikovati. Prvo se virus specifino vezuje za svoju eliju domaina. Ova faza se zove adsorbcija i oznaava nekovalentno vezivanje virusa za odreeni receptorni molekul na povrini elije domaina. Ukoliko elija ne poseduje odgovarajui receptor, ona je imuna na infekciju datim virusom. Ovo se npr. deava usled mutacije koja menja strukturu receptora molekula. Nakon adsorbcije dolazi do penetracije virusa u eliju. Penetracija moe da podrazumeva ili ulazak samo nukleinske kiseline u eliju dok proteinski omota ostaje van elije to je sluaj kod bakterofaga, ili itava virusna estica (nukleokapsid) ulazi u domaina. Nakon toga sledi faza replikacije virusa, koji ne znai samo replikaciju nukleinske kiseline virusa ve i sintezu specifinih proteina kapsida. Sledea faza je faza sazrevanja u kojoj dolazi do kombinovanja nukleinske kiseline sa proteinima, kako bi se formirao zreli nukleotid. Na kraju, virus se oslobaa iz elije domaina, to je vrlo esto praeno lizom elije, ali to ne mra da bude sluaj, jer postoje i virusi koji ne dovode do lize domaina. Ova faza se u zavisnosti od vrste virusa kao i vrste domaina razlikuje u nekim detaljima. Kriva rasta, odnosno one step growth (jednostepeni rast) podrazumeva

umnoavanje jedne virusne estice u eliji domainu. Kroz krivu se moe odrediti koliko e se virusnih estica osloboditi iz jedne elije tj. br. kopija virusa, to je karakteristika svake pojedinane vrste virusa. Za dobijanje krive rasta potrebno je zasejati viruse sa odgovarajuim domainom. Posle inficiranja npr. bakterijskih elija odreenim bakterofagom i nakon adsorbcije, centrifugiranjem se odvajaju neadsorbovane virusne estice od elija koje sadre virusnu nukleinsku kiselinu. Inficirane elije iz taloga se resuspenduju i inkubiraju odreeno vreme. U odreenom vremenskom periodu uzimaju se uzorci ove kulture, razreuju do pogodnog razreenja i odreuje se takozvani plack forming unit tj. broj elija iz kojih e se dobiti plake. Plack forming unit je termin koji se koristi ili za eliju koja je zaraena virusom pa zbog toga daje plaku ili za slobodnu virusnu esticu (virion) koja daje plaku po ulasku u eliju domaina. Praenjem promene broja plaka zapravo se prati umnoavanje virusa u domainu. Jedno izvesno vreme, koje se naziva latentni period, nee biti promene broja plaka. U tom periodu dolazi do sinteze virusnih enzima, regulacije virusne nukleinske kiseline i sinteze proteina kapsida. Taj latentni period se ustvari deli na dva podperioda. Prvi je period eklipse u kome i pored npr. vetakog razaranja elije (recimo hloroformom) nee doi do formiranja plake. Razlog je nepostojanje virusnih zrelih estica jer se proteini kapsida i nukleinske kiseline jo uvek nisu spojili u zreli nukleokapsid, infektivnu esticu. Ovaj period se naziva eklipsa (pomraenje), jer je virus prividno i privremeno nestao. Tek po sazrevanju virusnih estica u drugom podperiodu latentnog perioda, pri vetakom otvaranju elija moe doi do formiranja izvesnog broja plaka. Kod prirodnog razlaganja (liziranja) elija posle latentnog perioda, kada je zavreno sazrevanje virusa, poinje nagli porast broja plaka. Razlog je oslobienje velikog broja virusnih estica iz svake inficirane elije. Posle ovog porasta broja plaka sledi zaustavljanje na odreenom broju, jer su se sve virusne estice oslobodile iz svih zaraenih elija. Ovaj broj plaka podeljen sa odreenim brojem daje prosean broj virusnih estica koji se oslobodi iz elije domaina. ivotni ciklus bakterofaga poinje kao i kod ostalih adsorbcijom i penetracijom. U eliju ulazi samo nukleinska kiselina, dok prazni proteinski omotai ostaju van, adsorbovani na spoljanjoj povrini membrane elije i zovu se duhovi. Kod animalnih i biljnih virusa u eliju domaina ulazi itav nukleokapsid, to se odigrava na vie naina, ili translokacijom ili endocitozom ili fuzijom dodatnog omotaa virusa sa citoplazmatinom membranom elije . Kod biljnih virusa ulazak u elije je mogu jo i uz pomo insekata koji se hrane biljnom hranom. Po ulasku nukleokapsida u eliju, nukleinska kiselina se oslobaa od proteina kapsida. Mesto prvog kontakta virusne estice i elije kod bakterofaga ponekad nije telo elije, ve su to flagele ili sex pilusi, kod onih bakterija koje pored hromozomske DNK sadre i tzv. F faktore (plazmide) koji se razmenjuju tokom konjugacije. Kod bakterofaga koji kao nukleinsku kiselinu imaju dvolananu DNK, po njenom ubacivanju u eliju domaina dolazi do aktiviranja odbrambenih mehanizama bakterijske elije. Ovi odbrambeni mehanizmi ukljuuju restrikcione endonukleaze (koriste se u genetikom inenjeringu u tehnologiji rekombinovane DNK). Ovi enzimi tite bakt. eliju od virusne DNK. Restrikcione endonukleaze seku dvolananu DNK obino asimetrino i obino na polindromskim nizovima (sekvencama). Pored jedne restrikcione endonukleaze je ECO R1 endonukleaza. Endonukleaze dobijaju ime po bakteriji iz koje se izoluju, to znai da ECO R1

izolovana iz E. coli. Endonukleaza ECO R1 see dvolananu DNK na GAACCC, polindromsku sekvencu izmeu G i A. Kako se polindromske sekvence nukleotida nalaze i u bakterijskom hromozomu bakterije moraju da na neki nain zatite svoju DNK od dejstva endonukleaze. Ovo je u bakterijskim eijama postignuto time to restrikcione endonukleaze uvek funkcioniu u paru sa tzv. modifikacionim enzimima koji hemijski modifikuju neku od baza na mestu koje specifino prepoznaje endonukleazu. Tako npr. ukoliko je adenin u sekvenci GAACCC metilovan, endonukleaza EGO R1 ne prepoznaje ovaj niz i ne see ga, to se deava u bakterijskom hromozomu. Meutim i virusi imaju svoje odbrambene mehanizme koji oponaaju bakterijske. Oni, naime, poseduju enzime koji vre metilaciju ili glikozlaciju virusne DNK ime se izbegava odbrambeni sistem domaina. Replikacija virusne nukleinske kiseline u eliji se razlikuje u detaljima u zavisnosti od toga koja je vrsta nukleinske kiseline u pitanju. Postoji gruba klasifikacija na DNK, RNK viruse i tzv. DNK-RNK viruse. Pored ove takoe postoji i neto finija klasifikacija, koja osim prirode nukleinske kiseline uzima u obzir i nain njene replikacije u elijama. U zavisnosti od toga na koji nain virus zapoinje svoj ivotni ciklus, tj. na koji nain dolazi do svojih prvih iRNK, virusi su podeljeni na 7 grupa (klasa). U klasu DNK virusa spadaju klasa 1, klasa 2 i klasa 7, koje se meusobno razlikuju po nainu replikacije svog genoma. Klasu 1 ine dvolanani DNK virusi kod kojih do replikacije dolazi klasinim semikonzervativnim putem. Klasa 2 obuhvata viruse sa jednolananom DNK kao genetikim materijalom, koji je oznaen kao (+), jer je to lanac koji ima isti redosled nukleotida kao i informacione RNK. Kod ovih virusa neophodno je da prvo doe do sinteze komplemetarnog (-) lanca sa koga se onda sintetiu (+) lanci. Ovi + lanci slue i kao iRNK i kao genomi koji e biti upakovani u proteine kapsida. Klasu 7 za sada ini samo 1 virus, hepatitis B virus, koji ima dvolananu DNK kao genom, ali nema klasinu semikonzervativnu replikaciju ve dolazi do sinteze RNK sa te DNK, a zatim do reverzne transkripcije DNK sa RNK. Kod RNK virusa postoje 4 razliite grupe. To su: klasa 3, 5, 4 i 6. Klasu 3 ine virusi sa dvolananom RNK kao genomom Klasu 5 ine virusi koji imaju jednolananu RNK. Ali je ona (-) RNK, jer je komplementarna iRNK. iRNK se na njoj sintetie kao na kalupu. Kod dvolananih RNK virusa iRNK se takoe sintetie sa tog dvolananog molekula RNK. Kako u eliji ne postoje enzimi koji mogu da sintetiu RNK matrice, ovi virusi obavezno u virionu nose enzim koji to moe. To je jedini nain da ovi virusi zaponu svoj ivotni ciklus. Klasu 4 ine jednolanani RNK virusi koji su +, znai da su identini informacionoj RNK. Njihov genom zapravo slui i kao iRNK koja se odmah translatira u virusne proteine (virus specifine proteine).

Klasa 6 obuhvata retroviruse koji takoe imaju + jednolananu RNK kao genom, ali se oni ne koriste kao iRNK, ve se zahvaljujui enzimu reverznoj transkriptazi (pakovana je u virionu), najpre RNK prevodi u dvolananu DNK, a tek onda se sa te DNK sintetiu kako iRNK tako i genomske RNK koje se pakuju sa proteinima u nove virusne partikule. Bakteriofagi uobiajeno imaju dvolananu DNK kao genom i uobiajeno imaju kompleksnu simetriju kapsida. Ovakvi su tzv. T fagi koji se dele na parne i neparne T fage. Osim parnih T bakteriofaga (T2, T4, T6) i neparnih T faga (T3, T7) u ovu gruou bakteriofaga spadaju i bakteriofagi. Detaljno se obrauju samo i T4 iz ove grupe. U grupu bakteriofaga koji imaju jednolananu ___ kao genom, spadaju fagi sa ikosoedarnom simetrijom kapsida (FH 174) i fagi sa spiralnom simetrijom koji se zovu filamentozni fagi. Filamentozni fagi su slini FH 174 fagu i imaju interesantan nain naputanja elije i pakovanja. Od RNK bakteriofaga postoje jednolanani + RNK fagi, dok za sada nisu poznati. Takoe postoji samo 1 bakteriofag koji ima dvolananu RNK kao genom a parazitira na vrsti roda Pseudomonas. Bakteriofag T4 je jedan od faga sa veoma velikim genomom. Njegov genom ima 168kb u vidu dvolanane DNK koja je u virionu upakovana kao linearna. Kodira oko 250 proteina to je veliki kodirajui kapacitet za jedan genom te veliine. Ovaj fag ima kompleksnu simetriju kapsida u iji sastav ulazi oko 25 razliitih proteina. Fag T4 je izgraen od glave u vidu izduenog ikosaedra koja sadri nukl. Kiselinu, repa koji je kontraktilan i bazalne ploe sa kukicama. ivotni ciklus T4 faga je ciklus jednog virulentnog faga. Ovo znai da fag sa svojim domainom stupa u odnos koji se zavrava umnoavanjem virusa i smru domaina. Ovakav ciklus se naziva litiki ciklus i karakteristian je za sve virulentne viruse. Vreme koje protekne od adsorpcije faga do lize domaine, kada se novi virusi oslobaaju iz elije iznosi 25 min. Proces umnoavanja ovog faga u eliji je, dakle, vrlo brz. Po ulasku T4 bakteriofaga u eliju domaina, a to je elija E. Coli, dolazi do podreivanja metabolizma bakterije potrebama virusa. Ekspresija gena virusa se moe podeliti u 3 faze: faza ranih iRNK, faza srednjih iRNK, faza kasnih iRNK. Ove faze su praene sintezom ranih, srednjih i kasnih proteina. Rani proteini virusa u ovom sluaju su nukleaze koje razlau hromozom domaina tako da vrlo rano po infekciji bakterijska DNK vie ne funkcionie, jer je u fragmentima.