ISBN electronic: 978-606-8236-26-1 coordonator: Simona Ivana Autori: Alexandru T.

Bogdan Iulian ogoe Gheorghe Cmpeanu Simona Ivana Traian Enache Stelian Britreanu Ipate Iudith Alexandru Popescu

MicrobiologiA AliMENTElor - volumul iii Patogeni alimentari

Ediie mbunatit i revizuit

Editura Asclepius Bucureti, 2011

Toate drepturile sunt rezervate editurii. Tiprit n Romnia. Nici o parte din aceast lucrare nu poate fi reprodus sub nici o form, prin nici un mijloc, mecanic sau electronic sau stocat ntr-o baz de date, fr acordul prealabil, n scris, al editurii. All rights reserved. Printed in Romania. No part of this publication may be reproduced or distributed in any form, by any means or stored in a data base or retrieval system without the prior, written, permission of the editor.

ISBN electronic: 978-606-8236-26-1

Editura Asclepius, Bucureti Tel: 072.44.66.481, tel/fax: 021/242.11.01 Website: www.asclepius.ro, e-mail: editura@aslcepius.ro
2

cuprins CAPITOLUL 1 ImPlICAIIlE BACTERIIloR dIN GENul ShIGEllA N PRoduCEREA ToxIINfECIIloR AlImENTARE 7 1.1. Caractere generale 7 1.2. Taxonomie 10 1.3. Ci de transmitere 12 1.4. Caractere de cultivare 13 medii uzuale i medii selective de cultivare. 13 1.5. Structura antigenic 13 1.6. Patogenitate 15 1.7. Epidemiologie 22 1.8. manifestri clinice 24 1.9. Sensibilitatea fa de factorii de mediu 25 1.10. Izolarea i identificarea shigelelor 36 CAPITOLUL 2 ImPlICAIIlE BACTERIIloR dIN GENul ESChERIChIA N PRoduCEREA ToxIINfECIIloR AlImENTARE 70 2.1. Caractere generale 70 2.2. Istoric 71 2.3. Taxonomie 72 2.4. morfologie 73 2.5. Condiii de cultivare i caractere culturale 73 2.6. Proprieti biochimice 74 2.7. Proprieti antigenice 75 2.8. Sensibilitatea fa de factorii de mediu 77 2.9. Patogenitatea 78 2.10. Epidemiologie 87 2.11. detectarea EPEC, ETEC i EIEC n alimente i materiale patologice 91 2.12. detectarea Escherichia coli o157:h7 din fecale i alimente 93 2.13. Infeciile naturale la animale 98 Colibaciloza vieilor 99 Colibaciloza purceilor 99 Colibaciloza psrilor 100 2.14. Infecii cu Escherichia coli la om 100
3

2.15. Toxiinfecii alimentare produse de Escherichia coli 101 2.16. Strategii de prevenire i combatere 103 2.17. metode de izolare i identificare a lui E. coli din alimente

106

cAPiTolUl 3 ImPlICAIIlE BACTERIIloR dIN GENul YERSINIA N PRoduCEREA ToxIINfECIIloR AlImENTARE 124 3.1. Caractere generale 124 3.3. Specii ale genului Yersinia implicate n toxiinfeciile alimentare 127 3.3.1. Yersinia pseudotuberculosis subsp. pseudotuberculosis (Pasteurella pseudotuberculosis) 127 3.3.2. Yersinia enterocolitica 131 3.4. Specii zoonotice din genul Yersinia 132 3.4.1. Yersinia enterocolitica cu serotipurile 03, 05, 27, 08, 09 i Yersinia pseudotuberculosis 132 3.4.2. Yersinia pestis 133 cAPiTolUl 4 ImPlICAIIlE BACTERIIloR dIN GENul VIBRIo N PRoduCEREA ToxIINfECIIloR AlImENTARE 143 4.1. Caractere generale 143 4.2. Taxonomie 144 4.3. Istoric 145 4.4. morfologie 146 4.5. Condiii de cultivare i caractere culturale 147 4.7. Ecologie 150 4.8. factorii de patogenitate 150 4.9. Specii mai importante de vibrioni 150 4.10. metode de izolare i identificare 154 a speciilor din genul Vibrio din alimente 154 4.11. Izolarea i identificarea vibrionilor din produsele acvatice 163 Bibliografie 170 cAPiTolUl 5 ImPlICAIIlE CAmPYloBACTERIIloR N ToxIINfECIIlE AlImENTARE 173 5.1. Caractere generale 173 5.2. Taxonomie 174 5.3. Specii ale genului Campylobacter implicate n producerea
4

toxiinfeciilor alimentare 174 5.3.1. Campylobacter jejuni 174 5.4. Epidemiologie 176 5.4.1. distribuia campylobacteriozelor la om dup vrst i sex 177 5.4.2. Sezonalitatea 178 5.4.3. Cazurile importate 178 5.6. metode de izolare i identificare a genului Campylobacter 181 din alimente 181 5.6.1. Prepararea probelor 181 5.6.2. Izolarea speciilor de Campylobacter 183 5.6.3. Identificarea speciilor de Campylobacter 183 5.6.4. Confirmarea campilobacteriilor 183 cAPiTolUl 6 ToxIINfECII AlImENTARE dE oRIGINE BACTERIAN Cu INCIdEN REduS 194 6.1. Genul Aeromonas 194 6.1.1. Taxonomie 194 6.1.2. morfologie 195 6.1.3. Condiii de cultivare i caractere culturale 195 6.1.4. Ecologie 196 6.1.5. diagnostic 197 6.2. Genul Plesiomonas 199 6.3. Genul Photobacterium 200 6.4. Genul Brucella 200 6.5. Genul Enterobacter 205 6.6. Genul Bacteroides 205 6.6.1. Bacteroides fragilis 205 6.7. Genul Klebsiella 205 6.7.1. Klebsiella pneumoniae 206 6.8. Genul Streptococcus 208 6.9. Genul Erysipelothrix 211 6.9.1. Erysipelothrix rhusiopatiae 211 capitolul 7 PRINCIPAlElE mICoToxINE ImPlICATE N PRoduCEREA ToxIINfECIIloR AlImENTARE 226 7.1. Aflatoxinele 228 7.2. Toxinele produse de Alternaria 234
5

7.3. Citrinin 235 7.4. ochratoxinele 237 7.5. Patulina 239 7.6. Acidul penicilic 241 7.7. Sterigmatocistina 241 7.8. fumonizinele 242 7.9. Sambutoxina 244 7.10. Zearalenonele 245 capitolul 8 SCuRT PREzENTARE A PRINCIPlAlEloR VIRuSuRI CE SE TRANSmIT PRIN AlImENTE 254 8.1. Virusurile hepatice enterice 257 8.1.1. Virusul hepatitei A 257 8.1.2. Virusul hepatitei E (hEV) 260 8.1.3. Virusul hepatitei f (hfV) 260 8.2. Norovirusurile 261 cAPiTolUl 9 PRINCIPAlII PRIoNI CE SE TRANSmIT PRIN AlImENTE 9.1. Encefalopatia spongiform bovin (BSE) 266 9.2. Boala Creutzfeldt-Jakob (CJd, vCJd) 269 9.3. Boala cahectizant cronic (Chronic Wasting disease - CWd) 266 270

CAPITOLUL 1 ImPLICAIILE BACTErIILOr dIn gEnUL ShIgELLA n PrOdUCErEA TOxIInfECIILOr AliMENTArE

1.1. Caractere generale
multiplicarea shigelelor pe suport alimentar, chiar la temperaturi de 10-19C, explic implicarea n declanarea toxiinfeciilor alimentare a unor alimente contaminate iniial cu un numr subinfectant de germeni. Produsele lactate au fost cauza unor focare familiale, ns controlul curent al materiei prime n fabricile de lapte i a produsului finit nainte de comercializare reduce posibilitatea contaminrilor acestei categorii de produse. Alte produse alimentare de origine animal (oule, carnea i derivatele lor) pot fi contaminate cu germeni din genul Shigella spp. prin manipulare i procesare neigienic. la nceputurile investigaiilor tiinifice despre cauza mbolnvirilor produse la om prin consumul alimentelor de origine animal, Paul Riegler a publicat, n anul 1906, o valoroas lucrare despre Otrvirile cu carne, care reprezint prima expunere tiinific din ara noastr asupra toxiinfeciilor alimentare la om, datorate consumului de carne contaminat cu germeni patogeni din genul Salmonella (Enache T., i col., 2002). Paul Riegler mpreun cu Victor Babe cerceteaz un episod grav de mbolnviri (27 persoane din care 3 au murit), ca urmare a consumului de carne de miel (infectat cu Salmonella Gartner) din care a izolat germenul, identificat apoi i la persoanele decedate. medicii legiti suspectau iniial o otrvire colectiv. din analiza chimic a probelor recoltate de la cadavre nu s-a descoperit ns nici o substan toxic, dar serul bolnavilor din acest episod a aglutinat germenul izolat, la un titru de 1/50 - 1/100, chiar i dup o lun de la debutul bolii. din punct de vedere juridic, acest episod a beneficiat de un diagnostic corect care a nlturat cu argumente tiinifice prezumia de atentat criminal
7

prin otrvire, dezlegnd totodat o obscur problem a vremii: aa-zisele otrviri cu carne. datorit relaiilor comerciale, specificului i tradiiilor culinare, modului de preparare a alimentelor sau utilizrii mai frecvente a unor produse disponibile n anunite zone geografice, alimentele se pot constituii n verigi majore de diseminare a germenilor patogeni sau potenial patogeni pentru oameni i animale. Globalizarea industriei alimentare, comerul i transportul, implic desfacerea i utilizarea alimentelor la distane mari fa de locul producerii lor, ceea ce subliniaz posibilitatea diseminrii patogenilor care le contamineaz la un moment dat. n acest context, bolile transmise prin alimente dobndesc tot mai mult un caracter epidemiologic universal. Riscul epidemiologic este mare i pentru faptul c alimentele nu reprezint doar un vehicul, ele sunt i substrat nutritiv pentru multiplicarea germenilor, producnd simultan toxiinfecii alimentare la mai muli indivizi. de la ogor pn la consumator, lanul producerii, procesrii i preparrii alimentelor este foarte lung, greu de controlat i, cu ct alimentul trece prin mai multe etape, cu att crete riscul de contaminare, ntruct orice etap este susceptibil de a fi contaminat. n general produsele alimentare de origine animal (carne i derivate, lapte i derivate, ou, pete, fructe de mare etc.) se pot contamina cu germeni enteropatogeni dac: animalele de mcelrie sunt purttoare de germeni enteropatogeni; animalele de mcelrie sntoase sunt stresate naintea tierii, iar manoperele de abator se fac neigienic; nu sunt respectate condiiile de igien la procesare, depozitare i transport, dar i n buctrii i la servire. Prin urmare, contaminarea poate fi primar (origine) sau secundar (manipulare, prelucrare, depozitare etc). metoda cea mai sigur de prevenire a mbolnvirilor la om rmne prelucrarea termic (fierbere, etuvare, cuptor), cu condiia ca temperatura de peste 100C s fie activ uniform, n profunzimea alimentului. Alimentele de origine vegetal nu constituie substrat de supravieuire i multiplicare a germenilor, dar se pot contamina prin praf, ape de irigaie, sol, fertilizante organice. Riscul epidemiologic major l constituie faptul c unele din aceste produse se consum crude (exemplu: salatele). Alimentele mixte (de origine animal i vegetal), care de obicei nu se prelucreaz termic i se consum ca atare (salate, creme, maioneze, ngheat etc) se pot contamina, fie ca materii prime, fie n cursul preparrii,
8

depozitrii, servirii. Riscul de contaminare a minilor persoanelor care manipuleaz aceste alimente este corelat cu exercitarea profesiilor care asigur asisten medical, paramedical, prim-ajutor, personalul din sectorul sanitar i sanitarveterinar, personalul care lucreaz la salubritate (att pentru ndeprtarea reziduurilor solide, ct i la ntreinerea reelei de canalizare). Importana minilor murdare n transmiterea bolilor infecioase este influenat de intensitatea contaminrii, de anumite deprinderi neigienice individuale, de nivelul cultural i igienico-sanitar, ct i de condiiile de supravieuire ale patogenilor pe suprafaa tegumentului. Insectele joac rolul de vectori activi sau pasivi n transmiterea patogenilor, dup cum germenii se nmulesc sau nu pe organismul insectei vector. Vectorii mecanici (biologic-pasivi) vehiculeaz doar microorganisme care supravieuiesc pasiv pe suprafaa corpului lor sau n tubul digestiv, fr a se multiplica. musca domestic prin habitatul ei peridomestic, mobilitate, voracitate, preferine coprofage, poate vehicula infecia la mari distane de locul contaminrii iniiale. Gndacii de buctrie (Blatella germanicus i Blatella orientalis) pot vehicula pasiv enterobacterii, enterovirusuri, stafilococi, ou i larve de helmini etc. furnicile pot transmite mecanic germenii Gram negativi. Aceti factori biologici au rol important n transmiterea infeciilor n locuine, colectiviti umane, sector alimentar, medical etc. Cel de-al treilea element constitutiv al focarului epidemiologic este reprezentat de organismul uman i de receptivitatea indivizilor care alctuiesc o populaie. Rezistena antiifecioas reprezint capacitatea natural a organismului de a mpiedica ptrunderea patogenilor n organism, de a asigura distrugerea i eliminarea lor din organism i de a neutraliza produii toxici care induc boala. Pentru om, riscul reprezentat de consumul crnii animalelor acvatice este condiionat de mediul din care provin aceste vieuitoare. literatura de specialitate cuprinde date relativ puine despre microbiologia acestor produse. Riscurile sunt mai mari la carnea animalelor acvatice provenite din zonele tropicale unde bolile digestive evolueaz sub form endemic. molutele sunt frecvent purttoare de germeni patogeni enterici, n organismul lor concentrndu-se cele mai diverse bacterii i virusuri luate
9

din ap n timpul hrnirii. Pericolul pentru om l reprezint consumul n stare crud sau numai dup o superficial tratare termic a acestora. Animalele acvatice crescute n condiii artificiale prezint un pericol i mai mare pentru consumator, ntruct este frecvent contaminarea lor cu microorganisme provenite din dejeciile umane deversate n cursurile de ap. n timpul hrnirii, molutele filtreaz i concentreaz n tubul digestiv microorganismele din apa n care triesc. de aceea se impune controlul microbiologic periodic al apelor n care triesc i din care se recolteaz molute pentru consum uman (Brzoi d., Apostu S., 2002). Produsele alimentare de origine animal se pot contamina cu flora microbian prezent n mediul n care ele se prelucreaz, manipuleaz, depoziteaz i se transport pn ajung la consumatori. Izolarea i identificarea microorganismelor patogene din alimente, prezint, nc, unele dificulti datorit posibilitilor de contaminare simultan cu mai multe specii de germeni, dintre care numai unii au capacitate patogen. dintre agenii patogeni cunoscui i descrii care produc toxiinfeciile alimentare, germenii aparinnd genului Shigella spp. au ocupat pn n prezent un loc mai puin important, shigelozele fiind considerate aproape exclusiv, infecii bacteriene, fr ca iniial s fie recunoscut rolul alimentelor n transmiterea infeciei. datele recente din literatura internaional de specialitate demonstreaz ns implicarea frecvent a germenilor din genul Shigella spp. n declanarea unor episoade grave de toxiinfecii alimentare la om, care, n afar de ap, numeroase alte alimente de origine animal, dein o pondere crescnd. dup datele statistice ale organizaiei mondiale a Sntii (omS) boala diareic este considerat a doua cauz de deces la scar global dup bolile cardiovasculare, fiind cel mai frecvent sindrom ntlnit n patologia infecioas, caracterizat printr-o simptomatologie polimorf cu evoluie foarte grav. Este demonstrat faptul c Shigella spp. provoac sindromul diareeic infecios denumit dizenterie bacilar, al crui diagnostic presupune mai multe etape succesive foarte laborioase.

1.2. Taxonomie
Genul Shigella este component al familiei Enterobacteriaceae i prezint multiple nrudiri cu genul Escherichia, ns nu face parte din flora saprofit a intestinului.
10

datorit numeroaselor asemnri metabolice i antigenice, mecanismelor patogenice i nrudirilor antigenice cu speciile din genul Escherichia, muli autori au propus ca aceste grupuri s fie reunite i s constituie o grup unic: Escherichia-Shigella (farmer J.J. III, 1995). Avndu-se n vedere i unele considerente practice, ambele grupe sunt tratate separat, chiar dac taxonomic au suficiente elemente comune pentru constituirea unui gen unic. Tehnici mai noi, cum ar fi hibridarea acizilor nucleici, secvenierea acizilor nucleici i proporia dintre bazele purinice i pirimidinice, au demonstrat c ntre speciile genurilor Shigella i Escherichia exist deosebiri foarte mari, ceea ce a impus descrierea lor ca genuri complet diferite. Coninutul n guanin + citozin, exprimat n moli % difer semnificativ la cele dou specii (Bergeys manual of determinative Bacteriology, ed. Ix, 1999; J.P. Euzby, list of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature, 2009). Genul Shigella cuprinde specii de bacterii Gram negative, imobile, facultativ anaerobe, chemoorganotrope cu metabolism respirator i fermentativ, care se deosebesc de restul enterobacteriaceelor prin incapacitatea de a produce fenilalanindeaminaz, ureaze, hidrogen sulfurat, lizindecarboxilaz, acetil-metil-carbinol i de a nu hidroliza malonatul i esculina. Conform Taxonomic outline of the Procariotic Genera, din Bergeys manual of systematic bacteriology ediia a II-a (2001), ncadrarea taxonomic a genului este urmtoarea: domeniul familia Clasa III ordinul xIII familia Genul - Bacteria; - B xII Proteobacteria; - Gammaproteobacteria; - Enterobacteriales; - Enterobacteriaceae; - Shigella.

n prezent Genul Shigella spp. este caracterizat ca o grupare de Enterobacteriaceae, constituit din bacili imobili care fermenteaz glucoza fr gaz, nu produc hidrogen sulfurat, ureaz, lizindecarboxilaz i fenilanindeaminaz, nu cresc pe medii cu citrat ca unic surs de carbon. Producerea de indol, betagalactoxidaz i ornitindecarboxilaz sunt teste ce difereniaz ntre ele speciile de Shigella. Astzi sunt recunoscute speciile: Shigella dysenteriae (grupa A), Shi. flexneri (grupa B), Shigella boydii (grupa C) i Shigella sonnei (grupa d).
11

Shigella sonnei, denumit de unii autori n trecut ca S. pseudodysenteriae, are activitatea metabolic cea mai bogat, fiind spre deosebire de celelalte specii lactozo-pozitiv (tardiv), betagalactoxidaz prompt pozitiv i constant productoare de ornitindecarboxilaz (Negu m, 1998). la nivel mondial se estimeaz c numrul anual al toxiinfeciilor alimentare umane, cu Shigella este de 6,5-8 milioane (mahon C, manuselis G, 1995). 1.3. Ci de transmitere Enterobacteriile din genul Shigella spp. sunt patogene numai pentru om i primate non-umane, iar rspndirea lor este realizat exclusiv prin aceste surse. Contaminarea fecaloid intereseaz frecvent solul i apele de suprafa, de unde se poate dispersa direct (irigaii) sau indirect (prin vectori: vegetale, fructe, ape de suprafa, pete, fructe de mare i alte alimente), de unde germenii pot ajunge la om (Adams m. R., moss m. d., 1995). Alimentele de origine animal sunt contaminate n timpul procesri (surse umane) sau prin transportul i manipularea neigienic (vectori i alte surse). n funcie de anumite condiii, Shigella se poate izola din ap, alimente sau chiar de pe obiecte (Ballows A et al, 1992). Shigella alturi de Salmonella, Escherichia coli i Yersinia spp. au fost n mod clar demonstrate ca patogeni enterici (Cunin P et al. 1999; Gray dl, 1995). legumele i fructele se pot contamina cu Shigella n urma irigrii cu ape poluate i prin manopere de recoltare, pstrare i distribuire neigienic (Beuchat l R, 1996). Shigella poate fi izolat din legumele contaminate, att n stare crud, ct i din cele gtite (frost J A et al., 1995). ntruct acvacultura are o mare dezvoltare, contaminarea cu fecale a apelor poate cauza infectarea cu Shigella a petilor i crustaceelor i apoi a oamenilor prin consumul acestor vieuitoare (Bryan f. I. 1985). Petii i alte animale marine pescuite/recoltate din ape de suprafa contaminate consecutiv deversrilor de ape reziduale provenite din canalizrile urbane, constituie o surs tot mai frecvent de contaminare a oamenilor cu Shigella (Gessner Bd i Beller m, 1994).
12

1.4. Caractere de cultivare medii uzuale i medii selective de cultivare. Cultivarea pe astfel de medii permite o identificare preliminar. Pe agar nutritiv Shigella se dezvolt n 24-48 ore de incubare i formeaz colonii: de tip S, de 2-3 milimetri n diametru, rotunde, circulare, nepigmentate, netede; de tip R, de 2-3 milimetri n diametru, rotunde, plate, cu suprafa rugoas i margini neregulate. n bulion simplu tulpinile se comport astfel: cele de tip S tulbur mediul uniform fr depozit; cele de tip R cu sau fr turbiditate, prezint inel i depozit. Pe agar cu snge Shigella crete la fel ca i pe agarul nutritiv. Pe agar Mc Shigella formeaz colonii incolore, transparente, uor opace. Pe AdCL, Shigella dysenteriae tip 1 formeaz colonii mici cu nuane roz, Shigella sonnei formeaz colonii iniial incolore, ns dup cteva zile apar nuane roz deschis, datorit fermentaiei tardive a lactozei. Pe hE, Shigella formeaz colonii verzi. Pe EmB, Shigella formeaz colonii semitransparente, incolore sau roz pal. morfologia coloniilor se observ prin iluminatul direct al plcilor. Mediile selective nu permit dezvoltarea florei Gram pozitive; Mediul Mc permite dezvoltarea difereniat i a altor grupe de bacili Gram negativi. 1.5. Structura antigenic Grupele (sau speciile) de Shigella au fost extinse considerabil prin identificarea mai multor tipuri diferite din punct de vedere antigenic. Genul Shigella spp. cuprinde patru specii (serogrupe) cu 34 serotipuri: Shigella dysenteriae (grup A); Shigella flexneri (grup B); Shigella boydii (grup C);
13

 Shigella sonnei (grup d), denumit de unii autori n trecut S. pseudodysenteriae (Bergeys manual of determinative Bacteriology, ediia a Ix-a, 1999; Negu m., 1998). Speciile acestui gen sunt bacterii Gram negative ce se dezvolt bine pe agar macConkey. Toate tulpinile de Shigella spp. sunt imobile. Prin analiza de hibridare dNA-RNA, speciile de Escherichia coli i Shigella spp. sunt similare fenotipic, cu excepia S. boydii. Shigella sonnei are activitatea metabolic cea mai bogat, fiind spre deosebire de celelalte specii, lactoz pozitiv (tardiv), betagalactoxidaz prompt pozitiv i constant productoare de ornitindecarboxilaz. Specia tip a genului este Shigella dysenteriae (Bergeys manual of determinative Bacteriology, ediia a Ix-a, 1999). Shigelele fermenteaz glucoza fr formarea de gaz, nu produc hidrogen sulfurat, ureaz, lizin decarboxilaz i fenilalanindeaminaz (Jay m. J., 1988). legturile evolutive a 46 tulpini de Shigella spp., care reprezint fiecare dintre serotipurile aparinnd celor patru specii de Shigella (subgrupele dysenteriae, flexneri, Boydii, Sonnei) au fost determinate prin secvenionarea a opt gene (gene housekeeping), din patru zone cromozomale. Au fost identificate trei grupe de tulpini, fiecare incluznd tulpini de la diferite subgrupe. grupul 1 conine majoritatea tulpinilor de Shigella boydii i Shigella dysenteriae (Bl-4, B6, B10, B14, B18, d3-7, d-9, d3-11), precum i de la Shigella flexneri 6 i 6A. grupul 2 cuprinde ase tulpini de Shigella boydii (B5, B7, B9, B11, B15,B16 i Bl7) i tulpini de Shigella dysenteriae 2. grupul 3 cuprinde o tulpin de Shigella boydii (B12) i tulpini de Shi. flexneri, serotipurile 1-5. Tulpinile de Shigella sonnei i trei tulpini de Shigella dysenteriae (d1, d8 i d10) sunt n afara celor trei grupuri principale de gene. Shigella boydii 13 se pare c are legturi cu Escherichia coli (nrudite, dar mai ndeprtat). Tulpinile de Shigella spp., ct i unele tulpini patogene de Escherichia coli nu au avut o evoluie singular, ci convergent, aa cum arat proprietile fenotipice ale Shigella (Picking W. l., Coye l., osiescki J.C., Barnoski Serfis A., Schaper E., Picking W.d. 2001). Se estimeaz c cele trei grupuri principale de tulpini de Shigella sunt cauza prezumtiv a celei mai timpurii boli diareice descrise la om nc din antichitate. Shigella fiind lipsit de cili (imobil) expune antigene somatice (o) lipopolizaharidice care stau la baza identificrii serologice. Avnd specificiti de grup sau de tip, acestea sunt folosite n scheme corespunztoare fiecrei
14

specii, ori serogrup, respectiv Shi. dysenteriae (grup A) 13 serotipuri, Shi. flexneri (grup B) 6 serotipuri, Shi. boydii (grup C) 18 serotipuri i Shi. sonnei (grup d) un singur serotip. Serurile destinate acestei tipizri sunt accesibile i sunt utilizate mai frecvent n bacteriologia epidemiologic. majoritatea antigenelor o de la Shigella sunt identice sau nrudite cu cele o de Escherichia. din aceste motive identificarea biochimic, respectiv ncadrarea n gen, trebuie s precead obligatoriu tipizarea serologic. Inconstant, la Shi. dysenteriae, Shi. flexneri i Shi. sonnei pot fi prezente antigene de suprafa K, termolabile, ce pot include inaglutinabilitatea o unor tulpini. Inactivarea timp de o or la 100C determin redobndirea aglutinabilitii o.

1.6. Patogenitate
Elementele de patogenitate induse de Shigella spp., ca i cele produse de Escherichia coli enteroinvaziv (EIEC) se datoreaz capacitii acestor microorganisme de a invada epiteliul intestinal, de a se multiplica intracelular i de a se rspndi de la o un enterocit la altul (morris J. G. Jr. ferreccio C., Garcia J., lobos h., Black R. E., Rodriguez h., levine m.m., 1984, Page A. l., ohayon h., Sansonett, P. J., Parsot C., 1999). Capacitatea de a invada celulele epiteliale a fost demonstrat deopotriv i pe modele experimentale pe animale i in vitro. Aceast capacitate se poate verifica pe culturi celulare hela, prin numrarea coloniilor dezvoltate n monostrat. Variantele de Shi. flexneri care nu au fost capabile s invadeze culturile celulare, nu au determinat mbolnviri experimentale la maimu. hibrizii de Shi. flexneri 2a i Escherichia coli K12, capabili de a adera i invada celulele epiteliale i incapabili de se multiplica intracelular s-au dovedit nepatogeni la maimuta Rhesus (Kumene N f et al., 1999). Nu este ns suficient ca Shigella s invadeze i s se multiplice intracelular pentru a aprea leziunile caracteristice i pentru a declana fenomenele clinice. mutante de Shigella, capabile de a invada i a se multiplica intracelular, s-au dovedit nepatogene, ntruct nu aveau capacitatea de a se transmite de la o celul la alta (Sandlin R. C., maurelli A. T., 1999). Aceste capaciti, care reprezint totodat markeri de virulen, sunt expresia capabilitilor bacteriei, reglate genetic n succesiunea actului patogenic. Controlul genetic al invazivitii este multifactorial, necesitnd participarea ambilor determinani: plasmidic i cromozomal. n ansamblu acest control este reglat de temperatura ambiental. la
15

temperaturi sub 30C mecanismele genetice ale invazivitii sunt inactive (maguire hC et al., 1998). o gen cromozomal vir R (hus) codific un represor al exprimrii virulenei, n timp ce alte dou gene (vir f i vir B) codific activatorii virulenei. Reglarea termic acioneaz la nivel transcripional, categoria de gene activatoare devenind funcional numai la 37C. Participarea determinanilor plasmidici este dominant n reglarea invazivitii. dou plasmide mari de 180 Kb la Shi. sonnei i 220 Kb la Shi. flexneri sunt indispensabile invaziei (mc Cormick B h et al., 1999). un grup de gene Ipa B, C, d, A (invasion plasmid antigens) sunt eseniale pentru invadarea celulelor epiteliale de mamifere. Produsele acestor gene sunt proteine asociate membranei externe a celulei bacteriene i au rol n transmiterea semnalului ce precede internalizarea shigelelor n celula gazd. o alt gen Ipg C (invasion plasmid gene) este necesar n invazie, prevenind ca Ipa B i Ipa C s formeze complexe n citoplasm bacterian. Proteinele Ipa sunt secretate continuu n mediu. Cantitatea lor crete la contactul bacteriei cu celula gazd i probabil ele joac un rol n generarea semnalelor necesare ncorporrii de ctre enterocit. Produsul genei Ipa B se consider c ar fi responsabil de liza vacuolei ce conine bacteria dup internalizarea acesteia. Aceeai protein litic produs de Ipa B induce i apoptoza n macrofagele infectate. un grup de gene mxi/spa (membrane expression of invasion plasmid antigens) secret peste 20 proteine care controleaz secreia proteinelor Ipa i alte proteine de virulen asemntoare celor de la Salmonella sau Yops de la Yersinia. Acest tip de virulen protein-dependent este recunoscut astzi ca elementul esenial al patogenezei bacteriene la animale i plante (Edwards B h, 1999). un alt grup de gene desemnat Ies A (intracellular spread) nu are relaie cu invazia ns este esenial pentru motilitatea intra i intercelular (makino i col, citat de mahon C, manuselis G., 1995). Proteinele Ies A sunt aezate la un singur pol al bacteriei. Polimerizarea monomerilor de actin sub influena lor reprezint fora care mpinge bacteria prin citoplasm. Sinteza unui lipopozaharid (lPS) complet n peretele bacterian este responsabil pentru localizarea unipolar a proteinelor Ies A. lPS necesit locusuri specifice active (respectiv rfa i rfb) pe cromozomul bacterian. de asemenea alte locusuri cromozomale codific aerobactina, protein esenial pentru multiplicarea intracelular a shigelelor i superoxid dismutaza ce inactiveaz radicalii superoxid, protejnd astfel bacteria de
16

mecanismele celulare de aprare. Temperatura poate influena desfurarea mecanismului invaziv. la temperaturi mai mici de 30C, mecanismele genetice ale invazivitii devin inactive. Reglarea termic acioneaz la nivel transcripional, categoria de gene activatoare devenind funcional numai la 37C. o gen cromozomal vir R (hus) codific un represor al exprimrii virulenei, n timp ce alte dou gene (vir f i vir B) codific activatorii virulenei. n reglarea invazivitii, un rol dominant l dein determinanii plasmidici. Pentru invazie, plasmidele de 180 Kb, la Shigella sonnei i la 220 Kb, la Shi. flexneri (plasmide mari) sunt indispensabile. Eseniale pentru invadarea epiteliului intestinal al mamiferelor sunt genele Ipa, A, B, C, d (Invasion Plasmid Antigens). Aceste gene produc proteine asociate membranei externe a celulei bacteriene i ndeplinesc rolul de transmitere a semnalului care precede ptrunderea shigelelor n celula gazd. n invazie, un rol important l are i gena Ipg C (Invasion Plasmid Gene), aceasta prevenind ca genele Ipa B i Ipa C s formeze complexe n citoplasma bacterian. Gena Ipa d este responsabil de ataarea unui receptor, specific la celula gazd. Genele Ipa d i Ipa C induc endocitarea bacteriei. Genele Ies A i Ies B (Intracellular Spread) favorizeaz rspndirea intracelular. Capacitatea de invadare a fost demonstrat pe modele experimentale pe animale i in vitro. Shigelloza este considerat boal autolimitant la aduli, dar poate fi fatal la copiii malnutrii. Alturi de particularitile reactive ale gazdei, severitatea bolii depinde esenial de virulena tulpinii infectate. unele shigele exprim n bulion CYE (Casamino Acids Yeast Extract) o hemaglutinin celular de suprafa. microscopia electronic a Shigella dysenteriae 1, Shi. flexneri 2a, Shigella boydii 12 i a Shigella sonnei 1, crescute n bulion CYE a evideniat acest strat celular care provoac aglutinarea eritrocitelor. Subcultivarea repetat a Shi. boydii, Shi. sonnei i a tulpinilor hemaglutinante negative de Shi. dysenteriae i de Shi. flexneri, pe buliuonul CYE, induce proprieti adezive i hemaglutinante. Acestea pot fi inhibate de sodiul periodat, de acidul N-acetilneuraminic i de alfaglicoproteine, dar nu i de proteaze. Acest strat extracelular extras de pe suprafaa celulelor de Shigella spp. are proprieti hemaglutinante ca i lipopolizaharidul obinut de la aceleai tulpini, cu excepia Shi. dysenteriae 1 (hale T.l., 1991).
17

Studii funcionale au artat rolul potenial dual al funciilor miozinei i modulului GAP al myr 5 pentru internalizarea bacteriei. myr 5 este fixat n punctele de intrare a bacteriei. modul de fixare seamn cu cel al Rho C sau al ezerinei, dar nu cu cel al Rho A, Rac sau CdC 42, pe cnd, in vitro, activitatea GAP a myr 5 este asemntoare cu Rho A, B sau C. n procesul de internalizare bacterian, n celulele epiteliale intestinale este implicat o miozin din clasa Ix i un antagonist Rho, i anume o protein activatoare a GTP-azei (GAP), adic myr 5. Analiza unor mutante de myr 5 a artat c activitatea de cuplare a GTP-azei i a ATP-ului nu sunt necesare pentru fixarea acestei miozine atipice induse de Shigella la locul de internalizare a bacteriei. Aadar, Shigella induce rearanjri citoscheletale, asociate internalizrii (Graf B. et al., 2000). la locul de interaciune bacterie - celul gazd, Shigella induce reorganizarea citoscheletal. Aparatul secretor de tip III al shigelelor permite inseria unui por care conine proteinele Ipa B i Ipa C n membrana celulei, inserie care permite translocarea captului terminus carboxi al Ipa C, dar i al altor efectori ai shigelelor, cum ar fi Ipa A n citosolul celulei. Ipa C declaneaz polimerizarea actinei i formarea extensiei filopodiale i lamelipodiale dependente de GTP-azele CdC 42 i Rac. Ipa A, pe de alt parte, induce depolimerizarea filamentelor de actin. Ipa A i GTPaza Rho nu sunt necesare pentru polimerizarea actinei la locul de contact bacterie-celul gazd, dar permite transformarea extensiilor induse de Ipa C ntr-o structur necesar internalizrii ei. Rho este necesar pentru fixarea la locurile de intrare a ezerinei, un liant citoscheletal necesar pentru internalizare, dar i pentru tirozinkinaza Src. Activitatea tirozinkinazei Src, necesar inducerii de ctre Shigella a polimerizrii actinei, este implicat de asemenea i n rspunsul regulator, care coordoneaza activitatea Rho la locul de intrare (Tjoa WS et al., 1997). Sistemul secretor de tip III mxi-Spa este necesar i pentru evadarea bacteriilor din formaiunile de protrusie. Vacuolele cu membran dubl (double-membrane-bound vacuoles) Ipa secretate via mxi-Spa sunt necesare n protrusia vacuolei, servind la liza dublei membrane (Sansonetti PJ, 1992). Sistemul regulator format din dou componente PhoP/PhoQ controleaz transcripia mai multor gene virulente eseniale pentru supravieuirea Shi. flexneri n fagozomul din celula gazd, chiar i atunci cnd acest agent patogen scap din fagozom n citoplasma celulei gazd. o mutant PhoP de Shigella a determinat infecia i a indus un rspuns
18

inflamator acut pe dou modele experimentale pe animale diferite. Aceast infecie s-a stins mult mai repede dect o infecie cu tipul slbatic de Shigella. Gena mutant a fost mai sensibil la aciunea leucocitelor polimorfonucleare (PmNs) i la alte peptide antimicrobiene extrase de la animale. mutanta PhoP se rspndete intracelular, induce apoptoza macrofagelor i tolereaz ph-urile acide extreme, ca i tulpina slbatic. Se consider c ea regleaz susceptibilitatea bacteriei la moleculele antimicrobiene i la celule polimorfonucleare, aspect important pentru stadiile trzii ale infeciei. Shigelele ataate la celulele epiteliale foliculare i folosesc proprietile endocitolitice pentru a intra n celule, unde o dat ajunse i lizeaz vacuola endocitar i coopteaz actina i miozina pentru a forma o elice, care s le propulseze pentru a putea penetra n continuare epiteliul prin suprafaa bazolateral (Sayeed S et al., 2000). Cei mai cunoscui determinani ai virulenei shigelelor sunt codificai, n majoritate, ntr-o plasmid mare, unic, la tulpinile virulente de Shigella spp. i de Escherichia coli enteroinvaziv, aceste gene ocupnd 30-35% din plasmida de virulen (Tsinzerling VA et al., 1997; Summary of Notifiable diseases in uSA, 1994). Pentru Shi. flexneri 5a prin analiza secvenial complet a fost determinat mrimea plasmidei de virulen: 210 Kb. S-au descoperit 286 locusuri de inserie (oRfs open reading frames). 53% dintre ele au legtura cu secvenele de inserie (IS). Nu se cunoate nici o alt plasmid care s aib o asemenea proporie de elemente IS. 50 de proteine putative nu au artat o asemnare semnificativ cu proteinele cu funcie cunoscut. dintre acestea 18 au un coninut n guanin / citozin mai mic de 40%, tipic pentru genele virulente cunoscute din plasmid. Cele 18 proteine constituie gene potenial virulente necunoscute. dou alele ale Shet 2 i cinci alele ale Ipa h au fost i ele determinate n plasmid. Astfel, o analiz secvenial complet permite o caracterizare mai exact a noi poteniali determinani ai virulenei bacteriilor genului Shigella spp. (Vaida T et al., 1996). Shi. flexneri invadeaz celulele epiteliului intestinal prin internalizare i diseminare. Principalii efectori ai intrrii, Ipa B i Ipa C, sunt necesari i pentru activitatea hemolitic i eliberarea din fagozomi n macrofagele infectate. Aceste proteine sunt stocate n citoplasm n asociaie cu Ipg C, nainte de producerea lor de ctre un aparat secretor de tip III activat de ctre celulele gazd. Astfel, pentru o diseminare eficient, alturi de Ipa B i Ipa C, un rol important l are i Ipg C (operon citoplasmatic). Analizele de microscopie electronic a celulelor infectate au artat c aceste proteine au fost necesare pentru liza membranei (protruzie) i pentru rspndirea de la o celul la alta (ollinger-Snyder R i matthews mE, 1996).
19

Studii recente au artat c migraia transepitelial indus de Shi. flexneri leucocitelor polimorfonucleare este inhibat de cadaverin, care este activat prin decarboxilarea lizinei. Shigella spp. devine patogen prin achiziionarea genelor de virulen i prin tergerea celor de nevirulen. folosind monostrat de celule T84 care imit epiteliul intestinal uman s-a indus nglobarea Cad A (protein care encodeaz lizindecarboxilazei) n Shi. flexneri, iar exprimarea acesteia a atenuat capacitatea bacteriei de a induce influxul de polimorfonucleare n epiteliul model, pe cnd asupra aceleiai proprieti de a induce migrarea polimorfonuclearelor la Salmonella i la Escherichia coli enteropatogeni nu a avut nici un efect. Toate acestea sugereaz folosirea potenial a cadaverinei n tratamentul dizenteriei (matsumoto m., Suzuki Y., Saito m., Yshikawa N., ohta m, 1998). dei capacitatea de invazie a Shigella spp. este limitat pe traiectul tubului digestiv, colitele cauzate de bacterie sunt relativ rare. Penetrarea celulelor epiteliale de ctre shigele este caracterizat de o reorganizare temporar a citoscheletului la locul interaciunii cu bacteria, ceea ce conduce la nglobarea bacteriei prin procesul de macropinocitoz. S-au efectuat studii care au artat c receptorul hialuronic Cd44 se asociaz cu Ipa B, protein secretat dup contactul cu celula. Studiul a folosit afinitatea cromatografic pe extracte de celule he la i a demonstrat c Ipa se leag direct la domeniul extracelular al Cd44. Experimentele de imunoprecipitare au artat i ele asocierea Ipa B cu Cd44 n timpul internalizrii shigelelor. Cd44 este fixat la locurile de intrare ale bacteriei i se localizeaz pe membrana plasmatic a extensiilor celulare induse de Shigella spp. Efectul Cd44 de cretere a vitezei formrii legturilor bacterie-celul i de internalizare sunt mult diminuate prin pretratarea celulelor cu anticorpi monoclonali; acetia inhib i reorganizarea citoscheletal indus de Shigella spp. Aadar, interaciunea Ipa B-Cd44 este necesar desfurrii mecanismului invaziv prin iniierea primilor pai ai procesului de intrare n celula gazd (Sears and Kaper, 1996). Ipa B (factor plasmidial de virulen, invazional) este necesar tuturor evenimentelor eseniale din cursul patogenezei infeciilor produse de Shigella spp.: invazia celulelor, eliberarea din fagozomi i inducerea apoptozei macrofagelor. Inducerea apoptozei este dependent de cuplarea Ipa B cu cystein - proteozo-caspase 1 (Casp 1). Activarea acestei enzime induce att apoptoza, ct i eliberarea citokinei proinflamatorii inter-leukin l-beta. S-a demonstrat c poriunea N-terminal a Ipa B este necesar pentru stabilirea expresiei Ipa B. un domeniu putativ alfahelicoidal se pare c ar conserva structurile Ipa B. S-au gsit 10 terminaii consecutive, cu terminaie aminic a regiunii hidrofobe, care joac un rol n invazie, eliberarea din fagozomi i
20

citotoxicitate. Studiile au artat c asocierea Ipa B-Casp 1 este doar un pas n declanarea apoptozei macrofagelor (Guichon A et al., 1997). Se consider c o protein de virulen este responsabil de glomerulonefrita indus de Shi. flexneri (mugochi T et al., 1999). Sistemul secretor mxi Spa de tip III al Shi. flexneri direcioneaz de la locul de contact o serie de invazine (Ipa s). S-a artat c Spa 33 este un element mobil din cadrul mxi Spa care exercit un control al translocrii Ipa n interiorul i n afara poziiilor membranei externe (om-outer membrane) ale structurii secretorii. Spa 33 este un substrat al mxi Spa care este translocat pe suprafaa celulei bacteriene dup inducerea secreiei de Ipa. dintre proteinele efectoare (Ipa) ale Shi. flexneri, numai C are activiti cuantificabile in vitro care au legturi cu invazivitatea (Thurston f l et al., 1998). S-au efectuat studii genetice ale aparatului secretor de tip III, mxi Spa i ale proteinelor Ipa A-d, care sunt encodate ntr-o plasmid de virulen. Studii secveniale ale plasmidei de virulen pWR 100 a Shi. flexneri, tulpina m90T (serotipul 5) au permis identificarea genelor care encodeaz aceste proteine i au artat c acest aparat secret circa 25 de proteine. Analiza coninutului n guanin i citozin, mpreun cu alte informaii despre localizarea i funciile acestor proteine au artat pWR100 conine blocuri de gene cu origini variate, dintre care unele au fost iniial purtate de patru plasmide diferite (Buchrieser C et al., 2000). dintre componentele mecanismului secretor de tip III al shigelelor compus dintr-o parte bazal i un vrf, care conine mxi d, mxi G, mxi J, mxi h Spa 47, s-a demonstrat c mxih este componenta de vrf cea mai important, fiind esenial n eliberarea proteinelor efectoare cu un rol deosebit n creterea invazivitii. n translocaia invazinei un rol important l deine i mxi m, o lipoprotein extramembran (Skoudy A et al., 2000). Shi. flexneri are i ea o plasmid de virulen mare, pmYSh 6000, care encodeaz un sistem killing postsegregaional (PSK) eficient (Sansonetti PJ et al, 1982). Studii recente au ntrit ipoteza conform creia concentraia vir f (virulence-related-transcriptional-regulator) este factorul critic al reglrii virulenei la Shigella spp., precum i faptul c rolul sistemului translaional bacterian n reglarea exprimrii genelor de virulen este la fel de important ca i reglarea n bune condiii a nivelului transcripional. modificarea RNA t, temperatura i superhelicitatea au aceeai int - expresia vir f - influeneaz exprimarea genei regulatoare centrale vir B i astfel a virulenei bacteriei. date recente arat c exprimarea citocromului bd, unul dintre cele dou oxidaze terminale ale lanului respirator microbian care reduce oxigenul
21

molecular la ap, este absolut necesar pentru supravieuirea intracelular i pentru exprimarea virulenei la Shi. flexneri (durand Jm et al., 2000). localizarea unipolar a Ies A pe suprafaa Shi. flexneri este necesar pentru formarea eficient a cozilor de actin i pentru protrusia n celulele eucariote infectate. S-a demonstrat c localizarea unipolar a Ies A n Shi. flexneri 2a nu depinde de determinanii plasmidici ai virulenei (Rducnescu fl i Bica Popii V., 1986). n exprimarea patogenitii bacteriilor enteroinvazive, un rol important l joac i apy-aza, apy fiind un locus din plasmid de virulen a crui expresie poate fi controlat de temperatur (induce sinteza la 37C i o represeaz la 30C) i de cascada vir f, vir B. Produsul genei apy este apyaza (ATP-difosfohidrolaza), (Berlutti R et al., 1988).

1.7. Epidemiologie
n 2006, au fost raportate 6.513 cazuri de shigeloz de ctre 26 state membre ale uE i state EEA/EfTA (danemarca, frana, Italia i liechtenstein nu au raportat). dintre acestea 6.410 au fost confirmate i rata notificrii medii la nivelul uE a fost de 1,7 la 100.000 locuitori. Aceste date sunt cu 24% mai mici dect raportrile din 2005 ale acelorai ri. Cea mai mare rat a notificrilor a fost realizat de Bulgaria (11,4 la 100.000 locuitori), Slovacia (8,1 la 100.000 locuitori), lituania (5,9 la 100.000 locuitori) i Suedia (4,7 la 100.000 locuitori). Raportul cazurilor de shigeloz importate versus domestice variaz substanial de la o ar la alta. n finlanda, Suedia, Norvegia, olanda, Irlanda, Germania i Regatul unit, 63%-92% din cazurile de schigeloz sunt considerate de import sau asociate cltoriilor. Aceasta este n contrast cu ri precum Grecia, Slovenia, Slovacia i ungaria, unde 87-100% din cazuri sunt domestice.
Tabelul 1.1. numrul i rata notificrilor cazurilor de shigeloz uman n UE i EEA/ EfTA, n 2006 (Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor, 2008)
ara Tipul de raportare Total cazuri Cazuri confirmate Nr. cazuri per populaii de 100.000 de oameni

Austria Belgia Bulgaria Cipru Republica Ceh danemarca Estonia

C u A C C u A

77 305 879 2 289 53 22

77 305 879 0 276 53

0,93 2,9 11,4 0,26 2,7 3,9

ara

Tipul de raportare

Total cazuri

Cazuri confirmate

Nr. cazuri per populaii de 100.000 de oameni

finlanda frana Germania Grecia ungaria Irlanda Italia latvia lituania luxembourg malta olanda Polonia Portugalia Romnia Slovacia Slovenia Spania Suedia marea Britanie Total uE Islanda liechtenstein Norvegia Total

C u C C C C u C A C u C A C C C C C C C C N C

74 814 30 93 54 87 203 13 0 256 35 2 559 465 43 148 429 1425 6375 0 138 6513

74 814 26 73 53 73 203 13 0 248 30 1 559 436 36 148 429 1425 0 138 6410

1,4 0,99 0,23 0,72 1,3 3,2 5,9 2,8 0,0 1,5 0,08 0,1 2,6 8,1 1,8 0,34 4,7 2,4 1,71 0,0 3,0 1,73

Sursa: Raportri naionale. A = Raportri de date agregate; C = Raportri bazate pe cazuri; - = fr raportare; u = nespecificat

distribuia shigelozelor pe grupe de vrst i sex Rata notificrilor a fost cea mai mare la grupa copiilor cu vrsta ntre 0 i 4 ani, cu 7,1 cazuri la 100.000 locuitori. Bulgaria i Slovacia au avut rate ale notificrilor mult mai mari, de 148,7 i respectiv 90,0 la 100.000 locuitori la grupa de vrst 0-4 ani. Numai cteva state, cum ar fi finlanda, olanda i Germania au avut cele mai mari rate ale notificrilor la grupa de vrst 25-44 ani. Nu au fost semnalate diferene semnificative ale ratelor de notificare n funcie de sex: din 4.514 cazuri cercetate brbaii au avut rata medie a notificrii de 1,3 la 100.000 locuitori, iar la femei de 1,4 la 100.000 locuitori.
23

Figura 1.1. distribuia pe grupe de vrst a cazurilor de shigeloz uman n EU i EEA/ EfTA n 2006 (n=142325 cazuri) (Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor, 2008)

Sursa: Raportri naionale. Austria, Belgia, Bulgaria, Cipru, Republica Ceh, Estonia, finlanda, Germania, Grecia, ungaria, Irlanda, latvia, luxembourg, olanda, Portugalia, Slovacia, Slovenia, Spania, Suedia, m.B., i Norvegia. malta i Islanda au raportat 0 cazuri

Sezonalitatea un vrf al numrului total de cazuri raportate a fost observat spre finalul verii i n lunile de toamn. Shigeloza nc are un impact major asupra copiilor de vrst foarte mic, cu o rat a notificrilor maxim la grupa 0-4 ani. n statele unde rata maxim a notificrilor a fost la grupele de vrst mijlocie, acestea au fost cel mai adesea asociate cltoriilor, iar la aceste state majoritatea cazurilor raportate au fost de import. de asemenea, variaia de la tiparul sezonier general observat n unele state se poate datora tot cazurilor asociate cltoriilor, din timpul vacanelor de iarn. 1.8. manifestri clinice Tabloul clinic de baz are dou forme de manifestare: diareea apoas asociat cu vom i deshidratare sau cu dizenterie (volum mic al fecalelor, cu mucus, snge, crampe i tenesme), (djuretic T, col., 1996; Guerrant l.R., 1995). Semnele clinice apar la 24-48 ore de la ingerare n infecia acut, cu limite ntre 7 i 36 ore, pn la 1-7 zile n transmisiile nealimentare. durata bolii este n medie de 7 zile la adulii tratai i pn la 30 zile la cei netratai.
24

Cazuri/100.000

dizenteria cauzat de Shigella spp. este marcat de penetrarea celulelor epiteliului intestinal, cu ataarea shigelelor la suprafaa mucoaselor. urmeaz inflamaia local, cu descuamarea celulelor epiteliului intestinal i formarea de ulcere. Inflamaia intestinului (colonului) este mediat de citokine, care produc necroza epiteliului intestinal. Germenii se multiplica mai nti n intestinul subire, apoi se mut n colon, de unde pot fi izolai n 1-3 zile de la debutul clinic al infeciei (Schuch R., maurelli A.T., 2001). Studiile efectuate pe voluntari arat c infecia poate fi provocat chiar i dup ingerarea unui numr redus de bacterii, cuprins ntre 10 i 100 microorganisme patogene. la copii, diareea poate dura ntre 3 i 5 zile (evoluie scurt), 6-9 zile (evoluie medie) i mai mult de 9 zile (evoluie cronic). una dintre cele mai severe complicaii este ileusul, obstrucie intestinal nsoit de balonarea abdomenului, prin blocarea tranzitului, care poate duce la megacolonul toxic. o alt complicaie este glomerulonefrita acut produs de Shi. flexneri, nsoit de evidenierea unei proteine sub form de complexe imune (mugochi T. et al., 1999). una din complicaiile tardive, deloc de neglijat, aprut dup infecia cu Shigella, la cea 3% din bolnavi, este sindromul Reyter, manifestat prin artrit reactiv dureroas, uretrit i conjuctivit. 1.9. Sensibilitatea fa de factorii de mediu Sensibilitatea shigelelor la factori fizici i chimici Shigelele rezist un timp scurt n condiii de aciditate extrem (ph 2,5); la cldur, inactivarea se produce n 10 minute la 58-60C, iar la lumin solar direct mor n cel mult 60 minute. Supravieuiesc n mediul nconjurtor aproximativ 60 de zile la temperaturi sub 0C, iar la uscciune maximum 20 de zile. Shigelele sunt enterobacterii cu rezisten sczut, comparativ cu flora fecaloid saprofit din alimente i din mediul natural. din aceast cauz probele de la pacieni i prelevatele alimentare trebuie prelucrate imediat sau conservate n medii speciale, sau prin crioconservare (-20C). n diferite alimente (lapte, brnzeturi, ou, crustacei, molute, suc de roii) inoculate experimental cu un numr mare de germeni, shigelele au supravieuit perioade de timp variind de la 3 sptmni la 3 luni. n lapte inoculat experimental, Shi. flexneri s-a multiplicat semnificativ la temperaturi de 19-37C, ns creterea a fost observat i la niveluri
25

mai joase 12C. Rezistena shigelelor n condiiile mediului extern este mai redus ca a salmonelelor, dar pot supravieui un timp suficient de lung pentru a asigura transmiterea infeciei. unele specii de Shigella (Shi. flexneri, Shi. sonnei) pot contamina laptele prin intermediul mutelor, prin minile mulgtorilor, procesatorilor sau prin apa poluat cu dejecii umane. multiplicarea shigelelor este mai intens n laptele pasteurizat din cauza lipsei florei concurente. rezistena shigelelor la antibiotice Rezistena shigelelor la antibiotice este condiionat de uurina cu care aceast grupare achiziioneaz i transfer plasmidial rezistena multipl. Rezistena intrinsec, adic rezistena unui grup dat la un anumit antibiotic este rar la genul Escherichia i Shigella. Susceptibilitatea varietilor izolate difer foarte mult i de aceea antibiogramele sunt folosite adesea ca markeri epidemiologici. Aceast rezisten non-intrinsec este uzual mediat plasmidic (du Pont h.l., 1995; Edwards Bh., 1999). din cauza folosirii curente n clinica uman a unui numr mare de antibiotice, Shigella spp. a devenit progresiv rezistent la cele mai rspndite i mai accesibile antibiotice (tabelul 1.2).
Tabelul 1.2 Susceptibilitatea shigelelor la acidul nalidixic i la cele mai noi quinolone (Toppley i Wilsons, sistematic Bacteriology, 1990)
Perioada ara nr. cazuri tratate Antibioticul Susceptibilitatea (%) Autorul

1977-1979 1984-1987

Suedia M.B.

43 120 1313 107 252 91 515 58 262 255

1984-1989 olanda 1985-1986 Elveia 1985-1986 SuA 1985 Bangladesh 1986 Bangladesh 1987 Bangladesh 1987-1992 Israel 1989-1990 Germania

Acid nalidixic Acid nalidixic Quinolone noi Acid nalidixic Acid nalidixic Acid nalidixic Acid nalidixic Acid nalidixic Acid nalidixic Acid nalidixic Acid nalidixic

100 100 99,8 98,0 99,6 100 68,7 40,0 98,1 100

houstonetal. (1981) lingetal. (1988) Voogaletal. (1992) Altweggetal. (1986) Tauneetal. (1990) musnshictal.(1987) munshietal. (1987) munshietal. (1987) Admonietal. (1995) Aleksieetal.(1993)

dobndirea uoar a rezistenei de la alte enterobacterii comensale, poate face ineficient terapia iniial (intit prin testarea sensibilitii),
26

iar pe de alt parte poate induce enterobacterii rezistente implicate apoi n complicaii secundare, reducnd gama antibioticelor active n terapie. n terapia shigelozelor la om sunt recomandate trimetoprim, sulfametoxazolul i quinolonele de toate generaiile, deoarece scurteaz evoluia i portajul cronic. fenomenul rezistenei transferabile, semnalat de Watanabe, 1963, citat de Brzoi d., meica S., Negu m., 1999, s-a extins mult, fiind raportat n procent ridicat n unele zone geografice (mexic, America Central, Asia, India i Africa). Aceast rezisten multipl dobndit la sulfamide, cloramfenicol, ampicilina i tetraciclin are dublu impact terapeutic. rezistena shigelelor n alimente, ap i alte suporturi biologice ntruct habitatul normal al shigelelor este tractul intestinal al omului i maimuelor superioare, rspndirea acestora n natur este limitat aproape exclusiv la om. Alimentele i sursele de ap contaminate de om au semnificaie de principal vector nespecific. Alimentele care nu sunt acide sau prea uscate sunt surse de risc potenial pentru mbolnvirea omului, ntruct aceti germeni pot supravieui i se pot multiplica pe acest substrat. Cu toate c rezistena n condiiile mediului extern este mai redus dect a salmonelelor, shigelele pot supravieui un timp suficient de lung pentru a asigura transmiterea infeciei. n apele poluate shigelele triesc 2-4 zile, iar n apa sterilizat, infectat experimental, 10-12 zile. Pe alimentele cu ph apropiat de neutru acestea supravieuiesc i se nmulesc. de exemplu, Shi. flexneri a putut fi izolat din icrele de manciuria cu ph 5,5 i concentraie de sare de 6%. n produsele n care shigelele se afl n asociaie cu Escherichia coli supravieuiesc puin timp, ntruct sunt sensibile la produsele de metabolism ale acestei bacterii i, desigur, sunt sensibile i la acidifierea substratului, produs de Escherichia coli. Shigelele au rezisten sczut la flora fecaloid sau saprofit din alimente sau din mediul natural. n lapte, brnzeturi, crustacei, molute, suc de roii, ou, etc. shigelele supravieuiesc ntre 3 sptmni i 3 luni. n vinurile roii i albe, precum i n vinul mukumbi (vin tradiional din zimbabwe), s-a observat c shigelele mor rapid, fenomen datorat aciditii mai ridicate. S-a observat c shigelele nu pot supravieui nici n pudra de sorg sau
27

n porrigde-ul fermentat sau gtit. Potenialul shigelelor de a se multiplica pe alimente la temperaturi de pn la 10C explic de ce unele alimente, iniial contaminate cu un numr subinfectant de germeni sunt implicate n declanarea toxiinfeciilor alimentare. Shigelele pot supravieui i se pot multiplica i pe zarzavaturile crude contaminate fie prin apa de la irigaii, fie prin manipularea lor neigienic de ctre muncitorii purttori de germeni. n praful uscat shigelele rezist aproximativ 10 zile, iar pe lenjerie peste 2 sptmni. n ap la temperatura de 7-10C shigelele supravieuiesc aproximativ 9 zile, iar n alimente 1-2 sptmni. n apa ngheat triesc circa 2 luni. 1.10. Prelevarea, ambalarea, transportul i conservarea probelor de alimente de origine animal destinate investigaiilor microbiologice Recoltarea, ambalarea, pstrarea i transportul probelor de alimente de origine animal destinate examenelor microbiologice, trebuie s respecte unele reguli procedurale obligatorii privind organizarea, prevzute n Normele ministerului Sntii. Proba prelevat trebuie s fie reprezentativ i, dac este posibil, n cantitate suficient pentru efectuarea tuturor investigaiilor necesare. n toate manoperele se va evita contaminarea suplimentar a probei cu ali germeni sau diveri ali ageni poluani care nu sunt implicai etiologic n cazul cercetat, astfel nct rezultatul final al examenului de laborator s nu fie denaturat sau influenat. Trebuie subliniat obligativitatea ca toate probele trimise pentru investigaii de laborator s fie expediate sigilat pentru pstrarea integritii lor, cu not de nsoire completat detaliat i semnat de cei care au solicitat examenul. n interiorul coletului se va introduce un exemplar al avizului de identificare al fiecrui produs n parte, de asemenea, semnat de fiecare din factorii autorizai. Probele se recolteaz din unitile productoare, depozite, mijloace de transport, reeaua de desfacere sau, n cazuri speciale, de la domiciliul cumprtorului sau productorului unor asemenea produse, precum i de la bolnavii suspeci de toxiinfecie alimentar. Recoltarea probelor se face de ctre un medic veterinar oficial de stat sau de ctre o persoan mputernicit de lege i de medicii care acord asisten clinic bolnavilor suspeci de toxiinfecie alimentar. nainte de recoltarea probelor, medicul veterinar trebuie s se
28

informeze amnunit asupra produsului ce urmeaz a fi expertizat, unitatea productoare, data fabricrii, condiiile igienico-tehnologice de fabricare, depozitare, transport sau desfacere, rezultatele controalelor sau analizelor de laborator efectuate pn la acea dat, aspectul general al produsului sau lotului, starea ambalajului, modul de etichetare sau tanare, dac asupra produsului respectiv au existat litigii i modul de soluionare a acestora, dac produsul se afl n termenul de valabilitate, etc. Probele recoltate trebuie s fie reprezentative, s reproduc n mic imaginea real a lotului i s fie corespunztoare pentru examenul solicitat. Se vor recolta n mod proporional, att probe din prile care par suspecte, ct i din cele care par nemodificate. Proba va cuprinde att pri de la suprafa, ct i din centrul produsului i se va ambala n recipiente curate i uscate care s permit o nchidere complet. n cazul recoltrii probelor pentru examene bacteriologice fiecare prob se va ambala n recipiente sterile sau n pungi de polietilen nefolosite. Recoltarea succesiv a mai multor probe trebuie s se fac astfel nct s nu se amestece pri din acestea sau s nu se contamineze ntre ele, iar pentru recoltarea fiecrei probe se vor folosi alte instrumente sterilizate. dup recoltare fiecare prob se va individualiza prin etichetare corect, se va ambala separat astfel nct s nu se deterioreze n timpul transportului i se va sigila pentru a mpiedica substituirea produsului. Sigiliul pus pe probe va fi menionat n procesul-verbal de recoltare. Produsele preparate i livrate n recipientele nchise ermetic (conserve, semiconserve) se vor recolta i expedia la laborator n ambalajele originale, nedeschise. dac aceste produse au sigilii, banderole sau etichete care servesc marcrii sau prezentrii, acestea vor rmne obligatoriu la proba ce se trimite la laborator. la ridicarea probelor se ncheie un proces-verbal de recoltare, care va fi semnat de medicul veterinar care recolteaz proba i va fi contrasemnat de un reprezentant al unitii asupra cruia se afl n gestiune sau proprietate produsul. Procesul-verbal de recoltare va cuprinde numele i calitatea medicului veterinar care a ridicat proba, numele i calitatea reprezentantului unitii care a asistat, denumirea produsului (cu specificarea numrului standardului sau al normei interne, dac este cazul), specificaiile de marcare a produsului, motivul recoltrii i analizele de laborator solicitate. n cazul crnii i laptelui se va meniona dac acestea provin de la animale tratate cu antibiotice, chimioterapice, substane hormonale, biostimulatori, etc. n procesul-verbal de recoltare a probelor se va meniona numrul
29

lotului, cantitatea sau numrul unitilor de ambalaj care constituie lotul controlat, numrul probelor recoltate i cantitatea lor, temperatura produsului n momentul recoltrii, laboratorul la care se expediaz probele i specificaia sigiliului pus pe ambalajele cu probe, alte informaii etc. Concomitent cu ridicarea probelor reprezentative se vor ridica i contraprobe identice pentru expedierea la laborator. Analiza contra-probelor se va face la solicitarea unitii deintoare, organelor de justiie, poliie sau altor foruri oficiale. Contraprobele din loturile de produse conservabile pe durat lung (conserve, semiconserve) se pstreaz pn la expirarea termenului de valabilitate. Nu se rein contraprobe din produsele evident alterate sau din cele care nu se pot conserva dect foarte puin timp. Probele recoltate trebuie transportate la laborator imediat, n condiii care s nu determine alterri sau modificri ale nsuirilor avute n momentul recoltrii. lotul de alimente aflat n litigiu se pune sub restricii sanitare veterinare pn la terminarea tuturor analizelor de laborator i clarificarea situaiei. n toat aceast perioad, deintorul produselor alimentare este obligat s asigure condiiile corespunztoare de conservare. Trebuie menionat c n practica curent exist tendina de a se da noiunii de lot cele mai diferite i incorecte sensuri i definiii ce pot denatura nu numai noiunea n sine, dar pot genera confuzii i interpretri cu implicaii epidemiologice, economico-sociale i juridice dintre cele mai grave (Enache T., 2002). de aceea pentru nlturarea acestor situaii echivoce s-a propus acceptarea n unanimitate a definiiei oficiale a noiunii de lot dat de dicionarul Explicativ al limbii Romne: 55 Grup de produse identice sau asemntoare fabricate simultan sau succesiv; 55 Grup de produse identice sau asemntoare, expediate n acelai timp sau sosite n acelai timp i/sau depozitate n acelai loc sau spaiu comercial. n continuare, n scopul unei orientri generale ct mai corecte i complete asupra modului n care se face recoltarea (pentru analize de laborator a probelor de alimente de origine animal) i chiar din considerente didactice, se va prezenta aceast conduit general pe grupe de produse. Preparate de carne. Recoltarea probelor se face din locuri diferite maximum 2% din numrul batoanelor sau calupurilor, dar nu mai puin de dou buci i nu mai mult de 6. din preparatele de carne prezentate
30

n ambalaje mici (sub 1 kg) se recolteaz din locuri diferite o cantitate de 1,5-2 kg. Batoanele sau calupurile recoltate sunt secionate longitudinal la faa locului, de ctre medicul veterinar, n jumti egale i se face un examen organoleptic (aspect pe seciune, miros i gust). Pentru preparatele n ambalaje mici (sub 1 kg) proba iniial se desparte n dou jumti egale. Cele dou jumti rezultate constituie proba i contraproba reprezentativ. dintr-o jumtate a batonului secionat se detaeaz de la mijloc i de la capete cteva poriuni n greutate total de 300-800 g, care se trimit la laborator pentru analize fizico-chimice i microbiologice. Conserve. Recoltarea probelor se face pe loturi dup cum urmeaz: cnd lotul are pn la 1000 recipiente se recolteaz 2 recipiente; de la 10015000 se recolteaz 5; de la 5001-10000 se recolteaz 10; de la 10001 - 50000 se recolteaz 20; de la 50001 -100000 se recolteaz 30 de recipiente. Pentru fiecare 100000 sau fraciuni de 100000 n plus se vor recolta cte 15 recipiente. din reeaua de desfacere se recolteaz de obicei 2% din cutiile de conserve existente, dar pe ct este posibil s se in seama de sortimente. V5 Semiconserve din carne. Recoltarea probelor se face pe loturi, n funcie de mrimea acestora, dup cum urmeaz: cnd lotul are pn la 1000 recipiente se recolteaz 2 recipiente; de la 1001 -2000 se recolteaz 4; de la 2001-3000 se recolteaz 6; de la 3001-5000 se recolteaz 8; pentru fiecare 5000 recipiente n plus se recolteaz cte 5 recipiente. V5 Untur de porc i de pasre. Se recolteaz la ntmplare 5% din numrul ambalajelor unui lot. untura este ambalat n blocuri sau preambalat n ambalajele de transport. din blocuri cu ajutorul unei sonde se scot probe din toate straturile. la loturile formate din pachete de pn la 1 kg se recolteaz 1% din numrul pachetelor, dar nu mai puin de 5 i se recolteaz cte 1 prob din fiecare pachet. din probele recoltate astfel se face o prob medie, din care se trimit la laborator 500 g. Cnd lotul este format din ambalaje de pn la 500 g se expediaz la laborator 1% din ambalajele originale luate la ntmplare, dar nu mai puin de 2 i nu mai mult de 5. V5 alimentar topit. Se deschid la ntmplare 5% din ambalajele Seu aparinnd aceluiai lot, dar nu mai puin de 3 ambalaje, din care se recolteaz probe din toate straturile cu ajutorul unui cuit sond. Se face o prob medie dup topire pe o baie de ap din care, dup omogenizare, se iau 500 g, se ambaleaz i se expediaz ctre laborator. V5 Pete. Se recolteaz la ntmplare 5% din ambalajele unui lot. V5 Cnd greutatea individual a petelui nu depete 2 kg, cte 2 exemplare din fiecare ambalaj, unul de la suprafa i cellalt din
31

profunzime; V5 Cnd greutatea individual a petelui depete 2 kg, cte o bucat (de aprox. 1 kg) dintr-un pete de la suprafa i o bucat dintr-un pete din profunzimea ambalajului. Cnd petele este n vrac se va recolta cte o prob (de 1 kg) pentru fiecare 1.000 kg, ns nu mai puin de 3 probe i nu mai mult de 10. Probele se vor recolta att de la suprafa, ct i din profunzime; V5 dac petele este ambalat n butoaie cu saramur, din fiecare ambalaj controlat se recolteaz i o prob de aproximativ 200 ml saramur. V5 Se desfac 10% din ambalajele lotului i se recolteaz cte o Icre. prob (suprafa i profunzime) de aproximativ 250 g din minimum dou i maximum 5 ambalaje deschise. V5 Crustacei i molute. Se recolteaz 1% din numrul exemplarelor care formeaz lotul, astfel nct greutatea probei s fie de 500-1000 g pentru fiecare lot. Probele se vor lua din diferite puncte ale lotului. V5 Pulpe de broasc (pui de balt). Se recolteaz ambalajele originale (brichete) n procent de 5%, dar nu mai puin de dou i nu mai mult de cinci. V5 Pentru probele de ou. Se deschid 10% din ambalajele care formeaz lotul i din fiecare ambalaj se recolteaz 12 ou din cutiile de 360 ou. Numrul total al oulor recoltate dintr-un lot nu va fi mai mare de 100. n cazul oulor preambalate se recolteaz 1% din numrul preambalajelor. V5 Pudr de ou sau produse de ou pasteurizate sau congelate (ou integral, glbenu, albu). Se recolteaz probe n procent de 2% din numrul ambalajelor, dar nu mai puin de 5 i nu mai mult de 10. V5 Recoltarea probelor de lapte la locul de producie se face n caz de litigii pentru stabilirea fraudelor privind integritatea (mai ales cantitatea de grsime) sau calitatea igienic, n acest caz se vor recolta probe n urmtoarele condiii: V5 mai trziu la 3 zile de la ivirea litigiului: de la aceeai vac sau Cel de la acelai numr de vaci i de la aceeai mulsoare sau de la acelai numr de mulsori ca i proba n litigiu; V5 va controla dac alimentaia animalelor nu s-a schimbat ntre Se timp; V5 mulgerea va fi complet i fcut n aceleai condiii ca i cea de la care s-a obinut laptele; V5 Pentru depistarea unor germeni n lapte se vor recolta probe individuale de la fiecare animal direct n recipientul de recoltare, dup ce n prealabil s-a asigurat dezinfecia ugerului i minilor muncitorului. Probele se vor recolta de la nceputul mulsorii dup ce s-au ndeprtat
32

primele 3-4 jeturi, cu excepia controlului pentru leucoz i tuberculoz, cnd probele se recolteaz din mulsul final. Probele se recolteaz n prezena unor martori. n unitile de prelucrare industrial se controleaz laptele sub aspectul integritii i al calitii igienice i se recolteaz probe la recepie, pe fluxul tehnologic de prelucrare i dup obinerea produsului finit. n unitile de desfacere, recoltarea probelor se face astfel: 5 Din cisterne, bazine i tancuri se recolteaz cu ajutorul unor sonde speciale minimum 500 ml pentru fiecare prob, dup o prealabil omogenizare; 5 bidoane se formeaz o prob medie de 10% din bidoanele care Din constituie lotul; din proba medie bine omogenizat se recolteaz 500 ml pentru examen de laborator; 5 buteliile de sticl, pungi din material plastic, 2-3 uniti de Din ambalaj din fiecare lot. Probele recoltate trebuie s ajung la laborator n maximum 4 ore de la recoltare, transportul lor fcndu-se n condiii de refrigerare. 5 Produsele lactate acide se recolteaz n ambalaje originale n procent de 1% din ambalajele care alctuiesc lotul, dar nu mai puin de 2 i nu mai mult de 5. 5 Smntn ambalat n bidoane i pregtit pentru livrare. Se deschid 5% din numrul bidoanelor i se recolteaz o prob medie de 250 g. dac smntn este preambalat n uniti mai mici de 0,5 kg se recolteaz 1% din unitile de ambalaj, dar nu mai puin de 2 i nu mai mult de 5. 5 Untul ambalat n lzi sub form de blocuri. Recoltarea probelor se face la 10% din ambalajele care formeaz lotul, dar nu mai puin de 3, cu ajutorul unei sonde speciale, recoltndu-se, att de la suprafa, ct i din profunzime cte 200 g din care se face o prob medie. din proba medie omogenizat se recolteaz 250 g pentru laborator. Cnd untul este ambalat n pachete de pn la 200 g se recolteaz pachete ntregi, n procent de 2% din numrul care formeaz lotul, dar nu mai puin de 2 i nu mai mult de 5. 5 Laptele praf n ambalaje mari (peste 1 kg). Se recolteaz 10% din numrul ambalajelor care formeaz lotul i se face o prob medie de 250 g. Recoltarea se face cu sonda, ndeprtndu-se stratul superficial pe o adncime de 5-10 centimetri. 5 Brnza proaspt de vac. Se deschid 10% din ambalajele care formeaz lotul, n cazul ambalajelor mari (bidoane, tvi) se iau probe de la suprafa i profunzime din care se formeaz o prob medie.
33

din proba medie se trimit la laborator 200 - 300 g. dac lotul este format din ambalaje mici (pachete) se recolteaz 2% din numru unitilor de ambalaj, dar nu mai puin de 2 i nu mai mult de 5. 5 Pentru probele de cacaval i brnzeturi fermentate (diferite sortimente) se deschid 5% din unitile de ambalaj care formeaz lotul, dar nu mai puin de 2 i nu mai mult de 5. din fiecare ambalaj deschis se recolteaz pentru laborator cte o prob de 200-300 grame n felii sau cu o sond special, astfel nct s cuprind att suprafaa, ct i profunzimea. Pentru sotimentele ambalate n pachete mici de pn la 250 grame se recolteaz pachete originale n procent de 1, dar nu mai puin de 3 i nu mai mult de 10. 5 Brnza telemea n cutii sau bidoane. Se recolteaz o felie dintr-o bucat de la suprafa i una dintr-o bucat din profunzime. de asemenea, se recolteaz i 200-300 mililitri saramur. 5 Mierea de albine. Se deschid 10% din numrul ambalajelor din fiecare lot, ns nu mai puin de 3 i nu mai mult de 7. dup o omogenizare atent se recolteaz din fiecare ambalaj deschis aproximativ 250 grame miere, fcndu-se o prob medie. dup omogenizare, din aceasta se recolteaz pentru laborator 250 grame. Trebuie menionat c n funcie de felul alimentului i al modului de ambalare, probele recoltate pentru examen de laborator se refrigereaz la 1-4C, fr ns a le congela. din alimente congelate, prezentate n ambalaje mici, probele se iau ca atare, iar din cele prezentate n ambalajele mari se recolteaz probe prin forare, tiere sau prin achiere cu instrumentar corespunztor. Prelevarea probelor de ap pentru identificarea germenilor din genul Shigella spp. Se recolteaz ap de robinet din sursa de alimentare, ap din rezervoare, bazine, lacuri, fntni, etc, n funcie de situaia existent. Pentru proba de ap din reeaua de alimentare se flambeaz robinetul, apoi se deschide complet i se las s curg ap 5 minute i aproximativ 10 secunde din rezervor. Se scoate dopul flaconului pentru prob i se menine sub jet pentru a se umple pn la aproximativ 2 centimetri sub dop. Sunt necesare probe de 1-5 litri. Probele se transport n lad izoterm pentru examinare n interval de maxim 2 ore. Examinarea se poate temporiza maximum 6 ore, dac proba este
34

refrigerat ab initio la 4C. Alternativ, se pot folosi tampoane moore, meninute 48 ore sub jetul lent de ap din conduct, dup care sunt transferate n recipient cu mediu de mbogire. Prelevarea probelor de ghea alimentar din blocul de ghea se recolteaz calupuri de aproximativ 2 kilograme. n laborator calupul se spal cu ap steril apoi, folosind instrumente sterile se taie din profunzime cteva buci (aproximativ 0,5 kilograme), care se menin n vas steril la temperatura camerei pn la topire, fiind supuse n continuri protocolului obinuit de lucru, n cel mai scurt timp. Prelevarea probelor de pe suprafeele de lucru Este recomandat prelevarea cu tampoane sau burei. metodele de amprentare sau incluzionare n mediu agarizat sunt contraindicate pentru investigaii n focarul de toxiinfecie alimentar. Cu mnui sterile i cu burete mbibat cu ap peptonat 0,1% se terge o suprafa ct mai mare, apoi buretele se introduce n flaconul cu mediu de mbogire. Alternativ, se folosete pentru tergere tampon umezit cu ap peptonat 0,1%. dac se urmresc determinri cantitative, se delimiteaz suprafaa investigat printr-un ablon metalic, cu aria de 100 cm2, sterilizat prin flambare. n final se introduce buretele sau tamponul ntr-un volum msurat de diluant. Pentru prelevarea probelor de ap clorinat se folosesc flacoane care conin 10 mg tiosulfat de sodiu pentru fiecare 500 ml de ap. dac suprafeele investigate au fost deja dezinfectate se stropesc cu o soluie N/10 tiosulfat de sodiu. Probele se refrigereaz i se expediaz la laborator pentru examinare n cel mai scurt timp. Prelevarea probelor de la pacienii cu sindrom diareic acut, de la purttorii cronici i de la personalul care produce, manipuleaz i transport alimente de origine animal n cazuri acute de toxiinfecii alimentare se vor preleva din colonul sigmoid probe de fecale cu tampon rectal sau cu sonda Nelaton, dar i din ulceraiile descoperite la rectoscopie. Nu se vor preleva probe de la pacienii
35

bolnavi de mai mult de 3 zile.

1.10. Izolarea i identificarea shigelelor

Izolarea i identificarea shigelelor din alimente mbogirea la Shi. sonnei: Se cntrete aseptic o prob de 25 de grame n 225 ml de bulion Shigella cu novobiocin 0,5 mg/ml. Amestecul se las 10 minute la temperatura camerei i se agit permanent, dup care se toarn ntr-un balon Erlenmeyer steril de 500 ml. Balonul se incubeaz anaerob ntr-un sistem Gas Pak, n baie marin, la 44C, timp de 20 de ore. Se omogenizeaz bine suspensia i se striaz n plci cu agar mac Conkey. Se incubeaz 20-48 de ore la 35C. mbogirea altor specii de Shigella: Se procedeaz ca mai sus, dar se ncorporeaz o cantitate de novobiocin de 3 mg/ml i se incubeaz anaerob n baie marin la 42C. Izolarea shigelelor: Se examineaz plcile cu agar mac Conkey. Coloniile de Shigella apar roz palide i translucide. Coloniile suspecte se nsmneaz n bulion cu glucoz, agar TSI, bulion cu lizin-decarboxilaz, agar pentru testarea mobilitii i tripton. Se incubeaz la 35C, 20-48 de ore, dar se examineaz la 20 de ore. Se ndeprteaz toate culturile care prezint mobilitate, produc hidrogen sulfurat, formeaz gaz, lizin-decarboxilaz, fermenteaz sucroza sau lactoza i produc indol. Identificarea biochimic: Shigelele pot fi caracterizate biochimic astfel: teste negative pentru: hidrogen sulfurat, ureaz, glucoz (gaz), mobilitate, lizin-decarboxilaz, ornitin-decarboxilaz (exceptnd Shi. sonnei), sucroz, adonitol, lactoz (2 zile), salicin, inozitol, cianur de potasiu, malonat, citrat, Voges-Proskauer; teste pozitive pentru: manitol (excepie Shi. dysenteriae) i reacia roului metil.

36

IdEnTIfICArEA gEnULUI ShIgELLA

1. Amestecul probei alimentare cu mediul de mbogire 225 ml bulion Shigella cu novobiocin 25 g aliment

2. decantarea supernatantului ntr-un balon steril

3. Incubare anaerob 20 de ore la 44C (Shi. Sonnei) sau la 42C (celelalte specii)

4. nsmnare n placa Petri. Incubare la 35C, 20-48 de ore Agar Mac Conkey

5. nsmnare pe mediul TSI i alte teste biochimice Agar TSI Pant alcalin (roie) Baz acid (galben); fr h2S

6. Confirmarea serologic

37

Izolarea Izolarea shigelelor de la pacieni i purttori se face dup metodologia general preconizat la investigarea sindromului diareic. Izolarea de la pacieni n stadiul acut al bolii se realizeaz prin etalarea materiilor fecale (omogenizate i suspensionate n soluii saline tamponate) direct pe mediile selective (fr a trece pe medii de mbogire), datorit densitii mari a shigelelor n fecale (aproximaiv 107/g). mediile selective recomandate sunt geloza macConkey (mC), agaruldeoxicolat-citrat-lactoza (AdCl), geloza Salmonella-Shigella (SS) i agarul xiloz-lizin-deoxicolat (xld) sau asocierea de medii din clase selective diferite, slab selective: mC i moderat selective: AdCl, SS, xld. Rezultatele cele mai bune au fost raportate cu xld. Izolarea shigelelor din alimente de origine animal Acest procedeu se realizeaz cu dificultate datorit mai multor factori: 5 coninut mare de grsimi n alimente; 5 parametri fizici: ph, concentraia electrolitic; 5 microbian alimentar de competiie; flor 5 numr redus de shigele n alimente; 5 starea fiziologic a shigelelor la izolare (stres termic la decongelare). mbogirea 18-24 ore la 37 C pe medii fr inhibitori (bulion manit sau pe medii preconizate pentru izolarea salmonelelor respectiv bulion pentru Gram negativi (BGN) i bulion selenit) este necesar ntotdeauna la izolarea shigelelor din alimentele de origine animal. dispersia pe mediile selective din mediile de mbogire trebuie s fie dens, datorit prezenei n cantiti reduse a shigelelor n alimente. Izolarea shigelelor din ap Izolarea shigelelor din ap se face, de asemenea, dup mbogire prin filtrare i nsmnarea membranei filtrante n ntregime n bulion pentru Gram negativi.
38

Identificare biochimic Identificarea biochimic a coloniilor prezumtive de Shigella spp. se poate face prin teste exoenzimatice asociate (metoda multitest) sau individuale pe seturi de teste comerciale. o asociere multitest de TSI (triple sugar iron) i mIlf (motilitate, indol, lizin, fenilalanin) este larg utilizat datorit multiplelor avantaje pe care le ofer. Celelalte metode de analiz biochimic, utile n caracterizarea izolatului se pot face de pe TSI, prin metode macrotest ori microtest. la acestea se adaug si testele de serotipizare sau de testare a sensibilitii la antibiotice. Identificare serologic Identificarea serologic se face utiliznd suspensii antigenice inactivate prin cldur (pentru a evita inaglutinabilitatea i a reduce riscul contaminrii profesionale) cu seruri aglutinante ori latex aglutinante. ncadrarea de serotip este obligatorie. Markeri epidemiologici oportunitatea investigaiilor epidemiologice a impus folosirea unor metode de difereniere a serotipurilor, mai ales n cazul Shi. sonnei (serotip unic) i Shi. flexneri 2a (serotip ubicvitar, larg rspndit geografic). Biotipia, antibiotipia, fagotipia i bacteriocinotipia au fost preconizate i utilizate de mai muli autori la investigarea unor focare cu areal de evoluie foarte larg. determinarea profilului plasmidic i caracterizarea dNA-ului plasmidelor de rezisten se utilizeaz n investigarea epidemiologic. Colicinotipia, antibiotipia i profilul plasmidic au o valoare limitat datorit mobilitii mari a plasmidelor de rezisten la acest gen. diagnosticul bacteriologic prin tehnici alternative detectarea shigelelor direct n prelevatele patologice ori alimentare prin mijloace rapide suscit un larg interes medical. metodele de diagnostic bazate pe principii genetice i imunologice au fost aplicate deja n diagnosticul dizenteriei acute.
39

metode bazate pe investigarea dnA-ului plasmidelor de virulena Hibridarea pe colonie. A fost introdus pentru evidenierea tulpinilor invazive de cele neinvazive. Se utilizeaz sonde oligonucleotidice de sintez marcate radioactiv care se sintetizeaz rapid, au timp de reacie scurt, ntruct folosesc concentraii nalte de dNA, au interferen mai redus (dNA-ul monocatenar), intesc o anumit gen (Ipa H), deosebit de util la diferenierea tulpinilor invazive. S-au utilizat i sonde ce folosesc un nucleotid conjugat cu fosfataz alcalin. Specificitatea a fost ns de numai 81%. hibridarea prin amplificare polimerazic (ErIC-PCr) Tehnica ERIC-PCR (Enterobactenal-Repetitive-Intergenic ConsensusPolymerase-Chain-Reaction) se aplic la prelevatele cu densitate redus de shigele, chiar i la cele alimentare i reprezint o modalitate simpl i rapid de tipizare a Shigella sonnei, cu un nivel nalt de discriminare echivalent cu PfGE, dar mai mare dect cel al profilului plasmidic, al folosirii endonucleazelor de restricie ale plasmidelor sau al ribotiprii. n prezent, pentru detectarea proteinelor bacteriene care sunt markeri de virulen, izolate din anumite medii se folosete tehnica mAldITof (matrix-Assisted-laser-desorption-Ionization Time of flight). la Shi. flexneri i Escherichia coli s-au detectat doi ioni markeri pentru proteinele specifice asociate cu proprieti de virulen (acidorezisten). Reacia ce utilizeaz primeri secveniali, corespunztori unor fragmente ale plasmidului hind III de 2,5 Kb este folosit att n determinri clinice, ct i n experimente cu alimente. Pragul de detecie nu depete 104 bacterii/gram. Randamentul metodei s-a mbuntit prin introducerea unei trepte de mbogire. metoda este mult mai sensibil i nu este radioactiv. un sistem universal care folosete amplificarea genic prin PCR a fost propus nu de mult timp pentru detectarea concomitent n alimente a 13 patogeni intestinali mai frecvent implicai n toxiinfeciile alimentare, ntre care i Shigella spp. metode imunoenzimatice Tehnica imunoenzimatic (ElISA) de evideniere a markerilor de
40

invazivitate (complexul Ipa BCdA) are specificitate redus n evidenierea proteinelor implicate n patogenitate. Prezena complexelor antigen-anticorp poate fi vizualizat i cuantificat prin adugarea n mediul de reacie a conjugatului unui antigen sau a unui anticorp cunoscut, cuplat cu o enzim i substratul cromogen specific enzimei de marcare. n funcie de modificarea activitii markerului enzimatic EIA (Enzyme Imuno Assay) testele pot fi clasificate n reacii n faza omogen i reacii n faza heterogen, acestea din urm fiind larg utilizate n microbiologia clinic. latex aglutinarea folosete diferite tipuri de latex (necolorat, colorat). Testul este rapid (1-2 minute) i efectuat direct din suspensia de materii fecale de la pacieni n stadiul acut, are o specificitate cuprins ntre 92,6 i 99,2%. Sensibilitatea redus a metodei nu permite ns aplicarea ei i la produsele alimentare. Testele imunoenzimatice ElISA cu antigen proteic, marker de virulen, dau rezultate foarte bune n testri pe prelevate clinice. Se poate utiliza la investigri largi de screening i furnizeaz rezultate rapide (in aproximativ 2 ore). Examenul bacteriologic pentru izolarea shigelelor din alimente de origine animal Prima etap de lucru n examenul bacteriologic pe alimente, produi de origine animal i ap const n efectuarea nsmnrilor din materialul suspect pe medii uzuale, de mbogire, selective, speciale, dup care se face examenul microscopic direct, urmat de examenul bacteriologic complex pentru izolarea, cultivarea i identificarea germenului. Prelevarea, conservarea i transportul probelor de alimente i ap pentru investigaii de laborator trebuie s se fac n condiii de umiditate i temperatur sczut i ntr-un timp ct mai scurt posibil. Identificarea i tipizarea se realizeaz prin analizarea particularitilor biologice, care permit stabilirea cu certitudine a agentului cauzal implicat n procesul patologic, n funcie de care se pot institui corect msurile igienicosanitare i conduita terapeutic sau de combatere i profilaxie specific i nespecific. n controlul de rutin al salubritii produselor alimentare de origine animal, apei i furajelor, ct i n expertiza medico-legal veterinar examenul microbiologic este indispensabil, ntruct permite detectarea contaminrii acestor produse cu germeni patogeni pentru om i animale.
41

Pe lng studierea caracterelor morfo-culturale i biochimice ale tulpinilor microbiene izolate, examenul microbiologic se completeaz cu antibiogram, pentru a determina sensibilitatea fa de antibioticele cunoscute. Sub aspect medico-legal veterinar, antibiograma este util i pentru aprecierea corectitudinii cu care a fost aplicat terapia cu antibiotice desigur cu un grad de subiectivism i relativitate inerente, care trebuie totui analizate i acceptate ns cu prudena cuvenit. n litigiile\cauzele penale, justiia cere verdicte categorice asupra eventualei ineficiene a actului terapeutic utilizat, care face obiectul cercetrii. Este tiut c nu ntotdeauna izolarea unui germen microbian din materialul patologic cercetat echivaleaz cu posibilitatea desemnrii lui ca agent etiologic responsabil de mbolnvirile unor animale sau a oamenilor. de aceea, se recurge i la testarea patogenitii germenului izolat pe animale de experien. Corobornd semnele clinice declanate la animalele de experien cu durata infeciei, localizarea modificrilor morfopatologice, tulburrile funcionale i transmiterea n serie a germenilor specifici se poate stabili cu precizie diagnosticul etiologic. Executarea i examinarea frotiurilor din alimente din probele de alimente se execut frotiuri colorate prin metoda Gram dup o prealabil pregtire. Alimentele lichide se omogenizeaz prin agitare, iar alimentele solide se vor mojara n prealabil cu diluant steril (soluie salin izotonic peptonat 0,1% n proporie de 1:5). frotiurile executate din alimente grase se vor degresa cu xilol timp de 30 secunde, de dou ori consecutiv i se vor usca nainte de colorare. Se numr bacteriile din cel puin 10 cmpuri microscopice i se calculeaz media pe cmp. Shigelele apar ca bacili Gram negativi, subiri, cu margini drepte i capete rotunjite, scuri sau mijlocii dar pot fi i pleomorfice, filamentoase i/ sau cu o coloraie neuniform, izolate sau n perechi, nesporulate. dac la coloraia Gram apar microorganisme cu proprietile morfologice caracteristice genului Shigella spp., iar n culturi germenii nu se izoleaz, acest lucru poate fi rezultatul contaminrii reagenilor sau a altor materiale, prezenei de ageni antimicrobieni sau diferite schimbri ale microorganismelor n funcie de condiiile de mediu.
42

Izolarea shigelelor din alimente prin metoda recomandat de Organizaia mondial pentru Agricultur i Alimentaie - fAO Principiul metodei publicat n manual of food Quality Control microbiological Analysis n 1992, const n parcurgerea succesiv a urmtoarelor etape de lucru: 5 mixarea probei de aliment cu mediul de mbogire; 5 decantarea supernatantului n bulion steril; 5 incubarea anaerob a supernatantului 24 ore la 44C (pentru Shigella sonnei i alte specii de Shigella spp. la 42C); 5 nsmnarea pe plci i incubarea la 35C, timp de 20-48 ore; 5 screening pe TSI i alte medii; 5 confirmarea serologic. dup obinerea probei omogenizate din alimentul studiat se fac diluii cu ser fiziologic steril i, din diluii se pipeteaz 0,25 ml pe suprafaa mediului cu xiloz solidificat i se uniformizeaz cu o baghet de sticl n form de l. dup incubare se numr coloniile caracteristice din plcile care conin pn la 300 colonii i se face calculul prezumtiv n funcie de diluie. Coloniile suspecte au o culoare roie uniform. Confirmarea biochimic se face dup inocularea coloniilr prezumtive n mediile pentru identificare i termostatare la 37C, timp de 24 ore. ulterior, la culturile reinute se efectueaz testele serologice. mbogirea pentru izolarea Shigella sonnei Se cntresc aseptic 25 grame prob i se introduc n 225 ml bulion Shigella cu novobiocin (0,5 micrograme/ml), sau bulion manit. Suspensia se pstreaz 10 minute la temperatura camerei, agitndu-se periodic. Eluatul se transfer ntr-un balon Erlenmeyer de 500 ml care se introduce ntr-un vas de anaerobioz cu catalizator proaspt, se insereaz Gas Pak i se activeaz adugndu-se ap. Catalistul este bine s fie uscat dup fiecare folosire. Se incubeaz 20 ore n baie de ap la 44C. Suspensia se agit i se striaz pe plci cu agar macConkey. Se incubeaz 20 ore la 35C.
43

mbogirea pentru izolarea altor specii de Shigella modul de lucru este identic, dar se adaug 3 micrograme novobiocin/ militru i se incubeaz anaerob n baie de ap la 42C. Izolarea Se examineaz plcile cu agar macConkey. Coloniile suspecte se inoculeaz n bulion glucozat, TSI n pant, bulion pentru lizin-decarboxilaz, agar pentru motilitate i tripton. Se incubeaz la 35C, timp de 48 ore, dar se examineaz i la 20 ore. Culturile care exprim mobilitate, formare de gaz, fermentarea glucozei, lactozei i lizin-decarboxilaz pozitiv se vor nltura. Se nltur i culturile obinute prin incubarea bulionului de mbogire la 44C, dar se rein cele care formeaz indolul. Se vor reine i culturile obinute la 42C, care pot fi pozitive sau negative. Izolarea germenilor din genul Shigella spp. din alimente prin mbogire pe medii fr inhibitori i dispersie pe medii selective mediile selective cele mai recomandate pentru alimente sunt agarul macConkey, agarul deoxicolat-citrat-lactoz, agar Salmonella-Shigella, agarul xiloz-lizin-deoxicolat. Sunt recomandate asocieri de medii din clase selective diferite, slab selective i moderat selective. Identificarea Identificarea biochimic Se face inocularea coloniilor selectate pe mediile pentru teste biochimice incubate la 35C i se examineaz dup 24 i 48 ore. Comportamentul shigelelor poate fi evaluat astfel: negativ pentru h2S, ureaz, glucoza (gaz), motilitate, lizin-decarboxilaz, ornitin-decarboxilaz (excepie Shigella sonnei, pozitiv), zaharoz, adonitol, lactoz (2 zile), salicil, inozitol, KCN, malonat, citrat, V-P. Cele mai multe shigele sunt pozitive pentru manitol (excepie Shigella dysenteriae, negativ) i reacia Rm. o alt metod de izolare a bacteriilor din genul Shigella spp. din alimente se bazeaz pe un test prezumtiv prin cultivarea pe un mediu care
44

conine xiloz (xld). Pentru efectuarea acestui test este necesar mediul cu xiloz, medii pentru teste biochimice i ser fiziologic steril. Identificarea serologic Se suspend cultura n 3 mililitri soluie salin 0,85%. Se marcheaz 9 dreptunghiuri 3x1 centimetri pe o plac Petri. Se adaug picturi din suspensie, antiser i soluie salin, n acord cu protocolul (tabelul 1.3). Se amestec coninutul fiecrui careu cu o ans i se agit plcile 3-4 minute pentru accelerarea aglutinrii.
Tabelul 1.3. determinarea grupurilor serologice de Shigella spp. dreptunghiul Suspensia 1 2 3 4 5 6 7 8 9 + + + + + + + + + A + + + + + + + + Al B Antiserul polivalent C CI C2 d A-d

Gradul de aglutinare poate fi: 0 - nu apare aglutinare; 1+ - aglutinare detectabil; 2+ - aglutinare cu 50% clarificare; 3+ - aglutinare cu 75% clarificare; 4+ - floculare vizibil cu clarificarea complet a lichidului de suspensie. Se reexamineaz suspensiile cu seruri monovalente, atunci cnd apare una din urmtoarele reacii pozitive (2+, 3+, 4+). Cnd reacia este negativ, suspensia se nclzete n baie de aburi 30 minute pentru hidroliza antigelului capsular interferent. Se reexamineaz n
45

antiser polivalent, iar dac aglutinarea este pozitiv se reexamineaz n ser monovalent. Nu se cunosc metode foarte sensibile pentru Shigella, iar metodele recomandate pot s nu detecteze shigelele prezente n numr mic n alimente. dac proba nu poate fi examinat n 24 ore, se va pstra prin congelare. Este necesar selectarea mai multor colonii din fiecare plac cu agar mC, deoarece multe bacterii enterice pot forma colonii asemntoare cu cele de Shigella. Examenul bacteriologic pentru izolarea germenilor din genul Shigella spp. din fecalele bolnavilor cu sindrom diareic acut din fecalele etalate pe o lam de sticl se face un frotiu n strat foarte subire i se coloreaz Gram. n frotiul de fecale se pot observa i leucocite WCBS (white cells bloody stools), care indic o infecie prin invazivitate. mucusul din fecale se omogenizeaz pe o lam ntr-o pictur de soluie de albastru de metil loffler, apoi se acoper cu o lamel i se examineaz. leucocitele din fecale sunt distruse n mediile de conservare sau de transport, de aceea este indicat ca examenul microscopic s se fac n momentul recoltrii. n caz de toxiinfecie alimentar produs de Shigella se evideniaz peste 50 polimorfonucleare neutrofile i eritrocite/cmp microscopic. Izolarea germenilor din genul Shigella spp. din ap prin metoda istrati-Meitert Cantiti diferite de ap (50 ml, 100 ml, 200 ml) sunt trecute prin filtru Seitz pe care s-a montat pentru fiecare prob de ap o membran filtrant cu pori de 0,7 microni diametru. Pentru filtrare, pe lama criblat a filtrului se monteaz 1-2 foi de hrtie de filtru de form corespunztoare. filtrul astfel montat este sterilizat prin autoclavare, timp de 30 minute la 120C. membranele filtrante se fierb nainte de utilizare, de trei ori cte 5 minute n ap bidistilat steril, schimbnd apa de fiecare dat. dup ce hrtia de filtru din filtrul Seitz este umectat cu ser fiziologic se aplic, cu precauie, membrana filtrant.
46

dup golire, cilindrul filtrului Seitz este splat cu ser fiziologic i cu ap bidistilat steril. membranele filtrante sunt aplicate pe un mediu selectiv, n plci Petri, dup o prealabil uscare a suprafeelor acestora (20-30 minute la 37C cu capacul ntredeschis), astfel nct s se evite formarea de bule de aer ntre membrana filtrant i mediu. dup 20-24 ore de incubare la 37C se vor examina plcile cu mediul selectiv pe care s-au depus membranele filtrante. dac pe acestea s-au dezvoltat colonii lactozo-negative se vor replica i identifica. Se recomand asocierea metodei cu textul biologic, prin inocularea pe conjunctiva palpebral la cobai a culturii recoltate de pe suprafaa membranelor filtrante. 1.11. Surse de contaminare ale alimentelor i apei cu Shigella sp. materiile prime i ingredientele destinate fabricrii produselor alimentare trebuie s fie condiionate cu respectarea tuturor normelor de igien. datorit posibilitilor de contaminare a alimentelor n timpul transportului, precum i a faptului c exist modaliti sigure de prevenire a acestor fenomene, transportul acestora este considerat un important factor de risc. la transportul materiilor prime i ingredientelor perisabile este esenial inerea sub control a temperaturii pe toat durata transportului, aceasta fiind un parametru critic pentru calitatea i inocuitatea produselor alimentare. un alt factor de risc la fabricarea produselor alimentare este recepia calitativ, ntruct n acest moment se decide acceptarea sau respingerea unui lot suspect, precum i destinaia lui ulterioar, pentru a nu fi introdus n mod fraudulos n consum. la intrarea n fabric, produsele uor perisabile sau considerate contaminate vor fi izolate de celelalte categorii de produse i vor fi introduse n ciclul de fabricaie doar dup minuioase i complete verificri de laborator. unele analize vor fi efectuate chiar naintea descrcrii materiilor prime din mijloacele de transport. materiile prime nu vor fi prelucrate pn cnd nu se cunosc rezultatele tuturor analizelor de laborator.
47

Pentru realizarea testelor i analizelor de laborator, fabricile de prelucrare vor fi autorizate numai dup ce vor amenaja laboratoare de analiz proprii, acreditate conform legislaiei naionale armonizat cu legislaia veterinar a uniunii Europene. Ali factori de risc din procesul tehnologic sunt practicile de lucru ale muncitorilor i operaiunile de curire-dezinfecie. Aceste operaiuni constituie puncte critice de risc n industria alimentar, datorit apariiei unor toxiinfecii alimentare provocate de microorganisme ce au ca surs purttorii cronici. n timpul distribuiei produselor alimentare, condiiile de asigurare a temperaturii de pstrare constituie, de asemenea, puncte critice de risc epidemiologie. Produsele refrigerate trebuie pstrate la temperaturi de 4-8C, iar cele congelate, la temperaturi de -18C. Este foarte important ca produsele s fie refrigerate, respectiv congelate, nainte de a fi ncrcate n mijloacele de transport, deoarece instalaiile frigorifice ale mijloacelor de transport sunt proiectate doar pentru a menine temperatura, nu pentru a rci produsul n cauz. operaiunea de ncrcare a produselor trebuie s dureze ct mai puin, pentru a nu permite creterea temperaturii n interiorul mijloacelor izoterme de transport. monitorizarea permanent a temperaturii n spaiile de depozitare trebuie s asigure integritatea produselor att n reeaua comercial, ct i la consumator, iar utilizarea vitrinelor frigorifice este obligatorie n comerul cu produse alimentare refrigerate i congelate. operaiunile de desfacere i servire a produselor alimentare se desfoar n cantine, restaurante, spitale i n uniti de tip fast-food. n toate unitile de alimentaie public trebuie supravegheat strict temperatura de pstrare a alimentelor care s nu permit dezvoltarea microorganismelor. meninerea n stare cald a unor mncruri n cantine sau restaurante, pentru un timp ndelungat, a determinat de nenumrate ori producerea de toxiinfecii alimentare grave la consumatori. n reeaua de desfacere a produselor alimentare prevenirea contaminrii ncruciate este un alt factor de risc. Trebuie evitat transferul microorganismelor patogene de pe alimentele crude, ustensile sau de pe minile personalului pe produsele finite. modul de preparare a alimentelor constituie factor de risc, n special pentru carnea de pasre, picioare de broasc, pete, fructe de mare etc. Valoarea minim a temperaturii ce trebuie atins la preparare n centrul
48

geometric al acestor produse este de minimum 72C. Pe plan mondial, abordarea calitii n toate domeniile activitii economice s-a fcut pornind de la principiile calitii totale i ale realizrii sistemelor calitii, n concordan cu prevederile standardelor din seria ISo 9000 (echivalente EN 29000 sau BS 5750). n industria alimentar, pe lng sistemele proprii de management al calitii devenite clasice, exist un sistem hACCP specific, care constituie un sistem de management al calitii ce are ca obiectiv fabricarea de produse sigure pentru consum. Introducerea metodei hACCP n industria de prelucrare a petelui i a produselor pescreti pornete de la identificarea principalelor riscuri aferente acestor tipuri de produse. n acest scop, produsele pescreti au fost clasificate n ordinea descresctoare a gradului de risc n urmtoarele categorii: 55 molute, inclusiv scoici i stridii proaspete sau congelate, cu sau fr carapace; aceste produse sunt consumate ca atare, fr a fi gtite; 55 produse pescreti uor conservate (coninut de NaCl mai mic de 6% n faza apoas, ph>5). Aceast categorie include produsele srate, marinate, afumate la rece, care se consum fr a fi gtite; 55 pete i crustacei, produse tratate termic (pasteurizate, fierte, afumate la cald); unele dintre aceste produse se consum fr a fi gtite; 55 produse tratate termic (sterilizate i ambalate n ambalaje ermetice), multe dintre acestea fiind consumate fr o alt pregtire culinar; 55 semiconservele de pete (cu peste 6% NaCl n faza apoas, ph < 5, eventual conservani). Acest grup include petele srat sau marinat i caviarul; se consum fr a fi gtite; 55 pete uscat, pete uscat i srat, pete uscat i afumat; n mod normal se consuma fr a fi gtite; 55 pete i crustacei n stare proaspt i congelat; n mod normal se consum dup gtire. Numeroase date epidemiologice din literatura internaional de specialitate fac tot mai des referire la implicarea produselor pescreti n toxiinfeciile de origine alimentar. Riscul nu const ns n simpla prezen a acestor microorganisme, ci n dezvoltarea lor pe produs. la obinerea i comercializarea petelui i fructelor de mare proaspete i congelate, riscul de contaminare cu shigele poate fi controlat n cadrul unui program exigent de asigurare a calitii, utiliznd metode i dotri corespunztoare.
49

Contaminarea petelui, fructelor de mare i a produselor din pete cu microorganisme din mediu nu este considerat de unii specialiti un risc, deoarece aceste microorganisme se gsesc n mod obinuit pe materiile prime utilizate. Trebuie subliniat c dac aceste microorganisme contamineaz spaiile de fabricaie, ptrunznd n crpturi sau alte spaii, unde se dezvolt n condiii favorabile de mediu, pot contamina i produsele finite. Este important s se reduc numrul de microorganisme n materiile prime i n produsele finite la minimum posibil, prin controlul condiiilor igienice pe fluxul de prelucrare. n marea Britanie, cerina de baz impus pentru obinerea de produse refrigerate sigure pentru consum, conform recomandrilor Institutului de tiin i Tehnologia Alimentelor, include: V selectarea unor furnizori siguri; V5 proiectarea i construirea igienic a seciilor de fabricaie i a depozitelor; V5 proiectarea instalaiilor n vederea facilitrii unei igienizri corespunztoare; V5 programe de ntreinere, curenie, igienizare i dezinfecie; V5 educarea i instruirea personalului pentru cunoaterea procedeelor de fabricare i de depozitare igienic a materiilor prime, materialelor i produselor finite. depozitele, mijloacele de transport i vitrinele frigorifice pentru comercializare trebuie proiectate i exploatate corespunztor, pentru a menine produsele la temperatura de siguran, indiferent de temperatura mediului ambiant. Temperatura produselor trebuie verificat, permanent la intrare n depozitul frigorific i la recepia lor n unitile de desfacere cu amnuntul. Spaiile folosite pentru asamblarea i manipularea produselor tratate termic trebuie separate de spaiile destinate depozitrii materiilor prime. 1.12. Prevalena tulpinilor de Shigella spp. n alimentele de origine animal i n ap Evaluarea riscului epidemiologic prin izolarea tulpinilor de Shigella spp din unele alimente de origine animal i ap Evaluarea riscului de contaminare cu Shigella, prin intermediul unor surse poteniale de contagiu, reprezint una dintre cele mai importante verigi de control epidemiologic i de prevenire a toxiinfeciilor alimentare
50

produse de aceti germeni. n acest context s-a inclus i studiul prevalenei, adic, evaluarea ntr-o anumit perioad de timp a numrului total de cazuri de produse alimentare de origine animal contaminate cu Shigella. S-a insistat n principal asupra studiului de prevalen la grupele de produse care sunt cel mai frecvent implicate n declanarea toxiinfeciilor alimentare i care sunt cel mai bine studiate i redate n literatura mondial de specialitate. Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n lapte i derivate din lapte n perioada 2001-2003 a fost studiat prevalena tulpinilor de Shigella spp. pe eantioane mari de lapte i derivate proaspete din lapte, provenite de la productorii neautorizai care comercializeaz aceste produse obinute n condiii precare de tehnologie i igien. din cele 743 eantioane examinate, s-a izolat Shigella spp. din 5 probe (0,6%), (tabelul 1.4).
Tabelul 1.4 Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n laptele comercializat de productorii neautorizai n pieele capitalei* (perioada 2001-2003) felul produsului lapte proaspt nepasteurizat Ca proaspt urd dulce Brnz proaspt de vaci Total numrul de probe examinate 320 120 46 257 743 numrul de probe pozitive 12 3 1 5

* Productorii privai neautorizai de la care au fost prelevate probe proveneau din mai multe judee limitrofe municipiului Bucureti

Prevalena tulpinilor de Shigella spp. n carnea de pasre dezosat mecanic (mdm) n perioada 2000-2003, n Romnia, s-au importat cantiti mari de carne de pasre dezosat mecanic (mdm), din care mai multe loturi (care au nsumat sute de tone de produs) au fost gsite contaminate cu Salmonella i
51

au fost distruse conform prevederilor legale referitoare la astfel de situaii. Avnd n vedere faptul c produsele contaminate cu Salmonella se pot contamina i cu Shigella spp., prin aceleai verigi, s-au investigat 6 loturi nsumnd 609 tone carne de pasre dezosat mecanic (mdm). Pe probele examinate nu s-a reuit izolarea de Shigella (tabelul 1.5).
Tabelul 1.5 Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n carnea de pasre dezosat mecanic (mdm) importat (perioada 2000-2003) ara de provenien numrul de loturi cantitatea (tone/lot) 20 99 29 139 390 31 609 numrul de probe examinate 1 3 2 7 14 1 28 numrul de probe pozitive -

Belgia SuA Italia frana olanda Brazilia Total

Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n prjituri i produse de patiserie comercializate de uniti de alimentaie public din studiul fcut rezult c aceast grup de produse (prjituri i produse de patiserie), cu un risc potenial aparent nesemnificativ n producerea toxiinfeciilor alimentare cu Shigella, prezint n mod cert un pericol real pentru sntatea public. din evaluarea surselor posibile de contaminare a acestor produse s-a constatat c materiile prime folosite la prepararea prjiturilor i produselor de patiserie nu sunt cauza contaminrii produsului finit. Sursa real de contagiu o reprezint prelucrarea neigienic a acestor produse, prin nclcarea normelor generale de tehnologie i igien individual a personalului (tabelul 1.6).
52

Tabelul 1.6 Prevalenta tulpinilor de Shigella sp. n prjituri i produse de patiserie comercializate de uniti de alimentate public (perioada 2000-2002) Anul denumirea produsului Prjituri 2000 2001 2002 Total Produse de patiserie Prjituri Prjituri cantitatea (buci) 785 524 23404 232 24945 numrul de probe analizate 20 12 10 15 57 numrul de probe pozitive 1 1 2

Prevalena tulpinilor de Shigella spp. n semiconserve de pete Rezultatele acestui studiu demonstreaz c petele i derivatele din pete pot fi surs de contaminare cu Shigella (tabelul 1.7.)
Tabelul 1.7. Probe de semiconserve de pete (fabricate n romnia) analizate n cadrul Institutului de Igien i Sntate Public Veterinar (perioada 2000-2003) denumirea produsului Salat de icre de crap Salat de icre hering Salat de icre cu adaosuri de legume Salat nordic Salat pescreasc macrou afumat Total cantitatea numrul de probe (kg/lot) examinate 2573 2135 100 30 42 3100 7980 17 11 6 1 2 15 52 5 Probe pozitive 1 2 2 -

din salata simpl de icre de crap i hering i salata de icre cu adaosuri de legume s-au identificat un numr de 5 probe pozitive pentru Shigella. Aceste produse au fost, probabil, contaminate cu Shigella de la purttori, n condiiile nerespectrii de ctre acetia a normelor de igien individual i tehnologic pe fluxul de procesare a materiilor prime, de la recepie pn la ambalarea i desfacerea produsului finit.
53

Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n maioneze i sosuri pe baz de maionez n conformitate cu legislaia Sanitar Veterinar Naional i cea aplicat n rile uniunii Europene, toate produsele alimentare de origine animal, precum i cele care au n coninutul lor componente de origine animal, provenite din import, se supun obligatoriu (nainte de a fi puse n consum) examenelor complexe de laborator pentru evaluarea riscurilor acestor produse pentru sntatea public. n tabelul 1.8 sunt prezentate loturile de maionez i sosuri pe baz de maionez importate n perioada 2000-2002. Pe probele examinate prin sondaj dintr-un import de aproximativ 32 tone din aceste produse nu s-a reuit izolarea de Shigella.
Tabelul 1.8 Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n maioneze i sosuri pe baz de maionez provenite din import (perioada 2000 - 2002) Anul ara de provenien Belgia olanda denumirea produsului maionez maionez sosuri pe baz de maionez 2000 Polonia Italia Germania maionez sosuri pe baz de maionez maionez sosuri pe baz de maionez maionez 2001 olanda Germania 2002 sosuri pe baz de maionez maionez sosuri pe baz de maionez maionez sosuri pe baz de maionez numrul numrul numrul cantitatea de loturi de loturi de probe (kg) importate examinate pozitive 12 8 23 1 9 11 24 3 6 2521 5795 2907 300 1440 1883 7012 3750 3041 324 8 1 7 114 54 32036 2701 360 7 5 13 1 4 7 21 3 6 1 6 1 8 75 -

Belgia Total

Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n ap din unele tranduri i lacuri din Bucureti Investigarea acestei zone cu potenial de risc epidemiologic este interesant pentru evaluarea riscului de contaminare cu Shigella a persoanelor care n sezonul estival fac baie n lacurile de agrement, dar i n trandurile supuse controlului sanitar permanent. Rezultatele investigaiilor efectuate pe o perioada de 3 ani (2001- 2003) au dovedit c, pe fondul unei igienizri ineficiente a bazinelor de not din tranduri i clorinarea necorespunztoare a apei, este posibil supravieuirea shigelelor provenite de la purttorii cronici. n aceste condiii este posibil contaminarea pe cale oral, prin intermediul apei, a unui numr mare de persoane receptive la aceast infecie (tabelul 1.9).
Tabelul 1.9 Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n apa din unele tranduri i lacuri din Bucureti (perioada 2001-2003) Sursa de ap din care s-au recoltat probe lacul floreasca lacul Tei lacul Toboc lacul Colentina trandul 1 lacul Snagov Total numrul de probe analizate 50 76 70 60 60 60 376 Probe pozitive pentru Shigella 2 1 : 3

Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n apa de fntn Pentru a izola shigelele din apa de fntn, n perioada 2001-2003, s-a studiat un set de probe de ap recoltate din zone geografice diferite, reprezentnd un numr de 9 judee din ar. Probele au fost prelevate numai n perioadele cele mai clduroase din an (iulie-august), din fntni aflate n incinta unor gospodrii rneti n care latrinele erau amplasate n imediata lor vecintate. faptul c s-a izolat Shigella din 3 fntni din cele 32 cercetate (aflate n
55

judee diferite) demonstreaz ca infiltrarea n pnza freatic a apei fecaloide din latrine poate ajunge n apa fntnilor, devenind astfel surs de contagiu pentru alte persoane din afara gospodriei prin consumul apei contaminate (tabelul 1.10).
Tabelul 1.10 Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n apa de fntn din mai multe zone geografice (perioada 2001-2003) numrul de probe pozitive pentru Judeul numrul de probe analizate Shigella Giurgiu mehedini Botoani Clrai Ialomia dmbovia Vaslui Galai Tulcea Total 5 2 8 4 2 1 3 1 6 32 1 1 1 3

Prevalena tulpinilor de Shigella spp. n apa din canalele deltei dunrii ntruct n literatura de specialitate din ar nu este fcut nici o referire n ceea ce privete izolarea de Shigella din apa canalelor deltei dunrii, n intervalul 2001-2003 s-a studiat un numr de 192 probe de ap n perioada canicular iulie-august (Enache T., Enache T. Jr., 2005). Probele au fost luate din zona de vrsare n marea Neagr a braului Sulina, dar i din interiorul braelor Chilia, Sf. Gheorghe i Sulina, n perimetrele n care sunt concentrate colectiviti umane care deverseaz, n aceste zone apele menajere i haznalele din incint (tabelul 1.11).
56

Tabelul 1.11 Prevalena tulpinilor de Shigella spp. n apa din canalele deltei dunrii n perioada 2001-2003 (Enache T. Enache T. Jr., 2005) Locul de recoltare a probelor zona de vrsare a dunrii-Sulina Braul Sulina Braul Sf. Gheorghe Braul Chilia Total 192 numrul de probe recoltate 6 72 60 numrul de pozitive pentru Shigella 1 5 4

din probele pozitive, suspectate de a fi contaminate cu Shigella, dup testarea biochimic i serologic, INCdmI Cantacuzino a confirmat o singur tulpin atipic de Shi. flexneri. Izolarea i identificarea n premier a unei tulpini de Shi. flexneri din apa canalelor dunrii este deosebit de util pentru evaluarea corect i critic a surselor poteniale de contaminare a petelui i apoi a consumatorilor acestui produs (Enache I, Enache T., Jr., 2005). Screening privind portajul tulpinilor de Shigella spp. la animale de ferm i n abatoare Pentru a verifica datele din literatura de specialitate n ceea ce privete portajul tulpinilor de Shigella spp., numai de ctre om, s-a fcut un screening referitor la eventualitatea prezenei acestor germeni pe probe coprologice recoltate de la bovine, porcine i psri din exploataii zootehnice din mai multe judee din ar. n perioada 2001-2003 s-au prelevat 582 tampoane rectale recoltate cu predilecie de la animale i psri cu simptomatologie digestiv, manifestat prin enterite dizenteriforme cu descrcri diareice acute i cronice, precum i de la animale aflate ntr-o stare aparent de sntate, dar care au coabitat cu cele bolnave (tabelul 1.12).
57

Tabelul 1.12 Probe coprologice recoltate de la animale vii pentru evaluarea contaminrii cu Shigella spp. (perioada 2001-2003) numrul numrul de exploataii de probe controlate analizate 23 16 9 48 184 128 270 582 medii de izolare folosite Mac Conkey Agar Salmonella cu lactoza Shigella Agar xLd

Specie

Probe pozitive Probe pozitive Probe pozitive -

Bovine Porcine Psri Total

n aceeai perioad de timp s-au studiat 101 probe de ap tehnologic prelevat din reeaua de evacuare a unor abatoare de psri, porci, ovine i bovine (tabelul 1.12).
Tabelul 1.13 Probe de ap tehnologic recoltate din reeaua de evacuare a unor abatoare (perioada 2001-2003) Locul de recoltare a probelor Abatoare de psri Abatoare mixte (porcine, ovine, bovine) Total numrul numrul de numrul de unitilor probe analizate probe pozitive verificate 3 5 8 36 65 101 -

din apa tehnologic de la abatoare i de la animalele i psrile cu sindrom digestiv acut i cronic nu s-a putut izola Shigella, confirmnd astfel datele din literatura de specialitate care susin c animalele i psrile nu sunt rezervor natural pentru aceast specie microbian. 1.13. rolul alimentelor de origine animal ca verig epidemiologic n producerea toxiinfeciilor alimentare cu Shigella spp. Cu toate acumulrile de date noi rezultate n urma studiilor ntreprinse pe plan mondial pentru cunoaterea particularitilor biologice i de patogenitate a tulpinilor de Shigella spp. exist nc numeroase incertitudini, dar i faete inedite ale acestui domeniu deocamdat nc insuficient
58

investigat. n acest context, trebuie avut n vedere faptul c infeciile produse de bacteriile din genul Shigella nu pot fi nc controlate eficient, datorit necunoaterii incidenei reale la bolnavii cu toxiinfecii alimentare, ntruct prevalenta n produsele alimentare de origine animal i n ap nu este evaluat corect i complet. Pe acest teren, cu numeroase elemente incerte sau nc necunoscute, n cadrul studiilor ntreprinse s-a urmrit investigarea, aprofundarea, clarificarea i completarea acestor date cu noi observaii de cert valoare tiinific i practic. de aceea s-a cutat s se evidenieze i s se aprofundeze i alte elemente revelatorii pentru clarificarea rolului alimentelor de origine animal ca verigi epidemiologice majore n declanarea toxiinfeciilor alimentare la om. Rezultatele obinute ofer posibilitatea formulrii unor concluzii fundamentate pe baza analizei comparative a acestor date cu cele din literatura internaional: Pn n prezent n literatura de specialitate nu s-au comunicat nc rezultate certe, bazate pe date aprofundate privind prevalena i incidena acestor germeni, pe grupe de alimente i nu exist statistici oficiale rezultate dintr-un amplu screening (derulat succesiv de la recoltare, prelucrare, transport, stocare, desfacere i pn la consumul alimentelor), din care s rezulte c produsele alimentare de origine animal constituie rezervorul de Shigella cu risc epidemiologic recunoscut pentru consumatori; Sub raportul problemelor de sntate public veterinar nu se cunosc nc ndeajuns sursele reale de contaminare cu Shigella i factorii care influeneaz i determin apariia i gravitatea evoluiei unor focare de toxiinfecii alimentare, care nu sunt ntotdeauna diagnosticate rapid i corect din punct de vedere etiologic; Cu toate c germenii din genul Shigella spp. fac parte din punct de vedere epidemiologic din grupa de risc n care este ncadrat toxiinfecia alimentar produs de Salmonella, nu este nc legiferat i impus obligativitatea investigrii curente, n ceea ce privete prezena de Shigella, a tuturor alimentelor de origine animal de ctre laboratoarele veterinare pentru controlul alimentelor de origine animal; datele din prezenta lucrare dau numai o orientare general asupra posibilelor surse de alimente de origine animal care constituie rezervor de contaminare a consumatorilor cu Shigella, fr a fi luat n considerare uriaul potenial de contaminare pe care l reprezint zarzavaturile i alte legume comestibile obinute de pe culturi irigate cu ap provenit din surse
59

poluate din ce n ce mai des cu dejecii umane; din 53.304 probe de alimente de origine animal, examinate n perioada 2000-2004 n laboratorul de Bacteriologie al Institutului de Igien i Sntate Public Veterinar, s-au selectat i urmrit n direcia identificrii shigelelor 1.202 probe de alimente (2,25%). dintre acestea s-au selectat i reinut pentru studiu i identificare 58 tulpini din care, pe baza testelor biochimice i serologice, s-au ncadrat n genul Shigella spp. 9 tulpini, confirmate ulterior de INCdmI Cantacuzino; Alimentele din care s-au izolat, identificat i confirmat tulpinile de Shigella spp. au fost reprezentate de lapte i derivate proaspete din lapte, produse de patiserie i cofetrie, salat de icre simpl i cu adaos de legume, crevei ntregi i decorticai i carne de scoici. Se constat varietatea suporturilor alimentare din care s-au izolat aceti germeni din vieuitoarele marine, care se consum tot mai mult i n ara noastr i care fac parte din grupele de risc epidemiologic ca urmare a contaminrii lor prin intermediul purttorilor, n condiiile lipsei de igien la recoltarea, depozitarea i prelucrarea lor; laptele crud i derivatele proaspete din care s-a izolat Shigella, proveneau de la productori particulari care nu fac pasteurizarea laptelui materie prim i care recolteaz, prelucreaz i transport aceste produse n condiii precare de igien; Tulpinile de Shigella spp. izolate din produsele de patiserie ar putea s provin de la purttorii care au contaminat aceste produse n timpul lucrului, prin nerespectarea condiiilor tehnologice i individuale de igien; Salata de icre simpl i cu adaosuri de legume, este posibil s fi fost contaminat cu Shigella de ctre purttori, n condiiile nerespectrii normelor de igien individual i tehnologic pe fluxul de procesare a materiilor prime, de la recepie pn la ambalarea produsului finit; fructele de mare provenite din import, din care s-a izolat Shigella, este posibil s fi fost contaminate prin infiltrarea sau chiar prin deversarea n bazinele de cretere intensiv a acestor vieuitoare a apelor menajere poluate cu dejecii umane; din cele 600 probe de ap recoltate din fntni, lacuri de agrement, tranduri i din braele de vrsare ale dunrii (Sulina, Sf. Gheorghe, Chilia) s-au izolat tulpini prezumtive de Shigella, din care au fost confirmate 5 tulpini; Apa din unele fntni rurale este posibil s fi fost contaminat prin infiltrarea deeurilor fecaloide umane, ca urmare a amplasrii latrinelor n apropierea fntnilor, iar apa din tranduri este posibil s fi fost contaminat cel mai probabil direct de la purttorii cronici de Shigella n condiiile unei
60

clorinri ineficiente a apei din bazinele de not; Apa din lacurile de agrement din Bucureti i din braele Chilia, Sulina i Sf. Gheorghe este posibil s fi fost poluat cu Shigella prin deversarea haznalelor de la colectivitile umane din perimetrele nvecinate; Pentru verificarea concordanei cu datele din literatura de specialitate, tulpinile confirmate de INCdmI Cantacuzino au fost analizate pentru evidenierea elementelor de patogenitate prin testul ansei ligaturate pe iepure. ntruct criteriile de interpretare a testului clasic sunt susceptibile de erori, care pot duce la obinerea unor rezultate neconcordante sau chiar derutante, s-a propus modificarea acestora, lundu-se n calcul numai parametri obiectivi, rezultatul testului fiind reprezentat de raportul dintre greutatea lichidului acumulat n lumenul ansei ligaturate i greutatea ansei dup golirea complet (Enache T., Enache T. Jr., 2005). n urma studiilor efectuate pe o perioad de 4 ani, pe un numr mare de probe de alimente de origine animal i pe probe de ap prelevate din diferite medii naturale (lacuri, fntni, bazine de not, etc.), se poate concluziona c, din punct de vedere al problemelor de sntate public veterinar, n Romnia trebuie fcute ample investigaii pentru a se cunoate prevalena i incidena alimentelor cu potenial real de risc i factorii care influeneaz i determin declanarea toxiinfeciilor alimentare cu Shigella. Pe baza acestor rezultate este necesar ca n toate laboratoarele veterinare pentru controlul alimentelor de origine animal s fie legiferat obligativitatea diagnosticului curent pentru Shigella, ntruct aceti germeni fac parte din punct de vedere epidemiologic din aceeai grup de risc din care face parte toxiinfecia alimentar produs de Salmonella (Enache I, Enache T. Jr., 2005).

61

62

Shigella sp. frotiu din fecale.

Shi. flexneri. microscopie electronic

63

S. boydii pe agar enteric Hektoen

Shigella sonnei. Agar mac Conkey

64

Shigella sonnei. Congo Red Agar.

Shi. flexneri. Agar luria.

65

Bibliografie selectiv Ashkenazi S (2004) Shigella infections in children: new insights. Semin Pediatr Infect dis 15:246-252 2. Ashkenazi S (2004) Shigella infections in children: new insights. Semin Pediatr Infect dis 15:246-252 3. Baird-Parker AC (1994) foods and microbiological risks. microbiology 140:687695 4. Baird-Parker AC (1994) foods and microbiological risks. microbiology 140:687695 5. Baylis, C. l., Penn, C. W., Thielman, N. m., Guerrant, R. l., Jenkins, C. and Gillespie, S. h., 2006. Escherichia coli and Shigella spp., In Principles and Practice of Clinical Bacteriology. Second Edition. S. h. Gillespie and P. m. hawkey Eds., John Wiley & Sons ltd, london: p 347-365. 6. Brian mJ, Van R, Townsend I, murray BE, Cleary TG, Pickering lK (1993) Evaluation of the molecular epidemiology of an outbreak of multiply resistant Shigella sonnei in a day-care center by using pulsed-field gel electrophoresis and plasmid dNA analysis. J Clin microbiol 31:2152-2156 7. Brian mJ, Van R, Townsend I, murray BE, Cleary TG, Pickering lK (1993) Evaluation of the molecular epidemiology of an outbreak of multiply resistant Shigella sonnei in a day-care center by using pulsed-field gel electrophoresis and plasmid dNA analysis. J Clin microbiol 31:2152-2156 8. Caprioli A, morabito S, Brugre h, oswald E., 2005. Enterohaemorrhagic Escherichia coli: emerging issues on virulence and modes of transmission. Vet Res. 2005. 36(3):289-311. 9. Center for disease Control and Prevention (2002) Shigella. Annual Summary. department of health and human services. National Center for Infectious diseases. division of Bacterial and mycotic diseases. foodborne and diarrheal diseases Branch. Atlanta, GA 10. Center for disease Control and Prevention (2002) Shigella. Annual Summary. department of health and human services. National Center for Infectious diseases. division of Bacterial and mycotic diseases. foodborne and diarrheal diseases Branch. Atlanta, GA 11. Chen Q, Savarino SJ, Venkatesan mm., 2006, Subtractive hybridization and optical mapping of the enterotoxigenic Escherichia coli h10407 chromosome: isolation of unique sequences and demonstration of significant similarity to the chromosome of Escherichia coli K-12. microbiology. Apr;152(Pt 4):1041-54. 12. Cheryl l. Tarr, Adam m. Nelson, lothar Beutin, Katharina E. P. olsen, and Thomas S. Whittam. 2008, molecular Characterization Reveals Similar Virulence Gene 66 1.

13.

14.

15.

16.

17. 18. 19. 20. 21.

22. 23. 24. 25. 26.

27.

Content in unrelated Clonal Groups of Escherichia coli of Serogroup o174 (ox3) J. Bacteriol. 2008 190: 1344-1349. de Sablet T, Bertin Y, Vareille m, Girardeau JP, Garrivier A, Gobert AP, martin C., 2008., differential expression of stx2 variants in Shiga toxin-producing Escherichia coli belonging to seropathotypes A and C., microbiology. 154:176-86. delappe N, ohalloran f, fanning S, Corbett-feeney G, Cheasty T, Cormican m (2003) Antimicrobial resistance and genetic diversity of Shigella sonnei isolates from western Ireland, an area of low incidence of infection. J Clin microbiol 41:1919-1924 delappe N, ohalloran f, fanning S, Corbett-feeney G, Cheasty T, Cormican m (2003) Antimicrobial resistance and genetic diversity of Shigella sonnei isolates from western Ireland, an area of low incidence of infection. J Clin microbiol 41:1919-1924 devasia RA, Jones Tf, Ward J, Stafford l, hardin h, Bopp C, Beatty m, mintz E, Schaffner W., 2006. Endemically acquired foodborne outbreak of enterotoxinproducing Escherichia coli serotype o169:h41. Am J med. 2006 feb;119(2):168. e7-10. donnenberg, m. S., 2002, Escherichia coli virulence mechanisms of a versatile pathogen, london, Academic Press. duffy, G., Garvey, P. and mcdowell, d. A., 2001, Verocytotoxigenic Escherichia coli, Trumbull, Connecticut, food & Nutrition Press Inc. duPont hl, levine mm, hornick RB, formal SB (1989) Inoculum size in shigellosis and implications for expected mode of transmission. J Infect dis 159:1126-1128 duPont hl, levine mm, hornick RB, formal SB (1989) Inoculum size in shigellosis and implications for expected mode of transmission. J Infect dis 159:1126-1128 EfSA, 2007, monitoring of verotoxigenic Escherichia coli (VTEC) andidentification of human pathogenic VTEC types, Scientific opinion of the Panel on BIoloGICAl hAzARdS (Question No EfSA-Q-2007-036) The EfSA Journal. hyams KC, Bourgeois Al, merrell BR, et al. (1991) diarrheal disease during operation desert Shield. N Engl J med 325:1423-1428 hyams KC, Bourgeois Al, merrell BR, et al. (1991) diarrheal disease during operation desert Shield. N Engl J med 325:1423-1428 Kaper, J. B. and oBrien, A. d., 1998, Escherichia coli o157:h7 and other Shiga toxin-producing Escherichia coli strains, Washington d.C, ASm Press. Karmali, m. A., 2003, The medical significance of Shiga toxin-producing Escherichia coli infections. An overview. methods mol. med. 73: 1-7 le Gall T, darlu P, Escobar-Pramo P, Picard B, denamur E., 2005, Selectiondriven transcriptome polymorphism in Escherichia coli/Shigella species. Genome Res. feb;15(2):260-8. lee Tm, Chang CY, Chang ll, Chen Wm, Wang TK, Chang Sf (2003) one 67

28.

29.

30.

31.

32.

33.

34.

35.

36. 37.

38.

39.

predominant type of genetically closely related Shigella sonnei prevalent in four sequential outbreaks in school children. diagn microbiol Infect dis 45:173-181 lee Tm, Chang CY, Chang ll, Chen Wm, Wang TK, Chang Sf (2003) one predominant type of genetically closely related Shigella sonnei prevalent in four sequential outbreaks in school children. diagn microbiol Infect dis 45:173-181 lee Tm, Chang ll, Chang CY, Wang JC, Pan Tm, Wang TK, Chang Sf (2000) molecular analysis of Shigella sonnei isolated from three welldocumented outbreaks in school children. J med microbiol 49:355-360 lee Tm, Chang ll, Chang CY, Wang JC, Pan Tm, Wang TK, Chang Sf (2000) molecular analysis of Shigella sonnei isolated from three welldocumented outbreaks in school children. J med microbiol 49:355-360 litwin Cm, leonard RB, Carroll KC, drummond WK, Pavia AT (1997) Characterization of endemic strains of Shigella sonnei by use of plasmid dNA analysis and pulsed-field gel electrophoresis to detect patterns of transmission. J Infect dis 175:864-870 litwin Cm, leonard RB, Carroll KC, drummond WK, Pavia AT (1997) Characterization of endemic strains of Shigella sonnei by use of plasmid dNA analysis and pulsed-field gel electrophoresis to detect patterns of transmission. J Infect dis 175:864-870 liu PYf, lau YJ, hu BS, Shyr Jm, Shi zY, Tsai WS, lin Yh, Tseng CY (1995) Analysis of clonal relationships among isolates of Shigella sonnei by different molecular typing methods. J Clin microbiol 33:1779-1783 liu PYf, lau YJ, hu BS, Shyr Jm, Shi zY, Tsai WS, lin Yh, Tseng CY (1995) Analysis of clonal relationships among isolates of Shigella sonnei by different molecular typing methods. J Clin microbiol 33:1779-1783 morabito S, Karch h, mariani-Kurkdjian P, Schmidt h, minelli f, Bingen E, Caprioli A., 1998, Enteroaggregative, Shiga toxin-producing Escherichia coli o111:h2 associated with an outbreak of hemolytic-uremic syndrome. J Clin microbiol. 1998. 36(3):840-2. Nataro J. P. and Kaper, J. B., 1998, diarrheagenic Escherichia coli. Clin. microbiol. Rev. 1998. 11(1): 142-201. Scheutz, f. and Strockbine, N. A., 2005, Escherichia. Bergeys manual of systematic bacteriology. G. m. Garrity, d. J. Brenner, N. R. Krieg and J. T. Staley Eds. New York, NY, Springer,: 607-624.17 Scheutz, f. and Strockbine, N. A., 2005, Escherichia. In Bergeys manual of systematic bacteriology, G. m. Garrity, d. J. Brenner, N. R. Krieg and J. T. Staley Eds. New York, NY, Springer,: 607-624. Scheutz, f., Beutin, l., Pierard, d. and Smith, h. R., 2001, Nomenclature of Vero cytotoxins. In Verocytotoxigenic Escherichia coli, G. duffy, P. Garvey and d. A. mcdowell Eds. Trumbull, Connecticut, food and Nutrition Press Inc: 447-452. 16 68

40. Simona Ivana, 2002 Bacteriologie veterinar special (Ed. Ceres, Bucureti; 460 pagini), ISBN: 973-40-0568-5 41. Simona Ivana, 2005 Bacteriologie general (Ed. tiinelor medicale, Bucureti; 250 pagini), ISBN: 973-86485-7-2 42. Simona Ivana, 2006 Tratat de bacteriologie medical-veterinar i introducere n micologie (Ed. tiinelor medicale, Bucureti;768 pagini), ISBN (10) 973-865715-6; ISBN (13) 978-973-86571-5-1 43. Simona Ivana, 2007 manual de microbiologia alimentelor (Ed. tiinelor medicale, Bucureti; 160 pagini), ISBN: 978-973-86571-3-7 44. Simona Ivana, 2007 microbiologie medical veterinar, Vol. I (Ed. tiinelor medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-01-6 45. Simona Ivana, 2007 microbiologie medical veterinar, Vol. II (Ed. tiinelor medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-02-3 46. Simona Ivana, 2008, microbiologia alimentelor, Ed. orizonturi, ISBN: 978-973736-090-8 47. Simona Ivana, 2008, Practical guide of microbiogical diagnosis, Ed. orizonturi, ISBN: 978-973-736-089-2 48. Sussman, m., 1997, Escherichia coli, mechanisms of virulence, Cambridge, Cambridge university Press. 49. Traian Enache, tefan Nicolae, tefan Enache jr., felicia hlciuc, 2005, Toxiinfecii alimentare, prin alimente de origine animal contaminate cu Shigella spp., Editura Coral Sanivet. 50. Welch RA, Burland V, Plunkett G 3rd, Redford P, Roesch P, Rasko d, Buckles El, liou SR, Boutin A, hackett J, Stroud d, mayhew Gf, Rose dJ, zhou S, Schwartz dC, Perna NT, mobley hl, donnenberg mS, Blattner fR, 2002, Extensive mosaic structure revealed by the complete genome sequence of uropathogenic Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci u S A. dec 24;99(26):17020-4. 51. Wick lm, Qi W, lacher dW, Whittam TS, 2005, Evolution of genomic content in the stepwise emergence of Escherichia coli o157:h7, J Bacteriol. mar; 187(5):178391. 52. Wickham, m. E., lupp, C., mascarenhas, m., Vazquez, A., Coombes, B. K., Brown, N. f., Coburn, B. A., deng, W., Puente, J. l., Karmali, m. A. and finlay, B. B, 2006, Bacterial genetic determinants of non-o157 STEC outbreaks and hemolytic-uremic syndrome after infection. J. Infect. dis. 194(6): 819-827 53. Yang J, Nie h, Chen l, zhang x, Yang f, xu x, zhu Y, Yu J, Jin Q., 2007, Revisiting the molecular evolutionary history of Shigella spp. J mol Evol. Jan;64(1):71-9.

69

CAPITOLUL 2 ImPLICAIILE BACTErIILOr dIn gEnUL ESChErIChIA n PrOdUCErEA TOxIInfECIILOr AliMENTArE

2.1. Caractere generale
Enterobacteriaceele sunt prezente n intestinul animalelor i al omului, iar fecalele conin peste 1010 per gram enterobacterii, de unde ajung n mediul ambiant (sol, ap, plante, animale). Sunt cunoscute ca fiind agenii etiologici ai sindromului diareic infecios. Grupul coliformilor se limiteaz la bacterii care cresc n tractul gastrointestinal al omului i al animalelor i include 5 genuri: Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Raoultella - adugat de curnd, formnd o parte din genul Klebsiella. Aceste bacterii prezint o mare importan pentru microbiologia alimentar deoarece reprezint unul din cei mai utilizai indicatori microbiologici sanitari care reflect condiiile de igien la prelucrarea i manipularea produselor, iar n multe situaii reflect modul de respectare al diferitelor tratamente termice (de exemplu, pasteurizare) aplicate diverselor produse. Separarea bacteriilor coliforme n cele de origine fecal i nefecal se face prin folosirea temperaturilor ridicate. Prin definiie grupul coliformilor fecali conine bacili sau cocobacili Gram negativi, nesporogeni, aerobi i facultativ anaerobi, mobili prin flageli peritrichi sau imobili care fermenteaz lactoza cu producere de gaz i produc colonii nchise la culoare ce au suprafaa cu luciu metalic i reflex auriu-verzui n decurs de 48 de ore la 45,5C. din genul Enterobacter, speciile mai importante pentru microbiologia alimentar sunt: E. (Pantoea) agglomerans, care a fost transferat n genul Pantoea i E. sakazakii. Citrobacter produce colonii tipice pigmentate n galben, fermenteaz lent lactoza i utilizeaz citratul ca unic surs de carbon. Specia prevalent din alimente este C. freundii, care se gsete de obicei n legume i carnea
70

proaspt. Klebsiella cuprinde mai multe specii trecute de curnd n genul Raoultella: K. (Raoultella) terrigena, R. planticola, R. ornitinolytica, ce se izoleaz din sol, ap, plante, dar i de la nivelul tubului digestiv. Contamineaz frecvent alimentele, de obicei n asociaie cu alte microorganisme, determinnd alterarea acestora. Escherichia coli este larg rspndit n natur i reprezint microflora dominant a intestinului gros, de unde prin intermediul fecalelor se elimin n mediul exterior contaminnd solul, apa, furajele, alimentele, etc. Tulpinile capabile de a provoca mbolnviri la om se situeaz ntr-una din cele 4 categorii de Escherichia coli enteropatogen: 1. 2. 3. 4. Tulpini enteropatogene (EPEC); Tulpini enterotoxigene (ETEC); Tulpini enterohemoragice (EhEC); Tulpini enteroinvazive (EIEC).

2.2. Istoric
Pentru prima dat n 1885 Theobold Escherich a izolat germenul din fecalele unor copii sugari, cu diaree. Implicaiile lui n patologia veterinar au fost recunoscute treptat, pe msura acumulrii cunotinelor dobndite n acest domeniu. Prezena n filtratele culturilor unor tulpini de Escherichia coli a unei citotoxine necunoscute pn atunci, activ pe celulele Vero, a fost relatat de Konowalchuk i colaboratorii n 1977. un antiser preparat mpotriva unei citotoxine Vero (VT) parial purificate, obinut de la tulpina de Escherichia coli productoare de VT (ECVT) prototip h30 (serotip o26:h11) a neutralizat activitatea verotoxinelor provenite de la 8 din 10 tulpini pozitive pentru VT, dar nu i pentru celelalte dou, sugernd existena unei heterogeniti serologice, observaie care a fost confirmat ulterior. apte tulpini ECVT au provenit de la pacieni cu gastroenterit, sugernd faptul c VT a fost un factor de virulen n boala enteric. n 1983, oBrien i la Veck au purificat i caracterizat toxina h30 i au demonstrat c este un polipeptid subunitar similar toxinei produse de Shigella dysenteriae tipul 1. de atunci a fost denumit Shigella-like toxin (SlT-toxin asemntoare toxinei Shiga). n 1983, Riley i colaboratorii, de la Centrul de Control al Bolilor din Atlanta, au coordonat investigaiile epidemiologice n dou episoade de
71

boal, puin neleas, pe care au numit-o colit hemoragic, caracterizat prin crampe abdominale severe, diaree hemoragic i absena unei febre semnificative. Au descoperit o legtur strns ntre boal i consumul de hamburgeri, ntr-un lan comercial fast-food. Investigaiile microbiologice au demonstrat asocierea dintre boal i prezena unei tulpini de Escherichia coli aparinnd serotipului rar o157:h7, care mai trziu a fost dovedit ca productor de VT. Tot n 1983, Karmali i colaboratorii, n Toronto, au stabilit legtura dintre infecia cu ECVT aparinnd ctorva serotipuri, inclusiv o157:h7 i sindromul uremic hemolitic (Suh), o stare patologic a crei etiologie era necunoscut i care fusese descris pentru prima dat n 1955. Suh se manifest printr-o triad de caracteristici: insuficien renal acut, trombocitopenie i anemie microangiopastic hemolitic, care, n sindromul clasic apar la cteva zile dup declanarea diareei sangvinolente, asemntoare unei colite hemoragice. n ultimul deceniu s-au nregistrat progrese semnificative n nelegerea epidemiologiei i patogenezei infeciei cu ECVT, care a fost recunoscut drept o infecie zoonotic major la om. holt i colaboratorii (1994) grupeaz cele dou entiti taxonomice nrudite, Escherichia i Shigella, ntr-un singur gen, numit Escherichia Shigella.

2.3. Taxonomie
n cadrul genului sunt incluse 5 specii de Escherichia: Escherichia coli (cu dou biovaruri: Escherichia coli normal i Escherichia coli inactiv), Escherichia fergusonii, Escherichia hermannii, Escherichia vulneris, Escherichia blattae, Escherichia adecarboxylata, Escherichia albertii. descoperirea unei toxine VT1, la Escherichia coli, care este virtual identic toxinei Shiga, produs de Shigella dysenteriae, tip 1 nu este surprinztoare. Proprietatea produciei VT distinge ECVT de alte serotipuri de Escherichia coli enterice, patogene, de tipul Escherichia coli enterotoxigen, Escherichia coli enteroinvaziv, Escherichia coli enteropatogen i Escherichia coli enteroagregativ. mai mult de 150 de serotipuri oh ECVT diferite au fost pn acum asociate cu boala de la om. multe altele au fost izolate exclusiv de la animale. Termenul Escherichia coli enterohemoragic (EhEC) a fost aplicat acelor serotipuri VT EC, care au caracteristici clinice, epidemiologice i
72

patogenetice identice celor asociate tulpinii prototip de Escherichia coli o157:h7. Whittam i colaboratorii au investigat originea clonal a tulpinilor ECVT o 157 prin testarea variaiei alelice la aproape 20 de loci enzimatici diferii prin electroforeza multilocus enzimatic. Tulpinile de Escherichia coli o157:h7 provenind de la diverse surse constituie un grup clonal genetic distinct, care este mai slab nrudit cu ECVT din alte serotipuri. Pe de alt parte, n comparaie cu tulpinile EPEC, clona o157:h7 s-a dovedit a fi strns nrudit cu tulpinile clonei o55:h7, care au fost de mult vreme asociate episoadelor de diaree infantil semnalate n ntreaga lume.

2.4. morfologie
Escherichia coli este o bacterie Gram negativ, de form bacilar sau cocobacilar cu dimensiuni de 1-1,5/2-6 microni. Este nesporogen, n general flagelat peritrich. Exist tulpini capsulogene i necapsulogene. unele tulpini prezint fimbrii i sunt hemaglutinante. Au fost identificate dou tipuri fimbriale: tipul 1, care sunt manozsensibile i tipul 2, manoz-rezistente, caracterizate printr-o mare diversitate antigenic. fimbriile manoz rezistente mplinesc funcia unor factori de patogenitate. unele tulpini prezint plasmide f, fiind prevzute cu pil de sex, detectabile serologic sau cu ajutorul fagilor sexuali.

2.5. Condiii de cultivare i caractere culturale

Escherichia coli este o bacterie aerob sau facultativ anaerob i se dezvolt optim la 37C (temperatur la care sunt produse i exotoxinele, enterotoxinele, hemolizinele). Se poate dezvolta i la temperaturi cuprinse ntre 14-44C sau n anaerobioz. n bulion, variantele S se dezvolt n 24 de ore i determin turbiditate uniform, fr sedimentare, iar variantele R tulbur mai mult sau mai puin mediul, formnd la suprafa inel sau vl i depozit, pe fundul eprubetei. Pe mediile solide variantele S formeaz colonii de 2-3 mm, rotunde, bombate, umede, cu suprafa neted i margini regulate, iar variantele R, colonii rotunde, plate, de mrime mijlocie, cu suprafa rugoas i margini
73

neregulate. Exist i tulpini care dau colonii mucoide. Pe agar snge de iepure, unele tulpini (n special cele izolate de la porcine) determin hemoliz incomplet, fr legtur cu enteropatogenitatea. longevitatea germenilor n culturi pe medii uzuale este de 2-3 luni. Culturile bacteriene degaj un miros caracteristic de amoniac.

2.6. Proprieti biochimice

Escherichia coli produce indol, reacioneaz negativ la testul VogesProskauer i pozitiv la testul cu rou metil, nu produce hidrogen sulfurat, nu descompune ureea, nu lichefiaz gelatina, fermenteaz glucoza i lactoza cu producie de gaz.
Tabelul 2.1 Principalele caractere exoenzimatice ale speciilor din genul Escherichia (dup Carp-Crare m., 1997) E. E. E. E. Escherichia Testul fergusonii hermannii vulneris blattae coli Indol + + + lyzin decarboxilaza + + (+) ornitin decarboxilaza d + + mobilitate + + + + KCN + (-) malonat d (+) Glucoz gaz + + + + d-adonitol l-arabinoz + + + + d-arabinol Celobioz + + + lactoz + d (-) manitol + + + + d-sorbitol + Voges-Proskauer h2S Catalaz + + + + Legend: + = 90-100% din tulpini reacioneaz pozitiv; - = 90-100% din reacioneaz negativ; d = reaciile difer de la o tulpin la alta. 74 + + + + + + tulpini

Importani liganzi la Escherichia coli sunt fimbriile Pap (pilli associated with pyelonephritis), numite i pili P, pentru c au, ca receptor, antigenul de grup sanguin P, prezent nu numai pe hematii, ci i pe uroepiteliu i n mucusul urinar. Avnd n vedere prevalena categoric a Escherichia coli de biotip 1 n totalul microorganismelor prezente n fecalele omului i animalelor, organismele internaionale de specialitate au stabilit c ea reprezint indicatorul sanitar cel mai important i cel mai fidel pentru aprecierea contaminrii fecale a apei i alimentelor. din aceleai motive Comitetul American Naional pentru Criteriile microbiologice la Alimente (NACmfC) a introdus de civa ani Escherichia coli biotip 1 (Escherichia coli generic) ca indicator igenico-sanitar i test obligatoriu pentru verificarea la nivelul abatoarelor a contaminrii fecale a carcaselor animalelor de mcelrie i ale psrilor. Acest test a fost introdus i n ara noastr i se regsete n Programul Naional al Aciunilor Strategice Sanitar-Veterinare.

2.7. Proprieti antigenice

n cadrul speciei Escherichia coli exist o mare heterogenitate antigenic. Principalele antigene identificate sunt urmtoarele: antigene somatice, notate cu o; antigene capsulare, notate cu K; antigene flagelare, notate cu h; antigene fimbriale, notate cu f; antigene comune cu alte enterobacteriacee, notate cu m. n cadrul fiecrei categorii exist mai multe fraciuni antigenice, pe baza crora au fost identificate peste 173 de antigene o, 101 antigene K i 56 antigene h. Antigenele o difereniaz specia n serogrupe i sunt de natur lipopoliglucidic. Antigenele somatice cresc persistena bacteriilor n tractusul urinar. Antigenele poliglucidice capsulare K au proprietatea de a proteja colibacilii fa de complement i fagocite favoriznd aderarea lor la enterocite. Antigenele K se subdivid n trei tipuri A, B i l dintre care numai cele de tip A (termostabile) sunt antigene capsulare adevrate, n timp ce antigenele B (relativ termostabile) i l (termolabile) sunt de nveli. Antigenele fimbriale (adezinele fimbriale), de natur proteic,
75

faciliteaz aderarea colibacililor la enterocitele jejunale i ileale, evitnd evacuarea lor n intestinul gros prin peristaltism. Adezinele fimbriale sunt notate cu f1, f2, f3, f4, f18, f41, f165. Primele trei tipuri sunt specifice colibacililor patogeni pentru om. Antigenul f4 este sinonim cu K88, fiind prezent la tulpinile enterotoxigene pentru purcei, f5 (K99), identificat la tulpinile enterotoxigene de la viei, f6, sinonim cu 987 P. Spre deosebire de antigenele somatice, capsulare i flagelare, determinate de gene cromozomale, antigenele fimbriale sunt de regul controlate de gene plasmidice.
Tabelul 2.2 Tipuri de antigene fimbriale la Escherichia coli (dup Orskov) Tipul de antigen fimbrial f1 f2 f3 f4 f5 f6 f7 f8 f9 f10 f11 f12 denumiri anterioare Tipul I CfA I CfA II K88 K 99 K 987 C 1212 C 1254-79 3669 C 1960-79 C 1976-79 C 1979-79 Asocieri patologice Antigene fimbriale comune ETEC la om ETEC la om ETEC la porc ETEC la bovine ETEC la porc ITu la om ITu la om ITu la om ITu la om ITu la om ITu la om

Pe baza structurii antigenice, colibacilii au fost clasificai n serogrupe i serotipuri. Grupele au fost constituite pe baza identitii de structur antigenic somatic i se noteaz cu numrul antigenului precedat de iniiala indicatoare o. Exist relaii ntre structura antigenic somatic i patogenitatea tulpinilor pentru diferite specii de animale. Pentru serotipizare se folosete reacia de seroaglutinare, iar pentru identificarea antigenelor fimbriale i a celor capsulare se poate aplica i seroprecipitarea n gel. n practica de laborator, pentru identificarea serologic a tulpinilor patogene de Escherichia coli se execut aglutinarea oK. Tulpinile vii care posed antigene K nu sunt aglutinate de serul
76

omolog anti o. de aceea, se lucreaz cu tulpini tratate termic (pentru distrugerea antigenelor de nveli K, care ar mpiedica aglutinarea antigenelor o) atunci cnd se urmrete identificarea antigenelor K.

2.8. Sensibilitatea fa de factorii de mediu

Escherichia coli rezist la 55C timp de o or i 15-20 minute la 60C. n fecale i gunoi de grajd, meninute ntr-un mediu umed, pot s supravieuiasc 45 de zile, n sol 45-140 zile, n apa de canal 70-270 zile. Este sensibil la aciunea dezinfectantelor uzuale (sod caustic 1-2%, aldehid formic 1%, clorur de var cu 1-2% clor activ, etc.) i a coloranilor din grupa trifenil metanului) ca verdele briliant i verdele de malachit. Antibioticele cele mai active sunt tetraciclina, gentamicina, polimixina, neomicina, amoxicilina, cloramfenicolul, colimicina, iar chimioterapicele: sulfatiazol, sulfametazin, nitrofuran, furazolidon. dobndesc cu uurin mutante rezistente la antibiotice datorit prezenei unor plasmide (factor R), care se pot rspndi repede n populaia de bacterii. majoritatea informaiilor privind creterea i rezistena se bazeaz n mod curent pe studiile asupra serotipului Escherichia coli o157:h7. Cunoaterea rezistenei n mediu este limitat, dar s-a demonstrat c o157 poate supravieui perioade ndelungate (> 40 zile) n ap i este posibil ca mediile contaminate cu materii fecale s fie surse pentru aceste microorganisme mai mult timp. n alimente, tulpina o:157 este distins prin pasteurizarea de rutin a laptelui sau la temperaturile de gtit, n mod similar multor altor bacterii patogene. Izolarea tulpinilor o:157 din carnea de vit tocat i congelat, dup mai multe luni, sugereaz c aceste microorganisme pot persista, n mediu, n condiii de iarn, perioade foarte lungi. Capacitatea unor tulpini de a supravieui n condiii de ph sczut (4,5), ntlnit n episoade asociate cu cidrul i maioneza au ndreptat investigaia asupra supravieuirii acestor microorganisme n urma diferitelor metode de preparare a hranei. Investigaiile ulterioare asupra ecologiei i rezistenei acestui grup complex de ageni patogeni vor fi decisive pentru elaborarea msurilor eficiente de aprare a sntii publice. n maioneza comercial E. coli 0157:h7 a supravieuit 35 de zile n produsele depozitate ntre 5oC i 7oC, dar dup 72 de ore la 25oC bacteria nu a mai fost detectat n acest produs. maioneza are un ph de 3,65, iar
77

inoculul de celule bacteriene a fost de ~107 utc/g. n ceea ce privete tolerana la sare, tulpinile de E. coli 0157:h7 n bulion cu NaCl 4,5% s-a dublat timpul de generaie, n timp ce la o concentraie de 6,5% NaCl n 36 de ore, timpul de generaie a fost de 31,7ore. Aceti cercettori au observat c dezvoltarea bacteriei este inhibat la un ph de 8,5% NaCl. Tulpinile EhEC sunt mult mai sensibile la aciunea temperaturii dect majoritatea salmonelelor. un studiu recent asupra valorilor d de temperatur ntre diferite produse de carne este notat mai jos: - carnea de vit - 0,45-47 - carne de porc - 0,37-0,55 - carne de pui - 0,38-0,55 - carne de curcan - 0,55-0,58 Valorile d se mresc o dat cu creterea coninutului n grasime. un studiu al valorilor d i z din carnea gras de vac arat urmatoarele: - 30,5% grsime; d=0,45 minute; z=8,37of - 2,0%grsime; d=0.30 minute; z=8,30of ntr-un alt studiu pe carnea tocat cu un coninut mai mic de grsime ce coninea tulpina 0157:h7 n inoculum de aproximativ 103/g, aceasta a fost distrus cnd temperatura intern a atins valoarea de 66oC, 68oC sau 72oC. din sucul de mere Escherichia coli 0157:h7 a fost distrus la 66oC n 1,6 minute. n ceea ce privete rezistena la radiaii a tulpinilor EhEC nu se difereniaz de celelalte bacterii enterice. din carnea de pui tulpinile de E. coli 0157:h7 au fost distruse la 5oC de radiaii d de 0,27 kGy, iar la temperatura de -5oC de radiaii d de 0,42 kGy.

2.9. Patogenitatea
Escherichia coli este o bacterie condiionat patogen cu numeroase fenotipuri patogene (patotipuri). Genele cromozomale, dar mai ales resortarea variailor factori de patogenitate prin transfer plasmidic i conversie lizogenic determin constituirea numeroaselor sale patotipuri diareigene i uropatogene. unele tipuri sunt predominant toxigene n timp ce altele sunt virulente i invazive. Pe baza mecanismului de aciune de la nivelul tubului digestiv, tulpinile de Escherichia coli se mpart n enteroinvazice i enterotoxice. Enteroinvazivitatea se datoreaz posibilitii bacteriei de a penetra
78

epiteliul intestinal, iar enterotoxicitatea se datoreaz producerii de enterotoxine. Enterotoxinele sunt exotoxine elaborate de colibacili in vitro i in vivo. Au fost identificate o enterotoxin termolabil i imunogen (lT) i dou enterotoxine termostabile i imunogene (ST I i ST II). Acestea sunt elaborate de tulpinile de Escherichia coli care posed K88 i K99 i alte antigene cu rol n colonizarea colibacililor. Enterotoxinele Toxina lT este distrus la 60oC n 30 de minute, n timp ce ST poate suporta 100oC, 15 minute. Toxina lT este o protein cu o greutate molecular de aproximativ 91 kda, posednd o activitate enzimatic similar cu cea a toxinei holerice (CT= cholera toxin). n timp ce CT este transportat din citoplasm la exteriorul celulelor producatoare, lT este depozitat n periplasm. mai mult, antiserurile pentru CT neutralizeaz lT, iar imunizarea cu CT induce protecia, att mpotriva lui CT ct i a lui lT. Aceste toxine sunt produse n faza timpurie de producere a tulpinilor, cu o cantitate maxim de ST dup 7 ore de cretere ntr-un mediu cu extract de drojdii cu 0,2% glucoz. n mediu sintetic ST a aprut dup 8 ore, atingnd maximul de cantitate produs dup 24 de ore, n condiii aerobe. Cu toate c lT i ST se dezvolt n orice condiii care permit dezvoltarea celular, eliberarea lui lT din celule ntr-un mediu mbogit a avut loc cel mai favorabil la un ph de 7,5-8,5. Toxina lT este compus din 2 protomeri: - A: cu o greutate molecular de 25,5 kda, care atunci cnd se combin cu tripsin devine A1 enzimatic activ i formeaz un lan polipeptidic de 21 kda legat printr-o legatur disulfidic cu un lan tip A2. - b: de 59 kda format din 5 lanuri polipeptidice legate individual necovalent; lTB constituie subunitatea de legatur, n timp ce lTA stimuleaz sistemul adenilat ciclazei. lTA i lTB posed proprietai imunologice similare subunitilor A i B ale toxinei lui Vibrio cholerae. lTh i lTp desemneaz tulpinile umane i porcine. STa este solubil n metanol i provoac un rspuns secretor la oareci infantili. Este un peptid format din 18-19 aminoacizi ce conine 3 legturi disulfidice, avnd o legtur molecular de 1972 da. Stimuleaz guanilat ciclaz intestinal. STb este insolubil n metanol fiind de origine porcin.
79

Este cea mai rspndit toxin asociat cu izolatele diareigene de origine porcin i afecteaz intestinul subire i ileonul purceilor. Genele pentru STb (EstB) au fost clonate i secvenializate. Toxina STb sensibil la tripsin este sintetizat de 71 de aminoacizi, fiind clivat pentru activarea unei molecule de 48 de aminoacizi cu 4 reziduuri de cistein care strbat membrana intern i ajung n periplasm. Cu toate c modul de aciune este nc neclar, s-a demonstrat c stimuleaz sinteza de prostaglandin E2. Receptorul celular n celulele intestinale de oarece este o protein cu greutatea molecular de 25 kda. modul de aciune al enterotoxinelor. Gastroenteritele produse de tulpinile ETEC sunt cauzate de ingestia de 106-1010 celule viabile per gram, care colonizeaz intestinul subire i produc enterotoxine. factorii de colonizare sunt n general fimbriile i pilii. Sindromul se caracterizeaz n prima faz prin diaree nesangvinolent fr exsudate inflamatorii n fecale. diareea este apoas, asemntoare cu cea produs de V. cholerae. Aceasta apare din activarea adenilat ciclazei intestinale de ctre enterotoxin. n ceea ce privete lT, protomerul B mediaz legarea moleculei de celule intestinale. lT se leag de gangliozide, n special de monosialogangliozide (gangliozidele monosialice) (Gm1). CT se leag i el, de asemenea, de gangliolizidele Gm1. Se tie c i lT mparte determinanii antigenici printre protomerii corespondeni cu toate c nu produc reacii ncruciate. la legare lanul polipeptidic A catalizeaz ribozilarea proteinei G care activeaz adenilat-ciclaza i induce creterea AmPC-ului intracelular. STA se leag ireversibil la un receptor monogangliozid specific cu afinitate nalt i iniiaz un semnal transmembranar pentru activarea guanilat-ciclazei declannd producerea de guanozin monofosfat ciclic (GmPC). Nivelurile ridicate de GmPC din mucoasa intestinal duc la pierderea de fluide i electrolii. ST difer de CT prin faptul c stimuleaz numai forma particular de guanilat ciclaz. STb crete cantitile luminale de 5-hidroxitriptomina i postaglandina E2, ambele fiind mediatori pentru secreiile intestinale. STb crete cantitile luminale de prostaglandin E2 i S-hidroxitriptoamin, ambii fiind mediatori ai secreiilor intestinale. STb crete cantitile luminale de S-hidroxitriptamin i prostaglandin E2, ambele fiind mediatori pentru secreiile intestinale. STb nu activeaz guanilat-ciclaza. Genele care controleaz producerea STb sunt nregistrate
80

subclonate i secvenializate. mecanismele produse de Shigella, Stx1, Stx2, Stx2e i ricin sunt asemntoare. Ele sunt N-glicozidaze ce cliveaz un reziduu de adenin specific din subunitatea 28S a RNA-ului eucariotic, ducnd la inhibarea sintezei de proteine. Capacitatea de a produce enterotoxine se evideniaz prin testul ansei ligaturate, care de regul se face pe iepure, prin administrare intragastric la oarece sau in vitro, respectiv prin teste serologice. Endotoxina de natur lipopolizaharidic, prezent i la alte bacterii Gram negative, favorizeaz diseminarea septicemic i particip la producerea ocului endotoxic. Se identific cu antigenele somatice o, fiind determinante pentru ncadrarea n serogrupe. Este responsabil de producerea septicemiilor, mamitelor, infeciilor urinare. hemolizinele alfa i beta acioneaz asupra integritii membranelor celulare. Sunt incriminate ca ageni etiologici ai bolii edemelor. hemolizinele sunt codificate plasmidic i acioneaz ca citotoxine calciu dependente. Sideroforii influeneaz aciunea colibacililor enteroinvazivi, ca urmare a competiiei dintre celulele somatice i cele bacteriene, pentru utilizarea fierului biodisponibil. factorii de patogenitate toxici, cu efect necrozant CNf1 i CNf2 sunt toxine de natur proteic, ce pot facilita rspndirea bilateral a tulpinilor uropatogene din tractusul urinar spre i din torentul sangvin. Acetia sunt: 1. Escherichia coli enterotoxigen (ETEC), fiind grupa cu cea mai important pondere n patologia enteritelor infecioase la animale. Acioneaz prin inhibarea absorbiei apei i electroliilor fr lezionarea mucoasei intestinale, n condiiile meninerii sau exacerbrii exorbiei, ceea ce se soldeaz cu deficit n balana hidroelectrolitic (deshidratare, acidoz). Aceste tulpini se ataaz i colonizeaz intestiul subire prin intermediul CfAs (colonization factor antigens = factor fenibrial (de colonizare) Exist 4 tipuri de CfA mature cu I, II, III, IV care au fost clonate i secvenializate. CfA-urile sunt codificate n general de aceeai plasmid care codific enterotoxina termostabil nefiind produse sub 20oC. o data ataate ele produc una sau dou enterotoxine. o dat ataate ele produc una sau dou enterotoxine. ntr-un studiu al tulpinilor ETEC izolate de la 109 pacieni ,cele care au produs att ST ct i lT erau mai restricionate n serotipurile o:K:h
81

dect cele care produceau doar una dintre aceste toxine. Spre deosebire de tulpinile EPEC (care cauzeaz diaree la persoanele foarte tinere), tulpinile ETEC produc diaree atat la copii ct i la aduli. Acestea reprezint principalele tulpini ce produc diareea cltorului. Simptomele sunt rareori acompaniate de febr, iar diareea apare subit. S-a estimat c pentru producerea diareei la aduli sunt necesari 108_1010cfu. 2. Escherichia coli enteropatogen (EPEC, AEEC) cuprinde tulpini de Escherichia coli, care nu produc enterotoxine i nici verotoxine, dar posed adezine, cu ajutorul crora ader la enterocitele vilozitare, pe care pot chiar s le penetreze, producnd enterite. i exercit patogenitatea prin ataarea la marginea n perie a enterocitelor vilozitare, urmat de distrugerea acestora i implicit a capacitii lor de absorbie (attaching and effacing AE), de unde i denumirea grupei de AEEC). Exist dou clase de tulpini AEEC: a) care posed gene numai pentru AE; b) care posed gene att pentru AE, ct i pentru producerea de toxine Shiga. 3. Escherichia coli enterohemoragic (EhEC), include tulpinile care, la fel ca EPEC, ader la mucoasa intestinal i produc distrugerea microvililor cu efect inflamator, mai ales la nivelul intestinului gros. Principala lor caracteristic este c elaboreaz verotoxine. Identificarea EhEC se face prin ncadrarea n serogrupul o157:h7 (pozitiv sau negativ) i, uneori, o26 sau o111 i determinarea capacitii citotoxice asupra celulelor VERo, genelor care codific SlT I i SlT II; genei eae A, care codific intimina (proteina responsabil de adeziunea celular). 4. Escherichia coli enteroinvaziv (EIEC) determin un sindrom diareic dezinteriform. Procesul invaziv are 4 faze: penetrarea EIEC n celulele m din mucoasa colonului; captate din aceste celule de ctre macrofage, bacteriile se elibereaz subepitelial i se ataeaz la suprafaa celulelor intestinale; bacteriile se multiplic activ intracelular i intercelular i se rspndesc rapid n submucoas prin intermediul fagocitelor n care supravieuiesc;
82

 moartea celulelor intestinale, ca urmare a blocrii sintezei proteice, precum i a leziunilor citoplasmatice ireversibile, ceea ce determin i ulceraiile tipice pe fond inflamator. 5. Escherichia coli enteroagregativ (EAggEC) Aceast grup se inrudete cu EPEC, dar aderena agregativ manifestat de aceast tulpin este unic. Tulpinile ader la celulele hep-2 sub forma unor crmizi aezate una peste alta (Stacked-Brick-Typ) i prezint o plasmid necesar pentru producia de fenibrii responsabile de aderare i pentru producia unei proteine specifice a membranei externe(omP). Anticorpii specifici omP previn aderena la celulele hep-2. o prob de dNA de EAggEC a fost construit prin folosirea unui fragment de Kilobaza(kb) 1,0 din plasmida mda-60 a tulpinilor 03:h2, i a fost gasit specific pentru aceste tulpini n proporie de 99%. unele tulpini EAggEC produc o enterotoxin termostabil care a fost denumit EAST1. Gena plasmidic pentru EAST1 este ast A care codific o molecul de 38 de aminoacizi n contrast cu ast A care codific enterotoxina Sta de 72 de aminoacizi. Aceste tulpini produc o enterotoxin /citotoxin de 108kda localizat pe o plasmid de virulen. manifestarea chimic specific tulpinilor EAggEC este diareea persistent care poate dura mai mult de 14 zile, n special la copii. Aceste tulpini nu reprezint ns cauza principal a diareei cltorului.Nu este ns foarte clar dac aceste tulpini reprezint patogeni alimentari.
Tabelul 2.3. Cteva serotipuri O ale celor 5 tipuri de virulen EAggEc 3 4 6 7 17 44 51 68 73 75 77 78 EHEc 2 5 6 4 22 26 38 45 46 82 84 88 EiEc 28 ac 29 112 a 124 135 136 143 144 147 152 164 167 83 EPEc 18 ab 19 ac 55 86 111 114 119 125 126 127 128 ab 142 ETEc 6 8 15 20 25 27 63 78 80 85 101 115

EAggEc 85 111 127 142 162

EHEc 91 103 113 104 111 116 118 145 153 156 157 163

EiEc

EPEc 158

ETEc 128 ac 139 141 147 148 149 153 159 167

Tabelul 2.4 Cazuri de gastroenterite alimentare provocate de Escherichia coli patogen Anul 1947 1961 1963 1966 1967 1971 1980 1981 1982 ara Anglia Romnia Japonia Japonia Japonia SuA SuA SuA SuA Sursa alimentar salam substitut de cafea ohagi - mncare tradiional din orez legume sushi brnzeturi importate carne de vit carne de vit carne de vit nr. de victime/ nr. de risc 47/300 10/50 17/31 244/435 835/1736 387/? 500/3000 282/3000 26/? Toxina/ Tipul tulpinii EIEC EPEC EIEC EIEC ? EIEC ETEC ETEC (lT) EhEC Serotip o124 o86:B7:h34 o124 o124 o11 o124:B17 o6:h16 o25:h+ o157:h7

Verocitotoxinele (toxinele Shiga-like) Verotoxinele cuprind o familie de proteine subunitare, nrudite, al crei prototip VT1 este virtual identic toxinei Shiga. A doua toxin major VT2 are un numr de variante strns nrudite, incluznd VT2c i VT2e. Verotoxinele sunt printre cele mai puternice substane biologice cunoscute, toxice pentru celule n concentraii de pico la nanomolar. utilizarea diferitelor denumiri pentru toxinele majore i subtipurile
84

acestora a condus la propunerea raionalizrii denumirii, astfel nct termenul VT este interschimbabil cu SlT (Shiga-like toxin) i desemnarea subtipului este identic. Astfel, SlTIIc este interschimbabil cu VT2c. Receptorul funcional pentru toxina Shiga, VT1, VT2 i VT2c este glico-lipidul de membran celular de mamifer, globotriosilceramida (Gb3). Aceste toxine sunt prin excelen inhibitori ai translaiei, activi la concentraii de pico sau nanomolar. Tipurile majore de toxine ale familiei VT au fost clonate i secveniate la nivel transcripional. o boal a ogarilor de curse denumit boala de Alabama sau vasculopatia cutanat i glomerulorenal idiopatic, se aseamn izbitor cu Suh de la om. Recent a fost demonstrat ca fiind asociat infeciei cu ECVT. fundamental, n leziunile microangiopatice observate la nivelul glomerulilor renali ai pacienilor cu Suh este edemul caracteristic al celulelor endoteliale din capilare, nsoit de depunerea de fibrin i ocluzia lumenului vaselor. Citokinele de tipul interleukinei-1 i factorul de necroz tumoral s-au dovedit a mri potenialul citotoxic al VT pentru celulele endoteliale ale venei ombilicale umane, n cultur, fapt corelat cu o expresie mrit de receptor Gb3. Rolul cert al VT include coagularea intravascular local, trombocitopenia i anemia microangiopatic hemolitic. Rolul VT n producerea diareei nu este clar. Nu exist receptori pentru toxin la nivelul mucoasei epiteliale intestinale; totui, pe seciunile intestinale umane de la pacienii cu Suh au fost observate: microangiopatie, edem i hemoragie, care pot afecta proprietile de absorbie ale intestinului rezultnd diareea. Examenul histopatologic al biopsiilor intestinale, prelevate de la pacieni sau al esuturilor de la animalele cu infecie natural ori experimental cu EPEC, a demonstrat un model caracteristic al atarii bacteriene la enterocite, care const n distrucia microvililor, nivelarea membranei citoplasmatice i aderena intim a bacteriei la epiteliu, care emite prelungiri ce nvelesc parial bacteria. Acest aspect este denumit leziune de ataare-nivelare (attaching and effacing AE). dovezi recente indic faptul c mecanismele leziunii AE implic interaciunea unor factori mediai plasmidic i cromozomal, care sunt supui unui complex de reglare genetic i ambiental.
85

Aderena iniial a EPEC, anterior leziunii AE, const n ataarea fimbrial la enterocite, care este mediat plasmidic prin formarea pililor de legare (bundle-for-ming-pillus BfP). Totui ECVT nu exprim BfP i eventuala faz de ataare fimbrial nu a fost stabilit cu certitudine. Toi factorii de virulen necesari pentru formarea leziunii AE, att la ECEP, ct i n cazul ECVT sunt codificai de un locus mai mare cromozomal de 35480 pb (insula de patogenitate), denumit lEE (locus for enterocyte effacement locus de nivelare a enterocitului lNE). una dintre genele structurale ale lEE, care este absolut important n formarea leziunii AE este gena eae, care codific proteina de ataare din membrana extern, intimina de 94 Kda, responsabil de ataarea intim a bacteriei la enterocit. Alte dou gene, esp A i esp B codific proteine (esp A i respectiv esp B), care activeaz semnalul cilor de transducie, care la rndul lor induc modificrile de citoschelet n enterocit i fosforilarea proteinei hp 90, aparinnd celulei gazd, protein ce se leag de intimin. Studiile asupra ECVT au demonstrat c tulpinile aparinnd mai multor serotipuri manifest leziuni AE in vitro i n modelele experimentale animale, iar dovezile de pn acum indic faptul c mecanismele leziunilor AE induse de ECVT i ECEP sunt similare.
Tabelul 2.5 Unele caractere ale Escherichia coli patogen productoare de toxiinfecii alimentare rezervorul Surse de grupa de Alimente implicate n cunoscut sau contaminare a E. coli toxiinfeciile alimentare presupus alimentelor prelucrtorii i carnea de porc; manipulatorii de apa; EPEc omul alimente; nlocuitorii de cafea apele de canal brnza Brie; brnza Camembert; EiEc salata; omul apa; conserve de Salmonidae brnza Brie; carnea de curc; ETEc omul maionez; preparate de restaurant, cofetrie 86

grupa de E. coli

rezervorul cunoscut sau presupus

Surse de contaminare a alimentelor

Alimente implicate n toxiinfeciile alimentare

EHEc

fecale de bovine carnea tocat de vit; vacile de lapte i i de alte animale; laptele nepasteurizat; alte animale utilaje; salata lptrii

Pentru demonstrarea enteropatogenitii tulpinilor de Escherichia coli se folosesc mai multe metode, dintre care menionm: testul ansei ligaturate; inocularea la oareci sugari; inocularea culturilor celulare; hemaglutinarea, efectul hemaglutinant fiind determinat de prezena pililor i corelndu-se cu existena antigenelor fimbriale. Pentru alte proprieti patogene, cu valoare relativ, se folosesc i alte criterii, cum sunt: activitatea hemolitic fa de hematiile de cal, tulpinile patogene fiind, de regul, hemolitice; colicinogenia i colicinosensibilitatea, tulpinile izolate din procese patologice fiind mai des colicinogene dect cele provenite din mediile naturale.

2.10. Epidemiologie
Infeciile cu Vero/shiga toxin Escherichia coli (VTEC/STEC) din 2006 au nregistrat la nivelul a 27 de state membre ale uE i EEA/EfTA un numr de 3.463 raportri cu 3.458 de confirmri, furniznd astfel o rat a notificrilor la nivelul uE de 0,74 la 100.000 locuitori.
Tabelul 2.6. numrul i rata notificrilor de cazuri VTEC/STEC raportate n UE i EEA/EfTA n 2006 ara Austria Belgia Bulgaria Cipru Tipul de raportare C C u u Total cazuri 41 47 0 0 87 Cazuri confirmate 41 47 0 0 Nr. cazuri per populaii de 100.000 de oameni 0,50 0,45 0,0 0,0

ara Republica Ceh danemarca Estonia finlanda frana Germania Grecia ungaria Irlanda Italia latvia lituania luxembourg malta olanda Polonia Portugalia Romnia Slovacia Slovenia Spania Suedia marea Britanie Total uE Islanda liechtenstein Norvegia Total

Tipul de raportare C C C C C C C C C C C u C C C C u u C C C C C C u C

Total cazuri 4 146 8 14 67 1236 1 3 158 17 0 0 2 5 42 4 8 30 13 265 1301 3412 1 50 3463

Cazuri confirmate 4 146 8 14 67 1236 1 3 153 17 0 0 2 5 42 4 8 30 13 265 1301 3407 1 50 3458

Nr. cazuri per populaii de 100.000 de oameni 0,1 2,7 0,59 0,27 0,11 1,5 0,1 0,1 3,6 0,1 0,0 0,0 0,43 1,2 0,26 0,1 0,15 1,5 0,1 2,9 2,2 0,74 0,33 1,1 0,74

Sursa: Raportri naionale. A = Raportri de date agregate; C = Raportri bazate pe cazuri; - = fr raportare; u = nespecificat 88

dup muli ani de evoluie ascendent a ratei notificrilor de VTEC/ STEC la nivelul uE (aceasta este consecina unui complex de factori i nu este obligatoriu o cretere real), rata notificrilor a nceput s nregistreze o scdere ncepnd cu 2004, aceasta probabil ca o consecin a creterii tendinei de raportare corect numai a infeciilor confirmate de VTEC/ STEC, care difer substanial de toate infeciile cu Escherichia coli patogene. o scdere a cazurilor raportate a fost observat n special n Slovacia, Germania (cu toate c aceasta contribuie cu aproape o treime din totalul cazurilor raportate) i Bulgaria, dar o cretere a fost notat n Norvegia, Suedia, Irlanda i Regatul unit. Cea mai mare rat a notificrilor a fost observat n Irlanda (3,6 al 100.000) i Suedia (2,9 la 100.000). Toate celelalte state membre ale uE i EEA/EfTA care au raportat date au avut rate ale notificrilor sub 3,0 la 100.000 (Portugalia, Romnia i liechtenstein nu au raportat). majoritatea cazurilor au fost contactate domestic cu o medie uE a cazurilor importate de 9%. distribuia pe grupe de vrst i sex. Rata notificrilor a fost semnificativ mai mare la grupa de vrst a copiilor de 0-4 ani, cu o rat la nivelul uE de 7,5 la 100.000, urmat de grupa copiilor de 5-14 ani cu o rat de 1,6 la 100.000. Nu au fost identificate diferene notabile ntre ratele celor dou sexe, att la brbai, ct i la femei aceasta fiind de 1,0 la 100.000. Sezonalitatea. A fost observat o evident distribuie sezonier a cazurilor de TEC/ STEC. Acestea cresc progresiv de la nceputul anului atingnd un maxim n lunile de var dup care descresc n timpul toamnei. o excepie a fost semnalat n Norvegia unde numrul cel mai mare de cazuri a fost raportat n februarie i martie datorit unui focar de boal asociat cu consumul unor mezeluri contaminate. Proporia serogrupurilor non-o:157 raportate n 2006 a crescut substanial fa de anii precedeni i nregistreaz aproape jumtate din serogrupurile cunoscute (serogrupuri raportate la 72% din cazuistica analizat). n Regatul unit 78% din cazuri sunt asociate serogrupului o:157 (1275 cazuri). ase state au raportat cazuri confirmate de sindrom uremic hemoragic: frana ungaria, Irlanda, olanda, Norvegia i Regatul unit, cu un total de 126 cazuri. majoritatea cazurilor de sindrom uremic hemoragic au fost la copii de 0-14 ani i au fost cel mai frecvent asociate cu serogrupul o:154. un tipar sezonier al incidenei cazurilor de VTEC o:157 este evident, dar acest lucru nu a fost observat i n cazul serogrupurilor non-o:157.
89

Figura 2.1 distribuia sezonier a cazurilor de VTEC/STEC n EU i EEA/EfTA n 2006 (3323 cazuri) (Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor, 2008)

Cazuri

Ian

Feb

Mar

Apr

Mai

Iun

Iul

Aug

Sep

Oct

Nov Dec

Copiii mici sunt semnificativ suprareprezentai n cadrul cazuisticii VTEC/STEC i al cazurilor de sindrom uremic hemoragic (huS). o explicaie a acestei situaii ar putea fi aceea c ei sunt mult mai sensibili la toxinele produse de aceste bacterii, dar aceasta poate s reflecte o expunere mai mare la VTEC/STEC. o alt motivaie este aceea c este mult mai probabil ca la copii s se solicite investigaiile de laborator. ntr-un studiu asupra factorilor de risc pentru bolile asociate infeciilor cu VTEC/STEC, n Germania, factorul de risc a avut cea mai mare valoare pentru copiii sub trei ani care s-au mbolnvit. n aceast investigaie laptele crud a fost singurul aliment identificat ca un factor de risc pentru acest grup de vrst. la copiii cu vrsta de 10 ani sau mai mari doar produsele alimentare (ex: carnea de miel i crnaii cruzi) au fost semnificativ asociate cu mbolnvirile. Alimentele sunt o surs bine cunoscut de infecie cu VTEC/STEC, n special alimentele provenite de la rumegtoare cum sunt laptele, brnza i carnea. n 2006, Norvegia a raportat un focar cu 17 cazuri de mbolnvire cu Escherichia coli o:103 produs prin consumul de crnai afumai, din acetia 10 au dezvoltat sindrom uremic hemoragic. Cinsprezece cazuri au avut vrsta cuprins ntre doi i opt ani. de asemenea, Regatul unit a raportat cteva focare de infecii cu Escherichia coli o:157 sorbitol-fermentative. dar sursa infeciei nu a fost identificat. Cu toate c serogrupul o:157 nc este cel mai frecvent serogrup izolat n cazurile de sindrom uremic hemoragic, i alte serogrupuri pot provoca boli severe aa cum s-a artat mai sus n exemplul din Norvegia.
90

Figura 2.2. distribuia pe grupe de vrst a cazurilor de VTEC/STEC n EU i EEA/ EfTA n 2006 (Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor, 2008)

Cazuri/100.000

2.11. detectarea EPEC, ETEC i EIEC n alimente i materiale patologice

Pentru distrugerea microflorei de asociaie se impune folosirea mediilor de mbogire i de izolare selective. Ca medii de mbogire se folosesc bulionul cu bil, lactoz i verde briliant (BBlV) sau bulionul cu lauril sulfat, iar ca medii selective, agarul mac Conkey (VRBl = cristal violet, rou neutru, bil, lactoz) i agarul EmB sau GEAm (eozin-albastru de metilen lactoz). mediile de mbogire turnate n eprubete cu tub de fermentaie, se inoculeaz cu materialul de cercetat i diluiile acestuia, se incubeaz, iar cultura obinut (cu gaze sau fr gaze) se striaz pe suprafaa agarului mac Conkey sau EmB. dup incubare, 10 colonii lactoz pozitive i 10 colonii lactoz negative se cerceteaz biochimic i asupra patogenitii. n acest mod se prind tulpinile de Escherichia coli din toate cele trei grupe (inclusiv tulpinile ETEC, care sunt lactoz negative). dac se bnuiete c materialele de cercetat conin un numr foarte mare de Escherichia coli, se poate renuna la faza de prembogire i se striaz ca atare sau diluate, pe suprafaa mediilor selective. n legtur cu izolarea Escherichia coli din grupele menionate trebuiesc fcute cteva precizri: folosirea temperaturii de incubare de 44-45C poate fi nefavorabil
91

unor tulpini patogene, acestea nedezvoltndu-se i neproducnd indol; mbogirea tulpinilor patogene n bulion lauril-sulfat la 44,5C determin pierderea plasmidelor care codific factorii de virulen i scad eficiena decelrii lor, rspunznd negativ la unele teste de patogenitate la care se supun; unele tulpini de EIEC nu se dezvolt pe agarul SS (SalmonellaShigella), motiv pentru care acesta nu trebuie folosit n lucrrile de detectare a Escherichia coli; ntruct marea majoritate a tulpinilor EIEC nu fermenteaz lactoza, se va avea n vedere c agarul mac Conkey, folosit ca mediu selectiv de izolare a Escherichia coli s se prepare cu glucoz, n loc de lactoz; EIEC prezint unele particulariti biochimice de care trebuie s se in seama. Ele sunt lizin-decarboxilaz negative, tartrat negative, incapabile de a fermenta mucatul i de a utiliza acetatul, ca unic surs de carbon. EIEC se aseamn din punct de vedere biochimic i antigenic cu Shigella. Pentru difereniere se execut urmtoarele teste: folosirea d-serinei, d-xilozei, acetatului de sodiu i fermentarea mucatului. Tulpinile EIEC pot da unul sau mai multe rspunsuri pozitive la aceste teste, n timp ce Shigella d numai rezultate negative. dup izolarea i identificarea izolatelor de Escherichia coli, n mai multe cazuri se impune determinarea patogenitii lor. Aceasta se poate realiza prin mai multe teste, dintre care unele sunt specifice numai unei serogrupe. Astfel izolatele de EIEC se pot identifica prezumptiv prin determinarea capacitii lor de a invada celulele hela i confirma, pentru potenialul invaziv, prin testul Sereny. Capacitatea ETEC de a produce enterotoxina lT se poate determina prin testarea filtratelor culturilor pe culturi Y-1 sau Cho, iar a enterotoxinei ST, pe oareci nou nscui sau prin ElISA, teste radioimune sau sonde dNA specifice EAf. o alt metod pentru detectarea ETEC o reprezint hibridarea dNA, pentru identificarea genelor care codific lT i ST. Sondele de dNA marcate cu 32P au un grad mare de specificitate i sensibilitate, dar un timp scurt de njumtire, cost ridicat i inactivarea isotopului. din acest motiv n ultimul timp s-a recurs la marcarea neizotopic a acizilor nucleici sub form de sonde de dNA biotinilat pentru lT i ST, dei sunt mai puin sensibile dect primele. deosebit de interesant i util pare aplicarea ElISA, n faza solid, pentru numrarea Escherichia coli productoare de lT din alimente, metoda
92

asigurnd detectarea bacteriei i n cazurile cnd aceasta reprezint 1 din totalul microflorei prezente n aliment. Nu exist nici o metod pe deplin fidel pentru detectarea direct a EPEC n alimente.

2.12. detectarea Escherichia coli O157:h7 din fecale i alimente

datorit semnificaiei patogene pronunate s-au pus la punct o serie de metode eficiente pentru detectarea acestei bacterii din fecale i alimente, din care menionm: 5 Strierea direct a fecalelor pe suprafaa agarului mac Conkey cu sorbitol. dup o incubare de 24 de ore la 35-37C sau la 42C, coloniile sorbitol negative (incolore) se transfer pe suprafaa agarului nutritiv nclinat, iar cultura obinut se supune seroaglutinrii rapide pe lam cu ser anti o157. dac aceast reacie este pozitiv se execut i reacia de seroaglutinare rapid pe lam cu ser anti h7. dac cele dou reacii sunt pozitive se apreciaz c bacteria izolat este Escherichia coli o157:h7. Pentru a uura recunoaterea coloniilor specifice dezvoltate pe suprafaa agarului mac Conkey cu sorbitol, la acest mediu se adaug 5 bromo-4 cloro-3 indolil--d-galactopiranosid de sodiu (BCIG) sau ortonitrofenil-galactopiranosid (oNPG) pentru punerea n eviden a -galactozidazei i 4-metilumbelifenyl--d-glucuronid (muG) pentru evidenierea glucuronidazei. Escherichia coli o157:h7 nu elaboreaz -galactozidaz i, deci, nu descompune substratul specific, iar colonia va fi incolor; de asemenea ea nu elaboreaz -d-glucuronidaz i deci nu hidrolizeaz indicatorul (muG), formnd colonii nefluorescente. metoda strierii directe pe agarul mac Conkey cu sorbitol este eficient pentru examinarea fecalelor de la pacienii n faz acut, dar nu i pentru alimente, n care numrul acestei bacterii fa de cel al microflorei de asociaie este foarte mic. 5 detectarea toxinelor Shiga-like direct din fecale sau din filtratele culturilor obinute se folosete n prezent n unele laboratoare. 5 Izolarea Escherichia coli o157:h7 din alimente este mult mai dificil din cauza numrului mic. dat fiind doza minim infectant, extrem de redus, specialitii americani accept folosirea numai a metodelor foarte sensibile, capabile s detecteze bacteria i din alimentele contaminate cu 3 celule bacteriene/g produs. n acest scop s-au pus la punct mai multe metode de lucru, care
93

includ o faz de mbogire, una de izolare selectiv i alta de identificare i confirmare. Pentru faza de mbogire se folosete bulion Escherichia coli modificat + novobiocin, pentru izolare, agarul mac Conkey cu sorbitol, BCIG i muG, iar pentru identificare i confirmare producerea de indol, mobilitatea, seroaglutinarea cu ser anti o157 i ser anti h7. n scopul sporirii posibilitilor de izolare a bacteriei din alimentele congelate, unii autori au folosit pentru prembogire un bulion Escherichia coli modificat, fr sruri biliare, incubat 2 ore la 25C i apoi mbogirea selectiv la 42C, timp de 18 ore, n mediu cu sruri biliare i novobiocin. deasemenea, ali cercettori au preparat o variant a agarului mac Conkey cu sorbitol, cu cefixin i telurit (CT-SmAC), prin adugarea salicinei i a 4 metilumbeliferil--galactopiranosidei. Acest mediu modificat s-a notat cu iniialele CT-SSmAC. din 101 tulpini de bacterii non-Escherichia coli, izolate de pe ridichi i care pe mediul CT-SmAC formau colonii incolore, ca i Escherichia coli o157:h7, 92 (91%) formau colonii roz-roii sau -galactozidaz negative i fr culoare pe CT-SSmAC. Coloniile de Escherichia coli o157h7 pe CT-SSmAC sunt incolore i -galactozidaz pozitive. deci, mediul CT-SSmAC s-a dovedit mai selectiv dect CTSmAC pentru Escherichia coli o157h7. Pentru a mri sensibilitatea metodei i a reduce timpul de analiz se aplic diferite tehnici intermediare, cum sunt separarea imuno-magnetic, imuno-captarea (TECRA) i altele. 5 folosirea testelor imunologice i imunoenzimatice: tratarea coloniilor transferate pe membrane de nitroceluloz, cu ser anti o157 conjugat cu fosfataz alcalin, latex-aglutinarea, ElISA (EhEC-Teck; Petrifilm kithEC). detectarea verotoxinelor (VT) are o foarte mare valoare, deoarece ntr-un substrat nu poate exista bacteria fr a nu fi prezent verotoxina liber. Verotoxina poate fi prezent, fr a se putea izola bacteria. din aceast cauz se acord mare importan metodelor de detectare a verotoxinelor din diferite substraturi (fecale, alimente, culturi). menionm cteva dintre acestea: o testarea efectului citotoxic al VT pe linia celular Vero; o tehnici ElISA; o folosirea sondelor sintetice oligonucleotidice pentru detectarea genelor care codific VT; o folosirea PCR.
94

Tabelul 2.7 metode de identificare a patotipurilor diareigene de Escherichia coli (dup Negu m., 1999) Metode in vitro Metode in ncadrare n Efect Metode Metode vivo serogr. citopatogen genetice imunologice iepure: - ans ligat. - factorul de perm. cut.; oarece nou nscut: - inoculare intragastric amplificare genic (PCR); efect citopatodetectarea genei gen pe celule: toxinei termola- Cho (globubile lTI (lt I); lizare); detectarea genei - Y1 (picnoz) toxinei termostabile ST (st I) amplificare genic (PCR): efect citopatodetectarea genegen pe celule lor SLT (slt IB): Vero; leziuni - direct n scaun de tipul A-E a eae A; (aderen, - n colonii tergere a izolate pe agar microvililor) mac Conkey cu sorbitol pentru lTi: - latex aglutinare; - ElISA; - Imunodifuzie (testul Biken); pentru ST: - ElISA latex aglutinare i ElISA pt. detectarea separat a toxi-nelor: - SlT 1; - SlT 2; seroneutralizarea efectului citotoxic pe celule Vero

Patotipul

neconcludent pentru incadrarea n patotip

ETEC

purcel: enterocolit hemoragic letal

ser 0157:h7 (aglutinare; coaglutinare; latex aglutinare)

EhEC

cobai: inoculare n sacul conjunctival (testul Sereny)

aglutinare/ latex aglutinare cu seruri polivalente i monovalente: 28, 29, 124, 136, 143, 144, 152, 164, 167 aglutinare cu seruri polivalente i monova-lente oK: 26, 55, 86, 111, 114, 119, 125, 126, 127, 128, 142, 158

efect citopatogen pe celule hela: dezvoltare intracelular

amplificare genic (PCR): detectarea genei ipa H

EIEC

efect citopatogen pe celule: hep-2: aderen difuz i leziuni de tip A-E (aderen, tergere a microvililor); hela: ibidem 95

amplificare genic (PCT): detectarea operonului alfa; detectarea genei eae A

EPEC

Episoade de infecie cu ECVT asociate serotipurilor o157:h7 au fost nregistrate n cel puin 14 ri din ase continente. Alte serotipuri ECVT care au fost implicate n episoadele de infecie cu Escherichia coli o157:h7 au indus o111, o145:Nm i o104:h21. n una dintre cele mai mari epidemii produs de Escherichia coli o157:h7 din America de Nord, aproximativ 500 de cazuri au fost nregistrate n statele Washington, Idaho, California i Nevada. un episod care se pare ca a implicat mii de cazuri, s-a petrecut n sudul Africii n 1992. n 1996, o epidemie produs de Escherichia coli o157:h7 n Scoia afectnd mai mult de 400 de persoane a fost legat de consumul produselor de carne la un mcelar local i a fost asociat cu 151 de spitalizri i 18 decese (afectnd pacienii n vrst). de asemenea, n 1996 s-a nregistrat un episod masiv al acestei infecii presupus a fi de origine alimentar, n Japonia, care a afectat 6309 copii de vrst colar (19,4%) din 62 de coli elementare. la 102 copii a fost nregistrat Suh, iar trei copii au decedat. n general, n episoadele de infecie cu Escherichia coli o157:h7 ratele de atac au variat de la 0,1 la 71%, iar locurile de izbucnire au inclus restaurantele, azilele, creele, penitenciarele i casele personale. Izolri sporadice de ECVT, de obicei Escherichia coli o157:h7 din cazuri de diaree sangvinolent sau Suh, au fost nregistrate n mai multe ri. majoritatea studiilor s-au concentrat asupra incidenei serotipului o157:h7 deoarece metodele de decelare pentru serotipurile non o157 nu sunt n uzul curent. ntr-un studiu prospectiv important, efectuat pe 2 ani de ctre Alberta, Pai i colaboratorii, care a inclus peste 5.000 de cazuri de diaree, prezentate n spitalele din Calgary, n 1988, a izolat ECVT (n majoritate serotipul o157:h7) la 3,7% din pacieni, comparativ cu Salmonella spp. la 2,7% i Campylobacter spp. la 2,0%. n alte studii, serotipul o157:h7 a fost izolat la 0,6-2,5 din probele de fecale examinate, de obicei reprezentnd a doua sau a treia bacterie patogen frecvent izolat. frecvena de izolare din probele de fecale sangvinolente a variat ntre 15-37%. n Europa i America de Nord numrul de cazuri crete n lunile de var, fapt care poate fi corelat unei combinaii de factori, cum ar fi consumul crescut de hamburgeri, incidena mai mare a ECVT la vaci i ncrctura bacterian mai mare n carnea tocat.
96

Vrful de frecven corelat cu vrsta a diareei asociate cu ECVT i Suh este la copiii mici. Principala complicaie a infeciei ECVT este Suh, care a fost nregistrat cu o frecven de aproximativ 8% n mai multe episoade de infecie cu Escherichia coli o157:h7, dei ntr-un episod care a afectat pacienii mai n vrst dintr-un azil, aceast frecven s-a situat la 22%. frecvena cazurilor sporadice de Suh n America de Nord este de aproximativ 2-3 cazuri la 100.000 de copii cu vrsta pn la 5 ani, n contrast cu incidena de aproape 10 ori mai mare la acest grup de vrst n Argentina. n Africa de Sud, Suh pare s fie mai frecvent la copiii albi, dect la cei de culoare. n Anglia, sindromul pare mai frecvent n zonele rurale, dect n cele urbane. Cazurile acestor diferene regionale i/sau socioculturale rmn a fi stabilite. factorii de risc majori pentru contactarea infeciei cu ECVT sunt ingestia alimentelor sau a apei contaminate i contactul strns cu indivizii afectai. factorii de risc pentru dezvoltarea unei boli severe de tipul Suh includ vrsta (foarte tineri sau btrni), gastrectomia anterioar, probabil mrimea inoculului i posibila utilizare recent de antibiotic. factorii de gazd de tipul imunitii preexistente antitoxice sau antibacteriene, distribuia receptorilor i fenotipul antigenic P al hematiilor, pot determina, de asemenea, natura i severitatea bolii, la fel cum le pot determina i factorii bacterieni, fenotipul toxinic i factorii de colonizare. Sunt necesare studii ulterioare pentru descrierea determinanilor bolii i a gravitii acesteia. Bovinele sunt, probabil, principalul rezervor animal pentru tulpinile ECVT implicate n boala de la om, iar alimentele de origine bovin (n special pateurile cu carne tocat de vit semigtit i laptele nepasteurizat) constituie sursele majore ale infeciei la om. Episoade asociate consumului de cidru, proaspt preparat au fost probabil corelate cu utilizarea merelor contaminate cu fecale bovine. un caz de infecie cu Escherichia coli o157:h7 la un lactovegetarian a fost presupus a se datora consumului de vegetale dintr-o grdin fertilizat cu fecale bovine. Alte alimente care au servit ca vehicul pentru infecia cu ECVT (fie ca surse primare, fie n urma contaminrii de la o surs primar) includ friptura de vit, apa, tartinele reci (curcan, unc i/sau brnz), cartofii cruzi i iaurtul.
97

dovezi ale contaminrii cu ECVT a arjelor de carne tocat din magazine au fost nregistrate n America de Nord i Thailanda i au variat de la 9 la 36,4% din probele testate, cu o frecven de izolare a microorganismului de 5-10% (toate serotipurile) sau de 0-3,7% (o157:h7). mai mult, n aceleai studii, ECVT au fost decelate n carnea de porc (1-10,6%), pui (0-1,5%) i miel (2%), cu o frecven de izolare a Escherichia coli o157:h7 de 0-1,5%, 0-1,5% i respectiv 2%. Nu este clar dac prezena ECVT n alimentele de alt origine dect cea bovin reprezint starea de purttor a acestor specii i/sau contaminarea de la sursele bovine n timpul prelucrrii. ECVT au fost decelate de asemenea, la 1% din filtrele de lapte. o dat cu recunoaterea faptului c infecia ECVT se transmite de la individ la individ, persoanele infectate constituie n mod clar o alt surs major de infecie ECVT. Infecia poate fi contractat prin contactul cu animalele infectate, oamenii infectai i consumul alimentelor sau a apei contaminate. A fost nregistrat i un caz de infecie n laborator contractat de un tehnician. frecvena relativ nalt a transmiterii infeciei cu Escherichia coli o157 de la persoan la persoan, demonstrat n studii de familie, sugereaz c doza infectant a acestui serotip este foarte mic, probabil chiar mai mic de 100 de microorganisme. Acest fapt mrete importana procedurilor de prevenire i combatere stricte ale infeciei n spitale i n alte instituii. Sunt disponibile cteva metode pentru subtipizarea tulpinilor de Escherichia coli o157 care s uureze studiile epidemiologice, metode care includ biotipizarea, tipizarea fagic, profilul plasmidic i polimorfismul de restricie cromozomal (RflP).

2.13. Infeciile naturale la animale

Se numesc colibaciloze i prezint urmtoarele trsturi caracteristice. Gravitatea infeciilor colibacilare este influenat de specie, vrst i starea imunologic, precum i de nsuirile tulpinii de colibacili infectani, putnd mbrca una din urmtoarele forme de exprimare anatomoclinic: enterita colibacilar (diareea colibacilar, colibaciloza enteric, colibaciloza enterotoxic); enterotoxiemia colibacilar (boala edemelor, colienterotoxiemia); septicemia colibacilar; mamita colibacilar; coligranulomatoza (granulomul lui hyarre).
98

Colibaciloza vieilor Poate evolua ca enterit colibacilar (diaree colibacilar) sau ca septicemie colibacilar. Tulpinile de Escherichia coli care produc enterita colibacilar aparin serogrupelor o8, o9, o101, o15, o115, dau pe medii glucozate colonii mucoide, produc enterotoxine, posed antigenul A i l (ca factori de adeziune), K99 sau f4. n etiologia septicemiei colibacilare, cel mai frecvent raportat, n toate rile este o78, urmat de o15, o111 i o115. Enteritele colibacilare reprezint rezultatul aciunii colibacililor aparinnd fie patotipului ETEC (cel mai frecvent), fie patotipului EPEC, EhEC sau EIEC. n cazul lui ETEC i EPEC sunt prezente adezinele fimbriale f5 (mai frecvent) fie adezinele f6, f41, f17 (rar). n cazul colibacilozei septicemice, principalul factor de patogenitate l reprezint endotoxinele, care dup ce se multiplic intravascular, genereaz ocul endotoxic. Colibaciloza purceilor Se manifest sub urmtoarele forme: diareea colibacilar (dC) sau enterita colibacilar (EC) sau colibaciloza enterotoxic ntlnit la purcei n primele zile de via, fiind cea mai frecvent i pgubitoare form. Cele mai multe tulpini enterotoxigene izolate de la purcei posed adezinele fimbriale f4 (K88) i, mai rar f5 (K99), f6 (987) sau f41 i aparin serogrupurilor somatice o141, o147, o149, o157, o8, o9, o138, o64, o10, o15 i altele. o parte dintre acestea elaboreaz, n afara enterotoxinelor ST i lT i verotoxinele care, de obicei nu posed adezine fimbriale. diareea de nrcare (dI) apare n creterea intensiv, n primele zile dup constituirea loturilor de tineret; septicemia colibacilar (SC) apare la purceii sugari, dar n proporie mai mic dect dC; enterotoxiemia colibacilar, numit i boala edemelor (B.E.). de la purceii cu B.E. se izoleaz, de regul, tulpini de Escherichia coli hemolitice, care aparin serotipurilor o138 K81, o139 K82, o141 K85, care posed adezine i au capacitatea de a produce verotoxine.
99

datorit similitii (dar nu identitii) cu verotoxina produs de Shigella dysenteriae, la om, verotoxina produs de tulpinile de Escherichia coli izolate din B.E. se mai numete i Shiga-like. infecii cu localizare extraintestinal: mamita colibacilar, relativ rar ntlnit la vaci i scroafe i ocup ca frecven, locul trei dup mamitele streptococice i stafilococice. Colibaciloza psrilor Escherichia coli produce colisepticemia (CS) i coligranulomatoza (CG). Au fost izolate i identificate din colisepticemia aviar peste 60 de serotipuri, cele mai frecvente fiind: o2, o1, o8, o15, o3, o18, o22, o23, o73, o109, o17, o119, o139, o141, o165. Au fost recunoscui ca factori de virulen la tulpinile de Escherichia coli patogene pentru psri adezinele fimbriale f1 (active n tractusul respirator) i P (active n viscere), antigenul capsular K1 i indirect sistemul fe-dependent.

2.14. Infecii cu Escherichia coli la om

Infecia ECVT este asociat unui spectru larg de manifestri clinice, care include: colita hemoragic; sindromul uremic hemolitic (Suh). Colita hemoragic (colita ischemic). Se caracterizeaz prin apariia brusc a crampelor abdominale severe, urmate n cteva ore de diaree apoas. Pacienii pot prezenta grea, dar voma nu este caracteristic. diareea apoas progreseaz rapid spre faza caracterizat de eliminare sanguinolent profuz, asemntoare hemoragiei intestinale inferioare. febra este absent sau de mic intensitate. Coninutul n leucocite, din snge poate fi crescut, cu o uoar deviere spre stnga. Boala este, de obicei, autolimitant i dispare n decurs de o sptmn. forma mai grav poate fi complicat de constricia intestinal. Sindromul uremic hemolitic (SUh). Suh este definit de o triad de simptome: insuficien renal acut, trombocitopenia i anemia hemolitic microangiopatic. Cea mai comun form de Suh este cea clasic sau d + (asociat
100

diareei), care are cea mai nalt inciden la copii. de obicei, se manifest n cteva zile de la declanare, printr-o diaree acut prodromal, care este frecvent sanguinolent, cu trsturi indistincte de cele din colita hemoragic. Suh clasic rmne cauza major a insuficienei renale acute la copii. Se pot ntlni complicaii grave, ca rezultat al bolii microangiopatice de la nivelul altor sisteme organice, cum ar fi sistemul nervos (SNC), cordul, pulmonul i pancreasul. Suh clasic i/sau Suh asociat ECVT, cu manifestri predominant nervoase este frecvent denumit purpura trombotic trombocitopenic (PTT). Suh reprezint de asemenea complicaia major a dizenteriei Shiga, asociat cu Shigella dysenteriae, tipul 1. factorul responsabil n geneza Suh, aprut att n urma infeciei ECVT ct i a dizenteriei Shiga este probabil aceeai exotoxin proteic, denumit VT1 sau Shiga toxin (toxin Shiga), care este elaborat att de ECVT, ct i de Shigella dysenteriae tipul 1. la majoritatea pacienilor cu diaree i colit hemoragic, asociate ECVT, boala este autolimitant, iar recuperarea total se obine prin msuri generale de susinere. Suh nregistreaz, de obicei, o rat a fatalitii cazurilor de aproximativ 50%. Terapia intravenoas cu imunoglobuline a fost benefic n cazul unor copii cu Suh, dei bazele acestui efect rmn a fi elucidate.

2.15. Toxiinfecii alimentare produse de Escherichia coli

Tulpina prototip pentru sindroamele de mai jos este E. coli 0157 :h7. Tipul h7 a fost izolat iniial n 1944 la un om cu diaree, n timp ce tipul 0157 a fost izolat si definit 1972 din fecalele de la porci cu diaree. Tulpina 0157:h7 a fost pentru prima dat identificat n 1975 la un pacient cu diaree sangvinolent. Tulpinile producatoare de Stx de E.coli au fost identificate n 1977 n SuA i Canada. huS este cauza de tulpini de E. coli producatoare de Stx. S-a estimat c 2 pan la 7% din infeciile cauzate de E.coli 0157 :h7 vor produce huS. Acesta const n anemie hemolitic, trombocitopenie i insuficiena renal acut. Cu toate c nu a fost legat direct de tulpinile EmEC pan n 1985, huS a fost pentru prima dat descris n 1975. ntr-un studiu german asupra perioadei de eliminare a tulpinii E. coli 157:h7 la 53 de copii cei 28 de copii care aveau diaree hC au eliminat
101

microorganismul ntre 2 i 62 de zile (media de 13 zile), n timp ce ceilali 25 care au contactat huS au eliminat germenii ntre 5-124 de zile (media de 21 de zile). huS este asociat mai mult cu tulpinile care produc Stx2 dect cu cele care produc Stx1 sau ambele toxine. ntr-un studiu efectuat n Anglia n perioada 1989-1991, 15% din 1275 de indivizi de la care au fost izolate culturi pozitive EhEC au facut huS. Colita hemoragic (hC) ca boal de origine alimentar a aparut pentru prima dat n 1982 n oregon i michigan, unde n ambele cazuri victimele au consumat sandwichuri de la un fast-food care coninea carne de vit gatit necorespunzator. Toti cei 43 de pacieni au avut diaree sangvinolent i crampe abdominale severe, 63% manifestnd grea, 49% vom i doar 7% febr. n alte epdemii, perioada de incubaie a variat ntre 3 i 8 zile. Scaunul sngeriu reprezint simptomul caracteristic bolii i reflect implicarea agentului etiologic n colon. febra apare rar, iar doza infectioas se pare c este de doar 10 ufc. Prima epidemie datorat altor toxine STx dect cele produse de E.coli 0157 :h7 n uS (din 1994) a fost serotipul 014:h21. Sursa a fost reprezentat de laptele pasteurizat contaminat. Serotipul 0111:Nm a fost izolat n Australia de sud (1995) din crnai semiuscai fermentai. n 1992 n Italia acelai serotip a produs pentru prima dat tulpini producatoare de Stx asociate cu huS, iar moartea a avut loc la 1 din 9 copii. n Japonia, au fost 29 de epidemii cu E. coli 0157 :h7 ntre 19911995. n 1996 au fost 11826 de cazuri de gastroenterite cu 12 mori cauzate de E. coli 0157 :h7. Prevenirea: Trebuie luate msuri speciale datorit consecinelor pe care boala le poate avea asupra copiilor mici. msurile de prevenire trebuie ndreptate n primul rnd asupra toxiinfecilor alimentare produse la copii mici i a consecinelor pe care boala le poate produce asupra acestora. Aceti germeni sunt foarte sensibili la temperatura iar gastroenteritele nu ar trebui s apar dac mncarea ar fi gatit corespunzator. Se recomand n cazul crnii de vit ca mncarea s fie gatit la 71oC sau ca temperatura intern s fie de minimum 58,3oC pentru cel puin 15 secunde. Cu toate c cea mai mare epidemie a fost asociat cu carnea de vit, toate crnurile crude de pui, unele fructe i legume ar trebui considerate ca posibile vehicule ale colitelor hemoragice. diareea cltorului (Travelers diarrhea) Escherichia coli reprezint principala cauz a acestei boli. Printre voluntarii Peace Corps din Thailanda rural, 57% din 35 au
102

manifestat sindromul n timpul primelor 5 sptmni n ar i 50% au manifestat evident simptomele infeciei cu tulpini ETEC. n 1976 a fost raportat o epidemie pe un vas de croazier, cauzat de serotipul o25:K98:Nm productoare de lT. Alte microorganisme asociate cu acest sindrom sunt rotavirusurile, novovirusurile, Entamoeba histolytica, Yersinia enterocolitica, Giardia lamdia, Campylobacter jejuni/coli, Shigella spp., Aeromonas hydrophila, Klebsiella pneumoniae i Enterobacter cloacae.

2.16. Strategii de prevenire i combatere

marele episod ECVT nregistrat n mai multe state din vestul SuA n cursul anului 1992 a devenit punctul pivot n regndirea programelor de siguran alimentar, n lumea ntreag. S-a impus necesitatea unor strategii de siguran alimentar integrat, care s implice toate verigile lanului alimentar de la ferm la mas. Sistemele care se concentreaz, n special la nivelul prelucrrii, comercializrii i al consumatorului pot fi inadecvate, fr considerarea sectorului din amonte, incluznd informaii asupra strii de sntate a efectivelor i a fiecrui animal. Prevenirea expunerii bovinelor la ECVT n ferm ar genera o scdere considerabil a numrului de animale care transport ECVT n abatoare i, deci, o reducere a contaminrii produselor din carne. Testarea prezenei ECVT n fecalele bovinelor naintea comercializrii lor i reinerea acestora pn cnd nceteaz s mai elimine aceste bacterii reprezint una dintre opiunile de combatere, dar trebuie depit costul operaiunii i este necesar acordul prilor interesate. Tratarea vitelor infectate, cu antibiotice, nu este eficient financiar i poate genera dezvoltarea bacteriilor rezistente (ECVT i altele). Vaccinarea bovinelor pentru reducerea colonizrii intestinale cu ECVT ar putea fi luat n studiu. la abator, contaminarea crnii se poate produce atunci cnd coninutul intestinal sau materiile fecale vin n contact cu suprafeele acesteia. Gradul de contaminare poate fi mrit n timpul operaiilor de dezosare i tocare. orientarea actual pentru sisteme concentrate n sectorul de prelucrare alimentar i distribuie rapid a generat laboratoare care produc un milion de hamburgeri pe zi, cu distribuire n zone geografice mari. Acest fapt poate genera mari episoade, atunci cnd se aplic proceduri improprii de preparare sau manipulare la nivelul comercializrii sau al consumatorului. Pe de alt parte, o astfel de concentrare de volum poate facilita implementarea
103

strategiilor de control de tipul programelor hACCP (hazard Analisys Critical Control Points Analiza riscului n punctele de control critice), care pot asigura producii de mare volum de hran de calitate nalt i sigur. Este deosebit de important prevenirea transmiterii la nivelul preparrii alimentelor prin manipulare i tratare termic adecvate. Asocierea strns a infeciei cu ECVT i carnea tocat, spre deosebire de carnea de vit tranat se datoreaz probabil diferenelor de prelucrare. Atunci cnd carnea de vit tranat are suprafeele contaminate, microorganismele pot fi distruse uor prin gtit. n pateurile cu carne tocat, totui, microorganismul se afl amestecat n carne i realizarea unor temperaturi interne de distrugere i timpul de gtire devin foarte importante n reducerea riscului de infecie. o dat preparat, orice surplus rmas trebuie imediat refrigerat sau congelat. n plus, minile i orice material care a venit n contact cu carnea crud (cuite, ustensile) trebuie splate cu ap fierbinte i detergent i s nu intre n contact cu orice alt aliment crud. datorit dovezilor tot mai abundente privind transmiterea infeciei cu ECVT de la o persoan la alta sunt necesare proceduri eficiente de prevenire i combatere, a acesteia n spitale, cmine i alte instituii. dezvoltarea i implementarea tehnicilor de diagnostic rapid, vor conduce la recunoaterea din timp a infeciei cu ECVT i, astfel, vor putea fi aplicate, la timp, msuri de control pentru sntatea public. dou posibile opiuni includ utilizarea vaccinurilor pentru prevenirea colonizrii cu ECVT a mucoasei intestinale i utilizarea toxoizilor sau a componentelor subunitare ale holotoxinelor pentru elucidarea consecinelor toxiemiei VT sistemice. Natura factorilor de colonizare i produii poteniali ai genei eae, aa cum este intimina, sunt nelese de abia acum, iar cunoaterea rspunsurilor locale sau sistemice n anticorpi fa de aceste proteine este nc limitat. n urma infeciei cu tulpini ECVT care exprim una sau mai multe toxine, numai unele persoane dezvolt anticorpi fa de VT1, n timp ce rspunsurile imune specifice fa de VT2 i VT2c par s fie foarte rare. motivul naturii inconsecvente a rspunsului seric antitoxic la pacienii cu infecie ECVT productoare de VT1 rmne s fie elucidat. Explicaiile posibile includ: stimulul antigenic sczut, datorat unei toxine cu activitate biologic nalt; efectul imunosupresor al toxinei, cunoscut ca fiind in vitro citotoxic pentru limfocitele B; limitarea rspunsului imun la indivizii cu genotipuri specifice clasei
104

II a complexului major de histocompatibilitate; epitopii moleculei VT1, fa de care are loc un rspuns imun mai consecvent in vivo, probabil nu au fost expui adecvat n testul utilizat. Absena rspunsului serologic nu exclude n mod necesar capacitatea de inducere a proteciei dup imunizarea cu toxoid. Toxoidul VT1, i componenii subunitii B-VT1 s-au dovedit a induce imunitate protectoare la animalele de laborator. n domeniul veterinar mac leod i Gyles (1991) au fost capabili s protejeze purceii fa de testul de control cu VT2e purificat, att prin imunizare pasiv cu anticorpi neutralizani, ct i prin imunizare activ cu toxoidul VT2e. Programele de inspecie a crnii din ntreaga lume sunt n revizuire i supuse unei schimbri de la o metod bazat pe metode organoleptice la implementarea analizei de risc hACCP i a altor strategii cu accent pe gestiunea total a calitii. Integrarea sectorului zootehnic n programele de siguran alimentar va genera probabil extinderea metodei de analiz a riscului hACCP i la nivelul fermei. Pe plan internaional, sistemele de control ale crnii sunt sub presiunea tot mai mare a comerului pentru a corespunde standardelor internaionale de tipul seriilor ISo 9000. n multe ri reglementrile de sntate public indic temperaturile minime de preparare care trebuie respectate i practicile de igien alimentar care s asigure alimentele gata de consum de la nivelul vnzrii cu amnuntul. Alte metode de control propuse, includ utilizarea compuilor chimici sau iradierea pentru scderea sau eliminarea ncrcturii microbiene din produsele de carne. detergenii de tipul fosfatului trisodic s-au dovedit a fi promitori n scderea numrului de coliformi de la nivelul carcaselor i sunt deja acreditai ca mijloace de prelucrare n anumite ri. un alt mijloc de reducere a ncrcturii microbiene este -iradierea. Acest procedeu s-a dovedit a reduce eficient ECVT din hamburgeri i nu pare s aib efecte adverse asupra produsului. Comercializarea recent a puilor iradiai n Statele unite ale Americii a demonstrat schimbarea de atitudine a consumatorilor i faptul c iradierea poate fi o metod util pentru reducerea contaminrii cu ECVT a alimentelor comercializate cu amnuntul. Aceste dezvoltri cuplate cu programele de educaie public privind manipularea adecvat a alimentelor i tehnicile de preparare vor avea un
105

efect pozitiv n reducerea gradului de expunere a populaiei la ECVT prin alimente contaminate. n anumite ri sunt implementate programe de control pentru ECVT la nivel de ferm, n special pentru o157:h7. n multe ri, comercializarea laptelui nepasteurizat este ilegal, ceea ce reprezint o msur eficace pentru reducerea episoadelor ECVT datorate laptelui. de asemenea, n multe state s-au stabilit reglementri privind standardele temperaturilor interne de preparare, care trebuie atinse n alimente i msurile sanitare de la nivelul comercializrii, care adecvat realizate, constituie bariere importante pentru infecia nregistrat la om. Supravegherea sntii publice privind infecia cu ECVT poate juca un rol major n conturarea i implementarea msurilor de control. n timp ce, n unele ri, raportarea ctre autoriti a cazurilor umane de infecie cu ECVT (sau doar de infecie cu o157:h7) este obligatorie, n alte ri ea nu este. Raportarea consecvent n toate rile poate fi o contribuie esenial la supravegherea internaional i la conturarea unor strategii de prevenire i combatere globale.

2.17. metode de izolare i identificare a lui

Escherichia coli din alimente Tehnica de lucru: determinarea prezenei i a numrului de bacterii coliforme se poate efectua att n medii lichide ct i pe medii solide, de izolare selectiv (fr mbogire). 1. Se cntresc 50 g de prob ntr-un blender de nalt vitez. Se adaug 450 ml de fosfat tampon Butterfield i se omogenizeaz 2 minute la 10.000-12.000 rot/min. Astfel se obine diluia 10-1. 2. Toate diluiile zecimale se pregtesc cu 90 ml diluant + 10 ml din diluia anterioar. diluiile pregtite depind de densitatea anticipat a coliformilor. Se omogenizeaz bine fiecare diluie. 3. Pentru testul prezumptiv se transfer cte 1 ml din fiecare diluie n cte 3 tuburi per diluie cu bulion lT (lauril-triptoz). Pipeta se ine n aa fel nct marginea sa inferioar s fie sprijinit de tub. 4. Se incubeaz tuburile 24-48 de ore, la 35C. Se examineaz la 24 de ore pentru producia de gaz n tubul durham. 5. Se reincubeaz tuburile negative nc 24 de ore i se examineaz pentru a doua oar pentru producia de gaz.
106

6. Se efectueaz testul de confirmare pe toate tuburile prezumptiv pozitive (productoare de gaz). Se consider c bacteriile coliforme sunt prezente dac se observ att dezvoltarea bacterian ct i apariia gazelor n tubul de fermentare, iar n urma coloraiei Gram, la examinarea frotiului apar exclusiv bacili sau cocobacili Gram negativi. n acest caz, n funcie de diluiile pozitive se raporteaz prezena sau absena coliformilor la o anumit cantitate de produs. de exemplu: s-au confirmat bacterii coliforme n diluiile 10-1, 10-2. Aceasta denot c bacteriile coliforme sunt prezente n 0,01 g prob, dar sunt absente n 0,001 g de prob. Testul de confirmare pentru coliformii totali 1. Se agit uor fiecare tub cu mediul lT (lauril-triptoz), care elibereaz gaze i se transfer o ans din suspensie ntr-un tub cu mediu BGB (bulion cu bil verde-briliant 2%). 2. Se incubeaz tubul BGB 48 de ore la 35C. 3. Se examineaz pentru producia de gaz i se nregistreaz. 4. Se consider reacie pozitiv atunci cnd prezena gazelor apare n cel puin 1/10 din nlimea tubului durham. 5. Se calculeaz numrul cel mai probabil de germeni (mPN = most probable number) pe baza combinaiei unor tuburi lT (m47), cu eliberare de gaze confirmate de-a lungul a trei diluii consecutive. n funcie de numrul de eprubete pozitive, din fiecare diluie se raporteaz mPN per gram (ml) produs, conform tabelului mc Crady. de exemplu: dac s-au confirmat bacterii coliforme n 3 eprubete cu diluia 10-1, n dou eprubete cu diluia 10-2, i n dou eprubete cu diluia 10-3, se va obine combinaia de 3 cifre 322, n dreptul creia se va citi din tabelul mc Crady mPN-ul. Testul de confirmare pentru coliformii fecali 1. Se agit uor fiecare tub lT care elibereaz gaze i se transfer o ans din fiecare suspensie n tubul cu mediu EC. 2. Tubul cu mediul EC se incubeaz 48 de ore la 45,5C. Examinarea produciei de gaz se face dup 24 de ore, iar dac testul este negativ se examineaz din nou dup 48 de ore. 3. Se calculeaz mPN pentru coliformii fecali pe baza proporiei tuburilor confirmate productoare de gaz pe mediul EC, pentru 3 diluii consecutive.
107

Testul de confirmare pentru Escherichia coli Se aplic o ans de suspensie din fiecare tub eliberator de gaz, cu mediul EC pe agar l-EmB (levine eozin albastru de metilen) (m 49). Se incubeaz plcile timp de 18-24 de ore la 35C. Se examineaz coloniile, iar cele tipice pentru Escherichia coli au centrul ntunecat i suprafaa cu sau fr luciu metalic. Se transfer 2 colonii tipice din fiecare plac cu agar l-EmB pe pante PCA (plate count agar) (m 8) pentru testele morfologice i biochimice. Se incubeaz mediul nsmnat 18-24 de ore la 35C. Se recolteaz 2 colonii din fiecare plac. Se efectueaz coloraia Gram din fiecare cultur. Pentru toate culturile Gram negative cu bacili scuri sau cocobacili se urmrete n continuare: producia de indol; testul Voges-Proskauer; testul roului metil, producia de gaz din lactoz. Interpretarea reaciei: toate culturile care fermenteaz lactoza cu producie de gaz n 48 de ore la 35C; sunt bacili sau cocobacili Gram negativi asporogeni; i dau tipuri de ImViC de ++-- (biotipul 1) sau -+-biotipul 2 sunt considerate a fi Escherichia coli. Se calculeaz mPN pe baza proporiei de tuburi cu mediu EC n 3 diluii succesive care s-au dovedit a fi Escherichia coli. metoda mUg pentru numrarea rapid a lui Escherichia coli din alimente refrigerate sau congelate Acest test se bazeaz pe determinarea glucuronidazei, enzim posedat de majoritatea tulpinilor de Escherichia coli spre deosebire de celelalte bacterii intestinale. Substratul muG (4-metilumbeliferil beta d-glucuronidaz) se ncorporeaz n bulionul lT. Tuburile inoculate se incubeaz n condiii specifice i se examineaz n lumina uV pentru prezena ca produs final a unei glucuronidaze fluorogene. fluorescena n mediul lT-muG (m 48) termolabil indic prezena lui Escherichia coli. Testul prezumptiv LT-mUg pentru Escherichia coli 1. Se prepar probele alimentare dup cum s-a descris la metoda convenional. 2. Se prepar diluii zecimale ca la metoda convenional. 3. Se inoculeaz 1 ml n trei tuburi lT-muG pentru fiecare diluie.
108

4. Se incubeaz tuburile 24 de ore la 35C i se examineaz: creterea, producia de gaz i fluorescena. fluorescena se examineaz la o lamp cu uV la ntuneric. dac aceasta este albstruie testul este pozitiv. Testul de confirmare a LT-mUg 1. din fiecare tub fluorescent, se nsmneaz prin striere o ans pe agar l-EmB i se incubeaz 24 de ore la 35C. 2. Interpretare: toate culturile care devin fluorescente n mediul lTmuG; fermenteaz lactoza cu producie de gaz n 48 de ore la 35C; apar ca bacili sau cocobacili Gram negativi asporogeni; dau tipurile ++-- (biotipul 1) sau -+-- (biotipul 2), sunt considerate a fi Escherichia coli. Izolarea i identificarea unor serotipuri de E. coli enteropatogene (enterotoxigene) din carne i preparate din carne ncrctura cu E. coli a crnii, ca materie prim (porc, vit), ca i a semi-preparatelor (salamuri, carne tocat, past de mici, slnin) i a tampoanelor de sanitaie recoltate de pe diverse utilaje sunt redate n tabelul 2.9., sub forma numrului de tulpini de E. coli. Acest studiu s-a efectuat n cadrul facultii de medicin Veterinar i a INCdmI Cantacuzino n perioada 2008-2009.
Tabelul 2.8. ncrctura cu E. coli a crnii i preparatelor din carne Probe nr. probe nr. de E. coli nEC/g Tampoane de pe utilaje 20 64,02 Carne de porc 17 27,12 Carne de vit 19 290,98 Slnin 5 0,22 Salamuri semiafumate finite 8 12,2 Carne tocat 4 65,1 Past de mici 12 355,4

din totalul de 85 de probe prelucrate s-au izolat 15 tulpini de E. coli. Rezultatele serologice referitoare la numrul de tulpini de E. coli izolate, ncadrabile i nencadrabile sunt redate n tabelul 2.9.
109

Tabelul 2.9 Sortiment Tampoane utilaje Carne de porc Carne de vit Slnin Salamuri semiafumate finite Carne tocat Past de mici Total nr. probe 20 17 19 5 8 4 12 85 Tulpini izolate nr. 5 2 1 0 3 1 6 18 % 25 11 5 0 37 25 50 21 Tulpini ncadrate serologic nr. 1 1 0 0 1 0 2 5 % 20 50 0 0 33 0 33 27 Tulpini nencadrate serologic nr. 4 1 1 0 2 1 4 13 % 80 50 100 0 66 100 66 72

datele privind structura antigenic a tulpinilor de E. coli izolate i principalele serogrupe identificate sunt prezentate n tabelul 2.10:
Tabelul 2.10 Principalele serogrupe de E. coli identificate n materia prim utilizat la prepararea mezelurilor, produselor finite i a unor semipreparate Serogrupe identificate Probe nr. tulpini izolate/ nr. tulpini ncadrate 07 nr 1 0 0 0 0 1 0 2 % 20 0 0 0 0 50 0 11 nr 1 0 0 0 0 0 0 1 08 % 20 0 0 0 0 0 0 5,5 nr 0 0 0 0 0 0 1 1 010 % 0 0 0 0 0 0 16,6 5,5 015 nr 0 0 0 0 0 1 0 1 % 0 0 0 0 0 100 0 5,5 nr 0 1 0 0 0 0 1 2 020 % 0 50 0 0 0 0 16,6 11

Tampoane utilaje Carne porc Carne vit Slnin Salamuri semiafumate finite Carne tocat Past mici Total

5/1 2/1 1/0 0/0 3/1 1/0 6/2 18/5

Aspectele legate de unii factori de patogenitate cercetai la tulpinile izolate sunt redate n tabelul 2.11.
110

Tabelul 2.11 Testarea patogenitii unor tulpini de E. coli izolate pe fluxul producerii mezelurilor i a unor semipreparate Tulpini Tulpini globule examinate pozitive roii Testul Obs. nr. % nr. % oaie/om 1=N Producia de hemolizine 85 100 2 23,52 1 = 010 RSAR 85 100 2 23,52 1 = N:K99 f41 Prezena fimbriilor latex aglutinare 1 1,17 1 = N: f41 Testul ansei ligaturate pentru ST/lT 5 100 0 0 (purcel sugar nrcat) Producia de h2S 85 100 10 11,76 N = tulpin nencadrat serologic

Valorile individuale ale parametrilor analizai (numrul de E. coli) variaz n limite largi, n funcie de prob, seria de probe i respectiv unitatea din care s-au recoltat probele. ncrctura cu E. coli (NEC/g) prezint urmtoarele valori: slnin (0,35), carne de porc n lucru (45,12), salamuri (32,5), tampoane de pe utilaje i mini personal (120,07). la restul probelor se constat valori cuprinse ntre 380,57-1234,5. din analiza acestor date se poate deduce faptul c materiile prime ajung la fabricile de prelucrare cu o anumit ncrctur bacterian dependent n principal de zestrea microbiologic a animalului nainte de sacrificare, condiii igienico-sanitare pe flux, condiii de pstrare a crnii dup sacrificarea animalelor, frecvena manipulrilor pe timpul pstrrii i, respectiv, condiiile igienice n timpul transportului. Se cunoate, de asemenea, c att carnea i, mai ales, semifabricatele i respectiv compoziia de umplere prin contactul cu minile lucrtorilor, cu utilajele de lucru, cu adaosul diferitelor ingrediente, i sporete ncrctura bacterian, aspect confirmat i de investigaiile noastre. Remarcm, de asemenea, rolul deosebit al proceselor de prelucrare termic (fierbere i afumare), care n condiiile cnd sunt bine efectuate, reduc ncrctura n bacterii E. coli la produsele finite (prospturi i salamuri semi-afumate), indiferent de ncrctura iniial a crnii i semifabricatelor. Acest aspect dorit att de productori ct i de controlorii de calitate a fost ntlnit pe ntreaga perioad a investigaiilor noastre. n condiiile noastre de lucru s-au preparat 15 seruri anticolibacilare o pentru 15 serogrupe. Examenul serologic al tulpinilor de E. coli izolate din materia prim, semifabricate, produse finite, unele semipreparate i tampoanele de sanitaie
111

ne-au permis ncadrarea serologic a unui procent de 18 tulpini din cele 85 de tulpini izolate. majoritatea sunt nencadrabile serologic 13 (72,22%), fapt datorat n principal marii variabiliti genetice a germenilor din familia Enterobacteriaceae, precum i din alte familii, aspect constatat i de ctre ali autori. dintre serogrupele identificate, menionm: o7 = 2 tulpini (11,11%), o8 = 1 tulpin (55,55%), o10 = 1 tulpin, o15 = 1 tulpin, o20 = 1 tulpin. Serogrupele o7 i o10 sunt recunoscute pe plan mondial ca avnd implicaii n patologia uman. Serogrupele o8, o15, o20 sunt implicate n patologia animal n septicemiile nou-nscuilor. Studiul factorilor de patogenitate prin reacia de seroaglutinare rapid (RSAR) i latex aglutinare, cu un kit fimbrirex K99, f41 ne-au permis evidenierea prezenei fimbriilor de tip f41 la o tulpin nencadrabil serologic, izolat din carnea tocat. datele din literatura de specialitate arat c tulpinile cu astfel de fimbrii sunt tot mai frecvent implicate n forma enteric de colibaciloz la viei, porci i miei. Studiul prezenei enterotoxinelor prin testul ansei ligaturate la purcelul sugar/nrcat a unui numr de 5 tulpini de E. coli nu a evideniat prezena enterotoxinelor termostabile (ST) sau a enterotoxinei termolabile (lT). Testarea activitii hemolitice ne-a permis identificarea a dou tulpini (23,52%), una nencadrabil, izolat din carnea de mici i una aparinnd serogrupei o10 izolat din salam. Activitatea de producere a hidrogenului sulfurat a fost identificat la 10 probe (11,76%) din cele 85 analizate i la 2 probe (23,52%) din tampoanele de pe utilaje i minile lucrtorilor. Tulpinile de E. coli productoare de h2S nu au fost identificate n produsele finite. Se cunoate c hidrogenul sulfurat determin o cretere a motilitii intestinale, putnd determina deranjamente gastro-intestinale, att la om, ct i la animale. din studiul efectuat n cadrul facultii de medicin Veterinar i INCdmI Cantacuzino s-au desprins urmtoarele concluzii: 1. Probele testate au fost reprezentate de carne de porc, vit, slnin, salamuri, carne tocat, past de mici, din diferite uniti de desfacere a acestora. 2. Pentru examenul serologic al tulpinilor de E. coli izolate au fost ncadrate serologic un numr de 18 tulpini (21,17%) din cele 85 de tulpini izolate. Serogrupele identificate au fost: o7 (11,11%), o8 (55,55%), o10
112

(55,55%), o15 (55,55 %), o20 (55,55%). 3. Examenele bacteriologice efectuate din carnea de bovin i porcin (materie prim), din unele preparate i semipreparate din carne, au condus la izolarea i identificarea unor serotipuri de E. coli enteropatogene. 4. mediile folosite n cadrul testrii prezumptive au fost reprezentate de: bulionul glucozat (B.G.) i mediul levine (GEAm). 5. Prin testarea tulpinilor pentru evidenierea fimbriilor s-a constatat prezena fimbriilor de tip f41 la o tulpin nencadrabil serologic, izolat din carnea tocat. 6. Studiul prezenei enterotoxinelor prin testul de ans ligaturat la purcel sugar sau nrcat, la un numr de 5 tulpini de E. coli nu au evideniat prezena enterotoxinelor lT (termolabil) sau ST (termostabil). 7. Prezena activitii hemolitice a fost constatat la dou tulpini de E. coli (23,52%) din carne de mici i din salam. 8. Au fost identificate n produsele finite 10 tulpini de E. coli (11,76%) productoare de hidrogen sulfurat. 9. Pentru testele de confirmare s-au folosit un agar nutritiv nclinat, bulion-bil-lactoz-verde-briliant (BBlV) i ap tripeptonat.

113

dETErmInArEA COLIfOrmILOr TOTALI

1. Se amestec proba alimentar ntr-un blender rotativ de nalt vitez.

450 g diluant tampon fosfat Butterfield 50 g aliment se amestec la 10.000-12.000 RPm pentru 2 minute 90 ml diluant

2. Se dilueaz omologatul de prob alimentar.

3. Test prezumptiv. Se incubeaz la 35C pentru 24-48 de ore

Bulion lauril-triptoz

4. Test de confirmare. Se incubeaz la 35C 48 de ore Bulion BGB 2% 5. Interpretare: Se numr tuburile gaz-pozitive i se calculeaz mPN din tabele.

114

Escherichia coli o157:h7. microscopie electronic

Escherichia coli o157:h7. Se remarc prezena flagelilor i a fimbriilor. 115

Escherichia coli o157:h7. microscopie electronic - Suh (sindromul urohemolitic)

Escherichia coli. Coloraia Gram. Preparat din cultur

Escherichia coli. Coloraia Gram. Preparat din cultur

Escherichia coli. Coloraia Gram. Preparat din cultur 116

Escherichia coli. Coloraia Gram. Preparat din cultur

Mediul Leifson. Colonii roii de Escherichia coli.

mediul mac Conkey. Colonii lactoz pozitive, roz-mate

mediul mac Conkey. Colonii lactoz pozitive, mucoide. Identificate cu ajutorul testului API pentru diferenierea de Klebsiella pneumoniae

Plac cu agar mac Conkey inoculat cu Escherichia coli (lactoz pozitiv) i Serratia marcescens (lactoz negativ, de culoare rou aprins)

117

bibliografie selectiv
1. Baylis, C. l., Penn, C. W., Thielman, N. m., Guerrant, R. l., Jenkins, C. and Gillespie, S. h., 2006. Escherichia coli and Shigella spp., In Principles and Practice of Clinical Bacteriology. Second Edition. S. h. Gillespie and P. m. hawkey Eds., John Wiley & Sons ltd, london: p 347-365. 2. Caprioli A, morabito S, Brugre h, oswald E., 2005. Enterohaemorrhagic Escherichia coli: emerging issues on virulence and modes of transmission. Vet Res. 2005. 36(3):289-311. 3. Chen Q, Savarino SJ, Venkatesan mm., 2006, Subtractive hybridization and optical mapping of the enterotoxigenic Escherichia coli h10407 chromosome: isolation of unique sequences and demonstration of significant similarity to the chromosome of Escherichia coli K-12. microbiology. Apr;152(Pt 4):1041-54. 4. Cheryl l. Tarr, Adam m. Nelson, lothar Beutin, Katharina E. P. olsen, and Thomas S. Whittam. 2008, molecular Characterization Reveals Similar Virulence Gene Content in unrelated Clonal Groups of Escherichia coli of Serogroup o174 (ox3) J. Bacteriol. 2008 190: 1344-1349. 5. de Sablet T, Bertin Y, Vareille m, Girardeau JP, Garrivier A, Gobert AP, martin C., 2008., differential expression of stx2 variants in Shiga toxin-producing Escherichia coli belonging to seropathotypes A and C., microbiology. 154:176-86. 6. devasia RA, Jones Tf, Ward J, Stafford l, hardin h, Bopp C, Beatty m, mintz E, Schaffner W., 2006. Endemically acquired foodborne outbreak of enterotoxin-producing Escherichia coli serotype o169:h41. Am J med. 2006 feb;119(2):168.e7-10. 7. donnenberg, m. S., 2002, Escherichia coli virulence mechanisms of a versatile pathogen, london, Academic Press. 8. duffy, G., Garvey, P. and mcdowell, d. A., 2001, Verocytotoxigenic Escherichia coli, Trumbull, Connecticut, food & Nutrition Press Inc. 9. EfSA, 2007, monitoring of verotoxigenic Escherichia coli (VTEC) andidentification of human pathogenic VTEC types, Scientific opinion of the Panel on BIoloGICAl hAzARdS (Question No EfSA-Q-2007-036) The EfSA Journal. 10. Kaper, J. B. and oBrien, A. d., 1998, Escherichia coli o157:h7 and other Shiga toxin-producing Escherichia coli strains, Washington d.C, ASm Press. 11. Karmali, m. A., 2003, The medical significance of Shiga toxin-producing Escherichia coli infections. An overview. methods mol. med. 73: 1-7 12. le Gall T, darlu P, Escobar-Pramo P, Picard B, denamur E., 2005, Selectiondriven transcriptome polymorphism in Escherichia coli/Shigella species. Genome Res. feb;15(2):260-8. 13. morabito S, Karch h, mariani-Kurkdjian P, Schmidt h, minelli f, Bingen E, Caprioli A., 1998, Enteroaggregative, Shiga toxin-producing Escherichia coli o111:h2 118

associated with an outbreak of hemolytic-uremic syndrome. J Clin microbiol. 1998. 36(3):840-2. 14. Nataro J. P. and Kaper, J. B., 1998, diarrheagenic Escherichia coli. Clin. microbiol. Rev. 1998. 11(1): 142-201. 15. Scheutz, f. and Strockbine, N. A., 2005, Escherichia. Bergeys manual of systematic bacteriology. G. m. Garrity, d. J. Brenner, N. R. Krieg and J. T. Staley Eds. New York, NY, Springer,: 607-624.17 16. Scheutz, f. and Strockbine, N. A., 2005, Escherichia. In Bergeys manual of systematic bacteriology, G. m. Garrity, d. J. Brenner, N. R. Krieg and J. T. Staley Eds. New York, NY, Springer,: 607-624. 17. Scheutz, f., Beutin, l., Pierard, d. and Smith, h. R., 2001, Nomenclature of Vero cytotoxins. In Verocytotoxigenic Escherichia coli, G. duffy, P. Garvey and d. A. mcdowell Eds. Trumbull, Connecticut, food and Nutrition Press Inc: 447-452. 16 18. Simona Ivana, 2002 Bacteriologie veterinar special (Ed. Ceres, Bucureti; 460 pagini), ISBN: 973-40-0568-5 19. Simona Ivana, 2005 Bacteriologie general (Ed. tiinelor medicale, Bucureti; 250 pagini), ISBN: 973-86485-7-2 20. Simona Ivana, 2006 Tratat de bacteriologie medical-veterinar i introducere n micologie (Ed. tiinelor medicale, Bucureti;768 pagini), ISBN (10) 973-86571-5-6; ISBN (13) 978-973-86571-5-1 21. Simona Ivana, 2007 manual de microbiologia alimentelor (Ed. tiinelor medicale, Bucureti; 160 pagini), ISBN: 978-973-86571-3-7 22. Simona Ivana, 2007 microbiologie medical veterinar, Vol. I (Ed. tiinelor medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-01-6 23. Simona Ivana, 2007 microbiologie medical veterinar, Vol. II (Ed. tiinelor medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-02-3 24. Simona Ivana, 2008, microbiologia alimentelor, Ed. orizonturi, ISBN: 978973-736-090-8 25. Simona Ivana, 2008, Practical guide of microbiogical diagnosis, Ed. orizonturi, ISBN: 978-973-736-089-2 26. Sussman, m., 1997, Escherichia coli, mechanisms of virulence, Cambridge, Cambridge university Press. 27. Welch RA, Burland V, Plunkett G 3rd, Redford P, Roesch P, Rasko d, Buckles El, liou SR, Boutin A, hackett J, Stroud d, mayhew Gf, Rose dJ, zhou S, Schwartz dC, Perna NT, mobley hl, donnenberg mS, Blattner fR, 2002, Extensive mosaic structure revealed by the complete genome sequence of uropathogenic Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci u S A. dec 24;99(26):17020-4. 28. Wick lm, Qi W, lacher dW, Whittam TS, 2005, Evolution of genomic content in the stepwise emergence of Escherichia coli o157:h7, J Bacteriol. mar; 187(5):1783-91. 119

29. Wickham, m. E., lupp, C., mascarenhas, m., Vazquez, A., Coombes, B. K., Brown, N. f., Coburn, B. A., deng, W., Puente, J. l., Karmali, m. A. and finlay, B. B, 2006, Bacterial genetic determinants of non-o157 STEC outbreaks and hemolyticuremic syndrome after infection. J. Infect. dis. 194(6): 819-827 30. Yang J, Nie h, Chen l, zhang x, Yang f, xu x, zhu Y, Yu J, Jin Q., 2007, Revisiting the molecular evolutionary history of Shigella spp. J mol Evol. Jan;64(1):71-9. 31. Erickson, J.P., J.W. Stamer, m. haycs, d.N. mcKenna, and l.A. van Alstine. 1995. An assessment ol Escherichia ,,,/, 0157:h7 contaniinaiion risks in commercial mayonnaise Iroin pasicurized eggs and environmcntal sourccs. and behavior in Iow-ph dressings. J. foodProtect. 58:1059-1064. 32. fenton, l.l., l.W. hand, T.G. Rehberger, f.K. Ray, and T.G. harbolt. 1995. fate of Escheruhia coli ol 57:h7 in theniially processed low fat ground becf pattics. Proc. Inst. food Technol. 36. 33. ficlding, l.m., P.E. Cook, and A.S. Grandison. 1994. The effecl of electron beam irradiation and modified ph on the survival and recovery of Escherichia coli. J. Appl. Bacteriol. 76:412-416. 34. fisher, T.l., and d.A. Golden. 1998. fate of Escherichia coli ol57:h7 in ground apples used in cider production. /. food Proiect. 61:1372-1374. 35. frantz, J.C., l. Jaso-fricdman, and d.C. Robertson. 1984. Binding of Escherichia coli heat-stable enterotoxin to rat intestinal cells and brush border membranes. Infect. Immun. 43:622-630. 36. Glass, K.A., J.m. loeffelholz, J.P. ford, and m.P. doyle. 1992. fate of Escherichia coli 0157:h7 as affected by ph or sodium chloride and in fermented, dry sausage. Appl. Environ. microbiol. 58:2513-2516. 37. Gonthier, A., V. Gue>in-faublee, B. Tilly, and m.-l. delignette-muller. 2001. optimal growth temperature of 0157 and non-0157 Escherichia coli strains. lett. Appl. microbiol. 33:352-356. 38. Griffin, P.m., and R. V. Tauxe. 1991. The epidemiology of infections caused by Escherichia coli 0157:h7, other enterohe-morrhagic Escherichia coli, and the associated hemolytic uremie syndrome. Epidemiol. Rev. 13:60-98. 39. Gross, R.J.. l.V. Thomas, T. Cheasty, N.P. day, B. Rowe, m.R.f. Toledo, and l.R. Trabulsi. 1983. Enterotoxigenic and enteroinvasive Escherichia coli strains belonging to a new o Group, 0167. J. Clin. microbiol. 17:521-523. 40. herriott, d.E., d.d. hancock, E.d. Ebel, l. V Carpenter, d.h. Rice, and TE. Besser. 1998. Association of hercl management factors with colonization of dairy cattle by Shiga toxin-positive Escherichia coli 0157../. food Proiect. 61:802-807. 41. hitotsubashi, S., Y. fujii, and K. okamota. 1994. Binding protein for Escherichia coli heat-stable enterotoxin II in mouse intestinal membrane. fEmS microbiol. lett. 122:297-302. 42. hitotsubashi. S., Y. fujii. and h. Yamanaka. 1992. Some properties of purified 120

Escherichia coli heat-stable enterotoxin II. Infect Immun. 60:4468-4474. 43. harrison, J., and m. harrison. 1995. fate of Escherichia coli 0157.h7, Listeria monocytogenes, and Salmonella Ty-phimurium during preparation and storage of becf jerky. Proc. Inst. food Technol. 30. 44. hathcox, A.K., l.R. Beuchat, and m.P. doyle. 1995. death of enterohemorrhagic Escheruhia coli 0157:h7 in real mayonnaise and reduced-caloric mayonnaisc dressing as influenced by iniial population and storage temperature. Appl. Environ. microbiol. 61:4172-4177. 45. hobbs, B.C., m.E.m. Thomas, and J. Taylor. 1949. School outbreak of gastroenteritis associated with a pathogenic paracolon bacillus. lancet 2:530-532. 46. Itoh, Y., Y. Sugita-Konishi, f. Kasuga, m. Iwaki, Y. hara-Kudo, N. Saito, Y. Noguchi, h. Konuma, and S. Kumagai. 1998. Enterhemorrhagic Escherichia coli 0157:h7 present in radish sprouts. Appl. Environ. microbiol. 64:1532-1535. 47. Janisiewicz, W.J., W.S. Conway, m.W. Brown, G.m. Sapcrs, R fratamico, and R.l. Buchanan. 1999. fate of Escherichia coli 0157:h7 on fresh-cut apple tissuc and its potenial for transmission by fruit flies. Appl. Environ. microbiol. 65:1-5. 48. Jordan, d., and S.A. mcEwen. 1998. Effect of duration of fasting and a shortterm high-roughage ration on the concentration of Escherichia coli biotype 1 in cattle feces. J. food Proiect. 61:531-534. 49. Karch, h., h. Russmann, h. Schmidt, A. Schwarzkopf. and J. heeseman. 1995. long-term shedding and clonal turnover of enterohemorrhagic Escherichia coli 0157:h7 in diarrheal diseases. J. Clin. microbiol. 33:1602-1605. 50. Klipstein, f.A., R.f. Engert, and R.A. houghten. 1983. Properties of synthetically produced Escherichia coli heat-stable enterotoxin. Infect. Immun. 39:117-121. 51. Konowalchuk, J., J.l. Speirs, and S. Stavric. 1977. Vero response to a cytotoxin of Escherichia coli. Infect. Immun. 18:775-779. 52. Kudva, I.T., K. Blanch, and C.J. hovde. 1998. Analysis of Escherichia coli 0157:h7 survival in ovine or bovine manure and manure slurry. Appl. Environ. microbiol. 64:3166-3174. 53. Kunkel, S.l., and d.C. Robertson. 1979. Purification and chemical characterization of the heat-labile enterotoxin produced by enterotoxigenic Escherichia coli. Infect. Immun. 25:586-596. 54. lallier, R., S. lariviere, and S. St-Pierre. 1980. Escherichia coli heat-stable enterotoxin: Rapid method of purification and some characteristics of the toxin. Infect. Immun. 28:469-474. 55. lee, C.h., S.l. moseley. h.W. moon, S.C. Whipp. C.l. Gyles, and m. So. 1983. Characterization of ihe gene encoding heat-stahle toxin II and prelitninary molecular epidomiological siudies of tnttrotoxigenic Escherichia coli heat-stahle toxin II producers. Infei i Immun. 42:264-268. 56. leJeune, J.T.. T.E. Besser. d.h. Rice. J.l. Berg. R.P. Stilborn, and d.d. hancock. 121

2004. longitudinal study ol fecal shedding of Escherichia coti ()157:h7 in feedlot cattle: Predominante and persistence of specific clonal typcs despite massive cattle population turnover. Appl. Environ mu robioi. 70:377-384. 57. leyer. G.J.. l.-l. Wang. and E.A. Johnson. 1995. Acid adaptation of Escherichia coli 0157:h7 increases survival in acidic foods. Appl. Environ. microbiol. 61:3752-3755. 58. line. J.E.. A.R. fain, Jr.. A.B. moran. l.m. martin. R.V. lechowich, J.m. Carosella, and W.l. Brown. 1991. lethality of heat to Escherichia coli 0157:h7: d-value and r-value determinations in ground beef. J. food Protect. 54:762-766. 59. lior. h. 1994. Escherichia coli0\51\hl and verotoxigenic Escherichia coli (VTEC). dairy food Environ. Sanil. 14:378-382. 60. louise, CB., S.A. Kaye. B. Boyd, CA. lingwood, and T.G. obrig. 1995. Shiga toxin-associated hemolytic uremie syndrome: Effect of sodium butyrate on sensitivity of human umbilical vein endothelial cells to Shiga toxin. Infect. Immun. 63:2766-2769. 61. machino. h.. K. Araki, S. minami, T. Nakayama, Y. Ejima. K. hiroe, h. Tanaka, N. fujita, S. usami, m. Yonekawa. K. Sadamoto, S. Takaya, and N. Sakai. 1998. Recent outbreaks of infections caused by Escherichia coli ol57:h7 in Japan. In Escherichia coli 0157.h7 and other Shiga Toxin-Producing Escherichia coli Strains, ed. J.B. Kaper and A.d. oBrien, 73-81. Washington. dC: ASm Press. 62. marier. R., J.G. Wells, R.C Swanson, W. Callahan. and I.J. mehlman. 1973. An outbreak of enteropathogenic Escherichia coli foodborne disease traced to imported french cheese. lancet 2:1376-1378. 63. mazaitis, A.J., R. maas. and W.K. maas. 1981. Structure of a naturally occurring plasmid with genes for enterotoxin production and drug resistance. J. Bacteriol. 145:97105. 64. merson. m.h., f. orskov. I. orskov. R.B. Sack. I. huq. and f.T. Koster. 1979. Relationship between enterotoxin production and serotype in enterotoxigenic Escherichia coli. Infect. Immun. 23:325-329. 65. montenegro, m.A., m. Buhe. T. Trumpf, S. Aleksic, G. Reuter, E. Bulling, and R. helmuth. 1990. detection and characterization of fecal verotoxin-producing Escherichia coli from healthy cattle. J. Clin. microbiol. 28:1417-1421. 66. mundell. d.h., C.R. Anselmo, and R.m. Wishnow. 1976. factors influencing heat-labile Escherichia coli enterotoxin activity. Infect. Immun. 14:383-388. 67. Neill. m. A.. P.I. Tarr. d.N. Taylor. and m. Wolf. 2001. Escheru hia coli. In foodborne disease handbook: diseases Caused by Bacteria, ed. Y.h. hui. m.d. Pierson, and J.R. Gorham, 2nd ed., 169-212. New York: marcel dekker. 68. oBrien. A.d., m.R. Thompson. J.R. Cantey. and S.B. formal. 1977. Production of Shigella dysenteriae-uke toxins by pathogenic Escherichia coli. Abstr.. Amer. Soc. microbiol. 32. 69. oBrien, A.d.. and R.K. holmes. 1987. Shiga and Shiga-like toxins. microbiol. Rev. 51:206-220. 122

70. oBrien, A.d.. V.l. Tesh, A. donohue-Rolfe, mP Jackson, S. olsnes, K. Sandvic, A.A. lindberg, and G.T. Keusch. 1992. Shiga toxin: Biochemistry, genetics, mode of action, and role in pathogenesis. Curr. Top. microbiol. Immunol. 180:65-94. 71. oelschlaeger, T.A., T.J. Barrett, and d.J. Kopecko. 1994. Some structures and processes of human epithelial cells involved in uptakc of enterohemorrhagic Escherichia coli 0157:h7 strains. Infect. Immun. 62:5142-5150. 72. omisakin, f. m. macRae, I.d. ogden, and N.J.C Strachan. 2003. Concentration and prcvalence of Escherichia coli 0157:h7 in cattle feces at slaughter. Appl. Environ. microbiol. b9\2444-2<WI. 73. 0rskov. I., f. 0rskov, B. Jann. and K. Jann. 1977. Serology, chemistry, and genetics of o and K antigens of Escherichia coli. Bacteriol. Rev. 41:667-710. 74. ostroff, S.m., P.I. Tarr. m.A. Neill, J.h. lewis, N. hargrett-Bean, and J.m. Kobayashi. 1989. Toxin genotypes and plasmid profiles as determinants of systemic sequelae in Escherichia coli ()157:h7 infections. J. Infect. dis. 160:994-998. 75. Palumbo. S.A., J.E. Caii. f.J. Schultz, and A.C. Williams. 1995. minimum and maximum temperatures for growth and verotoxin production by hemorrhagic strains of Escherichia coli../. food Protect. 58:352-356. 76. Park. S.. R.W. Worobo, and R.A. durst. 1999. Escherichia coli 0157:h7 as an emerging foodborne pathogen: A literatura review. Crit. Rev. fd. Sa Nutr. 39:481-502. 77. 70 Picken, R.N.. A.J. ma/aitis. W.K. maas. m. Rey, aud II heyneker. 1983. Nuclcotide sequence ofthe gene lor hcat-stable enterotoxin II of Escherichia coli. Infect Immun. 42:269-275.

123

cAPiTolUl 3 ImPLICAIILE BACTErIILOr dIn gEnUL YErSInIA n PrOdUCErEA TOxIInfECIILOr ALImEnTArE

3.1. caractere generale
A fost constituit n 1944 la propunerea lui Van loghem. Cuprinde 13 specii, dintre care, cele mai importante n patologia veterinar i uman sunt: Yer. pseudotuberculosis (cu dou subspecii: pseudotuberculosis i pestis), Yer. pestis, care este agentul etiologic al ciumei la om; Yer. pseudotuberculosis, care produce yersinioza la multe specii de animale; Yer. enterocolitica (subsp. enterocolitica i palearctica), care este agentul etiologic al unei enterite grave la om i animale, dar care se izoleaz i din intestinul porcilor sntoi; Yer. ruckeri, care produce la salmonide infecia numit gura roie. Bacterii din genul Yersinia, sunt Gram negative, au form bacilar, sunt facultativ anaerobe, imobile la 37C, mobile la 25-30C (cu excepia lui Yer. pestis i Yer. ruckeri, care sunt ntotdeauna mobile). Sunt oxidaz negative, catalaz pozitive, testul Voges-Proskauer negativ la 37C, nu produc hidrogen sulfurat, nu fermenteaz lactoza, ureaz pozitivi. Se dezvolt pe medii de cultur ca: snge, mac Conkey, bulion-cord, agar SS, la temperatura camerei sau la 39C i n ser fiziologic, tamponat, la 4C. Coloniile sunt foarte mici, dup 24 de ore, dar bine vizibile dup 48 de ore. 3.2. Epidemiologie n 2006, au fost confirmate 9.067 cazuri de yersinioz uman din 9.075 notificri provenide de la 25 state (frana, Grecia, olanda, Romnia i liechtenstein nu au raportat). Aceste notificri sunt cu 4,5% mai mici dect cele raportate cu un an n urm de ctre aceleai state. Rata medie a notificrilor pentru 2006 a fost 2,3 la 100.000 locuitori. distribuia yersiniozelor pe grupe de vrst i sex.
124

Aceast distribuie a fost furnizat de 19 state pentru un total de 8.608 (95%) cazuri raportate. Cel mai afectat grup a fost grupa de vrst 0-4 ani cu 2.799 (31%) cazuri, tot acest grup a avut i cea mai mare rat a notificrilor, respectiv de 14,8 la 100.000.
Figura 3.1. distribuia pe grupe de vrst a cazurilor de yersinioz n 2006 (8608cazuri) (Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor, 2008)

Informaiile referitoare la sexul persoanelor afectate au fost diponibile la 8.646 (95,3%) din cazuri. Analiza acestora nu a scos n eviden diferene semnificative ntre brbai (2,4 la 100.000) i femei (2,1 la 100.000). Sezonalitatea Cazurile de yersinioz nu expun un adevrat tipar sezonier, chiar dac majoritatea cazurilor au fost raportate spre a doua jumtate a anului 2006.
Tabelul 3.1. numrul i rata notificrilor yersiniozelor non-holerice raportate n UE i EEA/ EfTA n 2006 Tipul de raportare C C C U Cazuri confirmate 158 264 5 0 Nr. cazuri per populaii de 100.000 de oameni 1.9 2.5 0.06 0.0

Cazuri/100.000

ara

Total cazuri

Austria Belgia Bulgaria Cipru

158 264 5 0 125

ara

Tipul de raportare C C C C U C U C C U C A C U U C U U C C C C C C N C

Total cazuri

Cazuri confirmate 534 215 42 795 5161 38 1 0 92 411 5 0 110 0 82 76 375 558 59 8981 0 86

Nr. cazuri per populaii de 100.000 de oameni 5.2 4.0 3.1 15.1 6.3 0.38 0.1 0.0 4.0 12.1 1.1 0.0 0.29 0.0 1.5 3.8 0.86 6.2 0.10 2.4 0.0 1.9

Republica Ceh Danemarca Estonia Finlanda Frana Germania Grecia Ungaria Irlanda Italia Latvia Lituania Luxembourg Malta Olanda Polonia Portugalia Romnia Slovacia Slovenia Spania Suedia Marea Britanie Total UE Islanda Liechtenstein Norvegia Total

535 215 42 795 5161 38 1 0 94 411 5 0 110 0 83 80 375 558 59 8989 0 86

9075 9067 2.3 Sursa: Raportri naionale. A = Raportri de date agregate; C = Raportri bazate pe cazuri; - = fr raportare; u = nespecificat 126

Figura 3.2. distribuia sezonier a cazurilor de VTEC/STEC n EU i EEA/EfTA n 2006 (n=8660) (Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor, 2008)

Cazuri

Ian

Feb

Mar

Apr

Mai

Iun

Iul

Aug

Sep

Oct

Nov Dec

Investigaiile efectuate pentru evaluarea incidenei Yersinia spp. la diferite tipuri de animale i produse alimentare, inclusiv carne de porc i vit au artat c Y. enterocolitica este identificat rar. Izolarea i identificarea Y. enterocolitica creaz o serie de probleme, ntruct identificarea tulpinilor virulente pentru oameni solicit att stabilirea biotipului, ct i a serotipului. n Europa cea mai frecvent izolat Y. enterocolitica este biotipul 4 (serotip o:3) i, mai rar biotipul 2 (serotip o:9).

3.3. Specii ale genului Yersinia implicate n toxiinfeciile alimentare

3.3.1. Yersinia pseudotuberculosis subsp. pseudotuberculosis (Pasteurella pseudotuberculosis) istoric Germenul a fost descris n 1883 de malassez i Vignal, care inoculeaz la cobai materialul patologic din leziunea unui copil i reproduc o infecie asemntoare morfopatologic cu tuberculoza. Pfeiffer (1889) a fost primul care a descris Bacillus pseudotuberculosis, pe care l-a rebotezat Pasteurella pseudotuberculosis, n 1929. n 1935 a fost denumit Shigella pseudotuberculosis, iar Smith i Thal (1965) au plasat-o n genul Yersinia.
127

morfologie Bacterie Gram negativ, de 0,8-6/0,8 microni, pleomorf mai frecvent cocobacilar cu tendin de coloraie bipolar. Necapsulogen, nesporogen, prezint flageli peritrichi, cnd este cultivat la 28-30C. Condiii de cultivare i caractere culturale Crete bine pe medii de cultur uzuale n aerobioz. Pentru izolarea din materiale patologice cu flor bacterian mixt se utilizeaz mediul lui morris, n compoziia cruia intr substane care i confer selectivitatea, cum ar fi eritromicina, novobiocina, teluritul de potasiu. Pe agar dezvolt la 37C n 24 de ore colonii de 1-1,5 milimetri, care n 48 de ore ating 2-3 milimetri. Acestea sunt rotunde, uor granulate, translucide i cu centrul opac, avnd un aspect striat la periferia coloniei. Proprieti biochimice fermenteaz glucoza fr producia de gaz, nu produc hidrogen sulfurat, nu fermenteaz lactoza. la 37C este imobil (mediul mIlf se tulbur numai dup meninerea 24 de ore la temperatura camerei). Nu produce indol, lizindecarboxilaz i fenilalanin-deaminaz. Nu cresc pe mediul cu citrat (Simmons), nu scindeaz malonatul, produce ureaz i beta galactozidaz.
Tabelul 3.2. diferenierea biochimic a speciilor de Yersinia (dup fanner, 1995) mobilitatea la 37ca ornitindecarboxilaz Celobioz Zaharoz ramnoz Sorbitol 50 0 99 100 50 Salicin 70 25 20 92 0 Ureaz 5 95 75 70 0 128

Yersinia spp.

Yer. pestis Yer. pseudotuberculosis Yer. enterocolitica Yer. frederiksenii Yer. ruckeri

0 0 2 5 0

0 0 95 95 100

0 0 50 100 0

indol

0 0 95 100 0

1 70 1 99 0

0 0 75 100 5

mobilitatea la 37ca

ornitindecarboxilaz

Celobioz

Zaharoz

ramnoz

Sorbitol

Yersinia spp.

5 92 77 30 0 0 Yer. kristensenii 0 80 20 0 100 0 Yer. mollaretii 0 80 60 0 100 0 Yer. bercovierii 0 25 62 0 100 0 Yer. rohdei 0 40 60 0 20 0 Yer. aldovae 5 100 80 100 100 100 Yer. intermedia a) Cu excepia Yer. pestis, toate speciile sunt mobile la 25C

100 100 100 25 0 96

100 15 100 20 100 20 100 0 60 0 100 100

Proprieti antigenice Posed antigene somatice o i antigene flagelare h, pe baza crora specia este divizat n 8 serogrupuri majore, dintre care unele sunt subdivizate n subgrupe, fiecare cu mai multe serotipuri. Subspecia pseudotuberculosis prezint antigene comune cu subspecia pestis, salmonelele din grupele B, d i Escherichia coli. Nu exist nrudiri antigenice ntre Yer. pseudotuberculosis i Yer. enterocolitica. Identificarea antigenic prin aglutinare cu ser anti Yer. pseudotuberculosis tip 1 (serovarurile dominante n ara noastr) confirm apartenena de gen i specie. Comportarea fa de factorii de mediu Yer. pseudotuberculosis este o bacterie sensibil la aciunea factorilor de mediu fizici i chimici i a dezinfectantelor obinuite n concentraii uzuale. Cele mai active antibiotice sunt streptomicina, neomicina, tetraciclina. Ecologie Rezervorul natural al acestei bacterii l constituie roztoarele i psrile slbatice, de unde ajunge n sol i n apele de suprafa, unde supravieuiete chiar i la temperaturi joase. la om, ajunge pe cale alimentar, fiind cauza unor enterite subacute, nsoite de adenopatie mezenteric ce poate mima apendicita.
129

Salicin

Ureaz

indol

Patogenitate Ajunse n tubul digestiv, yersiniile se multiplic n mucoasa intestinal, producnd focare inflamatorii n lamina propria i nodurile limfatice aferente, sub form de microabcese determinnd atrofierea vilozitilor intestinale. Ca rezultat se produce malabsorbie, maldigestie i uneori diaree. Virulena bacteriilor depinde de antigenele V i W, care determin dependena de calciu, cnd sunt cultivate la 37C. Tulpinile patogene sunt rezistente la complementul seric, ptrund n celulele epiteliale umane (celulele he la), sunt letale pentru oarecii de laborator i prezint citotoxicitate. factorii de virulen sunt codificai de plasmida de 70 Kdal. Acetia sunt reprezentai de o protein-kinaz i de o protein din membrana extern (YoP = yersinia outer membrane protein), care inhib fagocitoza. Bacteria ptrunde n celulele eucariote folosind o protein de suprafa (invaziv), codificat de o gen cromozomal. multe tulpini produc o toxin termostabil similar cu cea generat de Escherichia coli. Aceasta prezint importan (cnd este eliberat la 22C) n producerea diareei. Germenul mai produce i o endotoxin, lPS, cu proprieti biologice similare ce cele provenite de la alte bacterii Gram negative. Infecia natural. mbrac forme anatomoclinice variate, care prezint urmtoarele trsturi comune: 55 calea digestiv de contaminare; 55 caracterul sezonier; 55 incidena mare n anotimpurile reci i umede; 55 afectarea constant a ganglionilor mezenterici; 55 prezena unor noduli pseudotuberculoi asemntori cu cei din tuberculoz, cu centrul necrotic cazeos, cu sau fr tendin de ncapsulare; 55 evoluia latent a infeciei evideniabil numai prin examen serologic. Infecia natural poart denumirea de yersinioz (pseudotuberculoz sau rodenioz), fiind mai frecvent la roztoare, dar afecteaz i multe specii de animale i omul. Se caracterizeaz prin slbire progresiv, adenopatie i formare de noduli cazeoi n diverse organe i pe seroase. la iepure i cobai, yersinioza se manifest prin apariia de leziuni nodulare n ganglionii limfatici, ficat, splin, rinichi, plmni, cu tendin de transformare n abcese.
130

Infecia are un caracter contagios i o evoluie enzootic. obolanul i oarecele reprezint un important rezervor natural, fiind purttori. mai sunt receptive: pisica, vulpea argintie, maimua, caprinele, bovinele, iar ovinele se infecteaz sporadic. omul se contamineaz rar, cu tendin de diseminare septicemic, care este urmat de cele mai multe ori de sechele renale. Infecia experimental. Animalele de laborator sensibile sunt cobaiul i iepurele, indiferent de calea de inoculare, tabloul anatomoclinic fiind foarte asemntor cu cel din infecia natural. 3.3.2. Yersinia enterocolitica Yer. enterocolitica a fost izolat pentru prima dat de mc Iver i Pike, n 1943, iar n 1964 frederiksen a propus actuala denumire a acestei bacterii. n cadrul speciei au fost recunoscute dou subspecii, enterocolitica i palearctica i cinci chimiotipuri (biotipuri), care cuprind aproximativ 27 de serotipuri. unele chimiotipuri produc indol i dau testul VP pozitiv. Yer. enterocolitica posed factori de virulen i toxicitate ca enterotoxinele termostabile (ST), asemntoare cu cele de la Escherichia coli i factori de adeziune. Yer. enterocolitica nu produce un siderofor pentru transportul fierului, necesar n cretere i multiplicare, dezvoltndu-se mai bine n prezena altor bacterii, care posed aceast capacitate. Endotoxinele sunt responsabile, ca i n cazul colibacililor de producerea exorbiei i, n ultim instan, a diareei. Acestea sunt elaborate att in vitro ct i n alimentele pstrate la temperatura mediului ambiant sau la frigider, conducnd la apariia toxiinfeciilor alimentare. Pe baza antigenelor somatice i flagelare au fost identificate 50 de serotipuri, dintre care unele (0:9) posed antigene comune cu brucelele i reacioneaz ncruciat cu Brucella spp. la RAl i RfC (reacii fals pozitive). Germenul este foarte rezistent n alimentele de origine animal, la temperatura de refrigerare i la ph acid. Este sensibil la aciunea substanelor dezinfectante n concentraii uzuale, la antibiotice i chimioterapice cu spectru larg, printre care: gentamicina, cloramfenicolul, clotrimazolul, acidul nalidixic. Infeciile cu Yer. enterocolitica se ntlnesc la bovine, ovine, cabaline, caprine, porcine, cmile, cini. dintre animalele domestice afecteaz, mai ales, tineretul ovin sub un an, porcii, cini, pisicile.
131

la om infecia cu Yer. enterocolitica se produce cel mai adesea cu tipurile 0:3, 0:5, 0:8, 0:9, de origine porcin, care se manifest prin enterocolite, mai rar prin septicemie. Ca rezultat al numrului mare de specii care constituie rezervorul natural de Yer. enterocolitica, n natur i a incidenei ridicate a purttorilor, sursele de infecie secundare contaminate cu fecale, cum sunt punile, apele de suprafa, furajele, apa de but, alimentele, ocup veriga intermediar n circuitul epidemiologic al yersiniilor n natur i animalul receptiv sau omul.

3.4. Specii zoonotice din genul Yersinia

3.4.1. Yersinia enterocolitica cu serotipurile 03, 05, 27, 08, 09 i Yersinia pseudotuberculosis Sunt cei doi ageni zoonotici ai yersiniozei umane. Prin studiile de hibridare dNA s-a demonstrat c ntre Yer. pseudotuberculosis i Yer. pestis exist o strns nrudire, astfel nct, bacilul pestei a fost redenumit Y. pseudotuberculosis subsp. pestis. n ceea ce privete ns epidemiologia i rezervoarele de infecie cele dou infecii sunt diferite la om. Infecia uman cu Yer. enterocolitica a fost descris pentru prima dat n 1939 de ctre Schleifstein i Coleman. n 1963, daniels o denumete Pasteurella x, iar n 1964 frederiksen o adaug genului Yersinia. n 1975, s-au raportat aproximativ 6000 de cazuri n toat lumea. Cele mai multe au fost descrise n Scandinavia, Europa, Canada i SuA. Gazdele principale de Yer. enterocolitica sunt reprezentate de ctre porci, roztoare, iepuri, oi, capre, bovine, cai, cini i pisici, bacteria gsinduse n orofaringele i lumenul tractului gastrointestinal al acestor animale. n cazul lui Yer. pseudotuberculosis gazdele sunt reprezentate de roztoare, cprioare, animale domestice, psri. n general animalele infectate sunt purttoare asimptomatice, nepre-zentnd manifestri clinice. oamenii reprezint gazde ntmpltoare nefiind implicai nici n meninerea microorganismului n natur i nici n transmiterea lui la ali oameni. manifestrile clinice includ febra, diareea, durerile abdominale, care mimeaz apendicita i artrita cronic. Apar de asemenea leziuni tipice de enterit i limfadenit mezenteric. mai receptivi la infecie sunt copii dect adulii. Transmiterea se
132

realizeaz prin ingestia de alimente sau ap i mai rar prin contact direct cu animalele infectate sau pacienii umani. Transmiterea infeciei n rile nord europene de la animale la om, se realizeaz probabil prin cinii de companie i prin consumul de carne de porc insuficient pregtit. Germenul se poate gsi n lacuri, izvoare, ap potabil, ns rareori, s-au produs infecii pe aceast cale. Supravieuiete la frigider, ceea ce arat c produsele refrigerate pot fi contaminate. Epidemiile de boal n SuA prin consum de alimente s-au semnalat prin ciocolat contaminat, lapte pasteurizat, intestine crude de porc. Infecia cu Yer. pseudotuberculosis, este extrem de rar, fiind semnalat mai ales n Europa, transmiterea realizndu-se prin ingestie, dup contactul cu un animal infectat sau prin contaminare intrafamilial prin ap i alimente. majoritatea mbolnvirilor depind de: vrst (copiii ntre 5-15 ani); sex (masculin); anotimp (iarna). Transmiterea bolii de la un animal la altul se realizeaz pe cale fecaloral, prin ingestia furajului sau a apei contaminate. Yer. enterocolitica este sensibil in vitro la aminoglicozide, cloramfenicol, tetracicline, trimetoprim, sulfametoxazol, piperaciclin i cefalosporine de generaia a III-a. Yer. pseudotuberculosis prezint sensibilitate la urmtoarele antibiotice: ampicilin, tetraciclin, cloramfenicol, cefalosporine i aminoglicozide. Combaterea trebuie concentrat asupra rezervoarelor animale din toate zonele. Pregtirea complet a crnii i pasteurizarea laptelui ar trebui s fie principalele mijloace de protecie. Christiansen (1987) a propus evitarea refrigerrii crnii pentru perioade mai mari de timp datorit capacitii bacteriei de a se nmuli la 4C. Pentru a mpiedica transmiterea bolii prin transfuziile de snge este necesar testarea donatorilor pentru episoadele recente de diaree sau febr. 3.4.2. Yersinia pestis Pesta a produs dezastre nc din Evul mediu, cnd a ucis un sfert din populaia Europei. n prima jumtate a secolului trecut, India a fost grav afectat de o epidemie de pest n care au murit mai mult de 10 milioane de oameni. ntre anii 1960 i 1970 n Vietnam, pesta a fcut peste 10.000 de
133

victime pe an. o dat cu descoperirea streptomicinei a sczut drastic mortalitatea la om. mai mult de 10 milioane de oameni au fost vaccinai n timpul rzboiului din Vietnam cu tulpina atenuat EV76. Cele mai importante rezervoare ale acestui bacil sunt reprezentate de obolanii urbani i domestici. n SuA, n focarele silvatice, rezervoarele sunt reprezentate de ctre veveria de stnc i cinele de preerie. mai rar, iepurii, pisicile i alte carnivore. Yer. pestis rezist n interiorul fagocitelor mononucleare multiplicndu-se intracelular, prin producerea antigenelor de membran. Cel mai eficient vector este puricele obolanului asiatic. Transmiterea ntre animale se face prin muctura puricelui sau prin ingerarea de esuturi animale moarte. Boala, la animale se poate prezenta de la forma bacteriemiei subclinice pn la afeciuni cu limfadenopatii i abcese n multiple organe sau moarte subit prin septicemie. Cea mai comun manifestare, la om este pesta bubonic. Boala se manifest prin febr, frisoane, cefalee, iar n cteva ore apar buboanele (adenoflegmoane), n special n zona inghinal, axilar i cervical. o caracteristic special a pestei o reprezint capacitatea bolii de a nvinge rezistena organismului prin proliferarea intens a bacteriilor n fluxul sanguin. una din complicaiile de temut ale pestei la om este reprezentat de pneumonia secundar. diagnosticul bacteriologic const n efectuarea de culturi din biopsii ganglionare. Picturile din aspiratul biopsic trebuie puse pe lame de microscop i uscate la aer i apoi colorate Gram sau Wayson. n coloraia Wayson, aspiratul este aplicat pe o lam, fixat 2 minute n metanol concentrat i colorat 10-20 secunde n amestecul colorant, splat cu ap i uscat (Thomas Butler). Yersiniile apar sub forma unor bacili azurii cu o extremitate albastru nchis, iar mediul apare colorat n roz. Pesta netratat prezint o rat a mortalitii de 50%. Streptomicina reduce mortalitatea la mai puin de 5%. Se administreaz intramuscular n doze de 30 de mg/kg/zi, timp de 10 zile. majoritatea infeciilor apar n mai-octombrie, cnd oamenii ies n natur i vin n contact cu roztoarele. ntre 1980-1989 s-au raportat de omS, 8554 de cazuri de pest n 17 ri. rile cu mai mult de 100 de cazuri sunt: Tanzania, Vietnam, zair,
134

Brazilia, madagascar, Peru, uganda, Burma, Bolivia, SuA, Botswana (Thomas Butler, 2005). omul nu are nici un rol n meninerea infeciei n natur fiind gazd accidental. Infecia se transmite prin muctura puricilor infectai. Transmiterea infeciei de la om la om se realizeaz extrem de rar (n epidemiile de pest pneumonic). dei purecii, sunt parazii specifici ai fiecrei specii schimbndu-i rar gazdele, au fost identificai la cinii i pisicile de companie implicai n transmiterea pestei la om n SuA. Pacienii suspeci de pest trebuiesc raportai la departamentul Sntii Publice i la omS. n laboratoarele n care se lucreaz cu acest germen, este absolut necesar existena unor tehnici bacteriologice standard, care s evite contactul culturilor cu pielea sau formarea de aerosoli. la persoanele care cltoresc n zonele epidemice, la cele care vin n contact cu roztoarele i la tehnicienii care manipuleaz Yer. pestis se folosete Plaque Vaccine uSP (vaccin cu bacterii inactivate cu aldehid formic) (Thomas Butler). datorit potenialului exploziv al acestei infecii, o dat identificat o epidemie, sunt necesare msuri de urgen din partea autoritilor. Se va folosi tratamentul cu pulberi insecticide, deoarece puricii infectai reprezint cea mai mare ameninare pentru oameni. Cea de-a doua msur prioritar const n omorrea obolanilor (dup administrarea tratamentului cu insecticide, deoarece puricii infectai pot trece la oameni, cnd animalele sunt otrvite).

135

harta focarelor de unde Yersinia pestis f1991016, E1979001, B42003004, K1973002 a fost izolat. dup zhou et al., 2004 Acest bacil Gram negativ, produce la oameni, psri, animale domestice i animale de companie infecii gastrointestinale caracterizate prin scaune apoase uneori sangvinolente, febr i dureri abdominale. uneori poate mima durerea provocat de apendicita. Yersinia enterocolitica. microscopie electronic de transmisie. Coloraie negativ pentru mbuntirea contrastului. Wadsworth Center, New York State department of health 136

Yer. enterocolitica. mediul xld (xylose lysine Sodium deoxycholate)

Yersinia enterocolitica. Coloraia Gram. 137

bibliografie selectiv
1. Aleksic, S., and J. Bockemuhl. 1984. Proposed revision of the Wauters et al. antigenic scheme for serotyping of Yersinia enterocolitica. J. Clin. microbiol. 20:99-102. 2. Aleksic, S., A. Steigerwalt, J. Bockemuhl, G. huntley-Carter, and d.J. Brenner. 1987. Yersinia rohdei sp. nov. isolated from human and dog feces and surface water. Int. J. Syst. Bacteriol. 37:327-332. 3. Archer, J R, R f Schell, d R Pennell and P d Wick. 1987. Identification of Yersinia spp. with the API 20E system. J Clin microbiol. 25(12): 2398-2399. 4. Aulisio, C.C.G., I.J. mehlman, and A.C. Sanders. 1980. Alkali method for rapid recovery of Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis from foods. Appl. Environ. microbiol. 39:135-140. 5. Aulisio, C.C.G., J.m. lanier, and m.A. Chappel. 1982. Yersinia enterocolitica o:13 associated with outbreaks in three southern states. J. food Prot. 45:1263. 6. Aulisio, C.C.G., J.T. Stanfield, S.d. Weagant, and W.E. hill. 1983. Yersiniosis associated with tofu consumption: serological, biochemical and pathogenicity studies of Yersinia enterocolitica isolates. J. food Prot. 46:226-230. 7. Aulisio, C.C.G., J.T. Stanfield, W.E. hill, and J.A. morris. 1983. Pathogenicity of Yersinia enterocolitica demonstrated in the suckling mouse. J. food Prot. 46:856-860. 8. Aulisio, C.C.G., W.E. hill, J.T. Stanfield, and R.l. Sellers, Jr. 1983. Evaluation of virulence factor testing and characteristics of pathogenicity in Yersinia enterocolitica. Infect. Immun. 40:330-335. 9. Bercovier, h., d.J. Brenner, J. ursing, A.G. Steigerwalt, G.R. fanning, J.m. Alonso, G.P. Carter, and h.h. mollaret. 1980. Characterization of Yersinia enterocolitica sensu stricto. Curr. microbiol. 4:201-206. 10. Bercovier, h., A.G. Steigerwalt, A. Guiyoule, G. huntley-Carter, and d.J. Brenner. 1984. Yersinia aldovae (formerly Yersinia enterocolitica-like group x2): a new species of enterobacteriaceae isolated from aquatic ecosystems. Int. J. Syst. Bacteriol. 34:166-172. 11. Bhaduri, S., C. Turner-Jones, and R.V. lachica. 1991. Convenient agarose medium for simultaneous determination of the low-calcium response and congo red binding by virulent strains of Yersinia enterocolitica. J. Clin. microbiol. 29:2341-2344. 12. Boyce, J.m., E.J. Evans, Jr., d.G. Evans, and h.l. duPont. 1979. Production of heat-stable methanol-soluble enterotoxin by Yersinia enterocolitica. Infect. Immun. 25:532-537. 13. Buchrieser, C., S. d. Weagant and C. W. Kaspar, 1994. molecular characterization of Yersinia enterocolitica by pulsed-field gel electrophoresis and hybridization of dNA fragments to ail andpYV probes. Appl. and Environ. microbiol. 60:4371-4379. 14. Carter, P.B., and f.m. Collins. 1974. Experimental Yersinia enterocolitica 138

infection in mice: kinetics of growth. Infect. Immun. 9:851-857. 15. doyle, m.P., m.B. hugdahl, and S.l. Taylor. 1981. Isolation of virulent Yersinia enterocolitica from porcine tongues. Appl. Environ. microbiol. 42:661-666. 16. feng, P. 1992. Identification of invasive Yersinia species using oligonucleotide probes. mol. Cell. Probes 6:291-297. 17. fukushima, h., K. Saito, m. Tsubokura, and K. otsuki. 1984. Yersinia spp. in surface water in matsue, Japan. zentralbl. Bakteriol. Abt. 1 orig. B. hyg. Kranhenhaushyg. Betreibshyg. Praev. med. 179:235-247. 18. fukushima, h., m. Gomyoda, S. Ishikua, T. Nishio, S. moriki, J. Endo, S. Kaneko, and m. Tsubokura. 1989. Cat-contaminated environmental substances lead to Yersinia pseudotuberculosis infections in children. J. Clin. microbiol. 27:2706-2709. 19. Gemski, P., J.R. lazere, and T. Casey. 1980. Plasmid associated with pathogenicity and calcium dependency of Yersinia enterocolitica. Infect. Immun. 27:682685. 20. Gemski, P., J.R. lazere, T. Casey, and J.A. Wohlhieter. 1980. Presence of a virulence-associated plasmid in Yersinia pseudotuberculosis. Infect. Immun. 28:10441047. 21. heesemann, J., B. Algermissen, and R. laufs. 1984. Genetically manipulated virulence of Yersinia enterocolitica. Infect. Immun. 46:105-110. 22. hill, W.E., W.l. Payne, and C.C.G. Aulisio. 1983. detection and enumeration of virulent Yersinia enterocolitica in food by dNA colony hybridization. Appl. Environ. microbiol. 46:636-641. 23. Isberg, R., A. Swain, and S. falkow. 1988. Analysis of expression and thermoregulation of the Yersinia pseudotuberculosis inv gene with hybrid protein. Infect. Immun. 56:2133-2138. 24. Isberg, R., d.l. Voorhis, and S. falkow. 1987. Identification of invasin: a protein that allows enteric bacteria to penetrate cultured mammalian cells. Cell 50:769778. 25. Isberg, R., and S. falkow. 1985. A single genetic locus encoded by Yersinia pseudotuberculosis permits invasion of cultured animal cells by Escherichia coli K-12. Nature 317:262-264. 26. Isberg, R., and J.m. leong. 1988. Cultured mammalian cells attach to the invasin protein of Yersinia pseudotuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. uSA 85:6682-6686. 27. Isberg, R. 1989. determinants for thermoinducible cell binding and plasmidencoded cellular penetration detected in the absence of Yersinia pseudotuberculosis invasin protein. Infect. Immun. 57:1998-2005. 28. Kandolo, K., and G. Wauters. 1985. Pyrazinamidase activity in Yersinia enterocolitica and related organisms. J. Clin. microbiol. 21:980-982. 29. Kay, B.A., K. Wachsmuth, and P. Gemski. 1982. New virulence-associated plasmid in Yersinia enterocolitica. J. Clin. microbiol. 15:1161-1163. 139

30. laird, W.J., and d.C. Cavanaugh. 1980. Correlation of autoagglutination and virulence of Yersinia. J. Clin. microbiol. 11:430-432. 31. lee, W.h., P.P. mcGrath, P.h. Carter, and E.l. Eide. 1977. The ability of some Yersinia enterocolitica strains to invade hela cells. Can. J. microbiol. 23:1714-1722. 32. linde,h.-J. h. Neubauer, h. meyer, S. Aleksic, and N. lehn. 1999. Identification of Yersinia Species by the Vitek GNI Card. J. Clin. microbiol.. 37:211-214. 33. miliotis, m.d. 1991. Acridine orange stain for determining intracellular enteropathogens in hela cells. J. Clin. microbiol. 29:830-832. 34. miliotis, m.d., and P. feng. 1992. In vitro staining technique for determining invasiveness in foodborne pathogens. fdA laboratory Information Bulletin, march, 9(3):3754. 35. miliotis, m.d., J.E. Galen, J.B. Kaper, and J.G. morris. 1989. development and testing of a synthetic oligonucleotide probe for the detection of pathogenic Yersinia strains. J. Clin. microbiol. 27:1667-1670. 36. miller, V.A., and S. falkow. 1988. Evidence of two genetic loci in Yersinia enterocolitica that can promote invasion of epithelial cells. Infect. Immun. 56:1242-1248. 37. miller, V., J.J. farmer III, W.E. hill, and S. falkow. 1989. The ail locus is found uniquely in Yersinia enterocolitica serotypes commonly associated with disease. Infect. Immun. 57:121-131. 38. minnich, S. A., m. J. Smith, S. d. Weagant and P. feng. 2001. Yersinia, Chapter 19, pp. 471-514. In foodborne disease handbook, 2nd Ed., Vol. 1. Y. h. hui, m. d. Pierson, J. R. Gorham (Eds.) marcel dekker, Inc. New York. 39. Pai, C.h., and l. deStephano. 1982. Serum resistance associated with virulence in Yersinia enterocolitica. Infect. Immun. 35:605-611. 40. Pierson, d.E., and S. falkow. 1990. Nonpathogenic isolates of Yersinia enterocolitica do not contain functional inv-homologous sequences. Infect. Immun. 58:1059-1064. 41. Portnoy, d.A., S.l. moseley, and S. falkow. 1981. Characterization of plasmids and plasmid-associated determinants of Yersinia enterocoliticapathogenesis. Infect. Immun. 31:775-782. 42. Portnoy, d.A., and R.J. martinez. 1985. Role of plasmids in the pathogenicity of Yersinia species. Curr. Top. microbiol. Immunol. 118:2943. Prpic, J.K., R.m. Robins-Brown, and R.B. davey. 1985. In vitro assessment of virulence in Yersinia enterocolitica and related species. J. Clin. microbiol. 22:105-110. 44. Ramamurthy T, Yoshino K, huang x, Balakrish Nair G, CRNAiel E, maruyama T, fukushima h, Takeda T. 1997. The novel heat-stable enterotoxin subtype gene (ystB) of Yersinia enterocolitica: nucleotide sequence and distribution of the yst genes. microbial Pathogenesis. 23: 189-200. 45. Robins-Brown, R., and K. Prpic. 1985. Effects of iron and desferrioxamine on infections with Yersinia enterocolitica. Infect. Immun. 47:774-779. 140

46. Robins-Brown, R., m.d. miliotis, S. Cianciosi, V.l. miller, S. falkow, and J.G. morris. 1989. Evaluation of dNA colony hybridization and other techniques for detection of virulence in Yersinia species. J. Clin. microbiol. 27:644-650. 47. Schiemann, d.A. 1982. development of a two-step enrichment procedure for recovery of Yersinia enterocolitica from food. Appl. Environ. microbiol. 43:14-27. 48. Schiemann, d.A. 1989. Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis, pp. 601-672. In: foodborne Bacterial Pathogens. m. doyle (ed). marcel dekker, New York and Basel 49. Sereny, B. 1955. Experimental Shigella keratoconjunctivitis. Acta microbiol. Acad. Sci. hung. 2:293-296. Simona Ivana, 2002 Bacteriologie veterinar special (Ed. Ceres, Bucureti; 460 pagini), ISBN: 973-40-0568-5 50. Simona Ivana, 2005 Bacteriologie general (Ed. tiinelor medicale, Bucureti; 250 pagini), ISBN: 973-86485-7-2 51. Simona Ivana, 2006 Tratat de bacteriologie medical-veterinar i introducere n micologie (Ed. tiinelor medicale, Bucureti;768 pagini), ISBN (10) 973-86571-5-6; ISBN (13) 978-973-86571-5-1 52. Simona Ivana, 2007 manual de microbiologia alimentelor (Ed. tiinelor medicale, Bucureti; 160 pagini), ISBN: 978-973-86571-3-7 53. Simona Ivana, 2007 microbiologie medical veterinar, Vol. I (Ed. tiinelor medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-01-6 54. Simona Ivana, 2007 microbiologie medical veterinar, Vol. II (Ed. tiinelor medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-02-3 55. Simona Ivana, 2008, microbiologia alimentelor, Ed. orizonturi, ISBN: 978973-736-090-8 56. Simona Ivana, 2008, Practical guide of microbiogical diagnosis, Ed. orizonturi, ISBN: 978-973-736-089-2 57. Tsubokura, m., K. otsuki, K. Sato, m. Tanaka, T. hongo, h. fukushima, T. maruyama, and m. Inoue. 1989. Special features of distribution of Yersinia pseudotuberculosis in Japan. J. Clin. microbiol. 27:790-791. 58. Wauters, G. 1981. Antigens of Yersinia enterocolitica, pp. 41-53. In: Yersinia enterocolitica. E.J. Bottone (ed). CRC Press, Boca Raton, fl. 59. Wauters, G., m. Janssens, A.G. Steigerwalt, and d.J. Brenner. 1988. Yersinia molleretii sp. nov. and Yersinia bercovieri sp. nov., formerly called Yersinia enterocolitica biogroups 3A and 3B. Int. J. Syst. Bacteriol. 38:424-429. 60. Weagant, S.d. 1983. medium for the presumptive identification of Yersinia enterocolitica. fdA laboratory. Appl Environ microbiol. 45(2):472-3. 61. Weagant, S. d. and P. feng. 2001. Yersinia, Chapter 41, pp. 421-428. In Compendium of methods for the microbiological Examination of foods. 4th Ed., f. Pouch downes and Keith Ito (Eds.) American Public health Assoc. Washington, d. C. 141

62. Weissfeld, A.S., and A.C. Sonnenwirth. 1982. Rapid isolation of Yersinia spp. from feces. J. Clin. microbiol. 15:508-510. 63. zink, d.l., J.C. feeley, J.G. Wells, C. Vanderzant, J.C. Vickery, W.d. Roof, and G.A. odonovan. 1980. Plasmid-mediated tissue invasiveness in Yersinia enterocolitica. Nature 283:224-226.

142

cAPiTolUl 4 ImPLICAIILE BACTErIILOr dIn gEnUL VIBrIO n PrOdUCErEA TOxIInfECIILOr ALImEnTArE

4.1. Caractere generale
Genul Vibrio face parte din familia Vibrionaceae (cu 8 genuri). Cuprinde 76 de specii. Genul reunete bacili Gram negativi cu aspect caracteristic de virgul (rar n S), necapsulogeni, nesporogeni i extrem de mobili. n mediile lichide prezint flageli polari (mono sau lofotrichi), iar pe mediile solide formeaz flageli laterali. V. parahaemolyticus reprezint principala cauz a gastroenteritelor epidemice, mai ales n zonele unde se consum pete crud (Japonia). Exist dovezi c nc alte 4 specii halofile de Vibrio sunt patogene pentru om: V. alginolyticus, V. fluvialis, V. metschnikovii i V. vulnificus. Toate aceste specii halofile se difereniaz printr-unul sau mai multe teste biochimice.
Tabelul 4.1. Teste biochimice de difereniere ntre V. parahaemolyticus i alte specii de Vibrio Specia flageli laterali pe mediul solid Bacili Reacia Voges-Proskauer Creterea n mediu cu 10% NaCl dezvoltarea n NaCl 6% fenomenul de roire Producia de acetoin/ diacetil Sucroz Celobioz utilizarea putresceinei Agar TCBS V. parahaemolyticus V. alginolyticus V. vulnificus + d + + v + d + + + + + + % g C + + v

Legend: d = drept; C = curb; v = verde; g = galben; % = 11-90% din tulpinile pozitive 143

Alimentele frecvent implicate n epidemiile cu V. parahaemolyticus sunt reprezentate de: pete, stridii, crevei, crabi, homari, scoici. Toxiinfeciile alimentare sunt probabil provocate de refrigerarea necorespunztoare, de fierberea insuficient, de contaminarea ncruciat sau de recontaminare. Tulpinile izolate de la bolnavi sunt de regul hemolitice, iar activitatea hemolitic a acestei bacterii poart denumirea de fenomenul Kanagawa. Tulpinile Kanagawa pozitive produc o hemolizin direct termostabil, iar tulpinile Kanagawa negative produc o hemolizin termolabil. Exist tulpini care produc ambele hemolizine. hemolizina termolabil nrudit reprezint un factor important de virulen pentru unele tulpini de V. parahaemolyticus. Acesta este un organism halofil ce poate fi detectat n apele oceanice i costiere la temperaturi n jur de 19-20C. un studiu efectuat n golful Chasapeake (pe coasta de est a SuA) arat c bacteriile supravieuiesc n sedimentul marin pe timpul iernii, iar apoi sunt eliberate n coloana de ap prin zooplancton din aprilie pn la sfritul lui iunie. Aceste microorganisme nu se gsesc de obicei n adncimile oceanelor deoarece nu pot tolera presiunea hidrostatic. V. parahaemolyticus se dezvolt optim la un ph de 7,2-7,3 i 3% NaCl sau la un ph 7,6 i 7% NaCl. Genul Vibrio reunete bacili Gram negativi, frecvent ncurbai sau n virgul, nesporogeni, mobili n medii lichide, prin flageli polari, mono sau lofotrihi, iar pe medii solide prin flageli laterali cu lungime de und mai mic dect flagelul polar, catalaz i oxidaz pozitivi. Excepie face numai V. metschnikovii, care este oxidaz negativ. Sunt germeni nepretenioi nutritiv, facultativ anaerobi i fermenteaz zaharurile fr producere de gaz. Cele mai multe specii sunt sensibile la agentul vibriostatic o/129 (2,4-diamino-6,7-di-izopropilpteridin) n concentraii de 10 i/sau 150 g. Produc variate enzime extracelulare, care includ toxine citotoxice i citolitice, neuraminidaz, chitinaz, proteaze, lipaze etc. Sunt organisme acvatice adaptate la variate saliniti (clorura de sodiu stimuleaz creterea unor specii i este obligatorie pentru altele). Abund n apele marine i estuariene n simbioz cu vertebratele i nevertebratele acestor ecosisteme.

4.2. Taxonomie
familia Vibrionaceae, cuprinde genurile: Vibrio, Allomonas, Catenococcus, Enterovibrio, Grimontia, Listonella, Photobacterium, Salinivibrio n genul Vibrio sunt ncadrate mai multe specii, patogene i nepatogene.
144

hibridrile RNA-dNA indic o nrudire, de aproape 60%, cu genurile Aeromonas i Plesiomonas, ceea ce justific separarea acestor taxoni. Sunt cunoscute pn n prezent aproximativ 49 specii de Vibrio, patogene att pentru om (aproximativ 12) ct i pentru animale (24). dintre speciile nou ncadrate i descrise de ctre Bergeys manual of determinative Bacteriology, 9th ed., 2000, amintim: 5 Vibrio albensis, a fost descris de ctre lehmann i Neumann n 1896 i inclus taxonomic de Skerman, n 1980. 5 Vibrio alginolyticus, subspecia iophagus a fost descris de ctre Welton i Woods, n 1973 i ncadrat taxonomic de ctre moore i Cato (1985); 5 V. anguillarum, descris de ctre Bergeman, n 1909 i ncadrat taxonomic de ctre Skerman n 1980, rencadrat de mac donell i Colwell, n 1986, sub denumirea de Listonella anguillarum. 5 V. fischerii, a fost studiat i ncadrat taxonomic de lehmann i Neumann sub aceast denumire, nc din 1980, ns a fost recunoscut i ncadrat ca specie Vibrio n 1994. 5 V. campbelli a fost denumit i studiat de Baumann n 1981; 5 V. diabolicus a fost descoperit la un anelid polichet, descoperit n curenii marini hidrotermali de adncime, fiind descris i ncadrat n 1997. 5 V. ichthyoenteri a fost descris n 1996 de Ishimaru i col.; 5 V. gazogenes a fost denumit i ncadrat taxonomic de ctre harwood i col., n 1980, fiind recunoscut ca specie n 1994. Cinetica asocierii dNA-RNA indic o anumit heterogenitate filogenetic a genului n care se pot contura urmtoarele grupuri de vibrioni: 5 vibrioni O:1 V. cholerae; 5 vibrioni non O:1 V. metschnikovii 5 vibrioni halofili V. furnissi.

4.3. Istoric
holera a fost descris pe toate continentele n decursul a ase pandemii. Prima a aprut n 1817, n India, Pakistan, Birmania, de unde a difuzat n China i Europa n decursul a patru ani. Cea de-a doua s-a declanat n Europa (1829) i a difuzat n America de Nord. n Romnia a fost semnalat n 1913, n cursul celei de-a asea pandemii. nc din 1855, Snow a artat c holera este transmis la om de un microb din ap, fecale sau alimente contaminate.
145

n anul 1833, Robert Koch, izoleaz agentul cauzal i demonstreaz reproducerea bolii la cobaii inoculai intraduodenal i intragastric. n trecut, holera gastric era denumit i holer asiatic, datorit izbucnirii mai frecvent a pandemiilor n zona Indiei i Asiei. ncadrat n categoria vibrionilor non-holerici, Vibrio parahaemolyticus determin gastroenterite la consumatorii de produse acvatice contaminate. fujino i col. au izolat pentru prima dat bacteria n anul 1951 din scaunele bolnavilor care au consumat o specialitate de pescrie denumit shirasu, de unde au dat i numele toxiinfeciei alimentare. Takikawa i fujisawa izoleaz bacteria din fecalele unor bolnavi cu gastroenterit, ncadrnd-o n genul Pseudomonas. miyamoto i col. (1961) decid ncadrarea acestei bacterii n familia Enterobacteriaceae. ulterior, datorit diferenelor metabolice clare fa de aceast familie, a fost ncadrat n genul Vibrio. Sakazaki i col. mpart tulpinile izolate n trei grupe, i anume: grupa 1, ce ncadreaz tulpinile ce se dezvolt n ap peptonat, cu adaos de 3-7% clorur de sodiu, nu produc acetil-metil-carbinol, nu fermenteaz zaharoza; grupa 2, cuprinde tulpinile care se dezvolt n ap peptonat, cu adaos de 3,7-10% NaCl, fermenteaz zaharoza, produc acetil-metil-carbinol, se izoleaz, de obicei, din apele marine i din animalele acvatice, implicat, mai rar n etiologia gastroenteritelor umane; grupa 3, cuprinde tulpini care se dezvolt pe medii cu 3% NaCl, nu fermenteaz zaharoza i nu produc acetil-metil-carbinol, care se izoleaz de la animalele acvatice. Brzoi i lzrescu (1972) au izolat mai multe tulpini de vibrioni nonholerici din petele marin, n Romnia.

4.4. morfologie
Genul Vibrio reunete bacili Gram negativi, cu diametrul de 0,5-2/0,30,4 microni, frecvent ncurbai ntr-un singur plan, cu aspect caracteristic de cornioare sau de virgul, necapsulogeni, nesporogeni i extrem de mobili. n mediile lichide, mobilitatea le este asigurat de flageli polari, mono sau lofotrihi, iar pe mediile solide, prin flageli laterali, cu lungime de und mai mic dect a flagelului polar. la examenul ntre lam i lamel, pe fond ntunecat din culturi n medii lichide, V. cholerae prezint o micare vie de rostogolire, caracteristic organismelor monoflagelare, care se traduc plastic prin traversarea
146

cmpului microscopic ca bancurile de pete, ca sgeile sau cu micri dezordonate, de unde i numele de Vibrio (vibraii). n culturile tinere predomin formele ncurbate n virgul i ocazional sub forma literei S. o dat cu mbtrnirea culturii, formele drepte devin tot mai numeroase, iar diferenierea de ali bacili enterici devine tot mai dificil. Cultivai pe medii cu concentraii suboptimale de clorur de sodiu, vibrionii apar polimorfi. Polimorfismul este accentuat, mai ales la speciile halofile, n frotiurile din prelevate patologice de la formele fine, bacilare, cu ncurbare minim, pn la forme cocobacilare. dup subcultivarea acestor specii, pe medii cu concentraie salin favorabil, revin la morfologia normal.

4.5. Condiii de cultivare i caractere culturale

Sunt germeni aerobi (dezvoltndu-se foarte bine n prezena oxigenului la suprafaa mediilor) i tolereaz ph-ul alcalin 8,6-9,6. Nu sunt pretenioi din punct de vedere nutritiv, dezvoltndu-se pe medii simple (ap peptonat, glucoz simpl) sau ap peptonat alcalin la 37C. n bulion produc o turbiditate intens, iar uneori formeaz la suprafaa mediului o pelicul. dezvoltarea culturii bacteriene apare mai abundent la suprafaa mediului, fiind mai intens n medii alcaline. Pe agar simplu formeaz colonii cu diametrul de 2-5 mm, turtite sau uor convexe, netede, umede, lucioase. Exist variante de colonii transparente sau opace. Variantele rugoase formeaz colonii zbrcite, greu emulsionabile. Pe agar cu 5% snge de berbec, iepure sau cal, V. fluvialis, V. metschnikovii, tulpinile non o:1 de V. cholerae produc beta hemoliz dup 24 de ore de incubare la 37 C. V. alginoliticus V. parahaemolyticus sau V. vulnificus sunt nehemolitice sau produc numai o nverzire a mediului, circumscris coloniilor, echivalent alfa hemolizei. Activitatea hemolitic a lui V. parahaemolyticus este cunoscut sub denumirea de fenomenul Kanagawa. Acest fenomen reprezint beta hemoliza pe care o produce V. parahaemolyticus n condiii speciale de cultivare, i anume pe agarul Wagatsuma (agar cu d-manitol, cu 7% NaCl i snge uman grupa o sau snge de iepure). Tulpinile Kanagawa negative se izoleaz mai rar din cazuri de toxiinfecii alimentare i nu reproduc boala prin administrri la voluntari.
147

hemolizina Kanagawa a fost identificat ca o toxin letal cu efect cardiotoxic. Pe medii fr concentraie optim de sare, majoritatea speciilor halofile nu se pot dezvolta. unele tulpini de V. alginoliticus i V. parahaemolyticus prezint o cretere invaziv. la V. parahaemolyticus acest tip de cretere este declanat de condiiile feriprive i de limitarea rotaiei flagelare la replicarea n bulion pe mediu agarizat (dezvoltarea flagelilor laterali). Pe agarul mac Conkey se dezvolt numai unele specii (V. cholerae), care formeaz colonii lactoz-negative. Izolarea vibrionilor (din materii fecale) impune utilizarea mediilor selective. Selectivitatea se bazeaz pe capacitatea vibrionilor de a crete la ph 8,6, care este defavorabil dezvoltrii multor specii bacteriene. de asemenea, au capacitatea de a tolera concentraiile toxice ale unor compui organici (bil, sruri biliare) sau anorganici (iodur de potasiu, telurit de potasiu). Cel mai indicat este s se foloseasc un mediu cu selectivitate medie, cum ar fi mediul B.S.A. (bile salts agar) i cu selectivitate nalt, ca de exemplu mediul T.C.B.S. (thiosulphate-citrate-bile-salts-sucroze).
Tabelul 4.2. Aspectul culturii de 18-24 ore pe mediul T.C.B.S. a speciilor de Vibrio, comparativ cu alte specii posibil asociate (dup Buiuc d., 1999) fermentarea diam. culoarea Specia zaharozei Cretere coloniei (mm) coloniilor (% tulpini) V. cholerae V. alginolyticus V. fluvialis V. furnissi V. metschnikovii V. parahaemolyticus Aeromonas hydrophila Plesiomonas shighelloides Proteus vulgaris Alte enterobacteriacee Pseudomonas spp. 2-3 2-5 2-3 2-3 2-4 2-5 0-3 1 2-3 0,1 variabil 148 100 99 100 100 100 1 > 90 0 97 variabil 0 galben galben galben galben galben verde galben verde galben transparente verde bun bun bun bun poate fi slab bun variabil variabil bun variabil variabil

Se mai folosete, ca mediu de izolare, agarul cu 5% snge de berbec. Izolarea germenului din plgi contaminate cu ap de mare, muctur de rechin etc., se poate face pe un mediu selectiv. 4.6. Proprieti biochimice fermenteaz zaharurile fr producere de gaz (glucoz, galactoz, sucroz, manoz). Produc oxidaz i catalaz. lichefiaz gelatina, hidrolizeaz cazeina, reduc nitraii n nitrii. Nu produc ureaz i nici hidrogen sulfurat. V. cholerae i V. parahaemolyticus produc lecitinaz i indol la 22C i la 37C, fermenteaz manita, hidrolizeaz amidonul, decarboxileaz lizina i ornitina, cresc la 5C.
Tabel 4.3. Caractere biochimice difereniale ale speciilor din genul Vibrio (dup Janda, 1998, mclaughlin, 1995) V. V. parahae- V. alginoV. V. V. cholerae molyticus lyticus fluvialis furnissi metschnikovii 100 100 100 100 100 0 99 20 19 31 0 90

Testul

oxidaz 0/129 zon de inhibiie la discul cu 150 g Crete n bulion cu 0% NaCl 1% NaCl 6% NaCl 8% NaCl 10% NaCl 12% NaCl Indol decarboxilaze, Moeller Arginin lizin ornitin oNPG VogesProskauer

100 100 53 1 0 0 99 0 99 99 94 75

0 100 99 80 2 1 98 0 100 95 5 0 149

0 99 100 94 69 16 85 0 99 50 0 95

0 99 96 71 4 0 13 93 0 0 40 0

0 99 100 78 0 0 11 100 0 0 35 0

0 100 78 44 4 0 20 60 35 0 50 96

Acid din: l-arabinoz m-inozitol lactoz zaharoz ureaz

0 0 7 100 0

80 0 1 1 15

1 0 0 99 0

93 0 3 100 0

100 0 0 100 0

0 40 50 100 0

4.7. Ecologie
Vibrionii sunt microorganisme acvatice. Speciile halofile sunt limitate la apele marine, estuariene, costiere i lagunare. Speciile non-halofile se gsesc i n apele dulci: ruri, lacuri. Prezena vibrionilor n apele dulci este tranzitorie. n apele marine se gsesc sub mai multe forme: forma liber triete n aceste ape atta timp ct apa le ofer transporturi i concentraii de nutrieni optime pentru cretere; forma epibiotic reprezint o asociaie intim a vibrionilor cu matricea chitinoas a zooplanctonului, a scoicilor sau copepodelor. Vibrionii epibioni rezist mai mult n mediul marin dect vibrionii liberi i traverseaz mai uor bariera gastric acid; forma dormant este reprezentat de microvibrioni, care sunt celule necultivabile, prezena lor fiind demonstrat prin coloraii imunofluorescente a probelor provenite din mediul marin.

4.8. factorii de patogenitate

Vibrionii sunt rspunztori de producerea enzimelor extracelulare, care sunt foarte variate i includ toxine citotoxice i citolitice, neuraminidaz, chitinaz, proteaze, lipaze etc.

4.9. Specii mai importante de vibrioni

Vibrio cholerae (Pacini, 1854), sinonim Vibrio comma. V. cholerae a fost izolat i descris de ctre Roberth Koch n 1884, ca fiind agentul holerei la om. holera se caracterizeaz prin gastroenterit, manifestat clinic prin diaree profuz (pn la 100 de scaune pe zi, cu aspect caracteristic de ap de orez) i deshidratare rapid. letalitatea este
150

n medie de 50%, prezentnd un interes major pentru sntatea public prin morbiditate i mortalitate. Este determinat de serogrupele o:1 i o:139. Principalul factor de patogenitate al vibrionilor holerigeni este reprezentat de enterotoxina termolabil de natur proteic, numit i factor de permeabilizare. Toxina se leag ireversibil de celulele mucoasei intestinului subire, fiind responsabil de fuga de ap i de ioni, din esuturi. Neuraminidaza (sialidaza) reprezint factorul de fluidificare a mucusului. lecitinaza eliberat de vibrionul holeric este nc insuficient studiat. Sursele de infecie sunt determinate de apa i alimentele infectate, vectorul viu fiind musca. holera are o evoluie epidemic sau pandemic, iar n prezent se limiteaz la Extremul orient i la Africa occidental, cu o recrudescen din patru n patru ani. Vibrionul holeric se transmite, cel mai frecvent, prin consumul de ap potabil contaminat i, mai rar, prin intermediul unor alimente (n principal acvatice). Rezervorul de infecie principal l reprezint omul bolnav, purttorii convalesceni i purttorii sntoi. n ultimii ani s-a evideniat c exist purttori umani cronici, ce pot elimina prin fecale, timp de cteva luni, cantiti enorme de vibrioni. Rezervoarele naturale de vibrioni holerici sunt reprezentate de crustacee, molute (crabi, midii, stridii) i unele specii de pete. Vibrionii holerici sunt considerai ca specie endemic pentru apele litorale, estuare, delte i chiar bli. Studiile fcute n apele de coast ale SuA i Australiei au demonstrat existena unor rezervoare de Vibrio cholerae (att tulpini o1 ct i non-o1) n crustacee i molutele cu cochilie. de aceea, n aceste state, sursa principal de infecie o constituie consumul de stridii. Vibrio parahaemolyticus (fujino i col., 1931) Este o bacterie halofil, cu sediul n mediul marin (ap i alimente derivate din fauna marin, mai ales pete oceanic) care determin la om enterite acute grave, mai ales n zonele geografice unde se consum mult pete de mare. Toxiinfeciile alimentare sunt mai frecvente n sezonul cald, cnd temperatura apei depete 15C. Tulpinile izolate de la bolnavi sunt de regul hemolitice, iar activitatea hemolitic a acestei bacterii poart denumirea de fenomenul Kanagawa.
151

hemolizina Kanagawa a fost identificat ca o toxin letal cu efect cardiotoxic. n mod obinuit aceast specie produce hemoliz de tip beta pentru sngele de om. factorul care d reacia Kanagawa pozitiv const ntr-o hemolizin termolabil i o lizin termostabil. n 1971, investigaiile fcute de Sakazaki i colaboratorii, pe 2720 de tulpini de V. parahaemolyticus izolate de la bolnavii cu diaree, au demonstrat c 98% dintre acestea erau Kanagawa pozitive, n timp ce din 650 de tulpini de V. parahaemolyticus izolate de la vieuitoare acvatice doar 1% erau Kanagawa pozitive. Aceast corelaie ntre fenomenul Kanagawa i proveniena tulpinilor, i-a determinat pe cercettori s foloseasc acest test pentru identificarea tulpinilor virulente. Testarea acestei teorii pe animalele de laborator a demonstrat c tulpinile de V. parahaemolyticus, Kanagawa pozitive produc dilatarea ansei ileale ligaturate de iepure, n timp ce tulpinile Kanagawa negative nu produc aceast dilatare. hemolizina Kanagawa este o molecul proteic sensibil la tripsin i termostabil, cu o greutate molecular de 44.000 daltoni, compus din dou uniti monomerice identice cu greutatea molecular de 22.000 daltoni. V. parahaemolyticus mai produce i alte toxine (adezine i mucinaze) ce asigur aderarea i ptrunderea bacteriei n enterocit, unde se iniiaz producerea de hemolizine. Rezervorul principal pentru V. parahaemolyticus este reprezentat de apele estuarelor, apele litorale, sedimentul blilor, zooplancton, pete, meduze, crustacee, sepii i calmari (oliver i colab., 1997). Toxiinfeciile alimentare au un caracter sezonier, majoritatea cazurilor fiind semnalate n lunile iunie-octombrie. Numai tulpinile Kanagawa pozitive sunt capabile s declaneze toxiinfecii alimentare (oliver i colab., 1997). Studiile efectuate pe probe de alimente, ap i sedimente marine, arat c doar 1% dintre tulpinile izolate sunt Kanagawa pozitive. Cel mai frecvent implicate n producerea unor toxiinfecii alimentare sunt crustaceele i lamelibranhiatele consumate crude sau insuficient preparate termic. Beuchat (1982) a constatat c din 42 de cazuri de toxiinfecii alimentare determinate de V. parahaemolyticus, 33 au fost produse prin consum de crevei, consumai sub form crud sau tratai termic prin abur nclzit. Cel mai mare episod de toxiinfecii alimentare cu V. parahaemolyticus a avut loc n SuA, producnd 320 de mbolnviri prin consumul de crevei fieri insuficient i pstrai n condiii improprii. Tot n SuA, majoritatea
152

cazurilor de mbolnviri au fost provocate de consumul de midii i stridii crude, recoltate din apele Pacificului. Vibrio vulnificus Produce mai multe toxine. Cea mai important este o hemolizincitolizin, o toxin extracelular cu proprieti antigenice, termolabil i citolitic pentru eritrocitele de mamifere. Aceast toxin are o greutate molecular de 56.000 daltoni i acioneaz mpreun cu ali factori de virulen. Aceast hemolizin acioneaz, n special, n infeciile extradigestive, determinnd edem, necroz local sau distrucii locale de esut (Kreger i lockwood, 1981). Studiile clinice efectuate de oliver i colab. (1989) au dus la concluzia c exist o legtur ntre septicemiile cu V. vulnificus i o serie de disfuncii hepatice, cum sunt cele produse de etilism, hepatite cronice, hepatoze, care determin o suprancrcare a capacitii de legare a fierului de ctre transferina seric. Simpson i olivier au demonstrat c tulpinile virulente de V. vulnificus nu au produs infecia, cnd transferina era incomplet saturat n fier, dar aceasta s-a instituit rapid, atunci cnd transferina era complet saturat. Simpson i colab. au artat c exist o corelaie strns ntre virulen i aspectul morfologic al coloniilor. Ei au observat c tulpinile virulente formau colonii opace i translucide, iar cele avirulente formau numai colonii translucide. Au corelat opacitatea coloniilor cu capacitatea tulpinilor de a folosi fierul, legat de transferin i cu virulena (prezena capsulei). V. vulnificus a fost izolat n toat lumea, rezervor principal fiind considerate stridiile. A fost izolat i din crabi, raci, peti i crevei (Tamplin i colab., 1982). Vibrio alginolyticus (miyamoto i col., 1961). Este o specie asemntoare cu V. parahaemolyticus. Prezint cili laterali, fenomenul de roire pe suprafaa mediilor solide, capacitatea de multiplicare la 40C, metabolizarea zaharozei, valeratului, l-leucinei i ltirozinei. farmer i colab. (1985) constat c n urma unui studiu pe 74 de izolate, 5,4% au origine fecal sau intestinal. n Japonia, V. alginolyticus a fost izolat n procent de 0,5% din populaia sntoas, neasociat cu simptome specifice bolilor aparatului digestiv.
153

Vibrio alginolyticus a fost izolat din toate tipurile de alimente cu origine acvatic: peti, crevei, homari, crabi, scoici, midii, stridii. Vibrio anguillarum (Bergeman, 1909) Este o specie patogen pentru peti, la care produce o boal septicemic (septicemia hemoragic) caracterizat prin leziuni de miozit necrotic i hemoragii subcutanate. Produce pierderi n cresctorii. declanarea infeciei este corelat cu temperatura apei, care trebuie s aib minimum 15C. 7. Vibrio metschnikovii, Gamabia, 1888 (V. cholerae biovar proteus, Shewar i Veron, 1974). Produce gastroenterit la psri i o form benign de holer la om, descris sub numele de cholera nostras. Aceast specie se ntlnete sporadic n apa potabil i apa marin din fiorduri, golfuri sau mri nchise. A fost semnalat la gtele i raele domestice, hrnite cu fin de pete sau care sunt crescute n sistem extensivgospodresc. Vibrio mimicus A fost izolat din scoici i probe de ap i din scaunele diareice i probele de secreie otic de la pacienii cu gastroenterite sau cu otite externe. Se transmite prin produse marine crude.

4.10. metode de izolare i identificare a speciilor din genul Vibrio din alimente
Pentru identificarea corect a vibrionilor trebuie respectate dou aspecte: cultivarea vibrionilor halofili s se realizeze pe medii de purificare a culturii i de identificare cu concentraie optim de clorur de sodiu. de exemplu, V. parahaemolyticus izolat pe mediul TCBS i subcultivat pe medii nesuplimentate cu clorur de sodiu prezint caractere biochimice aberante; urgena identificrii lui V. cholerae; este favorizat de caracterul nonhalofil al speciei.
154

Tabelul 4.4. Caractere difereniale ale biovarurilor de V. cholerae 0:1 (dup Buiuc d., 1999) Testula clasic biovarul El-Tor b hemoliza d c hemaglutinarea + Sensibilitatea la: + Polimixina B (50 uI) fagul clasic IV + fagul El Tor + a Simboluri: + = > 90% din tulpini pozitive; d = 11-89% din tulpini pozitive; - = > 90% din tulpini negative. b hematii de berbec. c hematii de pui de gin.

Pentru identificare se trimit la laborator materiale patologice reprezentate de probe de ap, coninut intestinal, alimente pete i fructe de mare. Examenul bacterioscopic const n efectuarea de nsmnri din probe proaspete sau conservate n medii de transport (Cary-Blair). folosirea ca mediu de cultur a apei peptonate alcaline cu efectuarea de pasaje la ase ore de la suprafaa mediului, permite izolarea rapid a germenului n cultur pur. Se examineaz aspectul cultural i mobilitatea accentuat a germenilor. Pentru identificarea preliminar a genului se mai pot folosi urmtoarele teste: oxidaz, sensibilitatea la agentul vibriostatic o/129, tolerana la 6-6,5% NaCl i testul uviei de dNA. Testul oxidazei difereniaz speciile de Vibrio, Aeromonas i Plesiomonas shigelloides, oxidaz pozitive, de enterobacteriacee, care eventual cresc pe mediile selective (de exemplu: Proteus vulgaris), oxidaznegative. Excepie face V. metschnikovii, lipsit de citocromul C, care este oxidaz negativ. Principiu: Citocrom oxidaza este o hemoprotein din lanul respirator de transport al electronilor, cuplat cu fosforilarea oxidativ. Sub aciunea citocrom oxidazei tetrametil-p-fenilendiamina este oxidat ntr-un compus de culoare purpurie. Procedura: Se plaseaz un dreptunghi din hrtie de filtru ntr-o plac Petri i se umecteaz cu reactivul pentru oxidaz. Se prelev o poriune de
155

colonie cu o ans de platin ori cu vrful unei pipete Pasteur cudat n tromp de musc i se etaleaz uor n spot pe suprafaa hrtiei impregnate. Testul pozitiv: Se traduce prin virajul spotului la purpuriu n interval de 10 secunde. un viraj mai tardiv, ntre 10 i 60 de secunde, nu este caracteristic: poate fi datorat testrii unei culturi btrne sau de pe un mediu cu carbohidrai fermentabili. Testul negativ: Se traduce prin absena culorii purpurii. Testul vibriostatic cu o/129 (2,4-dinamic-6,7-diizopropilpteridina). Se prepar o suspensie a tulpinii de identificat cu turbiditatea echivalent etanolului 0,5 mac farland i se nsmneaz ca pentru antibiograma difuzimetric o plac cu agar tripticaz soia. Se plaseaz pe aria nsmnat cte un disc cu 10 g i respectiv 150 g o/129. orice zon de inhibiie aprut n fundul discurilor dup ncurbare peste noapte semnific un test pozitiv. Eficiena testului a devenit relativ odat cu apariia tulpinilor de V. cholerae rezistente la o/129. de exemplu, peste 90% din tulpinile de V. cholerae o:1 izolate n India sunt rezistente la ambele concentraii. deci, rezistena la o/129 nu exclude n mod necesar aceast specie. Tolerana la 6-6,5% naCl. Acest test difereniaz corect genul Vibrio, tolerant, de Aeromonas i Plesiomonas, care nu cresc la aceast concentraie salin. Testul uviei de dnA. Se suspensioneaz o colonie suspect de Vibrio, ntr-o pictur din soluia 0,5% dezoxicolat de sodiu depus pe o lam de microscop. Prin liza vibrionilor este eliberat dNA, care poate fi tras cu ansa ca o uvi. Testul difereniaz rapid V. cholerae de Aeromonas spp., care sunt oxidaz pozitive i pot forma colonii asemntoare pe mediile de izolare. Alternativ, izolatele suspecte pot fi triate pe mediul TSI: Vibrionii cu interes medical: fermenteaz fr producere de gaz glucoza; fermenteaz sau nu zaharoza; uzual, speciile diareigene nu fermenteaz lactoza; nu produc h2S. Aeromonadele diareigene, uzual produc gaz din glucoz. orict de fidel ar fi, un singur test nu individualizeaz corect genul Vibrio.
156

Pentru ca diferenierea s fie corect avem nevoie de o baterie minimal de teste, care include: oxidaze, creterea pe agar nutritiv cu 0% i 6% NaCl, fermentarea glucozei cu/fr gaz, testul uviei de dNA, sensibilitatea la 10 i 150 g o/129, la 10 g ampicilin. Teste definitive. Se procedeaz la testele biochimice de confirmare a V. cholerae sau de identificare a celorlalte specii de Vibrio pornind de la cultura pur a izolatelor suspecte. Se utilizeaz pentru testri, medii cu concentraia de NaCl crescut pn la 1%, cu excepia testelor de cretere n absena sau la alte concentraii de sare. Se incubeaz la 30-37C i se urmresc rezultatele, pn la o sptmn cu citire zilnic, pentru c, frecvent se pozitiveaz i n primele dou zile.
Tabel 4.5. Caractere biochimice difereniale ale speciilor de Vibrio cu interes medical (dup Janda, 1998; mclaughlin, 1995) V. parahaemolyticus V. cincinnatiensis V. metschnikovii V. alginolyticus

Testula

oxidaz o/129 zon de inhibiie la discul cu 150 g Creterea n bulion cu: 0% NaCl 1% NaCl 6% NaCl 8% NaCl 10% NaCl 12% NaCl Indol Decarboxilaze Moeller Arginin lizin ornitin oNPG

100 100 100 100 100 100 100 100 95 99 100 100 53 1 0 0 99 95 100 100 49 0 0 0 98 20 98 19 31 0 40 90

0 90

100 100 25 100

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 99 99 99 99 99 100 100 100 100 99 65 100 96 100 83 95 78 100 100 80 0 94 71 78 0 0 44 62 0 2 0 69 4 0 0 0 4 0 0 1 0 17 0 0 0 0 0 0 0 98 97 85 13 11 97 0 20 8 100 0 99 50 0 93 100 0 0 0 0 40 35 0 0 0 0 95 50 0 0 60 35 0 50 0 0 57 100 0 0 86 0

0 0 0 0 99 100 100 99 99 99 95 55 94 90 5 75 157

V. carchariae

V. vulnificus

V. damsella

V. cholerae

V. mimicus

V. fluvialis

V. hollisae

V. furnissi

V. parahaemolyticus

V. cincinnatiensis 0

V. metschnikovii

V. alginolyticus

Testula

Voges-Proskauer 75 9 0 0 95 0 0 0 Acid din: l-arabinoz 0 1 80 0 1 93 100 97 m-inozitol 0 0 0 0 0 0 0 0 Salicin 1 0 1 95 4 0 0 0 lactoz 7 21 1 85 0 3 0 0 zaharoz 100 0 1 15 99 100 100 0 ureaz 0 1 15 1 0 0 0 0 a Rezultate pozitive exprimate procentual.

95 0 0 0 0 5 0

96 0 40 9 50 100 0

100 0 100 0 100 0 0 0 100 50 0 0

biotipia Vibrio cholerae o:1 se difereniaz n biovarurile, clasic i El Tor. Vibrio cholerae o:139 este o mutant o a biovarului El Tor. Serotipia Vibrio cholerae o:1 are, indiferent de biovar, trei serovaruri definite prin factorii antigenici a, b i c: ogawa (a, b), Inaba (a, c) i hikojima (a, b, c), primele dou curent izolate i cu rspndire epidemic, al treilea, foarte rar i nerecunoscut de ctre unii specialiti. Identificarea combinat biovar-serovar ofer un marker epidemiologic orientativ. Lizotipia Sistemul de lizotipare a biovarului El Tor a fost mult ameliorat prin completarea setului Basu-mukerjee, cu cinci fagi litici (I-V), cu ali cinci noi fagi i redefinirea diluiei test de la liza confluent la liza aproape confluent. n acest mod au fost definite 146 de lizovaruri care acoper tiparea a circa 99% din tulpini. Capacitatea discriminatorie a acestor lizovaruri este excelent, mai puin lizovarului 115, cu o prevalen de 12%. metode ale biologiei moleculare n prezent, mai greu accesibile, ofer markeri epidemiologici fideli pentru biovarul El Tor.
158

V. carchariae 50

V. vulnificus

V. damsella

V. cholerae

V. mimicus

V. fluvialis

V. hollisae

V. furnissi

Tehnica de lucru Prepararea probei a) probe de pete: se recolteaz esuturi de suprafa, intestine, branhii; b) crustacee cu cochilie: se recolteaz ntregul coninut interior; se adun 10-12 crustacee, din care se recolteaz 50 g pentru o prob test. c) crustacee fr cochilie: se prepar n ntregime sau se recolteaz poriunea central inclusiv branhii i intestine. Ziua I: Se amestec 450 ml de bulion cu NaCl 3% i polimixin B, ntr-un blender steril pentru 1 minut, cu 8.000 rpm. Aceasta reprezint diluia 1:10. n continuare se fac diluii seriate (1:100, 1:1.000, 1:10.000 etc.). din fiecare diluie seriat se trec cte 10 ml n cte 3 tuburi per diluie cu bulion GST (glucose salt Teepol). mbogirea: Se incubeaz bulioanele respective la 35C, 18-24 de ore. dac diluarea i incubarea nu se pot realiza n aceeai zi, probele se pstreaz pe ziua urmtoare la o temperatur cuprins ntre 0 i 5C. n cazul produselor congelate se recomand s se efectueze o a doua izolare dup 18 ore de incubare. ziua a II-a: Izolarea i identificarea: dup incubare se nsmneaz din fiecare tub o ans de cultur pe suprafaa mediului de izolare TCBS (agar cu sucrozsare-bil-citrat-tiosulfat) (m65) n plci Petri (cte 3 per diluie) astfel nct s se obin colonii izolate. Se incubeaz plcile la 35C, timp de 18-24 de ore. ziua a III-a: Testul diferenial I: Se recolteaz cu acul de nsmnare dou sau mai multe colonii tipice (netede, verzi, zaharoz negative, cu diametrul de 2-3 milimetri), de pe suprafaa plcilor cu agar TCBS i se transfer pe urmtoarele medii: a) Agar TSI salin: V. parahaemolyticus i V. vulnificus realizeaz o pant alcalin (roie = lactoz i zaharoz negative); baza mediului este acid (galben = glucoz pozitiv), fr producere de gaze i nu prezint nnegrire (hidrogen sulfurat negativ). Aceasta este o reacie tipic shigeloid (Shigella-like). V. alginolyticus, V. fluvialis i V. metschnikovii dau o pant acid i o baz fr gaz. b) Mediul TSA (3% NaCl) i TSB (3% NaCl): Se nsmneaz mediile TSA i TSB cu bacteria de cercetat i se nsmneaz 18-24 de ore la 35C. Aceste culturi se folosesc ca surse de inoculare pentru alte teste, pentru
159

coloraia Gram i examinri microscopice. Vibrionii sunt bacterii Gram negative, pleomorfe, cu aspect de bastonae, curbe sau drepte, prevzute cu flageli polari. c) Mediul pentru testarea mobilitii: Se inoculeaz un tub cu mediu pentru testarea mobilitii prin neparea centrului coloanei de mediu n profunzime. Se incubeaz 18-24 de ore la 35C. o cretere circular difuz de la linia de nepare constituie un test pozitiv. V. parahaemolyticus i vibrionii nrudii sunt mobili. ziua a IV-a: Testul diferenial II: a) Bulion cu glucoz Hugh-Leifson (Hugh-Leifson glucose broth): Se inoculeaz dou tuburi de mediu hlGB cu un ac de nsmnare de pe mediul TSA. Se acoper suprafaa mediului cu ulei mineral steril ntr-un strat de aproximativ 3 cm i se incubeaz 2-3 zile la 35C. dac culoarea mediului se modific din purpuriu n galben nseamn c microorganismul fermenteaz hidraii de carbon. V. parahaemolyticus i vibrionii nrudii fermenteaz glucoza fr producie de gaz. b) Testul de citocrom oxidaz: Se nsmneaz bacteria de cercetat pe mediul TSA i se incubeaz 24 de ore la 35C. Se adaug 2-3 picturi de reagent pentru testul oxidazei peste coloniile bacteriene crescute pe pant sau peste coloniile din plci Petri. dac n aproximativ 2 minute mediul se va colora n albastru nchis testul este pozitiv. V. metschnikovii este negativ, iar toi ceilali vibrioni halofili sunt pozitivi. c) Testul pentru dihidrolaza argininei, lizinei i ornitindecarboxilazei: mediile au culoare galben, ca rezultat al producerii de acid din glucoz. Apariia unei culori violete i tulburarea mediului la sfritul perioadei de incubare este considerat reacie pozitiv. Rezultatul acestor teste i a altor teste difereniale sunt prezentate n tabelul de mai jos:
Tabelul 4.6. Teste de difereniere a lui V. parahaemolyticus de bacteriile nrudite V. parahaemolyticus V. metschnikovii V. alginolyticus V. anguillarum Plesiomonas shigelloides + V. vulnificus Aeromonas hydrophila V. fluvialis var

Test

TCBS (colonii verzi) Creterea la 42C

+ +

160

+ nd

var

V. parahaemolyticus

V. metschnikovii

V. alginolyticus

V. anguillarum

Test

Creterea n medii cu: NaCl 0% NaCl 6% NaCl 8% NaCl 10% lizindecarboxilaz Arginindihidrolaz ornitindecarboxilaz fermentarea sucrozei fermentarea lactozei fermentarea manitolului fermentarea arabinozei Voges-Proskauer

+ + + + + + -

+ + + + var + + +

+ var var + + var

var + var + var -

+ var + + + + -

+ var var + + var + +

+ var var var var + var var

d) Mediul TSB (salt tripticase broth), halofilismul: Se nsmneaz 4 tuburi cu mediu TSB ce conin 0, 6, 8 i 10% NaCl, din cultura de TSB cu 3% NaCl. Se incubeaz 24 de ore la 35C. Speciile halofile de Vibrio care cresc i n absena srii se dezvolt bine n mediul cu 6% NaCl. V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. fluvialis i, ocazional, tulpinile de V. metschnikovii se dezvolt n 8% NaCl. Numai V. alginolyticus crete bine n mediile cu 10% NaCl. e) Creterea la 42C: Se inoculeaz un tub cu bulion TSB cu NaCl 2% cu o ans de cultur bacterian de 24 de ore de pe mediul TSB cu NaCl 3% i se incubeaz n baie marin la 42C, timp de 24 de ore. dac creterea are loc n profunzimea mediului reacia este considerat pozitiv. V. parahaemolyticus, V. alginolyticus i ocazional tulpinile de V. fluvialis i V. metschnikovii sunt pozitive la acest test. f) Bulionul MP-VP (testul Voges-Proskauer) (m56): se nsmneaz un mediu mP-VP cu o ans dintr-o cultur de pe mediul TSA i se incubeaz 2 zile la 35C. Se efectueaz testul Voges-Proskauer. V. parahaemolyticus, V. vulnificus i V. fluvialis sunt VP negative, n timp ce V. alginolyticus i V. metschnikovii sunt pozitive. g) Reaciile de fermentare n bulion cu bromcrezol purpuriu: Se inoculeaz cte un tub cu bulion cu sucroz, lactoz, manitol i arabinoz cu o cultur bacterian de pe mediul TSA i se incubeaz la 35C pentru 4,
161

Plesiomonas shigelloides + + + var var -

V. vulnificus

Aeromonas hydrophila

V. fluvialis

5 zile. Reacia acid se traduce prin virarea culorii bulionului din purpuriu n galben. Rezultatele acestor teste de fermentaie sunt incluse n tabelul de mai sus. h) Fenomenul Kanagawa (agar Wagatsuma) (m71): Reacia Kanagawa reprezint un test pentru determinarea prezenei hemolizinei termostabile directe specifice pe agarul Wagatsuma. S-a constatat c reacia pozitiv se coreleaz strns cu patogenitatea rezultatelor de V. parahaemolyticus. Izolatele care produc boala la om, sunt de obicei Kanagawa pozitive, n timp ce izolatele recuperate din hrana marin sunt Kanagawa negative, aproape ntotdeauna. Pentru efectuarea testului Kanagawa se introduce o pictur dintr-o cultur de 18 ore n TSB cu NaCl 3% cu o scobitoare steril pe o plac cu agar snge Wagatsuma, bine uscat. Se pot face mai multe nepturi de tip circular pe o singur plac. Se nsmneaz ntotdeauna culturi pozitive i negative pe fiecare plac. Se incubeaz la 35C i se urmresc rezultatele nregistrndu-se la 24 de ore. Testul pozitiv const n beta-hemoliz, adic n clarificarea mediului n jurul coloniei datorit unui proces de hemodigestie. zona are o singur margine, clar delimitat, fr inele concentrice multiple. hemoliza este pe deplin clar, fr s aib loc nverzirea mediului. zonele de hemoliz se observ de la marginea coloniei pn la marginea extern a zonei. Izolatele care produc zone clare de hemoliz, mai mici de 3 mm pot fi slab patogene prin testul ansei ileale de la iepure. Este important de reinut c n acest test nu e valabil nici o observaie dup 24 de ore. i) Conservarea culturilor bacteriene: Se inoculeaz un mediu de conservare semisolid pe termen lung prin nepare n profunzime. Se las capacul lax, pn la apariia unei creteri vizibile n cursul incubrii la 35C, timp de 24 de ore. Se nchide etan capacul pentru a mpiedica deshidratarea i se pstreaz la temperatura camerei. Pentru conservarea lui V. parahaemolyticus i a lui V. vulnificus pentru cteva luni la -70C se plaseaz 1 ml dintr-o cultur de 6-12 ore de TSB NaCl 3% i 0,09 ml de dimetil-sulfoxid (dmSo) n criotuburi sterile; se congeleaz imediat la -70C. f) Confirmarea serologic a lui V. parahaemolyticus: Antigenele K, care cuprind diferite grupe somatice sunt prezente n tabelul de mai jos:
Tabelul 4.7. o grup 1 2 3 4 Tipul K 1, 25, 26, 32, 38, 41, 56, 58, 64 3, 28 4, 5, 6, 7, 29, 30, 31, 33, 37, 43, 45, 48, 54, 57, 58, 59 4, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 34, 42, 49, 53, 55, 63 162

o grup 5 6 7 8 9 10 11 ToTAl

Tipul K 15, 17, 30, 47, 60, 61 18, 46 19 20, 21, 22, 39, 62 23, 44 19, 24, 52 36, 40, 50, 51 60 de tipuri K/63 de serotipuri

Se procedeaz astfel: se spal o pant cu 2 ml dintr-o soluie de NaCl 3% (o suspensie mai mare este optim pentru acest test de aglutinare pe lam). Suspensia de celule se mparte n dou volume egale n tuburi separate. Se autoclaveaz tubul o or la 121C. Aceast suspensie autoclavat reprezint antigenul o. Suspensia netratat reprezint antigenul K. Pentru efectuarea reaciei de aglutinare o se mparte lama n 12 compartimente egale, folosind un creion de cear. Se introduce o pictur n fiecare compartiment i se adaug cte o pictur din cele 11 antiseruri de grup o. n compartimentul al 12-lea care conine martorul de aglutinare se adaug o pictur de NaCl 3%. Se balanseaz uor lama timp de 1 minut pentru amestecarea componentelor. Aglutinarea pozitiv se citete imediat. Aceasta determin ce antigene de tip K trebuiesc testate. n acest sens se marcheaz pe lam numrul de compartimente pozitive. Se plaseaz o pictur mic de suspensie neautoclavat n fiecare compartiment i se adaug cte o pictur de antiser K adecvat n fiecare compartiment. n compartimentul de control se adaug o pictur de NaCl 3%. Se balanseaz uor lama nainte i napoi pentru amestecarea componentelor, timp de un minut. Se citete imediat.

4.11. Izolarea i identificarea vibrionilor din produsele acvatice

n perioada 2007-2009 au fost recoltate i prelucrate prin examen bacteriologic complex 25 de tulpini bacteriene din genul Vibrio, dintre care 10 tulpini de Vibrio parahaemolyticus din scaun diareic, 5 tulpini de Vibrio vulnificus izolate din scoici, molute i stridii, 3 tulpini de Vibrio alginolyticus izolate din probe de zooplancton, pete i ap, 2 tulpini de Vibrio metschnikovii izolate din pete congelat i fin de pete i 2 tulpini de Vibrio furnissi izolate din fin de pete. Studiul s-a efectuat n cadrul facultii de medicin Veterinar,
163

Bucureti i a INCdmI Cantacuzino, Bucureti. Caracteristicile celor 25 de tulpini analizate conform metodei propuse de organizaia Internaional de Standardizare (SR/ISo-8914/1992) sunt prezentate pe larg n tabelele 4.8 i 4.9.
Tabelul 4.8 Teste preliminare nr. colora- Mogaz nr. Oxiglulac- ZahaSpecia bacterian de tulia biliglucocrt. daz coz toz roz pini gram tate z 1 V. parahaemolyticus 10 + + + 2 V. vulnificus 5 + + + + 3 V. alginolyticus 5 + + + + 4 V. metschnikovii 3 + + + + 5 V. furnissi 2 + + + + Teste biochimice de confirmare nr. nr. de Specia bacterian Adh LdC oNPg OdC crt. tulpini 1 V. parahaemolyticus 10 + + 2 V. vulnificus 5 + + 3 V. alginolyticus 5 + 4 V. metschnikovii 3 + 5 V. furnissi 2 + + Legend: 5 Adh = arginin-dehidrolaz; 5 ldC = lizin-decarboxilaz; 5 oNPG = hidroliza ortonitrofenil--d-galactopiranozidei; 5 odC = ornitin-decarboxilaz; 5 2S = producere de hidrogen sulfurat. h Tabelul 4.9 indol + + + H2S -

rezultatele antibiogramei Analiznd comparativ rezultatele obinute n urma efecturii antibiogramelor, constatm c, speciile de Vibrio non-holerice sunt sensibile la aciunea tetraciclinei, a penicilinei, ampicilinei, cefalosporinelor, cloramfenicolului, aminoglicozidelor i fluorochinolonelor. Vibrio parahaemolyticus i Vibrio alginolyticus sunt rezistente la aciunea penicilinei i a ampicilinei. A fost constatat antibiorezistena unor tulpini la ampicilin (V. alginolyticus i V. parahaemolyticus), la gentamicin (V. metschnikovii), la
164

eritromicin (V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. alginolyticus). Sensibilitatea maxim a fost constatat la tetraciclin, cefalosporine i quinolone. Rezultatele statistice ale interpretrii antibiogramelor sunt prezentate n tabelul 4.10. 5tulpini rezistente, cele care au zona de inhibiie 0-1 mm; 5 tulpini cu sensibilitate medie, cele care au zona de inhibiie 10-14 mm; 5 tulpini cu sensibilitate maxim, cele care au zona de inhibiie 14-16 mm;
Tabelul 4.10 Testarea sensibilitii tulpinilor Vibrio non-holerice fa de antibiotice media zonei de inhibiie (mm) Specia bacterian T P A Cf Cfc c g E Ef Cft 1 10,25 15,92 V. parahaemolyticus 14,90 0,85 0,90 15,08 14,28 8,00 4,50 16,00 5,00 4,38 14,35 14,25 3,28 6,25 1 10,50 16,00 V. vulnificus 15,00 0,52 1,00 15,92 15,18 4,00 5,11 0,63 11,20 15,34 V. alginolyticus 15,52 6,28 2,00 16,00 15,92 8,25 0,73 3,28 13,40 14,28 V. metschnikovii 14,35 4,02 3,15 14,53 14,38 5,18 2,73 4,56 15,92 14,72 V. furnissi Legend: T = tetraciclin; P = penicilin; A = ampicilin; Cf = ciprofloxacin; Cfc = cefaclor; C = cloramfenicol; G = gentamicin; E = eritromicin; Ef = enrofloxacin; Cft = cefotaxim. Tabelul 4.11 Interpretarea statistic a rezultatelor obinute din citirea antibiogramelor Tulpini cu Tulpini cu Antibioticul media zonei Tulpini sensibilitate sensibilitate testat de inhibiie rezistente (%) medie (%) maxim Tetraciclin 15,15 0 0 100 Penicilin 3,33 40 60 0 Ampicilin 2,28 40 60 0 Ciprofloxacin 15,17 0 0 100 Cefaclor 14,80 0 0 100 Cloramfenicol 5,74 0 100 0 Gentamicin 3,86 20 80 0 Eritromicin 2,09 40 60 0 Enrofloxacin 12,25 0 0 100 Cefotaxim 15,25 0 0 100

din studiile efectuate s-au desprins urmtoarele concluzii: 1. Speciile de Vibrio au fost izolate i identificate din diferite probe biologice prin metoda ISo-8914/1992.
165

2. n ceea ce privete fermentarea lactozei, au fost negative tulpinile de V. parahaemolyticus, V. alginolyticus i pozitive cele de V. vulnificus, V. metschnikovii i V. furnissi. 3. Prin coloraia Gram s-a dovedit c toate tulpinile de vibrioni au fost Gram negative. 4. Testul oxidaz a fost pozitiv pentru toate speciile, n afar de Vibrio metschnikovii, care a rspuns negativ la aceste teste. 5. Testul mobilitii i fermentarea glucozei au fost pozitive, n toate cazurile, n timp ce nici una dintre tulpini nu a produs gaz din glucoz. 6. Testele preliminare au fost reprezentate de: testul oxidazei, coloraia Gram, mobilitate, glucoz, gaz-glucoz, lactoz, zaharoz. 7. Rezultatele testelor biochimice de confirmare au fost urmtoarele: cele 5 tulpini de V. alginolyticus au rspuns pozitiv la urmtoarele teste: ldC, indol i negativ la Adh, oNPG, odC, h2S; V. vulnificus, toate cele 5 tulpini au rspuns negativ la Adh, odC, h2S i pozitiv la ldC, oNPG, indol; V. furnissi, cu 2 tulpini pozitive la Adh i oNPG i negative la ldC, odC, indol, h2S; V. parahaemolyticus, toate cele 10 tulpini au rspuns negativ la Adh, oNPG, h2S i pozitiv la ldC, odC, indol. V. metschnikovii, cu 3 tulpini izolate a rspuns pozitiv la oNPG i negativ la toate celelalte teste de confirmare; cele 25 de tulpini non-holerice de Vibrio s-au dovedit a fi sensibile fa de urmtoarele antibiotice: tetraciclin, penicilin, aminoglicozide, fluorochinolone. am remarcat faptul c vibrionii sunt bacterii halofile, ce se dezvolt optim n mediile cu concentraii n clorur de sodiu situate n intervalul 1-6%; tulpinile de V. parahaemolyticus i V. alginolyticus au fost rezistente la aciunea penicilinei i a ampicilinei; sensibilitatea maxim (de 100%) a fost constat la tetraciclin, ciprofloxacin, cefaclor, enrofloxacin, cefotaxim; tulpinile de Vibrio testate de noi s-au dovedit a fi rezistente fa de aciunea penicilinei (40%), ampicilin (40%), gentamicinei (40%) i eritromicinei (20%). n produsele alimentare solide, la temperaturi de refrigerare i congelare vibrionii se distrug rapid, iar la temperaturi mai mari de 80C rezist cteva minute.
166

izolarea i identificarea lui V. parahaemolyticus -schema de lucru-

1. diluarea probei alimentare

450 ml de diluant (ap cu 3% NaCl) 50 g aliment; se amestec la 8.000 rpm pt 1 min.

diluii seriate n 90 ml tampon fosfat

2. Efectuarea diluiilor seriate

3. mbogirea Incubarea la 35C, 18-24 de ore

1 g de inocul n fiecare tub GSTB

0,1 g de inocul n fiecare tub GSTB

0,01 g de inocul n fiecare tub GSTB

4. Obinerea coloniilor izolate Agar TCBS 5. Teste biochimice i serologice de confirmare

167

mediu selectiv Agar TCBS (tiosulfat-citrat-bil-sucroz) propus de NAKANIShI (1962), modificat de KoBAYAShI et al. (1963). Se utilizeaz la izolarea i cultivarea selectiv a Vibrio cholere i ali vibrioni enteropatogeni (V. parahaemolyticus, NAG vibrios).

Vibrio parahaemolyticus: Colonii grii, de dimensiuni medii, nehemolitice 168

Bacili Gram-negativi, curbai. frotiu din cultur de Vibrio cholera

Vibrio parahaemolyticus : Bacili drepti sau curbai. microscopie n contrast de faz 169

BIBLIOgrAfIE 1. 2. Adams mR & moss mo., 2000, Bacterial Agents of foodborne Illness., food microbiology 2nd Edition, The Royal Society of Chemistry; P.184-271. Chai TJ & Pace Jl., 2001. Vibrio parahaemolyticus, hui Yh, Pierson md & Gorham JR, editors. foodborne disease handbook Volume 1: Bacterial Pathogens, 2nd Edition. New York: marcel dekker, Inc.; P.407-437. dalsgaard et al., 2001. Vibrio vulnificus., foodborne disease handbook Volume 1: Bacterial Pathogens, 2nd Edition. New York: marcel dekker, Inc.; P.439-470 fAo/Who. Joint fAo/Who Activities on Risk Assessment of microbiological hazards in foods. Preliminary document. hazard Identification, Exposure Assessment and hazard Characterization of Vibrio spp. in Seafood. disponibil la: ftp://ftp.fao.org/es/esn/food/vibrio.pdf Gram l & huss hh. fresh and Processed fish and Shellfish, 2000, The microbiological Safety and Quality of food. Volume I. maryland: Aspen Publishers, Inc; P.472-506. heymann dl., 2004, Cholerae and other Vibrioses., Control of Communicable diseases manual, 18th Edition. Washington dC: American Public health Association;. P.103-117 united States food and drug Administration Centre for food Safety and Applied Nutrition. Bad Bug Book: Vibrio cholerae Serogroup o1. disponibil la: http://www.cfsan.fda.gov/~mow/chap7.html International Commission on microbiological Specifications for foods., 1996, Vibrio cholerae, microorganisms in foods Characteristics of microbial Pathogens. london: Blackie Academic & Professional; P.414-425. International Commission on microbiological Specifications for foods, 1996, Vibrio parahaemolyticus, microorganisms in foods 5. Characteristics of microbial Pathogens, Blackie Academic & Professional; P. 426-435. International Commission on microbiological Specifications for foods, 1996. Vibrio vulnificus, microorganisms in foods 5. Characteristics of microbial Pathogens., Blackie Academic & Professional P.436-439.

3. 4.

5.

6.

7.

8.

9.

10. International Commission on microbiological Specifications for foods., 1998. fish and fish Products., microorganisms in foods 6. microbial Ecology of food Commodities, Blackie Academic & Professional; P. 130-189. 11. Kaysner CA., Vibrio species, 2000. The microbiological Safety and Quality of food. maryland: Aspen Publishers, Inc.; P.1336-1362. 170

12. Nutrition. Vibrio vulnificus. disonibil la: http://www.cfsan.fda.gov/~mow/ chap10.html 13. oliver Jd & Japer JB., 1997, Vibrio species., doyle mP, Beuchat lR & montville TJ. food microbiology fundamentals and frontiers. Washington dC: ASm Press; P.228 264. 14. Raport Comisia Europeana. opinion of the Scientific Committee on Veterinary measures, Public health on Vibrio vulnificus and Vibrio parahaemolyticus (in raw and undercooked seafood) (adoptat la data de 19-20 sept. 2001). 15. Simona Ivana, 2002 Bacteriologie veterinar special (Ed. Ceres, Bucureti; 460 pagini), ISBN: 973-40-0568-5 16. Simona Ivana, 2005 Bacteriologie general (Ed. tiinelor medicale, Bucureti; 250 pagini), ISBN: 973-86485-7-2 17. Simona Ivana, 2006 Tratat de bacteriologie medical-veterinar i introducere n micologie (Ed. tiinelor medicale, Bucureti;768 pagini), ISBN (10) 973-865715-6; ISBN (13) 978-973-86571-5-1 18. Simona Ivana, 2007 manual de microbiologia alimentelor (Ed. tiinelor medicale, Bucureti; 160 pagini), ISBN: 978-973-86571-3-7 19. Simona Ivana, 2007 microbiologie medical veterinar, Vol. I (Ed. tiinelor medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-01-6 20. Simona Ivana, 2007 microbiologie medical veterinar, Vol. II (Ed. tiinelor medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-02-3 21. Simona Ivana, 2008, microbiologia alimentelor, Ed. orizonturi, ISBN: 978-973736-090-8 22. Simona Ivana, 2008, Practical guide of microbiogical diagnosis, Ed. orizonturi, ISBN: 978-973-736-089-2 23. Sutherland J. & VRNAam A., 2000, Enterotoxin-producing Staphylococcus, Shigella, Yersinia, Vibrio, Aeromonas and Plesiomonas., Blackburn CW & mcClure PJ., editors. foodborne Pathogens. hazards, Risk Analysis and Control. Cambridge: Woodhead Publishing limited;. P. 358-415. 24. united States food and drug Administration Centre for food Safety and Applied Nutrition, Bad Bug Book: Vibrio cholerae Serogroup Non-o1. disponibil la: http://www.cfsan.fda.gov/~mow/chap8.html 25. united States food and drug Administration Centre for food Safety and Applied Nutrition, Vibrio parahaemolyticus: http://www.cfsan.fda.gov/~mow/chap9.html 171

26. united States food and drug Administration Centre for food Safety and Applied 27. xu h et al., 1998, occurrence and distribution of Vibrios in fishes and Shellfishes in Coastal Waters of hong Kong, Acta oceanologica Sinica, 17: 545-553. 28. Yam WC et al., 1999. Abundance of Clinical Enteric Bacterial Pathogens in Coastal Waters and Shellfish. Water Research; 34: 51-56.

172

cAPiTolUl 5 Implicaiile campylobacteriilor n toxiinfeciile alimentare 5.1. Caractere generale

Genul Campylobacter conine 25 de specii, iar dintre acestea cea mai important specie izolat din alimente este Cam. jejuni subsp. jejuni. Spre deosebire de Cam. jejuni subsp. doylei este rezistent la cefalotin, crete la 42C i reduce nitraii n nitrii. diferenierea de Cam. coli const n capacitatea de a hidroliza hipuratul. Genul Campylobacter este strns nrudit cu genul Arcobacter. Campilobacteriile au fost clasificate n trecut ca specii Vibrio. din punct de vedere morfologic Cam. jejuni este un bacil subire n form de virgul sau litera S. Se pot ntlni i forme mai lungi, multispiralate, ct i scurte, cocoide. Este monoflagelat, iar flagelul poate fi dispus la unul sau la ambii poli ai celulei bacteriene. Produce oxidaz i catalaz i nu se dezvolt la 25C, n prezen de NaCl 3,5%. Este microaerofil, necesitnd pentru cretere cantiti mici de oxigen (3-6%). Temperaturile minime, optime i maxime de cretere pe mediile solide sunt de 30C, 40C i respectiv 45C. Se dezvolt bine la un ph ntre 5,5-8,0 i n prezen de NaCl 1,75%. Creterea este inhibat de oxigen 21%. dioxidul de carbon 10% este necesar pentru creterea bacterian. metabolismul este respirator. datorit dimensiunilor lor mici, campilobacteriile pot fi separate de alte bacterii Gram negative folosind filtre de 0,65 microni. Campilobacteriile cresc mai lent pe mediile de cultur dect enterobacteriaceele. de obicei, nu sunt asociate cu mediul nconjurtor ci cu animalele homeoterme. S-a dovedit c majoritatea animalelor de carne conin aceste microorganisme n fecale, n special psrile de cas. Cel puin cteva tulpini de Cam. jejuni produc o enterotoxin termolabil asemntoare cu enterotoxinele produse de Vibrio cholerae i Escherichia coli. Producia maxim de toxin ntr-un mediu special are loc la 42C, n 24 de ore i sporete prin adugarea de polimixin. Simptomele toxiinfeciilor provocate de aceste microorganisme includ
173

durere sau crampe abdominale, diaree, disconfort, cefalee, febr. Perioada de incubaie este de obicei de 48-82 de ore, dar poate ajunge i la 7-10 zile, organismul putnd fi detectat chiar i dup dou luni de la ncetarea simptomelor. Enteritele campilobacteriene sunt de origine alimentar n proporie de 90%. Cam. jejuni, ca i Vibrio parahaemolyticus i Yersinia enterocolytica sunt bacterii ce se distrug uor la temperatura de pasteurizare a laptelui. Campilobacteriozele pot fi prevenite prin prepararea termic a alimentelor de origine animal, n special a laptelui i a crnii de pui.

5.2. Taxonomie
Genul Campylobacter face parte din familia Campylobacteriaceae (Vandamme i de ley, 1991) i cuprinde urmtoarele specii: Cam. fetus cu subspeciile: fetus i veneralis; Cam. jejuni cu subspeciile: jejuni i chloylei; Cam. hyointestinalis cu subspeciile hyointestinalis i lawsonii; Cam. sputorum cu subspeciile: sputorum i bubulus; Cam. mucosalis; Cam. coli; Cam. helveticus; Cam. upsaliensis. Tot din aceast familie, mai fac parte: 55 genul Lawsonia, cu specia Lw. intracellularis. 55 genul Helicobacter, cu specia tip Hlb. pylori. 55 genul Arcobacter, cu specia tip Aob. nitrofragilis.

5.3. Specii ale genului Campylobacter implicate n producerea toxiinfeciilor alimentare

5.3.1. Campylobacter jejuni Cam. jejuni se caracterizeaz morfologic prin forme caracteristice de virgul sau litera S. Se pot ntlni i forme mai lungi, multispiralate, ct i scurte, cocoide. n condiii neprielnice adopt forma cocoidal, care pstreaz intacte peretele celular i flagelii. Aceste forme pot trece ntr-o faz latent, n care tolerana la oxigen este crescut. Pot rmne viabile mai multe luni, n apa rece, fiind capabile s infecteze gazdele susceptibile, dar nu sunt cultivabile prin metode uzuale. Este mobil, nesporogen, necapsulogen, Gram negativ. Cam. jejuni i Cam. coli necesit o temperatur optim de cretere mai mare (42-43C), fa de cea necesar altor campilobacterii, ele fiind considerate specii termofile.
174

Se dezvolt pe medii obinuite, mbogite cu adaos de snge defibrinat i unii acizi aminai. Ca substane inhibitorii pentru restul florei bacteriene se nglobeaz bacitracin (25 u/ml), polimixina B, sulfat (20 u/ml) sau novobiocin (0,025 mg/ml). la Cam. jejuni exist dou categorii moleculare de lipopolizaharide (lPS) parietale. Prima cuprinde lPS de greutate molecular mare, cuprins ntre 4,5 i 5 Kdal. Aceste lPS au o structur asemntoare cu cea a tulpinilor de tip R de enterobacteriaceae. A doua categorie de lPS parietale este reprezentat de componeni cu greutate molecular mare, a cror structur este asemntoare cu lPS de la tulpinile de tip S de la enterobacteriaceae. n cadrul acestor dou categorii de lPS, exist o mare diversitate structural i antigenic. dup Euzeby, la Campylobacter s-au identificat 63 de serovarieti (dup schema propus de lior). dintre acestea biotipul I este implicat n leziuni intestinale (enterita campylobacterian) iar biotipul II responsabil de aa numita hepatit vibrionic (hepatit campylobacterian). Componentele polizaharidice sunt antigenic distincte, fiind antigene o termostabile, care formeaz baza schemei (larg utilizat) de serotipare Penner. Schema lior este construit pe baza proteinelor flagelare i de suprafa, care sunt antigene termolabile. n schema Penner au fost definite 66 de antigene o, iar n schema lior peste 160 de antigene termolabile. Serotipizarea reprezint cea mai uzual metod de diagnostic, ns utilizarea ei este posibil doar n laboratoarele specializate. n cele nespecializate pot fi utilizate seturi comerciale care combin biotipizarea i testele de rezistotipizare. Recent au fost descrise metode de tipizare molecular, majoritatea fiind bazate pe anumite forme de analiz a dNA-ului. Cam. jejuni este sensibil la aciunea unui spectru larg de ageni antimicrobieni (tetraciclin, streptomicin) i chimioterapice, dar nu i la aciunea polimixinei, bacitracinei i novobiocinei. Cam. jejuni este o bacterie sensibil la aciunea agenilor fizici i chimici. Este distrus de pasteurizare, clorinare, precum i prin iradiere cu raze gamma. Supravieuirea crete la rece, dar procesele de congelare i decongelare determin reducerea de 10 ori a numrului de microorganisme. n condiii naturale sunt receptive galinaceele, n special ginile tinere de 3-4 luni. Infeciile campylobacteriene au mai fost identificate la curc, bibilic, potrniche, dropie, ra, cioar, stru american Nandu.
175

Cam. jejuni mai produce gastroenterit i diaree mucoid-sangvinolent la taurine, ovine i om.

5.4. Epidemiologie
n 2006, au fost raportate 180.009 cazuri (179.510 confirmate) de ctre 24 state membre ale uE, Islanda i Norvegia (Grecia, Portugalia, Romnia i liechtenstein nu au raportat). Numrul cazurilor de campylobacterioz raportate n 23 de state cu date disponibile, att pentru 2005, ct i pentru 2006 a fost n mic msur diferit, constatndu-se doar o uoar scdere (12%) a cazuisticii din 2006 fa de cea din 2005. Rata total a notificrilor a fost de 39,5 la 100.000 locuitori, cu cea mai mare rat a notificrilor n Republica Ceh (220,2 la 100.000). Numai lituania a raportat 0 cazuri.
Tabelul 5.1. numrul i rata notificrilor camylobacteriozelor raportate n UE i EEA/EfTA n 2006 Tipul de raportare C C A C C C C C C C U C C C C A C C Cazuri confirmate 5020 5771 75 2 22571 3239 124 3439 2675 52035 6807 1812 801 0 624 285 54 Nr. cazuri per populaii de 100.000 de oameni 60,7 54,9 1,0 0,26 220,2 59,7 9,2 65,4 4,2 63,1 67,6 43,1 1,4 0,0 18,3 60,8 13,3

ara

Total cazuri

Austria Belgia Bulgaria Cipru Republica Ceh Danemarca Estonia Finlanda Frana Germania Grecia Ungaria Irlanda Italia Latvia Lituania Luxembourg Malta

5020 5771 75 2 22713 3239 124 3439 2675 52035 6829 1815 801 0 624 285 54 176

ara

Tipul de raportare

Total cazuri

Cazuri confirmate

Nr. cazuri per populaii de 100.000 de oameni

Olanda C 3401 3186 19,5 Polonia C 157 156 0,4 Portugalia U Romnia U Slovacia C 2797 2728 50,6 Slovenia C 944 897 47,1 Spania C 5883 5883 13,4 Suedia C 6078 6078 67,2 Marea Britanie C 52543 52543 87,0 Total UE 177304 176805 39,3 Islanda C 117 117 39,0 Liechtenstein N Norvegia C 2588 2588 55,8 Total 180009 179510 39,5 Sursa: Raportri naionale. A = Raportri de date agregate; C = Raportri bazate pe cazuri; - = fr raportare; u = nespecificat Figura 5.1. distribuia pe grupe de vrst a cazurilor de campylobacterioz n 2006 (177.469 cazuri)(Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor, 2008)

Cazuri/100.000

5.4.1. distribuia campylobacteriozelor la om dup vrst i sex

177

date referitoare la distribuia pe grupe de vrst a infeciilor campylobacteriene umane au fost furnizate n 2006 de 23 state europene (177.479 cazuri). Cel mai mare numr de cazuri raportate a fost la grupa de vrst 25-44 ani cu 51.155 cazuri (28,8%). Totui, n zece state cel mai mare numr de cazuri a fost raportat la copii sub 5 ani. Acest grup de vrst a avut i cea mai mare rat a notificrilor (107,1 la 100.000). Informaii privind sexul persoanelor bolnave au furnizat 23 de state europene raportul brbai/femei fiind de 1,1:1, cu o rat a notificrilor de 43,6 la 100.00 la brbai i 36,8 la 100.000 la femei. 5.4.2. Sezonalitatea date referitoare la luna n care a a vut loc fiecare caz de campylobacterioz au furnizat 23 de state europene, numai lituania a raportat 0 cazuri. Cele mai multe cazuri au fost raportate n lunile de var, ntre iunie i septembrie. 5.4.3. Cazurile importate date referitoare la statutul de boal importat sunt furnizate de 19 state membre ale uE, Islanda i Norvegia. Aproape 10% din cazurile de campylobacterioz sunt raportate ca importate. n Cipru, republica Ceh, ungaria, lituania, malta, Polonia, Slovacia i Spania 99% din cazurile raportate sunt domestice, n timp ce n Suedia i finlanda, 63% i respectiv 59% din cazurile raportate sunt importate.
Figura 5.2. distribuia sezonier a cazurilor de campylobacterioz n 2006 (178.838 cazuri) (Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor, 2008)

Cazuri

Ian

Feb

Mar

Apr

Mai

Iun

Iul

Aug

Sep

Oct

Nov

Dec

178

5.4.4. rezistena Campylobacter sp. la antibiotice datele furnizate de Enter-net arat c C. jejuni i C. coli reprezint 43,0% i respective 2,3% din totalul infeciilor campylobacteriene declarate de 25 state membre ale uE n anul 2006. o proporie mare (53,6%) a cazurilor confirmate nu furnizeaz informaii referitoare la specia dat. ntre 2.200 i 4.801 izolate C. jejuni i ntre 430 i 630 izolate C. coli au beneficiat de antibiogram. Proporia tulpinilor rezistente la ciprofloxacin, acid nalidixic i tetraciclin a fost mai mare la C. coli (57,6%, 51,0% i 45,9%) dect la C. jejuni. Aproape toate tulpinile C. jejuni i C. coli testate au fost sensibile la amoxicilina+acid clavulanic (99,9% i 100%) i gentamicin (98,8% i 98,2%). n 2006, la fel ca i n 2005, Campylobacter a fost cea mai frecvent raportat cauz a bolilor gastro-intestinale n uE, stnd la baza mai multor focare naionale i internaionale de boal. Existena unei variabiliti mari ntre sistemele de raportare a evenimentelor de la un stat la altul, alturi de numrul destul de mare al cazurilor de boal neraportate face extrem de dificil compararea datelor comunicate de diferite state. Sursele alternative de informare, cum ar fi utilizarea turitilor rentori n ar ca oameni santinel, sugereaz un nivel foarte ridicat al cazuisticii neraportate n unele state europene. datele furnizate de Raportul privind zoonozele al uniunii Europene pe anul 2006 arat c o surs important de expunere uman la campylobacteriile transmisibile prin alimente este carnea de broiler. majoritatea statelor au raportat nivele mari sau foarte mari ale prezenei acestei bacterii n carnea proaspt de broiler. o serie de state au raportat o proporie ridicat de izolate Campylobacter rezistente la antibiotice uzuale, i un interes particular l reprezint apariia tulpinilor rezistente al ciprofloxacin, un produs folosit frecvent n afeciunile gastrointestinale severe la om. 5.5. Specii zoonotice din genul Campylobacter dintre bacteriile care produc campylobacterioz la om i animale, numai Cam. jejuni i Cam. coli prezint interes pentru sntatea public. Aceti germeni se afl la nivelul tractului intestinal al psrilor slbatice i n cel al animalelor domestice. Carnea de pasre vndut n magazine este mai des contaminat dect carnea roie i subprodusele de carne. n rile industrializate determin pierderi economice ce se ridic la mai multe milioane de lire sterline, fiind cea mai frecvent form de diaree
179

infecioas identificat (inciden de 1% pe an). omul se contamineaz prin consum de carne i lapte crude, carne semipreparat sau prin apa contaminat. Prevenirea infeciei se face att prin respectarea normelor igenicosanitare n ferme (mai ales de psri), abatoare (la sacrificare i prelucrare), magazine i gospodriile populaiilor (prin manipularea corect a materiilor prime n timpul prelucrrii alimentelor). n anul 1886, Theodor Escherich descrie campylobacteriile n amprentele obinute din mucoasa colonului la autopsia copiilor mori de cholera infantum. n anul 1906, mcfadyean i Stockman izoleaz pentru prima dat bacteria n timpul unor investigaii asupra avortului epizootic la oi i vaci, iniiat de ministerul Britanic al Agriculturii. n anul 1919, Smith i Taylor izoleaz germenul denumindu-l Vibrio fetus. Cercetrile efectuate la Institutul Pasteur, n anul 1963, au demonstrat c aceste bacterii sunt diferite de vibrioni, iar pentru clasificarea lor a fost creat genul Campylobacter. ntr-un penitenciar din SuA, n anul 1938, s-a descris primul caz la om datorit consumului de lapte infectat, manifestat prin gastroenterit. Butzler, n Belgia (1948), a reuit s izoleze bacteria din fecale. El a demonstrat c n fecalele a 5% dintre copiii cu diaree pot fi gsite campylobacterii. Prin tehnologia dNA modern s-a demonstrat c genul Campylobacter alturi de Arcobacter, Helicobacter i Wolinella formeaz un grup distinct de familii, cunoscut ca Superfamilia VI RNAr. Acest grup de bacterii se caracterizeaz printr-o morfologie spiralat i o mobilitate mare care le permite s se deplaseze liber prin mucus. Cam. jejuni (90%) i Cam. coli (10%) produc majoritatea enteritelor campylobacteriene n rile industrializate i n cele n curs de dezvoltare. Cam. jejuni subspecia doylei se ntlnete la copii care triesc n condiii sociale precare. Cam. upsaliensis, Cam. lari, Cam. hyointestinalis i Arcobacter butzlerii determin infecii rare la copii din rile subdezvoltate cu semnificaie incert. Campylobacter fetus specia tip a genului, se ntlnete n infecii sistemice la pacienii cu imunodeficien sau boal preexistent. Helicobacter cineadi, izolat frecvent de la hamsteri i Hlb. fennelliae produc n majoritatea cazurilor proctocolita homosexualilor (mishu i col., 1995).
180

Hlb. heimannii, care nc nu a putut fi cultivat se pare c este identic cu cel izolat de la cini i pisici. Hlb. pylori este monopatogen pentru om, jucnd un rol important n producerea ulcerului peptic i a cancerului gastric.

5.6. metode de izolare i identificare a genului Campylobacter din alimente

5.6.1. Prepararea probelor 1. Buci de carne, molute, picioare de broasc. Se amestec 25 g de prob alimentar cu 100 ml de bulion de mbogire cu soluia numrul 1 de antibiotice, ntr-un sac cu filtru Stomacher, timp de 3 minute. Proba se recolteaz cu ajutorul unei pense sterilizate prin alcool flambare sau unui clete steril. dac proba este reprezentat de o carcas ntreag sau dac este sngernd sau foarte gras se cltete 3 minute cu pepton 0,1% la un raport prob/bulion de 1/6. Se ndeprteaz grsimea prin filtrare, printr-un tifon steril. Se centrifugheaz timp de 10 minute la 4C. Se ndeprteaz supernatantul i se resuspend depozitul n 5 ml de pepton 0,1%. Se obine diluia 1/10 dintr-un ml de sediment i 9 ml de pepton 0,1%. Se striaz n plci Petri cu agar de izolare. Se incubeaz 24-48 de ore la 42C, ntr-o atmosfer microaerofil. 2. Produse lactate. a) lapte i crem de ngheat. Se determin i la nevoie se regleaz ph-ul probei la 7,6. Pentru probele de lapte nefiert se elimin etapa de prembogire. n cazul probelor lactate procesate se utilizeaz o etap de prembogire, care dureaz 4 ore. Se cntresc 2 porii de cte 25 ml i se centrifugheaz la 16.000xg n condiii de refrigerare, 40 de minute. Se ndeprteaz supernatantul, se recolteaz o ans de sediment i se amestec cu 1 ml de pepton 0,1%. Se pipeteaz 0,1 ml de suspensie de cultur emulsifiat ntr-un tub steril i se adaug 0,1 ml de tampon pepton 0,1%. Se amestec uor i se striaz pe medii de izolare. Plcile se incubeaz 2448 de ore la 42C, n condiii microaerofile. b) Brnz i unt. Se amestec 2 probe de cte 25 g fiecare cu 100 ml de pepton 0,1%, la 10.000-12.000 rpm, 30 de secunde. Se filtreaz probele printr-un tifon steril i se centrifugheaz n condiii de refrigerare la 16.000xg, timp de 40 de minute. Se ndeprteaz supernatantul i din sediment se fac nsmnri pe un agar de izolare. Se resuspend un sediment n 100 ml de bulion de mbogire ce conine suplimentul de antibiotic nr. 1 i un
181

alt sediment se resuspend n 100 ml de bulion de mbogire ce conine suplimentul antibiotic nr. 3. Se regleaz ph-ul bulioanelor inoculate la 7,5. 3. Carne tocat sau organe. Se centrifugheaz 25 g de prob cu 100 ml de pepton 0,1% la 10.000-12.000 rpm, 15 secunde, dup care se centrifugheaz n condiii de refrigerare la 2.000 x g timp de 2 minute. Se transfer supernatantul ntr-o alt cup de centrifug steril i se centrifugheaz la 5.000 x g pentru 30 minute. Se ndeprteaz supernatantul. Se resuspend sedimentul n 2 ml de pepton 0,1% i se prepar o diluie de 1/10 folosind 0,1 ml suspensie i 0,9 ml pepton 0,1%. Se striaz n plci Petri pe agarul de izolare. Se incubeaz la 42C, 24-48 de ore, ntr-o atmosfer microaerob. Sedimentul rmas se introduce n 100 ml bulion. Pentru a crea o atmosfer microaerofil pentru creterea optim a campilobacteriilor se utilizeaz una dintre urmtoarele metode de producere de gaze: sistemul de gaz cu bule fluent: o se poate folosi o baie marin cu agitator care poate fi reglat la 3 temperaturi (pentru procedura de prembogire de 5 ore) sau la 2 temperaturi (pentru procedura de 4 ore); incubarea cu agitator este preferabil deoarece stimuleaz o rat de cretere mult mai rapid; se regleaz baia la 30C i se plaseaz sacii Stomacher; se conecteaz pipete la liniile de barbotare i se ncepe producia de gaze; viteza agitatorului se regleaz la 50 rpm; se incubeaz 3 ore; se regleaz temperatura la 37C i se incubeaz 2 ore; n final se regleaz temperatura la 42C i se incubeaz 19 ore; o dac se folosesc prembogiri timp de 5 ore, n baie de ap static, probele mbogite se incubeaz ntr-o prim etap la 30C pentru 3 ore, fr barbotare deoarece bulionul devine anaerob i va fi stimulat creterea clostridiilor; probele mbogite se transfer ntr-o baie de ap la 37C i se conecteaz pipetele din saci la liniile de barbotare; ncepe formarea gazelor; dup 2 ore se regleaz la 42C; o dac se utilizeaz o prembogire de 4 ore, sacii se plaseaz ntrun agitator sau ntr-o baie marin static la 37C; se conecteaz liniile de barbotare i ncepe producerea gazului; dup 4 ore instalaia se regleaz la 42C i se incubeaz nc 20 de ore; sistemul de agitare (incubator cu aer): o dac se folosete procedura de prembogire de 4 ore, se ncepe incubarea la 37C, dup care se regleaz temperatura la 42C i se incubeaz 20 de ore; o dac se folosete procedura de prembogire de 5 ore, se plaseaz sticlele gazate ntr-un incubator cu agitator la 30C i se ncepe agitarea la 200 rpm; dup 3 ore se ajusteaz temperatura la 37C; dup 2 ore se
182

regleaz la 42C i se incubeaz 19 ore; sistemul de vase gazate: o dac se folosete procedura de prembogire de 5 ore vasele se introduc ntr-un incubator la 30C, pentru 3 ore, iar apoi se transfer la 37C, timp de 2 ore, i n cele din urm la 42C, timp de 19 ore; o dac se folosete procedura de prembogire de 4 ore, vasele se incubeaz la 37C, 4 ore i apoi la 42C, 20 de ore. 5.6.2. Izolarea speciilor de Campylobacter Se striaz mediul de izolare dintr-o plac Petri cu o ans de cultur bacterian din mediul de mbogire. Probele de lapte (aproximativ 3 ml) se trec prin filtre de 0,65 microni. Este suficient un filtrat de 0,25-0,5 ml. Se nsmneaz att culturile filtrate ct i cele nefiltrate. Plcile se plaseaz n vasele de gazare i se incubeaz la 42C, timp de 24 de ore. dac dup 4 ore de incubare cultura bacterian nu se dezvolt, aceasta se reincubeaz 48 de ore la 37C. 5.6.3. Identificarea speciilor de Campylobacter Coloniile tipice de Campylobacter sunt rotunde sau de form neregulat, de culoare alb pn la incolor cu marginile netede. Se aleg cel puin 2 colonii per plac i se emulsifiaz pe o lam de sticl ntr-o pictur de ser fiziologic. Se acoper cu o lamel i se examineaz la un microscop cu cmp ntunecat sau cu ulei la un microscop cu contrast de faz. Celulele de Campylobacter sunt curbe cu lungimea de 1,5-5 microni, se execut micri n zig-zag dac preparatul este fcut din medii solide sau micri n tirbuon n cazul celulelor din bulion. Aproximativ 20% din izolatele de Cam. jejuni nu sunt mobile. Celulele btrne sau stresate pot prezenta o mobilitate diminuat i o form cocoid. dac este necesar resuscitarea plcilor, acestea se pstreaz la 4C, ntr-o atmosfer microaerofil, ferit de lumin. 5.6.4. Confirmarea campilobacteriilor Se recolteaz aproximativ 5 colonii caracteristice. Se transfer 2 colonii bacteriene n sticle cu bulion de confirmare. Se incubeaz la 42C, ntr-o atmosfer microaerofil 24 de ore, pn cnd bulionul devine tulbure. Pentru inocularea substanelor biochimice se folosesc culturi n bulion simplu, iar dac cultura respectiv nu se dezvolt
183

bine n acest mediu, se folosesc bulioane, cu ser bovin fetal. Se studiaz urmtoarele proprieti: producia de catalaz: se recolteaz o colonie pozitiv i se testeaz; prezena bulelor arat c testul este pozitiv; sensibilitatea la antibiotice: se inoculeaz uniform cu un tampon steril imersionat n cultura n bulion, suprafaa unei plci Petri cu agar infuzie de inim, cu 5% snge integral (sau lizat) i fBP 0,25%; se aplic un disc de cefalotin i unul de acid nalidixic; se incubeaz la 37C, timp de 24-48 de ore, ntr-o atmosfer microaerofil; se msoar zonele de inhibiie din jurul fiecrui disc; majoritatea tulpinilor de Cam. jejuni sunt sensibile la acid nalidixic i rezistente la cefalotin; coloraia Gram: se folosete carbol-fuxin pentru coloraia de contrast; speciile de Campylobacter sunt Gram negative; hidroliza hipuratului: se nsmneaz ntr-o eprubet cu soluie de hipurat o colonie mare de pe placa cu agar infuzie de inim (folosit la testul de sensibilitate la antibiotice); se incubeaz 2 ore la 37C ntr-o baie marin; se adaug 0,5 ml de reactiv minhidrin, se agit i se incubeaz 10 minute; tuburile se citesc rapid, o culoare violet nchis indic o reacie pozitiv; Cam. jejuni este pozitiv pentru acest test; agar TSI: se inoculeaz mediul TSI i se incubeaz la 35-37C timp de 5 zile, n atmosfer microaerob; Cam. jejuni produce o pant i o baz alcalin, fr producie de hidrogen sulfurat; utilizarea glucozei: se nsmneaz de 3 ori cu cultura de testat, 2 tuburi cu mediu fermentativ oxidativ; un tub conine glucoz, iar cellalt numai baz; se incubeaz la 35-37C, timp de 4 zile, ntr-o atmosfer microaerofil; speciile de Campylobacter nu utilizeaz glucoza sau alte zaharuri; testele de catalaz i oxidaz: se inoculeaz din culturi n bulion o pant de agar cu infuzie de inim i se incubeaz la 35-37C, 48 de ore ntr-o atmosfer microaerofil; se recolteaz o ans de cultur de pe pant i se plaseaz ntr-o pictur de peroxid de hidrogen 3%; se adaug o pictur de oxidaz; dac reactivul devine purpuriu, cultura este considerat oxidaz pozitiv; Cam. jejuni este catalaz i oxidaz pozitiv; tolerana la temperatura de cretere: se dilueaz 2 ml din cultura n bulion cu pepton 0,1%, pn la turbiditatea standard mc farland nr. 1; se striaz o linie n fiecare dintre cele 3 plci cu agar-snge i infuzie de inim fBP cu o ans de cultur diluat; n fiecare plac se pot inocula 4 culturi; se incubeaz o plac la 25C, una la 35-37C i a treia la 42C, pentru 3 zile ntr-o atmosfer microaerofil; dac se produce o turbiditate accentuat n mediul de cultur, nseamn c testul este pozitiv; Cam. jejuni nu crete la
184

25C, dar se dezvolt la 35-37C i la 42C; creterea pe agar Mac Conkey: se nsmneaz o ans din cultura n bulion pe agarul mac Conkey; pot fi testate pe aceeai plac, pn la 4 culturi diferite; se incubeaz la 35-37C, 3 zile, n condiii microaerofile; Cam. jejuni se dezvolt pe agarul mac Conkey; teste biochimice pe medii semisolide: mediul semisolid conine bulion Brucella, cu agar 0,18%; se aplic 0,1 ml de cultur diluat pe suprafaa mediului i se incubeaz 5 zile; o creterea n glicin 1%: Cam. jejuni este pozitiv; o creterea n NaCl 3,5%: Cam jejuni este negativ; o producerea de h2S din cistein: se inoculeaz mediul cu bacteria de cercetat i se introduce pe lng dopul eprubetei o band de hrtie de filtru mbibat cu acetat de plumb la aproximativ 1-2 cm distan de mediu: nnegrirea benzii reprezint reacia pozitiv; Cam jejuni nnegrete banda n poriunea de deasupra mediului; o reducerea nitratului: nroirea coloniilor dup adugarea reactivilor de nitrit este considerat reacie pozitiv; Cam. jejuni reduce nitraii n nitrii.

185

Tabelul 5.2. diferenierea speciilor de Campylobacter

Caractere biochimice

Cam. jejuni Cam. coli Cam. Cam. fetus Cam. Cam. Cam. Cam lari subsp. fetus cinaedi fennelliae cryaerophilus hyointestinalis

Cam. upsaliensis

Creterea la: + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + R S S S S S + S S + + + + + R S + + + + + + + + + + + + + + + + R R + + + + + + S R

25C 35-37C 42C Reducerea nitratului:

+ + +

+ + + + + + S S

NaCl 3,5 %

h2S, TSI

186

Catalaz

oxidaz

mac Conkey

mobilitate

Creterea n 1% glicin

utilizarea glucozei

hidroliza hipuratului

Rezistena la acid nalidixic

Rezistena la cefalotin

medii selective pentru Campylobacter Mediul Componenta bazal componenta (nutritiv) selectiv Vancomicin Trimetoprim Polimixin

Tabelul 5.3.

Aspectul coloniilor - 1-2 mm - semitransparente - rotunde, bombate - suprafa umed - tendin de a se ntinde pe striuri - 1-2 mm - semitransparente, gri-metalic, strlu- citoare - rotunde - nehemolitice - 1-2 mm - semitransparente, gri, umede - rotunde, de mrimi diferite - nehemolitice - 1-2 mm - rotunde, bombate - de culoare gri-castaniu - cu tendina de a se ntinde pe striu - 1-2 mm - translucide - plate, cu margini neregulate - cu tendin de ntindere pe striu - nehemolitice - 1 mm - semitransparente - preponderent rotunde - 3-5 mm - semitransparente - mucoase - de form neregulat cu tendin de a se ntinde pe striu - 2-3 mm - semitransparente - polimorfe, rotunde - deseori mucoide

Skirow

Agar Columbia snge de cal

Butzler

Agar Columbia snge defibrinat de cal

Novobiocin

BlaserWang

Agar Columbia snge de berbec ori snge de cal

Campy-ic

Agar nutritiv Campylobacter snge de berbec 7-10%

Campylosel Agar Columbia (biosnge de berbec 5% mrieux) Agar de baz Campylobacter snge de cal Agar Columbia crbune activat

Preston

Karmali

Vancomicin Trimetoprim Cephalothin Amfotericin B Polimixin B Vancomicin Rifampicin Cefalotin Trimetoprim Colistin Cefoprazon Colistin Vancomicin Amfotericin B Polimixin B Rifampicin Trimetoprim Cicloheximid hemin Piruvat de Na Cefoperazon Vancomicin Cicloheximid

CCdA

Agar nutritiv crbune activat Cefoperazon hidrolizat de cazein Amfotericin Sulfat feros B Piruvat de Na 187

Campylobacter jejuni. frotiu din cultur de pe mediu solid. Bacili n form de virgul sau litera S, dar i forme mai lungi, ct i scurte cocoide

Campylobacter fetus. hemocultur. Coloraia Gram. Se remarc prezena bacteriilor poliforme cu predominan a formelor ncurbate, n form de S sau spiralate

Campylobacter sp. Agar cu snge Campy

Campylobacter fetus. subsp. intestinalis. Agar cu snge 188

Campylobacter jejuni. microscopie electronic flageli bipolari

Campylobacter jejuni

Campylobacter fetus. Agar tioglicolat

Campylobacter lari - rezistent; Campylobacter jejuni subsp. jejuni - sensibil. Scopul acestui test este acela de a determina sensibilitatea unui microorganism la acid nalidixic. Este de obicei folosit pentru identificarea lui Cam. lari. discul cu acid nalidixic se plaseaz n centrul plcii Petri i se incubeaz, dup nsmnare n condiii microaerofile. dac apare o zon de inhibiie mai mare de 5-7 mm (msurat de la marginea coloniilor) cultura respectiv este considerat pozitiv.

Campylobacter sp. Agar Campy. 189

Bibliografie selectiv 1. Achtman, m., K. zurth, G. morelli, G. Torrea, A. Guiyoule, and E. CRNAiel. 1999. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. uSA 96:14043-14048. Adak, G. K., J. m. Cowden, S. Nicholas, and h. S. Evans. 1995. The Public health laboratory Service national case-control study of primary indigenous sporadic cases of campylobacter infection. Epidemiol. Infect. 115:15-22. Altekruse, S. f., N. J. Stern, P. I. fields, and d. l. Swerdlow. 1999. Campylobacter jejuni-an emerging foodborne pathogen. Emerg. Infect. dis. 5:28-35. Bolton, f. J., S. B. Surman, K. martin, d. R. A. Wareing, and T. J. humphrey. 1999. Presence of Campylobacter and Salmonellae in sand from bathing beaches. Epidemiol. Infect. 122:7-13. Bolton, f. J., d. R. A. Wareing, m. B. Skirrow, and d. N. hutchinson. 1992. Identification and biotyping of campylobacters, p. 151-161. InR. G. Board, d. Jones, and f. A. Skinner (ed.), Identification methods in applied and environmental microbiology. Blackwell Scientific Publications ltd., london, united Kingdom. Bygraves, J. A., R. urwin, A. J. fox, S. J. Gray, J. E. Russell, I. m. feavers, and m. C. J. maiden. 1999. Population genetic and evolutionary approaches to the analysis of Neisseria meningitidis isolates belonging to the ET-5 complex. J. Bacteriol. 181:5551-5556. Embley, T. m. 1991. The linear PCR reaction: a simple and robust method for sequencing amplified rRNA genes. lett. Appl. microbiol. 13:171-174. Enright, m., and B. G. Spratt. 1998. A multilocus sequence typing scheme for Streptococcus pneumoniae: identification of clones associated with serious invasive disease. microbiology 144:3049-3060. feavers, I. m., S. J. Gray, R. urwin, J. E. Russell, J. A. Bygraves, E. B. Kaczmarski, and m. C. J. maiden. 1999. multilocus sequence typing and antigen gene sequencing in the investigation of a meningococcal disease outbreak. J. Clin. microbiol. 37:3883-3887. harrington, C. S., f. m. Thomson Carter, and P. E. Carter. 1997. Evidence for recombination in the flagellin locus of Campylobacter jejuni: implications for the flagellin gene typing scheme. J. Clin. microbiol. 35:2386-2392. heuvelink, A. E., J. J. h. C. Tilburg, N. Voogt, W. van Pelt, W. J. van leeuwen, J. m. J. Sturm, and A. W. van de Giesen. 1999. Surveilance of zoonotic bacteria among farm animals (dutch). RIVm-report 285859-009. RIVm, Bilthoven, The Netherlands. holmes, E. C., R. urwin, and m. C. J. maiden. 1999. The influence of recombination on the population structure and evolution of the human pathogen 190

2.

3. 4.

5.

6.

7. 8.

9.

10.

11.

12.

Neisseria meningitidis. mol. Biol. Evol. 16:741-749. 13. hudson, J. A., C. Nicol, J. Wright, R. Whyte, and S. K. hasell. 1999. Seasonal variation of Campylobacter types from human cases, veterinary cases, raw chicken, milk and water. J. Appl. microbiol. 87:115-124. huson, d. h. 1998. SplitsTree: a program for analysing and visualising evolutionary data. Bioinformatics 14:68-73. Jackson, C. J., A. J. fox, d. m. Jones, d. R. Wareing, and d. N. hutchinson. 1998. Associations between heat-stable (o) and heat-labile (hl) serogroup antigens of Campylobacter jejuni: evidence for interstrain relationships within three o/hl serovars. J. Clin. microbiol. 36:2223-2228. Jolley, K. A., J. Kalmusova, E. J. feil, S. Gupta, m. musilek, P. Kriz, and m. C. J. maiden. 2000. Carried meningococci in the Czech Republic: a diverse recombining population. J. Clin. microbiol. 38:4492-4498. Ketley, J. m. 1997. Pathogenesis of enteric infection by Campylobacter. microbiology 143:5-21. Konkel, m. E., S. A. Gray, B. J. Kim, S. G. Garvis, and J. Yoon. 1999. Identification of the enteropathogens Campylobacter jejuni and Campylobacter coli based on the cadf virulence gene and its product. J. Clin. microbiol. 37:510-517. Kumar, S., K. Tamura, and m. Nei. 1994. mEGA: molecular evolutionary genetics analysis software for microcomputers. Comput. Appl. Biosci. 10:189-191. maiden, m. C. J. 2000. high-throughput sequencing in the population analysis of bacterial pathogens of humans. Int. J. med. microbiol. 290:183-190. maiden, m. C. J., J. A. Bygraves, E. feil, G. morelli, J. E. Russell, R. urwin, Q. zhang, J. zhou, K. zurth, d. A. Caugant, I. m. feavers, m. Achtman, and B. G. Spratt. 1998. multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. uSA 95:3140-3145. maynard Smith, J. 1991. The population genetics of bacteria. Proc. R. Soc. london B 245:37-41. maynard Smith, J., C. G. dowson, and B. G. Spratt. 1991. localized sex in bacteria. Nature 349:29-31. maynard Smith, J., N. h. Smith, m. oRourke, and B. G. Spratt. 1993. how clonal are bacteria? Proc. Natl. Acad. Sci. uSA 90:4384-4388. Nachamkin, I., B. m. Allos, and T. ho. 1998. Campylobacter species and GuillainBarre syndrome. Clin. microbiol. Rev. 11:555-567. Nachamkin, I., h. ung, and C. m. Patton. 1996. Analysis of hl and o serotypes of Campylobacter strains by the flagellin gene typing system. J. Clin. microbiol. 191

14. 15.

16.

17. 18.

19. 20. 21.

22. 23. 24. 25. 26.

34:277-281. 27. Parkhill, J., B. W. Wren, K. mungall, J. m. Ketley, C. Churcher, d. Basham, T. Chillingworth, R. m. davies, T. feltwell, S. holroyd, K. Jagels, A. V. Karlyshev, S. moule, m. J. Pallen, C. W. Penn, m. A. Quail, m. A. Rajandream, K. m. Rutherford, A. h. van Vliet, S. Whitehead, and B. G. Barrell. 2000. The genome sequence of the food-borne pathogen Campylobacter jejuni reveals hypervariable sequences. Nature 403:665-668. Peabody, R., m. J. Ryan, and P. G. Wall. 1997. outbreaks of Campylobacter infection: rare events for a common pathogen. Communicable dis. Rep. 7:R33R37. Penner, J. l., J. N. hennessy, and R. V. Congi. 1983. Serotyping of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli on the basis of thermostable antigens. Eur. J. Clin. microbiol. 2:378-383. Selander, R. K., d. A. Caugant, h. ochman, J. m. musser, m. N. Gilmour, and T. S. Whittam. 1986. methods of multilocus enzyme electrophoresis for bacterial population genetics and systematics. Appl. Environ. microbiol. 51:837-884. Skirrow, m. B. 1994. diseases due to Campylobacter, helicobacter and related bacteria. J. Comp. Pathol. 111:113-149. Simona Ivana, 2002 Bacteriologie veterinar special (Ed. Ceres, Bucureti; 460 pagini), ISBN: 973-40-0568-5 Simona Ivana, 2005 Bacteriologie general (Ed. tiinelor medicale, Bucureti; 250 pagini), ISBN: 973-86485-7-2 Simona Ivana, 2006 Tratat de bacteriologie medical-veterinar i introducere n micologie (Ed. tiinelor medicale, Bucureti;768 pagini), ISBN (10) 97386571-5-6; ISBN (13) 978-973-86571-5-1 Simona Ivana, 2007 manual de microbiologia alimentelor (Ed. tiinelor medicale, Bucureti; 160 pagini), ISBN: 978-973-86571-3-7 Simona Ivana, 2007 microbiologie medical veterinar, Vol. I (Ed. tiinelor medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-01-6 Simona Ivana, 2007 microbiologie medical veterinar, Vol. II (Ed. tiinelor medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-02-3 Simona Ivana, 2008, microbiologia alimentelor, Ed. orizonturi, ISBN: 978-973736-090-8 Simona Ivana, 2008, Practical guide of microbiogical diagnosis, Ed. orizonturi, ISBN: 978-973-736-089-2 192

28.

29.

30.

31. 1. 2. 3.

4. 5. 6. 7. 8.

9.

Slater, E., and R. J. owen. 1998. Subtyping of Campylobacter jejuni Penner heat-stable (hS) serotype 11 isolates from human infections. J. med. microbiol. 47:353-357. Staden, R. 1996. The Staden sequence analysis package. mol. Biotechnol. 5:233241. uerbaum, S., J. maynard Smith, K. Bapumia, G. morelli, N. h. Smith, E. Kunstmann, I. dyrek, and m. Achtman. 1998. free recombination within helicobacter pylori. Proc. Natl. Acad. Sci. uSA 95:12619-12624. Walker, R. I., m. B. Caldwee, E. lee, P. Guerry, T. J. Trust, and G. m. RuizPalacios. 1986. Pathophysiology of Campylobacter enteritis. microbiol. Rev. 50:81-94. Wareing, d. 1999. The significance of strain diversity in the epidemiology of Campylobacter jejuni gastrointestinal infections. Ph.d. thesis. university of Central lancashire, Preston, united Kingdom. Wassenaar, T. m., and d. G. Newell. 2000. Genotyping of Campylobacter species. Appl. Environ. microbiol. 66:1-9.

10. 11.

32.

33.

34.

193

cAPiTolUl 6 TOxIInfECII ALImEnTArE dE OrIgInE BACTErIAn CU InCIdEn rEdUS

6.1. genul Aeromonas
6.1.1. Taxonomie Interesul tiinific fa de bacteriile din genul Aeromonas a crescut foarte mult ncepnd cu anul 1980, cnd s-a demonstrat patogenitatea lor pentru om i animale, i mai ales asocierea unora dintre specii cu bolile gastrointestinale la oameni, cu alur de toxiinfecii alimentare. S-au izolat, de la muli copii cu diaree, specii de Aeromonas productoare de enterotoxine. din momentul demonstrrii semnificaiei lor patogene s-au ntreprins numeroase cercetri referitoare la taxonomia complicat a genului i la factorii de virulen implicai n infeciile umane i animale. dei continu s existe ideea c toxiinfecia alimentar ar fi provocat numai de A. hydrophila specia tip a genului n realitate aceast mbolnvire poate fi cauzat i de alte specii, n primul rnd de A. sobria. Genul Aeromonas cuprinde 14 specii. Speciile clasice ale grupului psichrofil (A. salmonicida, cu subspeciile sale) i ale grupului mezofil (A. hydrophila, A. caviae, A. sobria) sunt de fapt fenospecii, n care analizele prin hibridare dNA-RNA au delimitat 12 grupe de hibridare (hG) care, dat fiind homologia de 70-100% n cadrul unei grupe de hibridare, au cptat rang de genospecii: A. hydrophila = hG1; A. salmonicida = hG3; A. caviae = hG4; A. media = hG5; A. eucremephila = hG6; A. sobria = hG7; A. veronii biovar sobria = hG8; A. jandaei = hG9;
194

 A veronii biovar veronii = hG10; A. schubertii = hG12. Au rmas nenumite hG2 i hG11. la acestea se adaug noi specii, care au fost definite pe criteriul secvenierii RNAr 16S: A. allosaccharophila; A. trota. Analiza secvenial a RNA-ului subunitii ribozomale justific pentru aeromonade rangul de familie. 6.1.2. morfologie Aeromonadele sunt bacili Gram negativi, uneori cu aspect cocoid, de 0,3-1 micron grosime/1-3,5 microni lungime, drepi, indistinci de bacilii coliformi. Sunt monotrichi, cu un mic flagel polar, n mediile lichide i pot deveni peritrichi n culturile tinere pe mediile agarizate. Toate subspeciile de A. salmonicida sunt atriche (imobile). Sunt necapsulogeni i nesporogeni. 6.1.3. Condiii de cultivare i caractere culturale Germeni facultativ anaerobi, nepretenioi nutritiv, tolerani pn la 4% NaCl, ph 5-9 sau sruri biliare. Pot fi mbogii n ap peptonat alcalin i cresc bine pe medii selective uzuale pentru izolarea enterobacteriaceelor i a vibrionilor. Speciile mezofile se cultiv optim la 35-37C i formeaz n 24 de ore colonii cu diametrul de 3-5 mm, cenuii, uor rugoase. Coloniile de A. caviae sunt nehemolitice. multe tulpini ale altor specii sunt beta hemolitice pe agar cu snge de berbec, iar la o examinare superficial pot fi confundate cu Pseudomonas aeruginosa, fr a avea ns luciu metalic sau arome caracteristice bacilului piocianic. Exist tulpini care produc hemoliz dubl, format dintr-o zon extern de hemoliz incomplet i una intern, complet de beta hemoliz. A. salmonicida este specia tip a genului, este psichrofil, patogen pentru peti i se cultiv optim la 22-25C, formnd pe medii cu 1 tirozin un pigment brun, hidrosolubil. Pentru izolare se folosesc medii speciale, cum ar fi mediul difcofurunculosis-agar.
195

Tabel 6.1. Criteriile de difereniere ale subspeciilor din specia A. salmonicida (dup Quinn i col., 1994) A. salmonicida Pigment gaz din Catalaz Importana patogen (subspeciile) brun glucoz + + + furunculoz (tulpini tinere) Subsp. salmonicida Eritrodermatit la crap Subsp. nova Se izoleaz de la salmonide i Subsp. achromogenes + sunt considerate tulpini atipice + + Subsp. masoucida

dei aeromonadele sunt bacterii fr cerine nutritive speciale, putnd crete uor pe medii simple, izolarea lor din alimente i materiale patologice este posibil numai prin folosirea mediilor selective, pe suprafaa crora se striaz materialul de cercetat i pe care se dezvolt colonii caracteristice, dup o incubare de 24-48 de ore la 35C. menionm cteva dintre aceste medii selective: agarul nutritiv cu snge de oaie i ampicilin (SB-A); agarul cu amidon i ampicilin; agarul de difereniere pentru Aeromonas (AdA); agarul selectiv Pseudomonas-Aeromonas (GSP-agar). de pe suprafaa mediilor selective inoculate i incubate se aleg cte 5 colonii caracteristice, care se nsmneaz fiecare n cte o eprubet cu bulion nutritiv i alta cu agar nutritiv nclinat, care constituie cultura ce se supune testelor de diagnostic menionate mai sus. 6.1.4. Ecologie Aeromonadele se izoleaz curent din apele dulci (ruri, lacuri, fntni, rezervoare de ap), din coninutul gastrointestinal al petilor, batracienilor, reptilelor i a unor vertebrate superioare, de unde contamineaz uor solul i produsele agricole. Prezena lor n biotipurile marine este ocazional. la om produc gastroenterite. Acioneaz toxic prin elaborarea a dou enterotoxine, dintre care una este aerolizina (citolizin bet-hemolitic), iar alta o citotoxin. Exist mai multe aerolizine distincte imunologic i genetic, dar cu mecanism de aciune unic. Aerolizinele produse de A. hydrophila i A. veronii prezint cele mai strnse nrudiri imunologice. Infeciile extradigestive sunt reprezentate de infecii ale plgilor, bacteriurii, iar la gazdele imunocompromise (anemie aplastic, leucemie,
196

sarcoame, ciroz hepatic), infecii sistemice. A. salmonicida produce furunculoz la somn, iar A. hydrophila este patogen pentru broate, la care produce infecia numit red leg. la peti produce infecii locale sau septicemie. Elaboreaz o endotoxin i o hemolizin, care acioneaz cooperant. 6.1.5. diagnostic Tipurile de Aeromonas pot fi confundate cu Escherichia, Enterobacter, Providencia, ns spre deosebire de enterobacteriacee sunt oxidaz pozitive (tabelul 6.2).
Tabel 6.2 Teste minimale pentru diferenierea ntre genurile: Vibrio, Aeromonas i Plesiomonas (dup Buiuc d., 1999) Vibrio Testula Nonhalofil + + + Aeromonas halofil +b + + + + + Plesiomonas

Oxidaza Creterea pe agar cu: 0% NaCl 6% NaCl

Glucoz: + + + + fermentarea -c v Producere de gaz d + + Testul uviei DNA Rezistena la: -c v + o/129 (10 g) -e v + o/129 (150 g) v + Ampicilin (10 g) a Simboluri: + = reacie pozitiv (pentru testele de rezisten: rezistent); - = reacie negativ (pentru testele de rezisten: sensibil); v = diferit la diferite specii. b Cu excepia V. metschnikovii. c Cu excepia V. furnissi i rare tulpini de V. damsella. d Cu excepia unor tulpini de V. parahaemolyticus. e Cu excepia A. trota.

Teste definitive. Identificarea speciilor de Aeromonas poate fi fcut prin bateria de teste recomandate n tabelul 1.7.
197

Testele adiionale sunt necesare pentru diferenieri corecte ntre grupele A. hydrophila, hG2 A. salmonicida (utilizarea dl-lactatului i acidului urocanic, fermentarea d-rhamnozei). A. caviae A. media (utilizarea dl-lactatului, fermentarea manozei, producerea de pirazinamidaz i beta-hemoliz), dar rmn de competena laboratoarelor de referin. de altfel, erorile pentru izolatele cu semnificaie clinic sunt semnificative, dat fiind diferena de patogenitate ntre A. hydrophila i A. caviae, pe de o parte i speciile cu care pot fi confundate, pe de alt parte. A. allosaccharophila nu poate fi identificat corect n laboratorul clinic date fiind multiplele asemnri fenotipice cu alte specii. Ca markeri epidemiologici, accesibili numai laboratoarelor de referin, sunt de reinut grupele serologice o i ribotiparea.
Tabel 6.3. Caractere biochimice ale speciilor din genul Aeromonas (dup Euzeby, 1993) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 + V V + V V + V + + + + + v + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 6 = 7 = 8 = 9 = 10 = 11 = 12 = + + + + + + + + + v + + + + + v + + + + + + + + + v + + -

caracterul ldC odC Adh Indol VP hemoliz Esculin Glucoz** Arabinoz** Celobioz* manitol* zaharoz* Salicin

12 + + + + + + + + + + +

Legend: * Are loc acidifierea. ** Produce gaz din glucoz. 1 = A. allosaccharophila; 2 = A. caviae; 3 = A. enteropelogenes; 4 = A. eucrenophila; 5 = A. hydrophila;

A. ichthiosmia; A. jandae; A. schubertii; A. sobria; A. trota; A. veronii (sobria); A. veronii (veronii)

198

6.2. genul Plesiomonas

Conine specia P. shighelloides, care este un bacil Gram negativ, cilogen. Are form de bastona drept, cu capetele rotunjite (0,8-1-3 microni), grupat izolat, n perechi sau n lanuri scurte, asporogene, acapsulogene. Este o bacterie nepretenioas nutritiv, facultativ anaerob, catalaz i oxidaz pozitiv. metabolismul este fie respirator, fie fermentativ. fermenteaz hidraii de carbon cu producere de acid, dar nu i de gaze. Cele mai multe tulpini se dezvolt pe medii minerale, care conin o sare de amoniu, ca unic surs de azot i glucoza, ca singur surs de carbon. Nu elaboreaz exofermeni ca fosfataz, lipaz, deoxiribonucleaz i proteinaze. decarboxileaz lizina, ornitina i arginina. Reduc nitraii n nitrii, produc indol i nu produc acetilmetilcarbinol, hidrogen sulfurat, fenildezaminaz, gelatinaz. Nu hidrolizeaz malonatul i nu pot folosi citratul ca unic surs de carbon. dau reacia KCN negativ. un caracter biochimic important al bacteriilor din genul Plesiomonas este fermentarea inozitolului, caracter care lipsete la toate genurile cu care se aseamn. Se cultiv pe medii uzuale ntre 8 i 45C, la ph 4,5-8,5. Nu necesit suplimentarea cu sare a mediilor de cultur. Pe agar snge, dup 24 de ore de incubare la 37C formeaz colonii rotunde, cu diametrul de 1-2 mm, convexe, cenuii, nehemolitice. majoritatea tulpinilor sunt sensibile la vibriostaticul 0-129 (2-4 diamino-6,7 diizopropil-pteridin). n acest gen este ncadrat o singur specie P. shighelloides care mai nainte a fost repartizat de diferii cercettori ntr-unul din genurile sau familiile apropiate: Aeromonas, Vibrio, Pseudomonas, Enterobacteriaceae, de care se deosebete printr-o serie de caractere proprii, menionate mai sus. S-a constatat c aceast specie bacterian are un antigen o comun cu Shigella sonnei (de unde i numele), iar Sakazaki i colaboratorii, pe baza studiului serologic la 57 de tulpini, le-au mprit n 16 grupe o. P. shighelloides se izoleaz frecvent din apele dulci i estuariene, cu poluare fecal. Concentraiile realizate sunt dependente de temperatura ambiant, mari vara i mici iarna. Bacteria a fost izolat din sedimente estuariene de la ipari, peti, batracieni, crabi, scoici, precum i din fecale de om i maimu, ganglioni limfatici de cine, embrioni de pui mori.
199

Poate determina ocazional diaree acut. Autorii japonezi au descris un episod de gastroenterit infecioas, la om, produs de aceast bacterie.

6.3. genul Photobacterium

Bacteriile ncadrate n genul Photobacterium au form cocobacilar, mai rar bacilar, mici (1-2,5/0,4-1 microni), dispuse izolat i, rar, n perechi, asporogene, acapsulogene, de obicei mobile, Gram negative, facultativ anaerobe. Au un metabolism respirator sau fermentativ, oxidaz pozitive. fermenteaz hidraii de carbon, cu producere de gaze. n general, fermenteaz hexozele, dar nu i pentozele i hidraii de carbon mai compleci. Produc amoniac din pepton, nitrii din nitrai, decarboxileaz lizina, dar nu i ornitina. Reacia Voges-Proskauer i pepton sunt pozitive. diger chitina rar, lichefiaz gelatina slab, nu hidrolizeaz amidonul. Sunt sensibile la cloramfenicol, streptomicin, polimixina d i vibriostaticul o/129. Se dezvolt pe medii nutritive obinuite, la un ph 6-9. unele tulpini sunt halofile, neputndu-se dezvolta n bulionul nutritiv, dac nu conine 2-3% clorur de sodiu. Concentraia optim de sare din mediile nutritive pentru aceste bacterii este de 3%, majoritatea tulpinilor dezvoltndu-se la concentraii de 0,5-5%. Temperatura optim de dezvoltare este de 20-30C. n condiii convenabile acestei bacterii produc luminescen de unde i numele dat genului. Aceast proprietate se pierde n urma trecerilor repetate pe mediile artificiale. habitatul obinuit al acestor bacterii l formeaz apa marin, suprafaa corporal a unor specii de peti marini, precum i organele unor peti i cefalopode. Pot contamina petele i produsele din pete, i n condiii convenabile de multiplicare concur la alterarea lor. Speciile ncadrate n acest gen, sunt: P. phosphoreum; P. angustum; P. leiognathi.

6.4. genul Brucella

Genul Brucella face parte din familia Brucellaceae. Cuprinde ase specii: Bru. abortus, Bru. melitensis, Bru. suis, Bru. canis, Bru. neotomae, Bru. ovis. n cadrul primelor trei specii au fost identificate mai multe biovaruri.
200

Speciile se difereniaz prin susceptibilitatea lor la fagi. Bru. melitensis, Bru. abortus, Bru. ovis sunt subdivizate n 3,7 i respectiv 5 biovaruri, pe baza urmtoarelor teste suplimentare: 55 necesitatea prezenei de dioxid de carbon; 55 producia de hidrogen sulfurat; 55 creterea n prezena coloranilor pe baz de tiamin i fucsin bazic i aglutinarea serurilor monospecifice anti A i anti m. Istoric. marston, n anul 1861, semnaleaz pentru prima dat la om o infecie pe care o denumete febra de malta. n 1887, david Bruce a izolat primul reprezentant al genului, din splinele soldailor britanici mori, pe care l-a denumit iniial Micrococcus melitensis, dup numele dat de localnici insulei lor (melita). n 1897, Bang i Stribold, n danemarca, au izolat o bacterie asemntoare, de la vaci, care au avortat. Pe 21 iunie 1905, horrocks a izolat Bru. melitensis din laptele unei capre, infectate natural. Investigaiile ulterioare au artat c peste 40% din caprele de malta erau serologic pozitive, iar multe dintre ele aparent sntoase excretau Bru. melitensis n lapte. n 1918, Alice Ewans, n SuA, propune constituirea genului Brucella (n cinstea lui Bruce), n care ncadreaz dou specii: Bru. melitensis i Bru. abortus, fiind prima care a fcut legtura ntre micrococul lui Bruce i bacilul lui Bang. meyer i Shaw (1920) au confirmat cercetrile ntreprinse de Alice Evans i au propus crearea genului Brucella, cu dou specii: Bru. melitensis i Bru. abortus. n 1929, huddleson a izolat Bru. suis, care fusese mult timp considerat o varietate suin a bacilului lui Bang. Bruceloza este considerat de ctre omS ca fiind cea mai rspndit zoonoz. n ara noastr, bruceloza a fost identificat pentru prima dat n 1923, de ctre flcoianu i mihilescu la bovine, n 1934 de Pop Al. la porcine, iar n 1958 la iepuri i berbeci. la om a fost semnalat de ctre Combiescu n 1939. morfologie. Brucelele sunt cocobacili fini de 0,5-0,7 microni n diametru i 0,6-1,5 microni n lungime, dispui izolat i mai rar, n perechi, lanuri scurte sau mici aglomerri, Gram negativi. n general, se coloreaz palid i de aceea, este indicat prelungirea la 1-3 minute a recolorrii cu safronin sau fuxin. Sunt nesporogeni, necapsulogeni i imobili. Prezint un grad redus de acidorezisten, care st la baza coloraiilor speciale: Kster, Kozlowsky,
201

Stamp i, mai ales metoda Kster modificat, recomandat de ctre omS. Condiii de cultivare i caractere culturale. Brucelele sunt organisme exigente care pot fi cultivate pe medii de calitate, suplimentate cu glucoz, ser sangvin sau snge. Infuzia de ficat, frecvent utilizat n trecut, este n prezent nlocuit cu bulionul i agarul cu triptoz de soia. Agarul triptoz cu 5% ser bovin a devenit mediul standard pentru izolarea brucelelor, pentru c satisface exigenele nutritive ale pretenioaselor tulpini de Bru. ovis i Bru. abortus, biogrup 2, ca i a altor tulpini de Bru. abortus grup 3 i 4. hemoculturile trebuie fcute n medii difazice (R. m. mnzat). Izolarea brucelelor din prelevatele contaminate, impune suplimentarea mediilor cu amestecuri selective compuse din bacitracin (25 uI/ml), polimixin B (50 uI/ml), ciclohexamin (100 mg/ml) i nistatin (100 uI/ ml). din punct de vedere respirator, brucelele sunt aerobe i carboxifile. Necesit la cultivare anumii aminoacizi i vitamine i nu cresc pe agarul mac Conkey. Pentru cretere sunt necesare tiamina, nicotinamida i biotina. Creterea poate fi stimulat prin adaos de ser normal, n proporie de 5-10%. Creterea este inhibat pe medii care conin sruri biliare, telurit sau selenit. Tulpinile de Bru. abortus biovar 2 sunt cele mai sensibile la inhibitori. Temperatura optim pentru toate speciile de brucele este de 36-38C; ph-ul corespunztor este n jur de 7. Aciditatea excesiv (de ex: fermentaia unor brnzeturi) omoar rapid celulele de Brucella. la izolare creterea brucelelor este lent i de aceea culturile incubate aerob n atmosfer cu 5-10% dioxid de carbon trebuiesc urmrite pn la 10 zile, iar hemoculturile pn la 3 sptmni. Cultivate n medii lichide, dup cteva zile de incubare produc o turbiditate moderat cu depozit cenuiu i uneori inel la suprafa, producnd i alcalinizarea mediului (ph 8). Creterea este slab dac nu se asigur o aerare corespunztoare. Creterea n medii lichide statice favorizeaz disocierea coloniilor din netede n lucioase. Pe agar cu 1% glucoz i 5% ser sangvin ori pe medii similare, dup 48 de ore la 37 de grade Celsius apar coloniile de Brucella care sunt rotunde, convexe, de 0,1-1 milimetru n diametru i cresc n urmtoarele 4-5 zile pn la 2-7 milimetri. Pe agar-snge sunt nehemolitice. Pe cartoful glicerinat formeaz colonii lucioase de culoare glbuie, care se pigmenteaz prin nvechire n brun ocolatiu. n cazul mediilor semisolide, Bru. abortus Co2 dependent produce un disc de civa milimetri, sub suprafaa de cretere, n timp ce tulpinile Co2
202

independente de Bru. melitensis i Bru. suis produc o turbiditate uniform de la suprafa spre profunzime, pe o adncime de civa milimetri. Pe mediile solide, coloniile din culturile primare sunt de tip S (cu excepia lui Br. ovis i Br. canis, care dau colonii de tip R), dar prin nvechire i treceri repetate apare la brucele, un fenomen de disociere spontan n toate cele trei tipuri culturale principale (S, R, m). Acestea se pot diferenia prin examinarea lor n lumin oblic (henry, 1932), ct i pe baza caracterelor culturale n medii lichide, a stabilitii suspensiilor n soluie cloruro-sodic i a aglutinabilitii suspensiilor nclzite la 90 de grade Celsius (testul Burnet) sau tratate cu soluie de tripaflavin 1/1000 (testul Panama). Astfel, coloniile de tip S dau o suspensie omogen cu aceast soluie, iar cele de tip R i m aglutineaz. Coloniile S examinate n lumin transmis apar galben-deschise, transparente, cu aspect caracteristic de picturi de miere, iar n lumin reflectat prezint suprafaa neted, strlucitoare, cu transparen cenuiu albstruie. Coloniile R, mai puin transparente, au suprafaa mai granular, alb mat sau alb glbuie i sunt fragile sau vscoase, dificil de detaat complet de pe suprafaa mediului. Coloniile netede sunt mai patogene, n timp ce variantele rugoase sunt mai puin virulente. de aceea examinarea morfologiei coloniilor dintr-o cultur prezint o importan deosebit n producerea de vaccinuri vii i n antigene de diagnostic. longevitatea n culturi este de aproximativ 2 luni. diferenierea speciilor se poate face pe baza testului de cromobacteriostaz, care const n examinarea aciunii inhibante asupra multiplicrii germenilor a unor substane colorante (tionina, fuxina etc.) adugate n diferite concentraii la mediul huddleson. Proprieti biochimice. Brucelele prezint proprieti fermentative slabe, reduc nitraii n nitrii, nu produc indol, utilizeaz citratul de amoniu ca unic surs de carbon, lichefiaz gelatina, iar testul Voges-Proskauer i testul roului metil sunt pozitive. Caracterele biochimice permit diferenierea speciilor prin activitatea ureazic i prin producerea de hidrogen sulfurat. Proprieti antigenice i imunogene. la speciile clasice de brucele (abortus, melitensis, suis) s-au evideniat n faza S dou componente de nveli solubile, de natur polizaharidic, i anume: 5 factorul antigenic m (de la melitensis); 5 factorul antigenic A (de la abortus).
203

Cei doi factori antigenici difer cantitativ de la o specie la alta. Alte dou antigene majore (R i z) au fost identificate ulterior la celelalte specii. Ca urmare, identificarea serologic a speciilor este posibil numai pentru seruri aglutinante (adsorbite), antimelitensis (anti m) i antiabortus (anti A), inndu-se seama de titrurile reaciilor obinute n raport cu titrurile celor dou seruri imune de referin. Specii de brucele implicate n infeciile zoonotice Speciile de brucele care transmit bruceloza la om sunt Brucella melitensis, care afecteaz oile i caprele, Brucella abortus, care afecteaz bovinele i Brucella suis, patogen pentru porcine. Infecia se transmite prin contact direct sau indirect cu animalul infectat. Are loc o infecie primar a sistemului reticuloendotelial cu bacteriemie i febr ondulant. Infecia produce leziuni de tip granulomatos care pot afecta diferite esuturi i organe. n urma bolii pot aprea sechele osteoarticulare, cardiace i neurologice. n urma administrrii antibioterapiei adecvate se produce vindecarea n aproximativ 6 luni. la animale brucelele se localizeaz la nivelul placentei (producnduse avort sau ftarea de produi infectai) sau a ugerului. Contaminarea mediului se face prin excreie genital. Transmiterea bolii la om se poate realiza i prin consum de lapte nepasteurizat, brnz i alte produse din lapte. Bruceloza nc este considerat endemic n Africa, orientul mijlociu, Asia Central i de Sud-Est, America de Sud i unele ri mediteraneene. Bruceloza este i o boal profesional n sensul c atac grupuri expuse ca veterinari, fermieri, muncitori n abatoare, laboratoare, ferme, etc. Profilaxia bolii se bazeaz pe educaia sanitar i pe supraveghere. Tipurile predominante depind de sistemul regional de cretere. Speciile de brucele care dezvolt colonii natural netede (de tip S) cu localizare la nivelul placentei sau a ugerului, sunt responsabile de zoonoze grave la om, n timp ce coloniile natural rugoase (de tip R) produc infecii relativ benigne, fr transmitere la om. n Romnia nu s-a semnalat niciodat infecia cu Brucella melitensis la ovine, iar ultimul caz de bruceloz bovin a fost lichidat n 1969.
204

6.5. genul Enterobacter

Genul Enterobacter face parte din familia Enterobacteriaceae, fiind o specie condiionat patogen. Specia implicat n toxiinfeciile alimentare este Enterobacter sakazakii. Aceast bacterie a fost descoperit n anul 1961 i a fost iniial denumit Enterobacter cloaceae. Este o bacterie pigmentat n galben ce cauzeaz enterocolite necrotice neonatale (NEC), meningite neonatale i septicemii. Vehiculul alimentar a fost reprezentat de ctre laptele praf. Este considerat germen oportunist, de ctre unii autori. Cteva tulpini produc enterotoxine, iar infecia experimental se reproduce pe oarecele sugar.

6.6. genul Bacteroides

Taxonomie. Genul Bacteroides face parte din familia Bacteroidaceae i cuprinde 10 specii dintre care amintim: B. acidifaciens, B. gracilis, fragilis, B. oris, B. ovatus, B. putredinis, etc. Speciile din genul Bacteroides prezint urmtoarele caracteristici: sunt Gram negative, obligatoriu anaerobe, saharolitice, conin enzime ale ciclului fosfat-pentoz-monofosfat-hexoz. Are o compoziie n baze dNA, guanin+citozin, 40-48 mol%, membrana conine sfingolipide, acizi grai cu lanuri lungi, sintetizeaz menaquinonele mK 10 i mK 11 ca produi majori, conin n stratul de peptidoglican, acid mezo-diamino-pimelic. 6.6.1. Bacteroides fragilis Este un potenial patogen alimentar, deoarece a fost implicat n producere diareei la om, alturi de A. hydrophila, i P. shigelloides. Prezena enterotoxinei a fost demonstrat n 1984, iar tulpinile enterotoxice de B. fragilis au fost pentru prima dat asociate cu sindromul diareic uman, n 1987. B. fragilis face parte din microbiota intestinal uman, n proporie de 2%.

6.7. genul Klebsiella

Primul reprezentant al genului Klebsiella a fost descris de ctre friedlnder n anul 1883. Numele genului a fost dat n cinstea bacteriologului Edwin Klebs (1834-1913). Genul Klebsiella cuprinde bacterii imobile, capsulogene, care
205

fermenteaz glucoza cu producere de mari cantiti de gaz (excepie face K. rhinoscleromatis). Pe mediile gelozate simple sau slab selective crete repede, formnd de obicei colonii mucoide. fermenteaz majoritatea zaharurilor (cu excepia dulcitolului) i produc acetoin din glucoz (reacia Voges-Proskauer pozitiv). Taxonomie. Genul Klebsiella include 12 specii (K. pneumoniae, cu trei subspecii: pneumoniae, ozaenae, rhinoscleromatis; K. oxytoca, K. (Raoultella) terrigena; K. (Raoultella) planticola; K.(Raoultella) ornitinolytica). Pentru bacteriologia veterinar, de interes majoritar este K. pneumoniae, ca agent etiologic al unei game largi de infecii i K. oxytoca, care poate fi ocazional patogen. K. terrigena este saprofit, nepatogen, prezent n sol sau n ap, iar K. planticola se izoleaz de la plante i din mediul acvatic. Principalul caracter diferenial al ultimelor trei specii fa de K. pneumoniae este capacitatea lor de multiplicare la 10 grade Celsius. 6.7.1. Klebsiella pneumoniae morfologie. Bacil polimorf, mare (0,6-6/0,3-1,5 microni), Gram negativ, imobil, capsulogen i nesporogen. Tulpinile izolate din infecii au capsule mari, bine vizibile prin coloraii obinuite. Se dispun izolai sau n perechi, cap la cap, formnd diplobacili i uneori lanuri scurte (R. m. mnzat). Capsula este moale sintetizat in vivo i in vitro, cu caracter pronunat mucos, de natur polizaharidic (fig. 5.2). multe tulpini de K. pneumoniae i K. ozaenae posed pili (au fost descrise diferite tipuri morfologice i hemaglutinante). Condiii de cultivare i caractere culturale. Germen facultativ anaerob, ce se dezvolt pe medii uzuale la temperatura optim de 37 grade Celsius n 18-24 de ore. n bulion produce turbiditate intens i un inel gros, mucos la suprafa. Prin nvechire, gradul de vscozitate crete datorit secreiei n exces de substan mucoas capsular, iar mediul capt un aspect filant. Pe agarul nutritiv formeaz colonii neuniforme mari, 4-5 milimetri diametru, nepigmentate, rotunde, bombate, umede, cu aspect mucoid. Acest aspect se accentueaz dup 48 de ore, cnd diametrul coloniilor atinge 4-5 milimetri, aprnd o evident tendin de confluare. Pe mediile slab selective, coloniile lactoz-pozitive i pstreaz
206

caracterul mucoid. Proprieti biochimice. fermenteaz glucoza cu producie de gaz, produce ureaz, lizindecarboxilaz, utilizeaz citraii ca unic surs de carbon, reacia Voges-Proskauer este pozitiv. Nu produce indol, ornitindecarboxilaz, hidrogen sulfurat, gelatinoliz. Proprieti antigenice. Klebsielele conin antigene somatice o (lipopoliglucide, care dau frecvent reacii ncruciate cu polizaharizii o Escherichia) i capsulare K (poliglucide acide capsulare ce dau reacii ncruciate cu polizaharizii capsulari de S. pneumoniae, Escherichia, S. paratyphi B). deoarece, polizaharizii capsulari sunt termostabili, antigenele o situate mai profund sunt greu de pus n eviden. n practic, se face numai diferenierea serotipurilor K. Tipizarea serologic se practic dup schema Kauffman i orscov. ncadrarea ntr-un serovar K se poate realiza prin aglutinare, coagulare, latex aglutinare. Prin oricare din aceste metode ncadrarea este laborioas i pretenioas, datorit numrului mare de serovaruri i a nrudirilor antigenice frecvente dintre acestea. Ecologie. Principalul habitat al klebsielelor este tubul digestiv. n urma contaminrii mediilor naturale cu fecale, K. pneumoniae se poate adapta i multiplica ntr-o mare diversitate de biotipuri, cum ar fi suprafaa arborilor, plante, ceea ce implic acestora un caracter mucos-vscos. Patogenitate. K. pneumoniae este o bacterie virulent (prin capsula polizaharidic antifagocitar, prezena pililor cu aderen specific, bacteriocinele factori de autoselectare), posed o endotoxin, condiionat patogen. Afecteaz, n special organismele cu aprare antiinfecioas deficitar. odat ajuns n esuturi se nmulete rapid, este piogen, uneori bacteriemic. Klebsielele produc complicaii supurative bronhopneumonice postvirale (mai ales n viroze tratate cu antibiotice i chimioterapice), n tuberculoz; complic leziunile n pasteureloza iepurilor; produce infecii secundare n tusea de canis, mai ales dup intervenia agenilor virali, izolndu-se frecvent de la cinii bolnavi; mamite la vaci; infecii pulmonare primare sau asociate cu ali germeni la viei i cobai); metrite la iap, etc. la om, subspecia ozaenae determin ozena, care se manifest printr-o secreie nazal, purulent i fetid, cu leziuni granulomatoase i evoluie cronic, iar subspecia rhinoscleromatis (frisch, 1882) produce rinoscleroma, care se manifest printr-o rinit cronic cu leziuni granulomatoase. Aceast bacterie a fost izolat dintr-un episod de toxiinfecie alimentar
207

cu Escherichia coli din probe de hamburgeri i din sngele unui pacient. Tulpina de K. pneumoniae a fost lT pozitiv. Infecia experimental. Animalul cel mai sensibil este oarecele alb inoculat intraperitoneal, care face o infecie septicemic, iar n frotiurile efectuate din organe se evideniaz numeroi germeni capsulai. Sensibilitatea la antibiotice i chimioterapice. Speciile de Klebsiella sunt natural sensibile la majoritatea antibioticelor i chimiote-rapicelor cu spectru larg, n special la polimixine i la concentraii mari de penicilin G, dar tot mai multe tipuri sunt multirezistente datorit transferului de fR-plasmidic. datorit procentului foarte mare de tulpini rezistente la antibioticoterapie, Stp. aureus, Ps. aeruginosa, Proteus formeaz mpreun grupul bacteriilor problem a terapeuticii medicale umane i veterinare.

6.8. genul Streptococcus

familia Streptococcaceae face parte din ordinul Lactobacillales. Acesta cuprinde n afar de familia Streptococcaceae, nc ase familii, dup cum urmeaz: Lactobaci-llaceae (cu 3 genuri), Aerococcaceae, CRNAobacteriaceae, Enterococca-ceae (cu 5 genuri, streptococi enterici), Leuconostoccaceae (streptococii din produsele lactate), Incertae sedis. Istoric. Studiul streptococilor a preocupat n decursul timpului pe muli cercettori: lister, Rivolta, Billroth, Pasteur, Koch, Rosenbach, lancefield. n 1873, Rivolta pune n eviden agentul etiologic al gurmei, boal infecioas specific solipedelor. ulterior, s-au realizat studii ample de ctre numeroi cercettori, n ara noastr evideniindu-se cele efectuate de Jivoin i mitroi. Stc. suis a fost identificat prima dat ca specie n 1959, de ctre moor, care l-a izolat din leziuni septicemice de la porci. Taxonomie. familia Streptococcaceae a suferit numeroase remanieri pe baza criteriilor de taxonomie molecular: hibridarea acizilor nucleici, analiza secvenelor RNAr 16S, procentajul coninutului n G+C al dNAului, compoziia n lipide, analiza electroforetic a diverselor enzime, utilizarea anticorpilor monoclonali. Cuprinde n prezent 2 genuri (dup J.P. Euzby, 2006): Streptococcus (cu 83 de specii) i Lactococcus (cu 5 specii).
208

Tabelul 6.4 diferenierea grupelor de streptococi n funcie de unele caractere de baz (dup Rpuntean Gh., Boldizsar E., 2001) Streptococi de grup A B C d E Viridans Pneumococi hemoliz + nehemolitic Sensibilitatea la bacitracin + cAMP + 6,5% naCl + + Bil esculin + + -

Clasificarea streptococilor se poate realiza pe baza urmtoarelor caractere: 55 aspectul hemolizei determinat pe agar snge; 55 structura antigenic (clasificarea lancefield); 55 criterii ecologice i metabolice (clasificarea Sherman). Pe baza activitii hemolitice streptococii se clasific n urmtoarele tipuri: 55streptococii beta-hemolitici, care produc hemoliz complet (clar) n jurul coloniilor, cu diametrul variabil, n funcie de grupul antigenic. 55 streptococii alfa-hemolitici, care produc hemoliz incomplet, coloniile fiind nconjurate de o zon galben-verzuie, datorit transformrii hemoglobinei n methemoglobin sub aciunea peroxidului de hidrogen, hematiile fiind numai parial lizate. 55streptococii alfa prim () hemolitici, ce produc n jurul coloniilor o zon asemntoare alfa hemolizei, dar bordat de o zon ngust de beta hemoliz. 55 streptococii nehemolitici, care formeaz n mediul de cultur colonii, fr modificarea acestuia. Clasificarea antigenic Lancefield a fost realizat pe baza antigenului specific de grup, poliglucidul (poliozidul) C din peretele celular, cu excepia grupului d, care este constituit din acid glicerol-teichoic. n 1928, Rebecca lancefield a mprit genul Streptococcus n 18 grupe serologice, notate de la A la T. Grupele A, B, f, h i I sunt echivalente cu cte o specie, iar mai mult de 90% din infeciile streptococice sunt produse de grupa antigenic
209

A, respectiv de Stc. pyogenes. n prezent, clasificarea antigenic a fost readaptat n: V streptococi grupabili, grupele A-W (cu excepia literelor I i J); V streptococi negrupabili, care nu conin antigenul de grup. Specii de streptococi de interes zoonotic Speciile de streptococi de interes zoonotic sunt reprezentate de Stc. suis i Stc. equi subsp. zooepidemicus. n cazul lui Stc. suis, sursa de infecie pentru om este reprezentat de porcii sau carnea de porc infectat, iar n cazul Stc.equi zooepidemicus de laptele nepasteurizat. Toi streptococii zoonotici produc exotoxine (hemolizine, hialuronidaze i proteinaze) care distrug esuturile. Stc. equi zooepidemicus poate produce leziuni septice la numeroase specii de mamifere, de la bovine i cabaline, pn la cobai i iepuri. Produce infecii ale tractului respirator la cabaline, manifestate prin catar. la vaci poate fi implicat n producerea mastitelor, care reprezint principala cale de transmitere la om. la om determin faringite acute, datorit faptului c este localizat la nivelul tractului respirator. Infecia se poate complica prin diseminare pe cale pulmonar sau sangvin. Infeciile cele mai severe de la om au fost asociate cu consumul de lapte nepasteurizat de la vaci cu mastit. n Romnia, 85 de persoane s-au mbolnvit de glomerulonefrit acut prin consum de lapte nepasteurizat. un episod asemntor a avut loc ntr-o familie de fermieri din Yorkshire (R.T. mayon-White, 2005). Prevenirea acestui tip de infecii se poate realiza prin pasteurizarea laptelui. n tratament se folosete penicilina. Stc. suis. Exist dou tipuri, 1 i 2. Tipul 1 a fost semnalat la purceii nou-nscui i nu transmite boala la om, iar tipul 2 la purceii nrcai, rspunztor de infecia zoonotic cu Stc. suis face parte din grupul R (tipul 2), fiind implicat n producerea meningitei la om i la porc. Se pare c omul contracteaz infecia de la porc prin intermediul picturilor inhalate n timpul prelucrrii crnii. Germenul a fost identificat n 1959 de ctre moor, care l-a izolat din leziuni septicemice de la porc.
210

Pe baza antigenelor polizaharidice de grup speciile au fost divizate n grupul R (tipul 2) i grupul S (tipul 1). Boala a fost semnalat la om pentru prima dat ntre 1960-1966 n danemarca. S-a rspndit apoi n olanda, frana, marea Britanie. n hongKong (1978-1980) boala a fost considerat ca fiind cea mai frecvent cauz de meningit la om (R.T. mayon-White, 2005). Calea de contaminare nu este nc clar. Se pare c infectarea se produce de la esuturile de porc (carne, esut limfoid inclusiv tonsile) prin pielea lezat sau prin inhalarea streptococilor care colonizeaz subclinic faringele. Nu exist o metod satisfctoare de prevenire a infeciei deoarece majoritatea cazurilor umane au fost nregistrate printre persoanele care nu au intrat n contact direct cu purceii tineri sau bolnavi. Antibioticul de elecie este penicilina. Streptococcus iniae a fost pentru prima dat izolat n 1972 dintr-o infecie a delfinilor din Amazon, n Israel, n 1986, din infecii la tilapia i pstrv, iar mai trziu din Taiwan i SuA. Primul caz uman de intoxicaie alimentar a fost semnalat n 1991, n Texas i n 1994, n otawa. Patru cazuri de intoxicaii alimentare au fost semnalate n ontario, Canada 1995-1996, att din probele de pete consumat, ct i de la pacieni. Petele a fost tilapia, importat din SuA. S. iniae este beta-hemolitic pe globulele roii de oaie. la om produce infecii fulminante ale esuturilor moi.

6.9. genul Erysipelothrix

Taxonomie. Genul Erysipelothrix face parte din familia Erysipelothrichaceae. (Bergeys manual of Systematic Bacteriology, 2nd, 2004. Genul cuprinde trei specii: Ers. rhusiopathiae i Ers. tonsillarum, Ers. inopinata (Verbarg et al., 2004) 6.9.1. Erysipelothrix rhusiopatiae (migula, 1900; Buchanan, 1918) Istoric. Robert Koch n 1876, a izolat pentru prima dat dintr-o infecie septicemic, o bacterie fin, Gram pozitiv, pe care o denumit-o Ers. murisepticus. Pasteur i Thuillier (1883) descriu un germen asemntor dintr-un caz de rujet la porc.
211

friedrich lffler este primul care realizeaz un studiu concludent, iar Rosenbach (1909) descrie pentru prima dat infecia la om, pe care o denumete cu termenul de erizipeloid. ulterior, leclainche i lorenz au preparat serul antirujetic pe cal i, respectiv, pe porc. Trevistan (1885) propune denumirea de Ers. insidiosa, iar Migula (1900) cea de Bacterium rhusiopathiae. Buchanan (1918) combin cele dou apelative, crend numele de Ers. rhusiopathiae, acceptat pn n prezent. morfologie. Bacterie Gram pozitiv, cu dimensiuni de 0,5-2,5/0,2-0,4 microni. Este nesporogen, necapsulogen i imobil. Bacilul rujetului este considerat cel mai fin bacil din grupa bacteriilor clasice i apare n frotiuri drept sau uor ncurbat. Variantele S apar dispuse izolat, n perechi unghiulare (V, Y, N, etc.), grmezi sau lanuri scurte. Variantele R se caracterizeaz prin apariia formelor filamentoase, foarte lungi de circa 50-60 microni, care devin predominante. Ambele forme se decoloreaz uor i pot aprea Gram negative cu poriuni Gram pozitive, ceea ce d filamentelor un aspect moniliform, putnd fi considerat Gram labil. n frotiurile efectuate din ficat, n infecii experimentale, se ntlnesc numeroi bacili fagocitai n citoplasma celulelor Kuppfer, care iau aspectul unor pernie cu ace. Condiii de cultivare i caractere culturale. Germen facultativ anaerob sau microaerofil, care se dezvolt bine pe medii uzuale. Pentru stimularea creterii se recomand incubarea germenului la 37oC n bulion glucozat i atmosfer cu 5-10% dioxid de carbon. Pe agar infuzie de cord cu 5% snge de berbec sau iepure, n 24-48 de ore de incubare la 37 de grade Celsius n atmosfer mbogit cu dioxid de carbon, formeaz att colonii S ct i R. Variantele S sunt foarte fine (circa 0,5 milimetri), cu aspect de geam aburit caracteristic, rotunde, convexe, strlucitoare, transparente i cu centrul din ce n ce mai opac. Variantele R sunt mai mari, mai turtite, cu suprafaa ondulat i margini neregulat fimbriate. formele S (dar nu i cele R) sunt nconjurate de o zon ngust de alfa hemoliz de culoare verzuie. Cultivat n profunzimea mediilor semisolide, bacilul rujetului se dezvolt uniform de-a lungul liniei de nsmnare, cultura bacterian avnd
212

aspectul unei periue de splat eprubete. n bulion produce o turbiditate discret, care la agitare, n cazul culturilor tinere formeaz valuri cu aspect de fum de igar. n culturile vechi formeaz un depozit lenticular, care dup agitare se ridic n mediu sub forma unui filament rsucit (tirbuon). Pentru izolarea germenului din materiale patologice, se folosesc medii de mbogire selectiv cum ar fi: mediul Packer, pe baz de azid de sodiu i cristal violet; mediul Bhm, din bulion de carne de porc, pepton Whitte, fosfat de sodiu, glucoz, cristal violet i azid de sodiu. n cazul preparrii vaccinurilor se folosete un mediu lichid recomandat de feist, care conine: fosfat acid de sodiu, glucoz, pepton, extract de drojdie de bere, l-arginin i Tween80. Proprieti biochimice. fermenteaz fr producie de gaz: glucoza, lactoza, fructoza i galactoza. Nu produce catalaz, oxidaz n schimb produce hidrogen sulfurat pe mediul TSI (triple sugar iron). Proprieti antigenice. Bacilul rujetului posed antigene poliglucidice i polipeptidice cu caracter de haptene. Prin reacia de seroprecipitare n gel de agar au fost identificate iniial trei serogrupuri, notate cu A, B i N. ulterior, au fost identificate peste 23 de serovaruri, dintre care serovarurile notate cu 1 i 2, corespund celor notate anterior cu serogrupurile A i B. de remarcat c n primele dou serotipuri s-au ncadrat 75-80% din tulpinile examinate. Tipul 1 (fost tip A) are dou subtipuri 1a i 1b. Se izoleaz din infeciile acute i este virulent, iar tipul 2 (fost tip B) se izoleaz din infeciile cronice i posed n plus un antigen hemaglutinant i o substan solubil imunizant. de aceea, pentru prepararea vaccinurilor antirujetice se utilizeaz tulpinile de tip B. Prin testele de aglutinare ncruciat s-a dovedit c toate tulpinile de Ers. insidiosa, posed cel puin un antigen comun. Sensibilitatea fa de factorii de mediu. Bacilul rujetului prezint o rezisten destul de crescut la aciunea factorilor de mediu. la temperatura de 70oC rezist 5-10 minute i este rezistent la uscciune. n snge i carne rezist luni de zile, chiar dac acestea au intrat n putrefacie. n dejecii sau reziduuri de pete rezist pn la 6 luni, dac temperatura este sub 12oC.
213

Prezint o rezisten foarte mare n mediile de cultur. de exemplu, n culturile din medii lichide, supuse variaiilor de temperatur, germenii i-au conservat nu numai viabilitatea, dar i patogenitatea, ntre 6 luni i 2 ani. Bacilul rujetului este sensibil la aciunea substanelor dezinfectante, cum ar fi: hidroxid de sodiu 5%, formol 2% i clorur de var 1%. Este sensibil la antibiotice ca: penicilina i tetraciclina, fiind rezistent la polimixin, neomicin, kanamicin. Ecologie. Ers. rhusiopathiae este o bacterie cu rspndire cosmopolit, fiind natural gzduit la vertebrate (porci, ovine, cobai, bovine, psri, peti i nurca domestic) i nevertebrate (crustacee). Sediul de predilecie l constituie rinofarinxul i amigdalele. Prezena bacteriei n coninutul intestinal, dejecii, mucusul petilor i rezistena n mediul extern explic rolul solului, apelor de suprafa, apelor reziduale de la ferme i abatoare, a nmolului, n transmiterea bacteriei pe cale oral ntre animale. Produsele de carne i pete, chiar afumate ori saramurate, vehiculeaz eficient aceast bacterie. frecvena mbolnvirilor este mai mare n sezonul clduros i mai mic n sezonul rece iar n efectivele n care a aprut infecia, mbrac un caracter staionar sau trenant. Patogenitate. Nu este nc pe deplin neleas. Bacilul rujetului acioneaz prin virulen i toxigenez. Tulpinile virulente aparin serotipului A i produc de regul, hialuronidaz. Alte tulpini produc neuraminidaz, endotoxine productoare de eritem, evideniate de ctre leimbeck, n 1979, pe embrioni de gin. Activarea neuraminidazei poate fi asociat cu mai multe aspecte ale patogenezei bolii, cum ar fi: creterea permeabilitii pereilor vasculari, formarea n exces a fibrinei din fibrinogen i stimularea aglutinrii eritrocitare, ducnd la hemoliz. Neuraminidaza cliveaz legturile alfa glicozidice ale acidului neuraminic, un mucopolizaharid reactiv, care se gsete pe suprafeele celulare. modificrile cronice din artrita erizipelic sunt asociate cu procese imunologice. Bacteriile nu dispar complet din articulaiile afectate cronic i leziunea poate progresa ca rspuns la expunerea continu la aceste componente antigenice. Infecia natural. Se numete rujet (rash), iar popular, brnc i
214

afecteaz, de regul, suinele, dar este ntlnit i la alte specii de animale i psri inclusiv la om, cu caracter endemic. Se manifest clinic prin evoluie septicemic, febril, cu tulburri generale i leziuni cutanate congestive i urticariforme, sau prin evoluie cronic, cu localizri cardiace, auriculare i cutanate. Porcul este specia cea mai receptiv, iar datorit frecvenei i pierderilor mari, pe care le producea n trecut, a fost considerat boala numrul doi a porcinelor, dup pest. Infecia are de obicei, o evoluie enzootic producnd mari pierderi economice (cu dermatite, artrite, endocardite). n ordinea receptivitii, dup porcine urmeaz ovinele n special mieii cu vrsta de 2-3 luni i psrile, n special curcile i fazanii (Stilles, 1946). Au mai aprut infecii la gte, gini outoare, puni, potrnichi. omul, este de asemenea, receptiv, fcnd n special infecii localizate sub forma unei dermatite acute, numit i erizipeloidul lui Baker-Rosenbach, boal profesional, ce apare mai ales la mcelari, mezelari, care intr n contact direct i repetat cu carnea contaminat. Infecia poate mbrca aspectul unei dermite cu posibiliti de generalizare septicemic i localizri secundare (artrite, endocardite). unul dintre primele studii ale incidenei acestui microorganism n alimente a fost efectuat de ctre Ternstrom i molin, n 1982, n Suedia. Ei au examinat 135 de probe de carne de pui, de vit i de porc i au gsit E. rhusiopatiae n 36%, respectiv 13%, dintre probele de porc i pui. n probele din carnea de vit nu au gsit acest germen.

215

Aeromonas hydrophila susp. hydrophila: Colonii netede, de dimensiuni medii sau mari, de culoare alb. Coloniile au marginile regulate

Acelai mediu de agar cu snge examinat n fundal luminous. Coloniile sunt nconjurare de o zon de hemoliz
216

Bacteroides fragilis: cultur agar cu snge, colonii de dimensiuni mici, netede, de culoare alb.

Bacteroides fragilis: filamente bacilare n frotiu din cultur.

217

Enterobacter aerogenes: mediu Eosin-methylene Blue. Colonii mari mucoide, brune cu central ntunecat, ce indic fermentarea lactozei i producia de acid (Naowarat Cheeptham, Thompson Rivers university, Canada)

mediu Eosin-methylene Blue inoculat simultan cu (A) Escherichia coli, (B) Pseudomonas aeruginosa, (C) Klebsiella pneumoinae i (d) Enterobacter aerogenes. Toate cele patru bacterii gram-negative exprim morfologie diferit. Coloniile de Escherischia coli prezint morfologie tipic lactozofermentativ cu producie excesiv de acid i precipitarea de pigment verde metalizat (colonii verzi cu luciu metalic). Coloniile de Pseudomonas aeruginosa expun o morfologie nefermentativ (colonii roz), ambele colonii de Klebsiella pneumoniae i Enterobacter aerogenes au morfologie lactozofermentativ i productoare de acid (colonii brune cu centrul ntunecat). (Naowarat Cheeptham i Carolynne fardy, Thompson Rivers university, Canada)
218

Brucella suis: cultur n agar cu snge ( foto: CdC/dr. W.A. Clark, Public health Image library)

Brucella spp.: Cocobacili mici gram-negativi (0,5-0,7 x x0,61,5 ) (are gram-negative in their staining morphology (CdC, Public health Image library)
219

Klebsiella pneumoniae subsp. pneumonia: colonii gri, de dimensiuni medii, nehemolitice

Klebsiella pneumonia: microscopie in contrast de faz. Bacili scuri cu marginile paralele i capetele rotunjite, imobil
220

Mediu Plesiomonas shigelloides CCm 5860, 37C, 24h

Plesiomonas shigelloides CCm 5860 , mediu de cultur, 37C, 24h

221

Erysipelothrix rhusiopathiae: mediu agar cu snge. la 48 de ore coloniile sunt punctiforme, nepigmentate i transparente, nehemolitice

Erysipelothrix rhusiopathiae: bacilli drepi sau ncurbai

222

Streptococcus equi subsp. zooepidemicus. Agar cu snge , colonii mucoide, semitransparente, punctiforme i mici

Streptococcus zooepidemicus: coloratie Gram. lanuri de coci gram pozitivi

223

Bibliografie selectiv 1. Amagliani, G.; omiccioli, E.; Andreoni, f.; Boiani, R.; Bianconi, I.; zaccone, R.; mancuso, m.; magnani, m. development of a multiplex PCR assay for Photobacterium damselae subsp. piscicida identification in fish samples.; Blackwell Publishing, oxford, uK, Journal of fish diseases, 2009, 32, 8, pp 645-653, 28 ref. 2. Benno, Y.; mitsuoka, T. Incidence and isolation of three new Bacteroides spp. from abscesses in pigs.; Japanese Journal of Veterinary Science, 1984, 46, 5, pp 749-752, 9 ref. 3. Bergagna S, zoppi S, ferroglio E, et al. Epidemiologic survey for Brucella suis biovar 2 in a wild boar (Sus scrofa) population in northwest Italy. [Journal Article, Research Support, Non-u.S. Govt] J Wildl dis 2009 oct; 45(4):1178-81. 4. Chacko, K. l.; Vineeth Rajagopal; Jaibi, K.; latha, C.; Nanu, E. fish borne bacterial zoonoses. ; Intas Pharmaceuticals ltd, Ahmedabad, India, Intas Polivet, 2006, 7, 2, pp 207-211, 5 ref. 5. falkenhorst G, Bagdonaite J, lisby m, et al. outbreak of group A streptococcal throat infection: dont forget to ask about food. [JouRNAl ARTIClE] Epidemiol Infect 2007 Nov 16.:1-7. 6. Gonzlez-Rey, C.; Svenson, S. B.; Bravo, l.; Siitonen, A.; Pasquale, V.; dumontet, S.; Ciznar, I.; Krovacek, K. Serotypes and anti-microbial susceptibility of Plesiomonas shigelloides isolates from humans, animals and aquatic environments in different countries. ; Pergamon Press, oxford, uK, Comparative Immunology, microbiology & Infectious diseases, 2004, 27, 2, pp 129-139, 40 ref. 7. hassan, N. B. A.; Abdalla, m. o. m.; Nour, A. A. A. m. microbiological quality of heat-treated milk during storage.; ANSInet, Asian Network for Scientific Information, faisalabad, Pakistan, Pakistan Journal of Nutrition, 2009, 8, 12, pp 1845-1848, 24 ref. 8. Jaradat, z. W.; Ababneh, Q. o.; Saadoun, I. m.; Samara, N. A.; Rashdan, A. m. Isolation of Cronobacter spp. (formerly Enterobacter sakazakii) from infant food, herbs and environmental samples and the subsequent identification and confirmation of the isolates using biochemical, chromogenic assays, PCR and 16S rRNA sequencing. ; Biomed Central ltd, london, uK, BmC microbiology, 2009, 9, 225, pp (27 october 2009), 51 ref. 9. Jin ShengQuan; Yin BinCheng; Ye BangCe multiplexed bead-based mesofluidic system for detection of food-borne pathogenic bacteria.; American Society for microbiology (ASm), Washington, uSA, Applied and Environmental microbiology, 2009, 75, 21, pp 6647-6654, 44 ref. 10. linhart Y, Amitai z, lewis m, et al. A food-borne outbreak of streptococcal pharyngitis. [Journal Article] Isr med Assoc J 2008 Aug-Sep; 10(8-9):617-20. 11. manzat, R. m.; Vintil, C.; Isolation and cultivation of fusiformis (Bacteroides) nodosus. lucrri Stiintifice, Institutul Agronomic Timisoara, Seria medicin Veterinar, 1980, 17, pp 159-162, 12 ref. 12. munn, C. B. microbial diseases of fish. ; Garland Science, Taylor and francis Group, llC, New York, uSA, marine microbiology: ecology and applications, 2004, pp 223-242, 39 ref.

224

13. musgrove, m. T.; Jones, d. R.; Shaw, J. d.; Sheppard, m.; harrison, m. A. Enterobacteriaceae and related organisms isolated from nest run cart shelves in commercial shell egg processing facilities. ; Poultry Science Association, Savoy, uSA, Poultry Science, 2009, 88, 10, pp 2113-2117, 25 ref. 14. Nagano, I.; Inoue, S.; Kawai, K. Repeatable immersion infection with Photobacterium damselae subsp. piscicida reproducing clinical signs and moderate mortality.; oshima, S.; Springer-Japan, Tokyo, Japan, fisheries Science, 2009, 75, 3, pp 707-714 15. Nakazawa h, hayashidani h, higashi J, et al. occurrence of Erysipelothrix spp. in chicken meat parts from a processing plant. [Journal Article] J food Prot 1998 Sep; 61(9):1207-9. 16. Neta AV, mol JP, xavier mN, et al. Pathogenesis of bovine brucellosis. [JouRNAl ARTIClE] Vet J 2009 Sep 2. 17. Newaj-fyzul, A.; mutani, A.; Ramsubhag, A.; Adesiyun, A. Prevalence of bacterial pathogens and their anti-microbial resistance in tilapia and their pond water in Trinidad.; Blackwell Publishing, Berlin, Germany, zoonoses and Public health, 2008, 55, 4, pp 206-213, 44 ref. 18. Pereira, C. S.; Amorim, S. d.; Santos, A. f. das m.; Siciliano, S.; moreno, I. B.; ott, P. h.; Rodrigues, d. dos P. Plesiomonas shigelloides and Aeromonadaceae family pathogens isolated from marine mammals of southern and southeastern Brazilian coast.; Sociedade Brasileira de microbiologia, So Paulo, Brazil, Brazilian Journal of microbiology, 2008, 39, 4, pp 749-755, 30 ref. 19. Roop Rm, Gaines Jm, Anderson ES, et al. Survival of the fittest: how Brucella strains adapt to their intracellular niche in the host. [JouRNAl ARTIClE] med microbiol Immunol 2009 Sep 22. 20. Salerno, A.; deltoile, A.; lefevre, m.; Ciznar, I.; Krovacek, K.; Grimont, P.; Brisse, S. Recombining population structure of Plesiomonas shigelloides (Enterobactenaceae) revealed by multilocus sequence typing. ; American Society for microbiology (ASm), Washington, uSA, Journal of Bacteriology, 2007, 189, 21, pp 7808-7818, 57 ref. 21. Scheff, G. J. Comparison of fusobacterium sp. versus Bacterioides sp. in the monoxenic cultivation of E. histolytica.; zentralblatt fur Bakteriologie, Parasitenkunde und Infektionskrankheiten, Abteilung 1, originale A, 1978, 242, 3, pp 419-421 22. Suzuki J, Sakaguchi K [Properties of metabolic substance produced by group A Streptococcus from two food-borne epidemic] [English Abstract, Journal Article] Kansenshogaku zasshi 2009 Jul; 83(4):380-5. 23. Takayama Y, hikawa S, okada J, et al. A foodborne outbreak of a group A streptococcal infection in a Japanese university hospital. [JouRNAl ARTIClE] Eur J Clin microbiol Infect dis 2008 Aug 21. 24. Yez, m. A.; Cataln, V.; Apriz, d.; figueras, m. J.; martnez-murcia, A. J. Phylogenetic analysis of members of the genus Aeromonas based on gyrB gene sequences.; Society for General microbiology, Reading, uK, International Journal of Systematic and Evolutionary microbiology, 2003, 53, 3, pp 875-883, many ref. 25. Ye YingWang; Wu QingPing; Yao lin; dong xiaohui; Wu Kui; zhang Jumei; mary Ann liebert A comparison of polymerase chain reaction and international organization for standardization methods for determination of Enterobacter sakazakii contamination of infant formulas from Chinese mainland markets. Inc., New Rochelle, uSA, foodborne Pathogens and disease, 2009, 6, 10, pp 1229-1234, 31 ref. 225

cAPiTolUl 7 PrInCIPALELE mICOTOxInE ImPLICATE n PrOdUCErEA TOxIInfECIILOr ALImEnTArE

caractere generale micotoxinele sunt metabolii toxici produi de micei n substraturile alimentare i furaje. Termenul de micotoxin deriv de la grecescul mykes, mucos = ciuperc (fung) i latinescul toxicum = otrav. Se pare c fungii (mucegaiurile) reprezint grupul cel mai mare de microorganisme din sistemul biologic (~300 000 specii), fapt care a dus la concluzia c nu trim ntr-o lume cu fungi, ci mai degrab ntr-o lume a fungilor (Bulmer, 1969). un numr foarte mare de ciuperci produc micotoxine. unele sunt mutagene i carcinogene, altele prezint o toxicitate cu specificitate pentru anumite organe. Toxicitatea acestora pentru om nu a fost nc demonstrat. Se cunosc ca substane carcinogene 14 micotoxine, dintre care aflatoxinele sunt cele mai importante. n general este acceptat faptul c 93% dintre compuii mutageni sunt carcinogeni. micotoxinele sunt metabolii secundari. Ei se formeaz la sfritul fazei exponeniale, nefiind implicai n cretere sau metabolism. n general se formeaz cnd se acumuleaz cantiti mari de precursori primari de metabolism (aminoacizi, acetat, piruvat). din fericire speciile patogene sunt n numr de cteva zeci. n patologie, fungii sunt implicai n trei categorii de afeciuni: micoze, micotoxicoze i alergiile fungice. micozele sunt boli determinate de fungi a cror prezen este obligatorie n organismul afectat (de exemplu: candidoza, tricofiia, etc). micotoxicozele sunt entiti determinate de micotoxine care ptrund n organism o dat cu furajele n care au fost elaborate de ctre fungii toxici. Astfel, micotoxicozele nu implic prezena agentului biotic (fungului) n organismul animal i uneori nici chiar n substratul n care a fost elaborat micotoxina. Alergia fungic este un sindrom determinat cel mai frecvent de sporii
226

de mucegai.
Tabelul 7.1. Toxicitatea i efectele biologice ale unor micotoxine majore din alimente Alimentele Activitatea Ld50 (mg/ micotoxina Specii productoare implicate biologic kg) porumb, alune, 0,5 (cine), smochine, lapte Aspergillus flavus hepatotoxic, Aflatoxine 9,0 i produse din Aspergillus parasiticus carcinogen (oarece) lapte Aspergillus flavus Acid brnz, porumb, 36 Penicillium convulsii ciclopiazonic alune, mei (obolan) aurantiogriseum deoxinivaFusarium graminearum vom, refuzarea 70 cereale lenol Fusarium culmorum hranei (oarece) leucopenie toFusarium xic de origine 4 (obolan) Toxina T-2 cereale sporotrichioides alimentar Ergotamina secar Claviceps purpurea neurotoxin 5 encefalomalacia ecvin 5 edem pulmofumonizin porumb Fusarium moniliforme nar - la ecvine ? 5 carcinom esofagian - la suine 2030 porumb, cereale, Penicillium verrucosum ochratoxina nefrotoxic (obolan) boabe de cafea Aspergillus ochraceus edem, hemo35 suc de mere, Penicillium expansum ragii, posibil Patulina produse din mere (oarece) carcinogen Penicillium efect tremorgen 1,05 Penitrem A nuc aurantiogriseum (oarece) Sterigmatocistina Acid tenuazonic cereale, boabe de Aspergillus versicolor cafea, brnz past de tomate Alternaria tenuis hepatotoxic, carcinogen Convulsii, hemoragii 166 (obolan) 81 (oarece ) 186 (oarece ) nu prezint toxicitate acut Tabelul 7.2.

Zearalenona

porumb, orz, fin

Fusarium graminearum Efect estrogen

227

Limitele admise pentru micotoxine micotoxine Aflatoxine n alimente Aflatoxina m1 n lapte deoxinivalenol n fin ochratoxina A n alimente Patulina n sucul de mr Toxina T2 Zearalenona limite admise (g/kg) 0 0-1 1000-4000 1-300 20-50 100 30-1000 Nr. de ri 48 17 5 6 10 2 4

7.1. Aflatoxinele
Aflatoxinele reprezint un grup de metabolii secundari elaborai dup faza de cretere logaritmic a unor tulpini toxigene de Aspergillus. Sunt de departe cele mai studiate micotoxine. Sunt cunoscute, nc din anii 1960, cnd mai mult de 100.000 de pui de curc au murit n Anglia dup ce au consumat o mncare cu alune, importat din Africa i America de Sud. din alimentul toxic au fost izolate Aspergillus flavus i o toxina produs de acest microorganism, care a fost denumit aflatoxin (toxina lui A. flavus: A-fla-toxin). Aspergillus flavus este un microorganism mezofil care se dezvolt la temperaturi cuprinse ntre 6C i 46C, cu un interval optim de 36-38C. umiditatea, substratul, gradul de aerare etc sunt foarte importante pentru dezvoltarea tulpinilor aflatoxigene. Aspergillus flavus se dezvolt i elaboreaz aflatoxine cnd umiditatea relativ a aerului este de 80% i a substratului de 30%. Temperatura optim de dezvoltare n condiii de laborator este de 25C, cnd tulpina este cultivat pe arahide, iar elaborarea aflatoxinei ncepe din a 7 a pn n a 9 a zi de cultivare (diener i davis, 1966). hesseltine i col. (1966) au publicat o sintez a cercetrilor privind producerea aflatoxinei pe boabele de cereale ntregi sau mcinate: porumb, gru, orez. mayne i col. (1966) au artat c producia de aflatoxine pe seminele de bumbac a fost egal cu cea de pe gru i de dou ori mai mare dect cea de pe arahidele infectate cu Aspergillus flavus. Cantiti de ordinul zecilor de g/ml aflatoxin au fost obinute prin cultivarea fungului pe sucuri de mere, caise, grapefruit, struguri, portocale, piersici, ananas, roii (Wildman citat de diener i davis, 1969) precum i pe alte substraturi alimentare ca: paste finoase, brnz, lapte praf, alune de pdure, nuci, semine de mac, miez de nuc de cocos, cartof, bacon afumat, mazre,
228

fasole, prune, mere, pere, smochine (frank, 1966). n general, datele existente n literatur indic faptul c substraturile bogate n glucide (gru, orez) favorizeaz producerea unor cantiti mai mari de aflatoxine dect cele bogate n ulei (arahide, bumbac, soia), (diener i devis, 1969). Studiile asupra naturii toxine a acestor substane, relev urmtoarele 4 componente.

Aspergillus flavus produce AfB1 i AfB2, iar Aspergillus parasiticus produce toate cele 4 aflatoxine majore (B1, G1, B2 i G2) n funcie de culoarea fluorescentei lor n lumina uV de 254 i 366 nm (B - blue, G - green) i de poziia lor pe placa cromatografic. Aceti compui sunt cumarine, nalt substituite, fiind cunoscute cel puin 18 toxine nrudite. Afm1, este un produs hidroxilat al lui AfB1, i apare ca produs metabolic n lapte, urin, fecale. Afl, Aflh1, AfQ1, i AfP1, sunt derivai din AfB1, AfB2 (este forma 2,3-dihidro- a lui AfB1). Toxicitatea celor mai potente aflatoxine descrete n ordinea urmtoare: B1-m1 -G1-B2-m2-G2. Privite n lumin ultraviolet prezint urmtoarea fluorescen: B1 i B2 - albastru, G1 - verde, G2 -verde-albstrui, m1 -albastru violet, m2 - violet. Aflatoxinele sunt metabolii secundari al cror schelet de carbon vine de la acetat si malonat. Calea parial propus pentru sinteza AfB1 este urmtoarea: acetatacid norsolorinic-averantin-averufanin-averufin-acetat verziconal hemiacetal, versicolorina A, sterigmatocistina, metil-sterigmatocistina
229

o, AfB1.Verzicolorina A este prima din lan, care conine legtura dubl esenial C2-C3. Proprietile fizico-chimice ale aflatoxinelor Aflatoxinele naturale sunt compui foarte stabili n substraturile alimentare i furaje, fiind foarte reactivi la extremele de ph (10< ph< 3), n lumin uV i n prezena oxigenului, reactivitate datorat ciclului furanic nesaturat i structurii lactonice. din 25 de probe de A. flavus i A. parasiticus pe agar la 2C, 7C, 41C sau 46C n 8 zile, nu a fost produs nici o aflatoxin, sub 7,5C sau peste 40C, chiar i n condiii favorabile. Pe agarul Sabouraud dezvoltarea minim a lui A. flavus i A. parasiticus a aprut la 33C, la un ph 5 i un aw=0,99. la 15C dezvoltarea a aprut la un aw=0,95, n timp ce la 27C i la 33C, la aw=0,85 s-a observat o dezvoltare slab. ntr-un studiu, creterea maxim a lui A. parasiticus a aprut la 35C, dar nivelul cel mai nalt de toxin a fost produs Ia 25eC. Coninutul limitant (pn la 50 ng/g) de umezeal pentru AfB1 i AfB2 n porumb a fost de 17,5% la o temperatur peste 24C. la temperatura de 13C nu a avut loc producia de toxin. Per ansamblu producerea de toxin (cu valori raportate de 0,71 -0,94) a avut loc la un ph de 0,93-0,98. ntr-un alt studiu creterea maxim a lui A. parasiticus a avut loc la 35C, dar cel mai nalt nivel de toxin s-a produs la 24C. Per ansamblu parametrii maximali i minimali ce controleaz dezvoltarea i producerea de toxin de ctre aceste organisme eucariote, nu sunt uor de definit, pe de o parte datorit habitatelor diverse din natur, iar pe de alt parte datorit statutului lor de eucariote. Este clar c se pot dezvolta fr s produc toxine. AfG1 este produs la temperaturi de cretere mai mici dect AfB1. n timp ce unii cercettori au gsit mai mult AfB1 dect AfG1 la 30C, alii au gsit o producie relativ egal. A. flavus produce numai AfB1 i AfG1. Aerarea favorizeaz producerea de aflatoxin. Aceasta poate fi produs n cantiti de 2 mg/g, de ctre substane naturale ca orezul, porumbul, soia i altele. n bulion cu cantiti potrivite de zn2+ pot fi produse pn la 200-300 mg/l. Eliberarea de AfB1 de ctre A. flavus implic un sistem de transport energo-dependent.
230

Toxicitatea, mecanismul de aciune i metabolismul aflatoxinelor Efectele toxice acute ale aflatoxinei se datoreaz interferenei ei cu replicarea, transcripia i transducia dNA-ului, deci inhibiia sintezei proteice (moule, 1977). Inhibiia este rapid i intens chiar la doze de 1/20 din dl50 (lafage i frayssinet cit. de moule, 1977). Aceste tulburri biochimice au drept consecin alterarea infrastructurilor celulare, segregarea nuclear, deformri polisamice, agregarea granulelor intercromatiniene etc. Sistemele metabolizante ale mamiferelor sunt eseniale pentru aflatoxina AfB1 pentru exprimarea mutagenicitii. de asemenea, este esenial legarea de acizii nucleici, n special de dNA. AfB1 se leag de dNA-ul mitocondrial al ficatului, preferenial fa de cel nuclear. Situsul responsabil pentru mutagenicitate al aflatoxinei este dubla legtur din molecula de dihidrofurofuran C2-C3. Reducerea sa la forma 2.3 dihidro(AfB2) reducemutagenicitatea de 200-500 ori. leziunile genetice predominante induse de aflatoxine sunt mutaiile punctiforme. S-a demonstrat c mutageneza lui AfB1 poate fi potenat de 2 ori de ctre BhA (hidroxianisol-butilat) i de BhT (hidroxitoluen-butilat). dl50 de AfB1 pentru obolani pe cale oral este de 1,2 mg/kg i de 1,52,0 mg/kg pentru AfG1. Bobocii de ra i puietul de pstrv sunt printre cele mai sensibile, fiind urmate de obolani (30-1/713). majoritatea speciilor de animale susceptibile mor n trei zile dup administrarea toxinelor, apar grave distrucii ale ficatului, care dup examinare post mortem relev c aflatoxinele sunt hepato-carcinogene. Toxicitatea este mai mare pentru animalele tinere i pentru masculi, dect pentru animalele mai n vrst i pentru femele, iar efectele sunt sporite de dietele srace n proteine. Evidenele circumstaniale arat c aflatoxinele sunt cancerigene pentru oameni. Se pare c aflatoxinele au o influen destul de mare n producerea sindromului EfdV n Tailanda, sindromului Reye n Noua zeeland i a hepatomului acut la un copil din uganda. n ultimul caz s-au gsit modificri histologice identice cu cele observate la maimuele tratate cu aflatoxine. doi cercettori care au lucrat cu aflatoxina purificat au fcut carcinom de colon. Riscul apariiei cancerului de ficat n urma consumului de aflatoxine este de 30 de ori mai mare pentru indivizii care au fost expui hepatitei A.

231

Specie

dL50 n cazul aflatoxinelor pentru diferite specii de animale

Vrst (sau greutate) 1 zi 1 zi 1 zi 21 zile 21 zile 100 g 100g 150 g 30 zile adult nrcat adult adult 100 g Sex M M m-f M f M M f M M m-f cale per os per os per os per os per os per os intraperitoneal per os per os intraperitoneal intraperitoneal per os per os

Tabelul 7.3.

boboc de ra

obolan

hamster porc de guineea iepure cine

dL50 (mg/kg) 0,37 0,56 1,0 5,5 7,4 7,2 6,0 17,9 10,2 15,0 9,0 0,5 0,38 7,5

m-f m-f m-f

intraperitoneal

pstrv dup Wogan G. N.

AfB1 i AfB2 se pot distruge din porumb prin folosirea bisulfitului. Smochinele uscate dozate cu 250 ppb de AfB1 au fost supuse la cteva tratamente observndu-se urmtoarele aspecte: 1) n cazul folosirii bisulfitului de sodiu 1% s-a produs o reducere cu 28,2% n 72 de ore; 2) apa oxigenat 0,2% a produs o reducere de 65,5%; 3) nclzirea la 45-65C pentru o or a produs o reducere de 68,4%; 4) radiaia uV a produs o reducere 45.7%. Seminele de bumbac contaminat cu aflatoxin, tratate cu amoniac i date vacilor, au coninut niveluri mai mici de AFB1 n lapte, dect produsele netratate. S-a demonstrat c Flavobacterium aurantiacum produce AfB1 ntr-o mare varietate de alimente. Aceast bacterie n cantitate de 1010cfu/ml, din filtratele de culturi mai vechi de 72 de ore, au fost mai eficiente dect cele din culturile proaspete (24-48 de ore). ntr-un alt studiu s-a dovedit c mg2+ i Ca2+ sporesc activitatea distructiv a acestei bacterii. Cu toate c nu degradeaz aflatoxinele, bifidobacteriile i bacteriile acidolactice se leag de AfB1 i Afm1 n culturi i substraturi alimentare. Att celulele vii, ct i cele moarte se leag de aceste micotoxine.
232

Mixobacterianannocystis exedens care triete n sol, a fost testat mpotriva exosporilor i hifelor productoare de aflatoxine, A. flavus i A. parasiticus, iar rezultatele au artat c ambii fungi au fost inhibai dup 14 zile la 28C. de fapt, mixobacteria a lizat dezvoltarea coloniei dup 24 de ore. Nu este de neconceput c principiul activ pote fi extras i folosit n forma purificat mpotriva altor fungi i chiar a unor bacterii. descoperirile din acest studiu sugereaz c unele mixomicete pot fi eficiente n distrugerea fungilor micotoxigenici.
Tabelul 7.4 Limitele admise de aflatoxine n alimente, n diferite ri ara marea Britanie Limita (g/kg) 2 5 20 SuA 0,5 5 15 30 10 50 Alimente nuci, smochine uscate aceleai de sus, dar pentru procesate toate alimentele aflatoxina m1 n lapte integral, lapte degresat, lapte smntnit toate alimentele cu excepia produselor pe baz de alune produse pe baz de alune toate alimentele toate alimentele orez, alune, porumb, sorg, fasole, fin, orz i ovz

Australia India Japonia China

Analize chimice pentru evidenierea aflatoxinelor Acestea se mpart n 4 categorii: vizuale, calitative rapide, de confirmare i cantitative (Romer, 1976). 1) Metoda rapid de vizualizare a aflatoxinei n lumin UV permite identificarea acesteia n porumb la o concentraie de peste 10 ppb (Shatwell i col. 1972). 2) Testele de screening calitative rapid sunt cele mai numeroase i mai des utilizate, att n cercetarea micotoxicologic, ct i n scopuri practice. metodele oficiale n vigoare n diferite ri indic utilizarea pentru extracia aflatoxinelor a sistemelor: metanol-ap (liem i Belfoars); acetonap (Ponce i col.); cloroform-ap (Velasco. 1970); acetonitril-KCI (Stahr,
233

1977). Procedeele de purificare a extractului primar depind de compoziia chimic iniial a substratului analizat. Cele mai dificile sunt cele care implic analizele nutreurilor combinate, datorit multiplelor posibiliti de interferen fizico-chimic. Cel mai indicat procedeu n acest sens este utilizarea unui precipitat de plumb acid, urmat de trecerea fazei lichide pe o coloan de absorbie cu gel de aluminiu acid (Ponce i col, 1971). Separarea, identificarea i evaluarea aflatoxinelor se face prin procedee cromatografice: cromatografie, n strat subire (CSS), cromatografie n faz de gaz-lichid (CGt) i cromatografie de lichid de nalt presiune (CtIP). 3. Testele de confirmare se realizeaz de obicei prin reacii de derivatizare a aflatoxinei in situ pe placa cromatografic cu diferii reactivi chimici. derivatizarea are drept scop modificarea culorii fluorescentei aflatoxinei n lumin uV de 366 nm. 4. Pentru evaluarea cantitativ a aflatoxinelor din alimente i substraturife furajere, fluorodensimetria reprezint cea mai practic metod (Peterson, Stotoff, 1972). o nou metod cantitativ pentru determinarea aflatoxinelor o reprezint cromatografia n lichid de nalt presiune (ClIP) (Engsticom i col.).

7.2. Toxinele produse de Alternaria

Sunt produse de mai multe specii de Alternaria. Au fost gsite n mere, roii i alte alimente. Toxinele produse includ alternariolul, eter de alternariol monometil, alternuen, acid tenuazonic si altertoxina-1. Pe felii de mere, roii sau afine zdrobite, incubate 21 de zile la 21C, mai multe specii de Alternaria au produs toxine n cantitate de 137 mg/100g. ntr-un alt studiu, acidul tenuazonic a fost principala toxin produs n tomate cu niveluri pn la 13,9 mg/100g. Pe portocale i lmi, A. citri a produs acid tenuazonic, alternariol i eter de alternariol monometil, n concentraie de 1,15 - 2,66 mg/100g. fructele au fost incubate la temperatura camerei pentru 21-28 de zile. ntr-un studiu pe 150 de probe de floarea soarelui n Argentina, 85% conineau alternariol, 47% alternariol eter monometil i 65% acid tenuazonic. n urma fermentrii timp de 28 de zile de ctre A. alternata i separarea uleiului de aliment, toxinele au fost gsite numai n ulei. o tulpin de A. alternata a produs stemfiltoxina III, care s-a dovedit a fi mutagen prin testul Ames.
234

Specii de Alternaria i leziunile pe care le produc la om, plante i animale * Alternaria alternata - cauzeaz infecii respiratorii, la pacienii hIV pozitivi, astm, rinosinuzite cronice. Cauzeaz tciunele cartofilor i altor plante. * Alternaria arborescens - distrugerea celulelor stem la roii * Alternaria arbusti - pete pe frunzele prului asiatic * Alternaria blumeae - leziuni la Blumea aurita * Alternaria brassicae - legume i trandafiri * Alternaria brassicicola - culturi de varz * Alternaria brunsii - semine de chimen * Alternaria carotiincultae - frunze de morcov * Alternaria conjuncta - pstrnac * Alternaria dauci - morcov * Alternaria euphorbiicola - culturi de varz * Alternaria gaisen - leziuni punctiforme la pere * Alternaria infectoria - fin * Alternaria japonica - culturi de varz * Alternaria molesta - leziuni cutanate la marsuini (mamifer cetaceu) * Alternaria panax - ginseng * Alternaria petroselini - frunze de ptrunjel * Alternaria selini - ptrunjel * Alternaria solani - cartofi i roii * Alternaria smyrnii - ptrunjel

7.3. Citrinin
Cu toate c ciupercile productoare de citrinin au fost gsite pe boabele de cafea i cacao, acestea nu au produs micotoxine n aceste substraturi. Citrinina este o substan cristalin cu greutatea molecular de 250 Kda i punctul de topire la 170-1710C. n stare cristalizat din alcool citrinin (C13h14o5 ) formeaz cristale aciforme de culoare galben-citrin care n lumin uV de 366 nm prezint fluorescen galben strlucitoare.
235

Citrinina este puin solubil n ap, dar solubil n soluii diluate de Naoh i Na2Co3, i n majoritatea solvenilor organici. Citrinina este o micotoxin izolat pentru prima dat din Penicillium citrinum. Este produs de o mare varietate de fungi, folosii n producerea unor alimente ca brnzeturi, cereale, sake i pigmeni roii. Citrinina este o nefrotoxin ce cauzeaz nefropatii n efectivele de animale i a reprezint unul dintre agenii etiologici ai nefropatiei balcanice i a febrei galbene de orez. Citrinina este folosit ca reagent n cercetarea biologic. Induce permeabilitate mitocondrial, i inhib respiraia prin interferena cu complexul I al lanului respirator. Citrinina este produs de ctre Penicillium citrinum, P. viridicatum, Aspergillus niveus, Aspergillus ochraceus, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Monascus ruber, Monascus purpureus, Penicillium citrinum, Penicillium camemberti. A fost izolat din orez, pine mucegit, unc preparat n cas, gru i alte produse similare. Este un cunoscut cancerigen. din 7 tulpini de P. viridicatum toate au produs citrinin n bulion cu dextroz de cartof, n 14 zile la 20-30C, dar nu i la 10C. Citrinin a fost identificat n Germania din alimentele mucegite i mpreun cu alte micotoxine a putut fi produs ntr-un mediu sintetic. din culturile de micei toxigeni, citrinina poate fi obinut prin extracii simple la rece cu cloroform. din furaje i, n special din nutreurile combinate, tehnica de izolare i identificare este mai complicat, implicnd i etapele de degresare i decolorare (Coman i col. 1978).
236

Pentru confirmare se poate folosi sistemul de developare toluen acetat de etil-acid formic.

7.4. Ochratoxinele
Ochratoxina A este o substan cristalin, incolor, optic activ n cloroform i fluorescent n lumina uV de 254 nm i 366 nm. Greutatea ei moleculara este de 403 kda, iar punctul de topire de 90C, cnd este cristalizat din benzen i 169C cnd este cristalizat din xilen (Steyn i holzapfef, 1967).

Ochratoxina B este analogul decolorat al ochratoxinei A care se observ n lumin uV fluorescent albastr. micotoxina pur se prezint sub forma unei substane cristaline incolore cu greutate molecular de 369 Kda, fiind rar ntlnit n condiii naturale de mediu Krogh, 1979). Ochratoxina C este un ester etilic amorf al ochratoxinei A (Ioan Coman i ovidiu Popescu, 1985). ochratoxinele fac parte, mpreun cu citrinina, acidul oxalic i viridicatumtoxina, din grupul micotoxinelor nefrotoxice, care sunt implicate n etiopatogenia afeciunilor renale, ntlnite la om i animale. Ele sunt produse de micei ce aparin taxonomic genurilor Penicillium i Aspergillus. ochratoxinele au fost evideniate pentru prima dat n condiii de laborator, n cursul testrii toxicitii tulpinilor de micei din cereale i legume (Ioan Coman, ovidiu Popescu, 1985). Acestea conin un grup de 7 metabolii asemntori structural, din care ochratoxina A (oA) este cea mai cunoscut i cea mai toxic. oB este oA declorinat i mpreun cu oC poate aprea n mod natural. oA este produs de un numr mare de fungi, incluznd A. ochraceus. A. alliaceus, A. ostianus, A mellus, A. niger i A carbonarius. ultima a fost
237

gsit n Spania ca principal productor de oA din fructele uscate. din 91 de izolate, 97% au fost productori de oA. dintre speciile de Penicillium productoare de oA menionm: P. cyclopium, P. variable i altele. oA este produs la niveluri maxime la temperaturi de 30C i la un aw 0,95. A. ochraceus produce oA n furajele pentru psri la un aw minim de 0,85 i la temperatura de 30C. la obolani dl50 este de 20-22 mg/kg, avnd un efect hepatotoxic i nefrotoxic. Aceste micotoxine au fost gsite n porumb, boabele de cacao, boabele de soia, ovz, orz, citrice, nuci de Brazilia, tutun mucegit, alune, boabe de cafea i alte produse similare. A. ochraceus a produs oA i oB n mncruri de orez i alune. ntr-un studiu pe 4 inhibitori chimici privind dezvoltarea i producerea de oA la un ph de 4,5 n ordinea eficienei enumerm: sorbat de potasiu propionat de sodiu - paraben metil - bisulfit de sodiu; n timp ce la un ph de 5,5 cele mai eficiente au fost paraben metilul i sorbatul de potasiu. Ca multe alte micotoxine oA este termostabil. ntr-un studiu oA nu a putut fi distrus prin procedurile normale de gtire din boabele de faba (specie de fasole originar din Africa). n lumina uV, oA are o culoare verzuie, n timp ce oB emite o culoare albastr. oB induce o mitoz anormal n celulele renale de maimu. Biocenoza unui substrat condiioneaz n mare msur producia de ochratoxine, ntruct ntre elementele unui ecosistem pot exista relaii de antagonism sau de simbioz (loan Coman, ovidiu Popescu, 1985). de exemplu A. ochraceus nu se poate dezvolta pe grunele de cereale contaminate deja cu A. glaucus. fenomenul ar putea explica incidena mai redus a afeciunilor produse de A. ochraceus (Christensen, 1962). n condiii experimentale, ochratoxina s-a dovedit a fi teratogen i carcinogen. odat ptrunse n organism ochratoxinele sunt absorbite foarte lent n tractul digestiv, ncepnd din stomac i continund pn n intestinul subire. Imediat dup absorbie, ochratoxina A poate fi ntlnit liber n snge (Galtia, 1974) sau legat de proteine (Chu. 1971). ochratoxinele afecteaz echipamentul enzimatic celular, determinnd astfel tulburri metabolice grave. ochratoxina A inhib RNA-sintetaza i implicit procesele de sintez ale proteinelor la nivelul diferitelor celule microbiene, precum i celulele hepatomului la obolan (Creppy i col., 1979). Experienele efectuate pe obolan au demonstrat c aceast micotoxin
238

inhib gluconogeneza renal printr-un efect exercitat asupra carboxikinazei fosfoenolpiruvatului renal, n timp ce enzima hepatic similar a rmas neafectat (meisner i Selanic, 1979). ochratoxinele produc la om nefropatia endemic balcanic (nefrita endemic) descris pentru prima dat n 1950. A fost diagnosticat la populaia rural din Bulgaria, Iugoslavia, Romnia. Este ncadrat n grupa nefritelor cronice i se ntlnete mai des la femei ntre 30-50 ani, producnd o mortalitate ridicat (loan Coman, ovidiu Popescu, 1985). Cele mai multe metode de identificare a ochratoxinelor se bazeaz pe cromatografie. o separare bun a ochratoxinelor A i B prin cromatografie preparativ a fost realizat de ctre Steyn (1969) pe silicagel impregnat cu acid oxalic 5% dup developare cu un sistem neutru de solveni. Aceast faz staionar a fost utilizat n cromatografia pe coloan pentru separarea ochratoxinei A de compuii acizi nrudii (Scott i col., 1970).

7.5. Patulina
Patulina este un antibiotic toxic produs de un numr mare de fungi ce aparin genurilor Penicillium (P. claviforme, P. expansum, P. patulum), Aspergillus (A. clavatus, A. terreus i alii) i Byssochlamys (B. nivea, B. fulva). n mai multe ri s-au impus restricii n folosirea patulinei drept conservant n produsele pe baz de mere. omS (Who) recomand o concentraie maxim de 50 g/l n sucul de mere. n uE, limita maxim admis este 50 g/kg att n sucul de mere, ct i n cidru, 25 g/kg n produsele pe baz de mere, pentru aduli i 10 g/kg n produsele pe baz de mere pentru copii (1 noiembrie 2003). Proprietile sale biologice sunt asemntoare cu cele ale acidului penicilic. unii fungi pot produce patulina i sub 2C Aceast micotoxin a fost gsit n pinea mucegit, crnai, fructe, suc de mere, cidru, i alte produse. Au fost gsite n sucul de mere (de pn la 440 g/l) i n cidru (pn la 45 ppm). A fost identificat n alimentele mucegite examinate n Germania. P. expansum i P. patulum au nevoie petru dezvoltare de un minim de aw de 0,83 i 0,81. P. patulum i P. roquefortii au produs patulina n 10 zile n bulion cu dextroz de cartofi, prin incubare la 12C. P. roquefortii a produs pn la 1033 ppm. Patulina a fost produs i n sucul de mere la 12C de ctre B. nivea, cea mai mare concentraie obinndu-se dup 20 de zile la 21C Aceti cercettori au confirmat c producia de patulin este favorizat
239

de temperaturi sub optimul de cretere. ulterior au fcut cercetri pe P. expansum i au observat c producia de patulina are loc peste intervalul de 5-20C i n cantiti mici la 30C. n 5 probe comerciale din Georgia, nivelurile patulinei au fost de 244 pn la 3993 g/l. Atmosfera de Co2 i N2 a redus producia da patulin (comparativ cu aerul). So2 s-a dovedit mai eficient dect sorbatul de potasiu sau benzoatul de sodiu n inhibarea produciei de patulina. dl50 pentru obolani administrat pe cale subcutanat este de 15-25 mg/ kg. Iar la unele dintre animale induce formarea sarcoamelor subcutanate. Patulina produce aberaii cromozomale n celulele animale i vegetale i este carcinogen. Inhib sinteza RNA-ului n culturi celulare (Kawasaki, 1972). doza de aciune cancerigen a patulinei a fost adus nc din 1961 de ctre dickens i Jones. Autorii au inoculat subcutanat de 2 ori pe sptmn obolanilor masculi de 61-64 sptmni cte 0,2 mg de patulin solubilizat n ulei de arahide. la locul de injectare au aprut formaiuni tumorale la 6 din 6 animale, care au supravieuit la sfritul experienei. Patulina este dotat cu importante proprieti citostatice i antibacteriene, dar toxicitatea sa pentru animalele de laborator, aciunea sa mutagen faa de levuri i puterea ei cancerigen au mpiedicat utilizarea n terapeutic (Ioan Coman i ovidiu Popescu, 1985). Evidenierea patulinei n substraturi se face deobicei prin cromatografie n strat subire sau pe coloan. Ca solvent se folosete deobicei acetatul de etil. dup extracie purificarea se face prin cromatografie pe coloan, folosind ca element de separare alumina, silicagelul sau rinile schimbtoare de ioni (Norstadt). Rezidul brut obinut dup evaporarea extractului pe baia de ap (n vid sau n curent de N2), ori fraciile purificate prin cromatografie pe coloan sunt etalate pe plci cu silicagel, care se developeaz ntr-un tanc cromatografic. n care se gsete sistemul toluen-aceton-cloroform. dup developare plcile se usuc n curent de aer cald i se vizualizeaz n lumin uV, de 254 nm, condiii n care patulina apare ca un spot ntunecat (frank. 1976).
240

7.6. Acidul penicilic

Aceast micotoxin posed proprieti biologice similare cu patulina. Este produs de un numr mare de fungi care includ specii din genul Penicillium (ca de exemplu, P. puberulum) i membrii ai grupului A. ochraceus. unul dintre cei mai mari productori de acid penicilic este P. cyclopium. A fost gsit n porumb, fasole i alte cereale. A fost cultivat experimental n brnza elveian. dl50 pentru oarece administrat pe cale subcutanat este de 100-300 mg/kg i este cangerigen.

din 346 de izolate cu Penicillium din salam, aproximativ 105 au produs acid penicilic n mediile lichide, dar n cinci probe de crnai nu s-a produs toxina nici dup 70 de zile. din 183 de fungi izolai din brnza elveian la 5C, 87% au fost din genul Penicillium. Extractele de Penicillium au fost toxice n proporie de 35% pentru embrionii de gin, 5,5% din amestecurile toxice au coninut acid penicilic, patulin i aflatoxine. Acidul penicilic a fost produs la 5C, n 6 sptmni de 4 din 33 de tulpini fungice.

7.7. Sterigmatocistina
Sterigmatocistina i derivaii si au fost izolai iniial n condiii de laborator din culturi de Aspergillus versicolor (Bullocu si col, 1962, Pohland, 1976), P. luteum (dean, 1963), A. nidulans, A. rugulosus (Ballantin i col 1965), Bipolaris sorokiniana drechslera (holzapfel si col. 1966). Coman i col., 1981 au izolat din nutreuri combinate trei tulpini toxigene de A. versicolor, capabile s sintetizeze sterigmatocistina. Sterigmatocistina a fost identificat pe cromatoplci, pe baza fluorescenei i a valorii RG-ului. unele sortimente de brnz care reclam n procesul de preparare i
241

o faz de maturare se pot contamina foarte uor cu micei n spaiile n care sunt depozitate. Nortbolt i col, (1980) au izolat din astfel de probe de brnz mucegit o flor micotica variat. din 39 de probe analizate micotoxicologic, 9 au coninut sterigmatocistin, n cantiti cuprinse ntre 5 i 600 g/kg. Aciunea chimic a derivailor furofuranici fa de animalele de laborator depinde de specie, dar i de structura lor chimic. Sterigmatocistina a indus carcinogeneza la obolani prin inoculri subcutanate sau administrri orale (dickens i Jones). Intoxicaia oral cronic a maimuelor s-a caracterizat clinic prin scaune frecvente i hepatit cronic (Van der Watt). Sterigmatocistina este o micotoxin nrudit structural i biochimic cu aflatoxinele, avnd activitate hepatocancerigen la animale. Sunt cunoscui cel puin 8 derivai. dl50 pentru obolanii infectai intraperitoneal este de 60-65 mg/kg. n lumina uV toxina are o culoare fluorescent, roie-crmizie nchis. Cu toate c nu se gsete n produsele naturale, a fost izolat din gru, ovz, brnz danez i boabe de cafea. Sterigmatocistina se nrudete cu aflatoxinele dar nu este la fel de potent ca acestea. Acioneaz prin inhibarea sintezei de dNA. o metod semnificativ de evaluare a sterigmatocistinei din brnz a fost comunicat de Egmond i col. (1980). metoda const n extracia micotoxinei cu metanol -clorur de potasiu 4%, purificarea extractului pe o coloan de florisil i poliamid i apoi evidenierea sterigmatocistinei prin cromatografie n strat subire bidimensional. Testul de confirmare const n etalarea extractului brut pe placa cromatografic, developarea acesteia n cloroform metanol i urma ei uniform dup uscare cu acid trifluoracetic benzen. metoda este suficient de sensibil pentru a putea permite detectarea sterigmatocistinei n concentraii de pn la 5g/kg.

7.8. fumonizinele
fumonizinele sunt produse de Fusarium spp. pe porumb i pe alte cereale, iar mbolnvirile la oameni i animale sunt asociate cu consumul de cereale sau produse ale acestora, care conin niveluri ridicate de astfel de
242

mucegaiuri. Speciile care produc fumonizine sunt: F. sacchari, F. subglutinans, F. thapsinum, F. globosum, F. anthophilum, F. dlamini,F. napiforme, F. nygami, F. moniliforme, F. proliferatum. ultimele 3 specii produc cantiti mari de toxin. F. moniliforme (iniial denumit F. verticilliodes; Gibberella fujikuroi) este cea mai studiat dintre cele 3. Prevalena lui F. moniliforme este mai mare n porumb n zonele unde exist o rat ridicat a cancerului esofagian. Exist cel puin 15 fumonizine, cele mai cunoscute fiind: fB1, FB2, fB3, fB4, fA1, fA2, fA3. Cele mai importante sunt fB1-fB3 celelalte fiind considerate minore. din 9 tulpini de F. moniliforme, fB1 , produs n grul autoclavat n cantitate de 960 - 2350 micrograme/g n timp ce fB2 a fost produs ntre 120-320 g/g.

fuzarina A

fuzarina B

fuzarina C este produs de ctre F. moniliforme, dar aparent nu este implicat n activitatea hepatocancerigen. S-a demonstrat prin testul Ames c are un efect mutagen. o cantitate mai mare a fost obinut pe mediile de cultur, la ph 6,0, ntre ziua a 2-a i a 6-a, la o temperatur de 28C. Structura chimic a lui fB1 i fB2 difer prin faptul c fB1 are o grupare oh n loc de h pe carbonul 10. Aceste toxine difer de majoritatea celorlalte pentru c nu posed grupri ciclice sau inelare, fiind solubile n ap. Pe de alt parte sunt termostabile ca i alte micotoxine. ntr-un studiu, materialele de cultur liofilizate care conineau fB1 au fost fierte 30 de minute, iar apoi uscate la cuptor la 60C, 24 de ore fr s-i piard activitatea toxic. ntr-un alt studiu a fost demonstrat stabilitatea termic a acestor toxine la un nivel de 5 g/g de fB1, n porumbul procesat. la 204C, 30 minute nu s-a nregistrat nici o pierdere important. Reducerea complet s-a nregistrat la 218C, 15 minute. o reducere semnificativ a fost observat la pinea de porumb la 232C, 20 minute.
243

ntr-un studiu privind stabilitatea termic a acestor toxine n conserve, au fost adugate 5 g/g, dup care acestea au fost reconservate. Nu s-a observat nici o reducere semnificativa n porumbul cremat pentru copii i n mncarea pentru cini, reduceri semnificative aprnd n porumbul crem. la animalele de experien, ficatul este inta principal a fB1. ntr-un alt studiu, pe obolani pe o perioad de 26 de luni, toate animalele care au murit (dup 18 luni) au prezentat: ciroz micro i macronodular, noduli mari expansivi de colangiofibroz la nivelul hilului hepatic. Colangiofibroza este considerat un precursor al leziunilor de colangiocarcinom. din 15 obolani care au murit ntre 18 i 26 de luni, 66% au prezentat carcinom hepatic primar. Ctre sfritul studiului au aprut i unele disfuncii renale. Nu au fost nregistrate leziuni esofagiene sau modificri neoplazice. Activitatea hepatocancerigen a lui fB1 la oareci a fost demonstrat prin adugarea de 50.000 g/g n raiile alimentare, ntr-o perioad de 26 de luni. ntr-un alt studiu s-a demonstrat c fB1 este cancerigen prin capacitatea sa de a mri activitatea -glutamiltranspeptidazei la oareci. leucoencefalomalacia (lEm) a fost reprodus la un cal prin injectarea intravenoas a 7 doze de 0,125 mg/g greutate corporal de fB1, zilnic pe o perioad de 10 zile. la un porc, dup 4 zile de administrare a unei cantiti de 0,4 mg fB1/g s-a produs edem pulmonar. Prevalenta cancerului esofagian la om, n Transkei, Africa de Sud este corelat statistic cu nivelurile ridicate de fB1 si fB2 din cereale. 7.9. Sambutoxina Sambutoxina a fost izolat pentru prima dat n 1994, iar structura sa este prezentat mai jos. A fost asociat cu cartofii putrezii i uscai. Este produs de tulpinile de Fusarium sambucinum i F. oxysporum. din 13 specii de fusarium, 90% au produs aceast toxin. din probele de cartofi mucegii din Coreea, 9 din 21 au coninut 15,8-78,1 ng/g de sambutoxin. Toxina a fost gsit n cartofii din Irak unde exist o inciden mare a cancerului esofagian.
244

7.10. Zearalenonele
Exista 5 tipuri de zearalenone naturale, produse de Fusarium spp. (n special F. graminearum i F. tricinctum). zearalenonele se produc dup acumularea unor cantiti mari de fungi n cereale. Toxinele produc n lumina uV, cu unde lungi o fluorescen bleverzuie, iar n lumina uV cu unde scurte o culoare verzuie. Posed proprieti estrogene i produc estrus la oareci i hiperestrogenism la suine. Nu sunt mutagene prin testul Ames i produc un rspuns pozitiv la testul cu Bacillus subtilis. metode de izolare i identificare a levurilor i mucegaiurilor din alimente din cauza creterii lor lente i a capacitii relativ reduse de a concura cu bacteriile, levurile i mucegaiurile se gsesc, cel mai probabil n alimentele al cror mediu nconjurtor este mai puin favorabil creterii bacteriene: ph-redus, umiditate crescut, coninut mare de sare sau zahr, temperatur de depozitare redus, prezena antibioticelor sau expunerea la radiaii. Analiza probelor. Se prepar un mediu steril de agar (porii de 250 ml n sticle sau flacoane, autoclavate 15 minute la 121C). Se rcesc la 45C, n baie marin. Prepararea mediului se face cu mult timp nainte i se las s se solidifice. mediul nu se retopete, dect o singur dat sau sub presiune. Se recomand o camer de distilare Arnold. o dat ce mediul a fost rcit, acesta poate fi pstrat 2-3 ore nainte de folosire, cu condiia ca nivelul apei din baia marin s fie cu 2-3 centimetri deasupra suprafeei agarului. mediul de elecie este reprezentat de agarul cu dextroz de cartofi. Agarul cu dextroz de cartofi i sare este deosebit de util pentru analizarea probelor care conin mucegaiuri de rspndire (mucor, Rhizopus, etc.) deoarece NaCl inhib creterea lor permind detectarea altor propagule de levuri i mucegaiuri. Pentru inhibarea creterii bacteriene, mediul se amendeaz fie cu antibiotice, fie cu soluie de acid tartaric 10% (dup rcirea agarului i imediat nainte de turnarea plcilor), dup cum urmeaz: antibiotice: se recomand clortetraciclin hCl, la un mediu de agar cu concentraie de 40 ppm; mai pot fi folosite i alte antibiotice (cloramfenicol, streptomicin) n aceeai concentraie cu clortetraciclina hCl.
245

Se prepar soluia stoc prin dizolvarea a 1 gram de antibiotic n 100 ml de ap distilat steril i prin filtrare, printr-o membran de 0,45 microni. Soluia stoc se pstreaz la ntuneric, la 4-8C. Perioada de valabilitate nu trebuie s depeasc o lun. soluia de acid tartaric: se sterilizeaz soluia prin filtrare printr-o membran de 0,45 microni; se ajusteaz ph-ul la 3,5, dup adugarea soluiei n mediu se verific din nou ph-ul. Se prepar omologatul alimentar i se efectueaz diluii seriate. Sunt suficiente diluii pn la 10-6. Se transfer cte 1 ml din fiecare diluie n plci Petri i se adaug imediat 20-25 ml de agar cu dextroz de cartofi, rcit cu antibiotic sau acid tartaric. Se amestec bine coninutul prin rotirea uoar a plcilor n sensul acelor de ceasornic i n sens contrar, avnd grij s se evite rspndirea pe capacul vasului. fiecare diluie se toarn n plci Petri n triplicat, utiliznd pipete cu calibru mare. de la prepararea primei diluii i pn la turnarea plcii finale nu trebuie s treac mai mult de 10-20 minute. Plcile se incubeaz la ntuneric la 22-25C, pentru 5 zile. Nu se aeaz mai mult de 3 plci una peste alta i nici nu se inverseaz. Plcile nu se vor mai deplasa pn la numrare, deoarece manipularea lor ar putea avea drept rezultat o cretere secundar din sporii dislocai invalidnd numrtoarea dup 5 zile. Se numr plcile ce conin ntre 10 i 150 de colonii. Se raporteaz rezultatele n colonii per gram sau n colonii per mililitru, fcnd media setului n triplicat. dac a treia cifr este 6 sau mai mult se rotunjete pn la cifra superioar (de exemplu: 456 = 460). dac cifra a treia este 4 sau mai puin, se rotunjete pn la cifra inferioar (de exemplu 454 =450). dac a treia cifr este 5, se rotunjete pn la cifra inferioar dac primele dou cifre sunt un numr par (de exemplu: 445 = 440); se rotunjete la cifra superioar dac primele dou cifre sunt un numr impar (455 = 460). determinarea numrului de levuri i mucegaiuri prin nsmnarea direct n plci Petri (pentru alimente ca fasole uscat, nuci, condimente ntregi, boabe de cafea i cacao) Analiza alimentelor nedezinfectate pe suprafaa (nSd). nainte de nsmnarea n plci Petri, probele se pstreaz la -20C, timp de 72 de ore, pentru a omor cpuele sau alte insecte care ar putea mpiedica analiza alimentelor. Prepararea plcilor de agar. Se utilizeaz agar cu dextroz de cartofi i sare (conine 75 de grame NaCl per litru). Sarea inhib creterea
246

mucegaiurilor de rspndire i germinarea seminelor viabile, care ar putea ridica capacul plcii Petri. la agarul rcit se adaug 40 ppm clortetraciclin hCl. Se toarn aproximativ 30 ml de mediu n plci Petri i se las s se solidifice. Se prepar 10 plci per prob. Perioada dintre preparare i utilizare a plcilor nu trebuie s depeasc 24 de ore. nsmnarea probelor n plcile Petri. din fiecare prob se transfer aproximativ 50 de grame ntr-un pahar steril de 150 mililitri. Se plaseaz 5 poriuni de prob per plac, sub form de rozete (una n centru i celelalte n fiecare cuadrant) cu ajutorul unei pense flambate n etanol. Se utilizeaz alternativ mai multe pense pentru a se evita supranclzirea. Nu se aplic pe poriuni vizibil mucegite sau decolorate. Incubarea probelor. Se aliniaz plcile Petri n stive de cte 10. Se noteaz numrul probei i dat nsmnrii, pe fiecare plac. Stivele incubate se las nederanjate la ntuneric, la 22-25C, timp de 14-21 de zile. Citirea plcilor. Apariia mucegaiului se determin n procente. de exemplu, dac acesta a aprut n toate cele 50 de poriuni de prob, mucegirea este de 100%, dac mucegaiul a aprut n 32 de probe, mucegirea se consider c are loc n proporie de 64%.

247

dETErmInArEA nUmrULUI dE drOJdII I mUCEgAIUrI

(schem adaptat dup W. Andrews, 1992)

1. Se amestec ingredientele ntr-un blender

2. Se dilueaz omogenatul de prob alimentar

3. Se pipeteaz 1 ml din fiecare diluie n plci separate cu PdA

PdA (Potato dextrose Agar) suplimentat cu Clortetraciclin hCl sau acid tartric 4. Se incubeaz la ntuneric, la 22-25C, timp de 5 zile. 5. Se numr plcile ce conin ntre 10 i 150 colonii.
248

Saccharomyces cerevisiae microscopie electronic

Saccharomyces cerevisiae microscopie cu contrast de faz n cmp ntunecat

Saccharomyces cerevisiae microscopie cu contrast de faz n cmp ntunecat (coloraie cu floxin). Reproducere asexuat prin nmugurire

Saccharomyces cerevisiae microscopie cu contrast de faz n cmp ntunecat (coloraie cu floxin). Se observ n mijlocul figurii o asc cu 4 ascospori

Saccharomyces cerevisiae Cultur pe agar cu dextroz de cartof 249

Saccharomyces cerevisiae Cultur pe mediul Czapek

Bibliografie selectiv 1. Enomoto, m., and m. Saito. 1972. Carcinogens produced by fungi. Annu. Rev. Microbiut. 26:279-312. 2. Eschcr. f.E., P.E. Koehler, and J.C. Ayres. 1973. Production of ochratoxins A and B on country cured ham. Appl. Microbiol. 26:27-30. 3. Escobar, A., and o.S. Regueiro. 2002. determination of aflatoxin Bi in food and feedstuffs in Cuba (1990 through 1996) using an immunoenzymatic reagent kit (Aflacen). J. Food Proiect. 65:219-221. 4. farber, J.m., and G.W. Sanders. 1986. fusarin C production by North American isolates of Fusarium moniliforme. Appl.Eimron. Microbiol. 51:381-384. 5. Gclderblom. W.C.A., N.P.J. Kriek, W.f.o. marasas. and P.G. Thiel. 1991. Toxicity and carcinogenicity of the Fusarium moniliforme metabolite, fumonisin B|, in rats. Carcinogenesis 12:1247-1251. I. Gelderblom. 6. W.C.A., K. Jaskiewicz, W.f.o. marasas. P.G. Thiel, R.m. horak, R. Vleggaar, and N.P.J. Kriek. 1988. fumonisinsnovei mycotoxins with cancer-promoting aclivity produced by Fusarium moniliforme. Appl. Environ. Microbiol. 54:1806-1811. 7. Gourama. h., and l.B. Bullerman. 1995. Antimycotic and antiaflatoxigenic effect of lactic acid bacteria: A review. J. Food Proiect. 58:1275-1280. 8. K Gutema, T., C. munimbazi, and l.B. Bullerman. 2000. occurrence of fumonisins and moniliformin in corn and corn-based food products of u.S. origin. J. Food Proiect. 63:1732-1737. 9. harrison, m.A. 1989. Presence and stability of patulin in apple products: A review./ FoodSaf 9:147-153. ). 10. henry. S.h., f.x. Bosch, T.C. Troxell. and P.m. Bolger. 1999. Reducing liver cancerglobal control of aflatoxin. Science 286:2453-2454. ). 11. hesseltine, C.W. 1967. Aflatoxins and other mycotoxins. Health Lab. Sci. 4:222228. 12. I. holmquist. G.u., h.W. Walker. and h.m. Stahr. 1983. Influence of temperature. ph, water activity and antifungal agents on growth of Aspergillus flavus and A. parasiticus. J. Food Sci. 48:778-782. . 13. Jorgenssen, K.V., d.l. Park. S.m. Rua, Jr., and R.l. Price. 1990. Reduction of mutagenic potcntials in milk: Effects of ammonia treatment on aflatoxin-contaminated cotton-seed. J. Food Protect. 53:777-778, 817. 3. 14. Karunaratne. A., E. Wezenberg, and l.B. Bullerman. 1990. Inhibition of mold growth and aflatoxin production by Lactobacillus spp. J. Food Protect. 53:230236. 15. Kcdera. C.J.. R.d. Plattner. and A.E. desjardins. 1999. Incidence of Fusarium spp. 250

16.

17.

18.

19. 20. 21. 22.

23. 24. 25.

26.

27.

28.

29.

and levels of fumonisin B| in maizc in western Kenya. Appl. Environ. Microbiol. 65:41-44. Kim. J.-C., and Y.-W. lee. 1994. Sambutoxin, a new mycotoxin produced by toxic Fusarium isolates obtained from rotted potato tubers. Appl. Environ. Microbiol. 60:4380-4386. Kim. J.-C.. Y.-W. lee, and S.-h. Yu. 1995. Sambutoxin-producing isolates of Fusarium species and occurrence of sambutoxin in rotten potato tubers. Appl. Environ. Microbiol. 61:3750-3751. Kurtzman, C.P, B.W. horn, and C.W. hesseltine. 1987. Aspergillus nomutus, a new aflatoxin-producing species related to Aspergillus flavus and Aspergillus tamarii. Antonie van Leeuwenhoek 53:147-158. labuza. T.P 1983. Regulation of mycotoxins in food. J. Food Protect. 46:260265. lee, Y.J., and W.m. hagler, Jr. 1991. Aflatoxin and cyclopiazonic acid production by Aspergillus flavus isolated from contaminated maize. J. Food Sci. 56:871-872. leistner, l., and C. Eckardt. 1979. Vorkommen toxigener Penicillien bei fleischerzeugnissen. Fleischwirtsch. 59:1892-1896. leistner. l.. and f. Tauchmann. 1979. Aflatoxinbildung in Rohwurst durch verschiedene Aspergillus flavus-SlUmme und einer Aspergillus parasiticus-Slamm. Fleischwirtschaft 50:965-966. lie.J.l-.andE.h. marth. 1967. formation of aflatoxin in cheddarcheesebyAsperg/7/ w.s//avm.s and Aspci gillus pai -a.situ us. J.DairySci. 50:1708-1710. line, J.E.. R.E. Brackett, and R.E. Wilkinson. 1994. Evidence for degradation of aflatoxin B, by Flavobacterium auran-tiacum. J. Food Protect. 57:788-791. marasas. W.f.o., K. Jaskiewicz, f.S. Venter, and d.J. van Schalkwyk. 1988. Fusarium moniliforme contamination of maize in ocsophageal cancer areas in Transkei. 5. Afr. Med. J. 74:110-114. marin, S., N. magan, J. Serra, A.J. Ramos, R. Canela, and V. Sanchis. 1999. fumonisin B, production and growth of Fusarium moniliforma and Fusarium proliferatum on maize, wheat, and barley grain. J. Food Sci. 64:921-924. marin, S., V. Sanchis. f. Rull, A.J. Ramos. and N. magan. 1998. Colonization of maize grain by Fusarium monilifor and Fusarium proliferatum in the presence of competing fungi and their impact on fumonisin production. J. Food Pron 61:14891496. marin, S., V. Sanchis. 1. Vines. R. Canela. and N. magan. 1995. Effect of water activity and temperature on growth ; fumonisin B| and B? production by Fusarium proliferatum and F. moniliforme on maize grain. Lett. Appl. Microb 21:298-301. marth, E.h., and B.G. Calanog. 1976. Toxigenic fungi. In Food Microbiology: Public Health and Spoilage Aspects, m.P. defigueiredo and d.f. Splittstoesser, 210-256. New York: Kluwer Academic Publishers. 251

30. mphande. f.A., B.A. Siame, and J.E. Taylor. 2004. fungi aflatoxins, and cyclopiazonic acid associated with pea retailing in Botswana. J. Food Protect. 67:96-102. 31. Nelson. PE., R.d. Plattner, d.d. Shackelford. and A.E. desjardins. 1992. fumonisin Bi production by Fusarium spec other than F. moniliforme in section Liseola and by some related species. Appl. Environ. Microbiol. 58:984-989. 32. Newsome, R. 1999. Issues in internaional trade: looking to the Codex Alimentarius Commission. Food Technol. 53(6): 33. Niranjan. B.G., N.K. Bhat, and N.G. Avadhani. 1982. Preferenial attack of mitochondrial dNA by aflatoxin B| dur hepatocarcinogenesis. Science 215:73-75. 34. Northolt, m.d., C.A.h. Verhulsdonk. P.S.S. Soentoro, and W.E. Paulsch. 1976. Effect of water activity and temperat on aflatoxin production by Aspergillus parasiticus. J. Milk Food Technol. 39:170-174. 35. oatlcy, J.T., m.d. Rarick, G.E. Ji, and J.E. linz. 2000. Binding of aflatoxin Bi to bifidobacteria in vitro.y. Food Prot 63:1133-1136. 36. Pestka, J.J., J.I. Azcona-olivera, R.d. Plattner, f. minervini, m.B. doke, and A. Visconti. 1994. Comparative assessm of fumonisin in grain-based foods by ElISA, GC-mS, and hPlC. J. Food Protect. 57:169-172. 37. Pierides. m.. h. El-Nezami, K. Peltonen. S. Salminen, and J. Ahokas. 2000. Ability of dairy strains of lactic acid bact( to bind aflatoxin mi in a food model. J. Food Protect. 63:645-650. 38. Pittet, A., V. Parisod, and m. Schellenberg. 1992. occurrence of fumonisins Bi and B2 in com-based products from Swiss market. J. Agric. Food Chem. 40:13521354. 39. Park. K.Y., and l.B. Bullerman. 1983. Effect of cycling temperatures on aflatoxin production by Aspergillus prsii and Aspergillus flavus in rice and cheddar cheese. J. Food Sci. 48:889-896. 40. Ram, B.P. P hart. R.J. Cole, and J.J. Pestka. 1986. Application of ElISA to retail survey of aflatoxin B| in peanut bui ./ Food Protect. 49:792-795. 41. Rheeder, J.P. W.f.o. marasas, P.G. Thiel, E.W. Sydenham. and d.J. van Schalkwyk. 1992. Fusarium moniliforme fumonisins in corn in relation to human esophageal cancer in Transkei. Phytophathology 82:353-357. 42. Roland, J.o., and l.R. Beuchat. 1984. Biomass and patulin production by Byssochlamy.s nivea in apple juice as affec by sorbate, benzoate, SO and temperature. J. Food Sci. 49:402^*06. 43. Ross, P.f., l.G. Rice, R.d. Plattner, G.d. osweiler, T.m. Wilson, d.l. owens, h.A. Nelson, and J.l. Richard. 1< Concentration of fumonisin B| in feeds associated with animal health problems. Mycopathology 114:129-135. 44. Ross, P.f., P.E. Nelson, J.l. Richard, G.d. osweiler, l.G. Rice, R.d. Plattner. and T.m. Wilson. 1990. Productioi fumonisins by Fusarium moniliforme and Fusarium 252

45.

46. 47. 48. 49. 50.

51.

proliferatum isolates associated with equine leukoencephalomal; and a pulmonary edema syndrome in swine. Appl. Environ. Microbiol. 56:3225-3226. Schillinger, u.. R. Geisen. and W.h. holzapfel. 1996. Potenial of antagonistic microorganisms and bacteriocins for biological preservation of foods. Trends Food Sci. Technol. 7:158-164. Schindler, A.f. 1977. Temperature limits for production of aflatoxin by twenty-five isolates of Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus. J. Food. Protect. 40:39-40. Scrck-hanssen. A. 1970. Aflatoxin-induced fatal hepatitis? Arch. Environ. Health 20:729-731. Shelef, l.A., and B. Chin. 1980. Effect of phenolic antioxidants on the mutagenicity of aflatoxin Bi. Appl. Envi Microbiol. 40:1039-1043. Shih, C.N., and E.h. marth. 1974. Some cultural conditions that control biosynthesis of lipid and aflatoxin by Aspergi parasiticus. Appl. Microbiol. 27:452^156. Shim, W.-B.. J.E. flaherty, and C.P. Woloshuk. 2003. Comparison of fumonisin B, biosynthsis in maize germ degermed kernels by Fusarium verticillioides. J. Food Protect. 66:2116-2122. Shotwell. o.l.. and C.W. hesseltine. 1983. five-year study of mycotoxins in Virginia wheat and dent corn. J. Assoc. Anal. Chem. 66:1466-1469.

253

capitolul 8 SCUrT PrEZEnTArE A PrInCIPLALELOr VIrUSUrI CE SE TrAnSmIT PrIn ALImEnTE

caractere generale Moto Virusurile sunt entiti potenial patogene care au o faz infecioas, posed un singur tip de acid nucleic, se multiplic sub form de material genetic, nu cresc, nu se divid i sunt lipsite de sistem Lippman (Lwoll A, 1957; The concept of a virus; Y. gen. Microbul). n 1972, Uniunea Internaional de Biochimie (IUB) recomand folosirea prescurtrilor dnA i rnA pentru acid dezoxiribo i respectiv ribonucleic indiferent de limba n care este scris textul (diem K i Lentner). Virusurile constituie un regim aparte, VIRA, datorit caracterelor de structur i funcie prin care se deosebesc fundamental de microorganismele procariote i eucariote. Pasteur a intuit prezena virusurilor n studiile sale privind agentul turbrii (1884) ca fiind un microoganism infinitezimal de mic. d. I. Ivanovski (1892) demonstreaz c mozaicul tutunului este produs de un agent att de mic, nct poate trece prin filtrele care rein cele mai mici bacterii. loefler i frosch n 1898, n febra aftoas a bovinelor, J. Cord mpreun cu Watter Reed (1901) n febra galben, Remlinger (1903) n turbare, au pus n eviden faptul c agenii infecioi respectivi sunt filtrabili. n urmtoarele decenii, au fost identificai i ali ageni cu caractere asemntoare prin inocularea la animalele de laborator de filtrate lipsite de bacterii obinute din suspensii de organe sau fluide de la gazdele naturale (animale, plante, bacterii). Aceti ageni noi au fost denumii iniial virusuri filtrabile ultramicroscopice apoi virusuri ultrafiltrabile, i n cele din urm
254

virusuri. n 1915, Twort i, independent, n 1917, dherelle au descoperit bacteriofagul. n 1930, studiile pe modelul fag-bacterie i-au permis lui Schlesinger (1930) s arate c particula de fag este alctuit din dNA i protein. Virusurile sunt sisteme genetice independente dotate cu continuitate i variabilitate genetic i care posed o istorie evolutiv proprie. Pentru replicare virusurile utilizeaz mainria de sintez a celulei viigazd dirijnd-o spre sinteza de virioni, particule specializate care conin genomul viral (acid nucleic) i componentele structurale (proteine, nveli), care permit transferul acestuia la alte celule gazd. Clasificarea virusurilor se bazeaz pe urmtoarele criterii: 1) Tipul de acid nucleic: dNA sau RNA; structura i proprietile acestora; 2) dimensiuni i morfologie (tipul de simetrie al capsidei, numr de capsomere, prezena de inveliuri); 3) Comportarea fa de agenii fizici i chimici (fa de eter); 4) Caractere antigenice; 5) modul de transmitere n natur; 6) Gazda, esutul, celula pentru care prezint tropism; 7) leziuni celulare i anatomopatologice. 8) Simptome clinice. Componentele principale ale unui virus sunt acidul nucleic i proteina. metodele de purificare sunt reprezentate de: a) metode care se adreseaz fracionrii proteinelor din matricea lipoidal i b) metode fizice, ca de pild adsorbia i ultracentifugarea, care in seama de diferenele de dimensiune, densitate i proprieti de suprafa ntre particula de virus i componentele subcelulare, nevirale, prezente n omogenatul de celule sau esut infectat folosit ca surs de virus. Pn n prezent se cunosc mult mai puine date legate de incidena virusurilor n alimente, dect a bacteriilor i a fungilor. n primul rnd virusurile fiind parazii obligatorii nu se dezvolt pe medii de cultur ca bacteriile sau fungii. Replicarea lor se realizeaz numai n celulele vii. Pentru replicarea virusurilor animale se pot folosi celule vii provenind din trei surse: a) animale de laborator, b) embrioni de gin n dezvoltare (ou embrionate) sau c) culturi celulare.
255

datorit faptului c virusurile nu se pot replica n alimente, numrul lor n acestea fiind sczut n comparaie cu cel al bacteriilor, sunt necesare metode de extracie i concentrare pentru recuperarea lor. Cu toate c au fost efectuate multe cercetri n acest sens este dificil recuperarea a mai mult de 50% din particulele virale din carnea de vit tocat. un alt motiv este reprezentat de faptul c n majoritatea laboratoarelor de microbiologie alimentar nu se practic tehnicile de virusologie. deasemenea, nu toate virusurile care prezint interes pentru microbiologia alimentar, pot fi cultivate prin metode obinuite. un interes deosebit l reprezint reacia de revers transcriptazpolimerizare n lan (RT-PCR) care a permis detectarea virusurilor transmisibile pe cale alimentar din esuturile de stridii i molute. Eficacitatea tehnicii RT-PCR pentru detectarea virusurilor din alimente a fost demonstrat de mai muli cercettori. Au fost comparate 4 metode de concentrare i extracie a astrovirusurilor, hepatitei A i poliovirusurilor din stridii. Cele mai eficiente au fost metodele care au folosit soluia de glicerina i boratul tamponat. Astfel au fost folosite mai multe combinaii pentru detectarea celor 3 virusuri din probele de analizat. Intr-un alt studiu, detectarea prin hibridizare dot-blot a ampliconilor prin tehnica RT-PCR a permis detectarea a 8 ufp de hepatit A/g n carnea de stridii (ufp = uniti formatoare de plaje; pfu = plaque forming units). datorit faptului c s-a demonstrat c n condiii insalubre orice agent patogen bacterian poate fi gsit n alimente, se poate presupune acelai lucru i despre virusurile intestinale, cu toate c acestea nu se multiplic n alimente. Cliver a demonstrat c orice aliment poate servi ca rezervor de virusuri, marcnd importana modului de transmitere oral-anal, n special pentru hepatita viral de origine alimentar. la fel cum bacteriile non intestinale se pot gsi n alimente, acelai lucru se poate spune i despre virusuri, dar datorita afinitii lor pentru esuturi, alimentele vor juca rolul de rezervoare numai pentru virusurile intestinale i pentru enterovirusuri. Ca frecven, gastroenterita viral se pare c se situeaz imediat dup rceal.

256

8.1. Virusurile hepatice enterice

Tabelul 8.1. Virusul hepatic Virusul hepatitei A (hAV) caracteristici familia Picornaviridae, nenvelite, capsid icosaedral, 2732 nm, RNA monocatenar, nu produce infecii cronice i nu are statut de purttor, exist vaccinuri, mortalitate sczut familia Caliciviridae, nenvelite, 25-35 nm, capsid icosaedral, RNA monocatenar, nu produce infecii cronice, nu are statut de purttor, nu exist vaccin, mortalitate mare la femeile gravide Neclasificat, nenvelit, 27-37 nm, capsid icosaedral, dNA dublu catenar, nu produce infecii cronice, nu are statut de purttor, nu exist vaccin, mortalitate sczut

Virusul hepatitei E (hEV)

Virusul hepatitei f (hfV)

8.1.1. Virusul hepatitei A Hepatita A Virusul hepatitei A (hAV) este un virus ARN nenvelit, de 27 nm, termo-, acido- i etero-rezistent. Virionul conine patru polipeptide n capsid, denumite de la VP1 la VP4, care sunt clivate posttranslaional din produsul poliproteic al unui genom de 7500 de nucleotide. Inactivarea activitii virale se poate obine prin fiebere 1 minut, prin contact cu formaldehida i clorul sau prin iradiere cu raze ultraviolete. n ciuda variaiei de pn la 20% a secvenei nucleotidice printre izolatele de hAV, toate varietile acestui virus identificate pn acum nu se pot deosebi din punct de vedere imunologic i aparin unui singur serotip. hepatita A are o perioad de incubaie de aproximativ patru sptmni. Replicarea este limitat la ficat, dar virusul este prezent n ficat, bil, scaun i snge spre sfritul perioadei de incubaie i n timpul fazei acute preicterice a bolii. n ciuda persistenei virusului n ficat, eliminarea viral n fecale, viremia i infectivitatea diminu rapid o dat ce icterul devine manifest. hAV este singurul virus hepatic uman care se poate cultiva in vitro. Anticorpii anti-hAV pot fi detectai n cursul bolii acute, atunci cnd activitatea aminotransferazei serice este crescut i virusul nc se mai elimin n fecale. Acest rspuns precoce este reprezentat de elaborarea de anticorpi predominant din clasa Igm i persist mai multe luni, doar arareori pn la 6-12 luni. n timpul convalescenei anticorpii anti-hAV din clasa
257

IgG devin predominani. Ca urmare, diagnosticul hepatitei A este realizat n timpul bolii acute prin demonstrarea existenei titrurilor nalte de anticorpi anti-hAV din clasa Igm. dup perioada de boal acut, anticorpii antihAV din clasa IgG rmn detectabili pentru un timp nedefinit i pacienii cu anticorpi serici anti-hAV sunt imuni la reinfecie. ntr-adevr, activitatea neutralizant a anticorpilor crete concomitent cu apariia anticorpilor antihAV, iar protecia mpotriva infeciei hAV este oferit de anticorpii IgG anti-hAV prezeni n imunoglobuline. nainte de anii 1990 au fost nregistrate mai multe epidemii de hepatit A de origine alimentar, dect oricare alt infecie viral. Virusul aparine familiei Picornaviridae cu RNA monocatenar. din care fac parte: Enterovirusurile, din care face parte, virusul hepatitei A (hAV), clasificat de curnd n genul hepatovirus (nainte g. heparnavirus). Ca multe alte picornavirusuri, cauzeaz infecii cu simptome terse sau fr simptome, mai ales la copii. Incidena acestora este strns legat de condiiile de sanitaie i igien, majoritatea mbolnvirilor avnd loc n copilrie. Simptomele clinice apar de obicei la aduli, mortalitatea este mai mic de 1%. Poate cauza epidemii atunci cnd e prezent n ap i alimente. Calea de transmitere este cea oral-fecal, prin consum de ap i alimente poluate cu fecale sau prin contact direct cu o persoan infectat. un pas important l-a constituit vizualizarea hAV prin microscopie electronic imun. Ruta oral-fecal reprezint principalul mod de transmitere, iar rezervoarele principale sunt reprezentate de crustacee crude sau parial gtite din apele poluate. n SuA n 1973, 1974 i 1975 au fost 5, 6 i respectiv 3 epidemii cu 425, 282 i 173 de cazuri. Epidemiile din 1975 au fost datorate salatelor, sandwich-urilor i gogoilor glazurate servite n restaurante. Conform cu CdCP (Centrul de prevenire i control, Centers for disease control and prevention) numrul de cazuri de hepatit A a sporit n SuA ntre 19831989 de la 9,2 la 14,5 din 100.000 de oameni. din numrul cazurilor de hepatit, din anul 1988, n SuA, 7,3% au fost de origine alimentar. din 88 de elevi i profesori in Georgia, 15 s-au mbolnvit de hepatit A. din 641 de rezideni i angajai dintr-un centru pentru oamenii cu handicap din montana, 13 cazuri s-au mbolnvit de hepatit A. n ambele cazuri vehiculul a fost reprezentat de prjitura cu cpuni. Cea mai mare epidemie de hepatit A, nregistrat n SuA a avut loc n noiembrie 2003 i au fost cca 600 de victime i 3 mori. Alimentul vehicul a fost reprezentat de ceapa verde servit de un lan de fast-food.
258

ntre 1992-2001, au fost raportate de CdCP aproximativ 230.000 de cazuri de hepatit A. n 2001 ntr-o epidemie cu 46 de cazuri din massachusetts a fost asociat cu consumul de sandwich-uri contaminate de procesator.

Tabelul 8.2

genul

Specii (* = specia tip)

Enterovirus

Rhinovirus hepatovirus (nainte heparnavirus) Cardiovirus Aphthovirus Parechovirus Erbovirus Kobuvirus Teschovirus 259

enterovirusul bovin enterovirusul uman A enterovirusul uman B enterovirusul uman C enterovirusul uman d poliovirusul* enterovirusul porcin A enterovirusul porcin B enterovirusul simian A rinovirusul uman A rinovirusul uman B rinovirusul uman C virusul hepatitei A (hAV) virusul encefalomielitei aviare (AEV) virusul encefalomiocarditei (EmCV) theilovirus virusul febrei aftoase* virusul rinitei ecvine A (ERAV) parechovirusul uman (hPeV) virusul ljungan virusul rinitei ecvine B virusul aichi kobuvirusul bovin teschovirusul porcin

8.1.2. Virusul hepatitei E (hEV) Existena hEV a fost confirmat la sfritul anilor 1970. Acest virus a fost descoperit recent si producele hepatitele non-A, non-B (NANB). Este un calicivirus sferic, nenvelit, de 27-34 nm, i genom RNA monocatenar. n forma acut, perioada de incubaie este de 30-40 zile. Nu prezint form cronic i nici statut de purttor. Predomin la persoanele adulte (1540 ani). Pot aprea complicaii la femeile gravide, rata de mortalitate fiind la acestea de peste 40%. Patogenitatea este asemntoare cu cea a hepatitei A, virusul se replic iniial n intestin, dup care invadeaz ficatul i ajunge n fecale. Este slab virulent, fiind necesar o mare cantitate de virus pentru producerea infeciei. Se pare c incidena bolii este sczut n rile puternic industrializate. Epidemii mari au aprut n India, mexic i America de Nord, unde principala surs de infecie pare a fi contaminarea cu fecale a surselor de ap. Transmiterea interuman nu a fost raportat (se presupune c este necesar o cantitate mare de virus pentru transmiterea bolii). Virusul nu se poate cultiva in vitro. Pentru diagnostic se folosesc urmtoarele metode: identificarea particulelor de calicivirus n fecale prin microscopie electronic, teste serologice, PCR. 8.1.3. Virusul hepatitei f (hfV) hepatita f (non A, non E) a fost raportat recent, n cazuri izolate n Europa de Vest, SuA i India. hfV a fost izolat din fecalele subiecilor infectai, unde apare sub form de particule, cu dimensiuni cuprinse ntre 27-37 nm, conine o molecul de dNA dublucatenar de aproximativ 20 Kbytes. Nu a fost nc clasificat. Acest virus difer substanial de hAV, hEV ambele fiind alctuite dintr-o molecul de RNA monocatenar de 7,5 Kbytes. Nu exist teste serologice pentru diagnosticul hepatitei f, dar el poate fi pus n urma examinrii prin microscopie electronic, din scaunul pacienilor. Sunt suspecte cazurile de hepatit a cror etiologie nu poate fi determinat n urma testrii pentru celelalte virusuri. Infecia experimental a fost raportat la maimua Rhesus. Se replic i produce efect citopatic n linia celular hep-2 (human larynx carcinoma).
260

8.2. norovirusurile
Norovirusurile (nainte denumite Norwalk virus - like) sunt virusuri noi, aparinnd familiei Caliciviridae, cu RNA monocatenar, de 7,5 knt, conine proteina structural major VP1, de aproximativ 58-60 Kda i o protein capsidic minor (VP2). la microscopul electronic apar ca structuri amorfe, cu dimensiuni ntre 27 i 38 nm.

Tabelul 8.3. Serotipurile genului Norovirus Serotip desert Shield lordsdale Mexico Norwalk hawaii Snow mountain Southampton Tulpin [u04469] [x86557] [u22498] [m87661] [u07611] [l23831] [l07418] Izolat (hu/NlV/dSV395/1990/SR) (hu/NlV/ld/1993/uK) (hu/NlV/mx/1989/mx) (hu/NlV/NV/1968/uS) (hu/NlV/hV/1971/uS) (hu/NlV/SmV/1976/uS) (hu/NlV/ShV/1991/uK)

Aceste virusuri sunt responsabile de aproximativ 90% dintre epidemiile de gastroenterite non-bacteriene n lume i de 50% dintre epidemiile de gastroenterite alimentare din SuA. Norovirusurile afecteaz persoanele de toate vrstele, se transmit prin contaminarea apei i a alimentelor cu fecale sau de la persoan la persoan.
261

Imunitatea este incomplet i temporar. Exist o predispoziie la infecie a indivizilor cu grupa sanguin o, n timp ce persoanele cu grupele B i AB sunt mai rezistente. Epidemiile apar n comuniti nchise sau semi-nchise, cum ar fi spitale, nchisori, dormitoare, vase de croazier, campinguri, n care infecia se transmite cu repeziciune de la o persoan la alta, prin alimentele contaminate sau prin persoane infectate care manipuleaz alimentele. Norovirusurile sunt inactivate rapid de dezinfectante pe baz de clor, ns datorit anvelopei lipidice, sunt mai puin sensibile la alcool i detergeni. Norovirusurile sunt clasificate genetic n 5 genogrupe (GI-GV), care se clasific la rndul lor n mai multe grupuri sau genotipuri. de exemplu, genogrupul II, cel mai frecvent genogrup uman, conine 18 genotipuri. Genogrupurile I, II i IV sunt patogene pentru om, n timp ce genogrupul III infecteaz bovinele i genogrupul V, a fost izolat recent, de la oarece. Genogrupul II, genotipul 4 (GII.4) este responsabil de producerea epidemiilor de gastroenterite, n care sunt implicate, n special persoanele adulte, cu rspndire pandemic. Exemple recente de astfel de epidemii includ: tulpina uS95/96-uS - cu rspndire pe tot globul - anii 90; virusul farmington hills - Europa i SuA - 2002; virusul hunter - Europa, Japonia, Australia, Asia - 2004. n 2006, au crescut cazurile de mbolnaviri cu norovirusuri pe tot globul. n 2007, a izbucnit o epidemie, ntr-un club country din California de Nord, cu 80-100 de cazuri de mbolnvire. Istoric. Norovirusurile au fost denumite iniial Norwalk virusuri. denumirea provine de la localitatea Norwalk, ohio, unde a izbucnit o epidemie de gatroenterit acut, ce a afectat majoritatea copiilor din coala Elementar Bronson, noiembrie 1968. Virusul a fost identificat n 1972, prin microscopie electronic imun, efectuat din probe de fecale de la pacieni. n anul 2002, denumirea de Norovirusuri (genul Norovirus) a fost recunoscut de ctre Comitetul internaional de taxonomie viral. Boala poart diferite denumiri cum ar fi: winter vomiting disease, stomach flu gastroenterit viral sau gastroenterit acut non-bacterian. Virusul a purtat nainte diferite denumiri, cum ar fi: virusul Norwalk, Norwalk-like virus, SRSV (Small Round Structured Viruses) sau virusul Snow mountain diagnostic. Testele specifice de diagnostic de laborator sunt PCR, RT-PCR, care confirm rezultatul n cteva ore, putnd detecta concentraii
262

mai mici de 10 particule virale. Exista kituri ElISA comerciale, ns au specificitate i sensibilitate sczut. Norovirusurile sunt extrem de contagioase, n medie o persoan infectat transmite infecia altor 14. Splarea minilor i igienizarea suprafeelor rmn cele mai importante metod de prevenire a acestei infecii. n 2007, ligocyte i col., au creat un vaccin, nc n faz experimental. Recent, n Nicaragua s-a observat faptul c norovirusurile sunt responsabile de 11% din cazurile de diaree la copiii sub 5 ani, iar 15% dintre cazuri necesit rehidratare intravenoas. Norovirusurile se pot transmite direct de la persoan la persoan sau indirect prin apa sau alimentele contaminate. ntr-un studiu CdC, n 11 epidemii din statul New York, s-a observat c modul de transmitere la 7 dintre acestea a fost de la persoan la persoan, la 2 prin alimente, 1 prin apa de but, iar una necunoscut. Alimentele cele mai des implicate n epidemiile Norwalk, sunt alimentele pe baz de scoici i diferite salate. Consumul de molute i stridii crude sau insuficient preparate termic, prezint un risc mare de infeciozitate cu virusul Norwalk. 8.3. rotavirusurile (duovirusuri) Rotavirusurile sunt virusuri RNA dublu catenare din familia Reoviridae, care produc diaree sever la copii i sugari. Statistic, se poate spune c fiecare copil din lume a fost infectat cu Rotavirus cel puin o dat. Imunitatea se instaleaz treptat, pe parcursul vieii, persoanele adulte fiind rar afectate. Exist 7 specii de virus, notate cu A, B, C, d, E, f i G. Rotavirusul A este cel mai ntlnit, cauznd peste 90% din infeciile umane. Infecii umane mai produc i speciile B i C. Conine dou proteine structurale, glicoproteina VP7, care definete tipurile G i VP4 pentru tipurile P. Genomul este constituit din 11 molecule de RNA, dublu helix, constiuit n total din 18.555 de perechi de baze nucleotide. RNA-ul este nvelit de o capsid proteica, icosaedral, tristatificat. Particulele virale au aproximativ 76,5 nm i nu sunt nvelite. Virionul este format din 6 proteine structurale (VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 i VP7) i 6 proteine nestructurale (NSP1-NSP6).
263

stnga: Rotavirus A, microscopie electronic dreapta: distribuirea proteinelor n virion

Peste 500.000 de copii, sub 5 ani mor anual din cauza infeciilor cu rotavirusuri, iar peste 2.000.000 prezint forme severe. Istoric. n 1943, Jacob light i horace hodes au dovedit c agentul filtrabil, din scaunele diareice ale copiilor este acelai cu cel care produce diareea infecioas n efectivele de vite. n 1974, Thomas henry flewett, a propus denumirea de Rotavirus dup ce a observat prin microscopie electronic aspectul asemntor al particulelor virale cu al spielor de roat (rota n latin). Numele a fost recunoscut oficial de ctre Comitetul internaional de taxonomie viral, n 1978. n 1980 au fost descrise serotipurile de Rotavirus i n anul urmtor au fost izolate pe culturi celulare de rinichi de maimu. n 1998, a aprut primul vaccin comercial, n SuA, care a fost scos de pe pia un an mai trziu, deoarece exista suspiciunea ca ar produce ocluzie intestinal la 1/12.000 copii. n 2006, au aprut dou noi vaccinuri vii atenuate mpotriva infeciilor cu Rotavirus A (Rotarix - GlaxoSmithKline i RotaTeq - merck), care s-au dovedit a fi sigure i eficiente. Aceste vaccinuri sunt disponibile n Australia, Europa, Canada, Brazilia, Egipt, India, Israel, Taiwan, Africa de Sud, Panama, Argentina i SuA. Programul de vaccinare mpotriva rotavirusului A, reprezint o colaborare ntre PATh, omS i CPC i este finanat de GAVI Alliance. Programul are ca scop reducerea mortalitii i morbiditii prin campanii de vaccinare, n rile n curs de dezvoltare. n iunie 2009, Who a recomandat vaccinarea obligatorie n toate programele de imunizare naionale. Epidemiologie. Calea de transmitere este cea fecal-oral, prin contactul cu mini, suprafeele sau obiectele contaminate i posibil pe cale respiratorie. fecalele unei persoane bolnave conin peste 10 trilioane de particule infecioase/gram (numai 10-100 dintre acestea pot transmite
264

infecia la alte persoane).

Tabelul 8.4 ara rat de mortalitate Sursa

Anh dd, Thiem Vd, fischer TK, Canh dG, minh TT, Tho le h, Van man N, luan le T, Kilgore P, von Seidlein l, Glass RI Viet1 din 61 - 1 (2006). The burden of rotavirus diarrhea in Khanh hoa Provnam din 113 ince, Vietnam: baseline assessment for a rotavirus vaccine trial. Pediatr. Infect. dis. J. 25 (1): 3740 Tanaka G, faruque AS, luby SP, malek mA, Glass RI, Parashar Ban1 din 330 - ud (2007). deaths from rotavirus disease in Bangladeshi chilgladesh 1 din 660 dren: estimates from hospital-based surveillance. Pediatr. Infect. dis. J. 26 (11): 10148 Prez-Schael I, Salinas B, Gonzlez R, Salas h, ludert JE, EsVencalona m, Alcal A, Rosas mA, matern m (2007). "Rotavirus 1 din 1800 ezuela mortality confirmed by etiologic identification in Venezuelan children with diarrhea". Pediatr. Infect. dis. J. 26 (5): 3937. Soriano-Gabarr m, mrukowicz J, Vesikari T, Verstraeten T uE 1 din 20433 (2006). Burden of rotavirus disease in European union countries. Pediatr. Infect. dis. J. 25 (1 Suppl): S7S11. Cook Sm, Glass RI, leBaron CW, ho mS (1990). Global seaSuA 1 din 21675 sonality of rotavirus infections. Bull. World health organ. 68 (2): 1717.

n zonele temperate, infeciile cu rotavirusuri apar n special iarna, iar n cele tropicale de-a lungul ntregului an. de-a lungul anului 2005 a fost raportat cea mai mare epidemie, n Nicaragua.Au aprut mutaii genetice ale Rotavirusului A, care au afectat i populaia adult. Rotavirusul B, denumit i rotavirusul diareei la aduli (AdRV), a cauzat epidemii severe de diaree, ce au afectat mii de oameni de toate vrstele n China. Aceste epidemii au fost produse prin consumul apei. n 1998, a aprut i n India o epidemie cauzat de Rotavirus B, tulpina CAl, care este endemic. Rotavirusul C a fost asociat cu cazuri sporadice de diaree la copii, n mai multe ri, dintre care Japonia i Anglia.

265

cAPiTolUl 9 PriNciPAlii PrioNi cE SE TrANSMiT PriN AliMENTE

Prionii sunt proteine unice prin faptul c pot converti alte proteine n unele duntoare fcndu-le s i modifice forma. Proteina prionic din celula normal (PrP) exist n membrana celular din creier, avnd unele funcii vitale i fiind degradat de proteaze. forma sa patogen apare deformat, fiind rezistent la proteaze, i astfel se acumuleaz n esutul creierului i d natere bolilor. S-a postulat ideea c molecula prionic distorsionat acioneaz ca o matri, convertind proteinele normale n forme deformate. Proteina normal (forma -helical) cnd devine patogen ia o form -linear, rezistent la proteaze. formele patogene au tendina s se agrege n fibrilele amiloide, unde cauzeaz degenerarea celulei nervoase, ceea ce conduce la manifestarea clinic. Aceste particule au fost pentru prima dat denumite prioni de ctre Stanley Prusiner n 1982, cruia i-a fost acordat premiul Nobel pentru munca sa de pionierat n domeniul fiziologiei. Prionii cauzeaz scrapia la oi, capre i hamsteri i kuru la oameni. Alte infecii cu aceeai origine etiologic sunt: boala Kreutzfeldt Jacob (CJd), encefalopatia spongiform bovin (BSE) - boal a vacilor i oilor, denumit i boala vacii nebune, encefalopatia transmisibil a nurcilor, boala cahectizant a cervideelor. Toate acestea aparin unei familii de boli denumite encefalopatii spongiforme transmisibile (TSEs)

9.1. Encefalopatia spongiform bovin (BSE)

BSE (mad cow disease) a fost descoperit pentru prima dat n marea Britanie n 1984 i diagnosticat specific la vaci n 1986. Patru ani mai trziu, n marea Britanie, dintr-o populaie de 10.000.000 de vite au fost confirmate 14.000 de cazuri. Epidemia a atins un maxim de 1.000 de cazuri pe sptmn n 1993. Pn n februarie 1998 au fost confirmate 172.324 de cazuri.
266

Perioada de incubaie pentru BSE la om este ntre 1 i 15 ani. n 8 ri din afara Statelor unite au fost nregistrate 600 de cazuri, cu 256, numai n Elveia. din 1996-2000, au fost omorte 4.500.000 de vaci. ntre 1986 i noiembrie 2003, n SuA au fost diagnosticate cu BSE 183.634 de vaci i 4.469, n alte 22 de ri. n 2000 s-au nregistrat n SuA, n jur de 84 de victime umane. Primul caz confirmat n Japonia a aprut n septembrie 2001, iar pn n 2003 au fost nregistrate aproximativ 9 cazuri. n America de Nord, primul caz confirmat a fost anunat n mai 2003, n Alberta, Canada. n SuA, primul caz a fost confirmat n decembrie 2003 n mosses lake, Washington. Vaca avea 6 ani jumtate i consumase nutreuri cu materii animale (n prezent interzise). Testele de detectare a proteinelor prionice constau ntr-o metod imuno-histochimic (considerat metod standard), un CdI (conformation dependent immunoassay) practicat din 2003; un test screening elaborat de Bio-Rad Co. (TeseE) i alte 5-6 teste postmortem pentru SNC la vaci. BSE este o afeciune neurologic ntlnit numai la bovinele adulte, cu evoluie progresiv, insidioas. Se caracterizeaz clinic prin modificri de comportament, tulburri locomotorii, pareze i moarte, iar histopatologic prin vacuolizarea neuropilului, degenerarea pericarionilor i astroglioz, datorate interveniei unei proteine patogene (prion). datele epidemiologice arat c sursa primar de infecie o constituie hrana contaminat cu agentul cauzal al BSE. n momentul de fa se accept c sursa de infecie este reprezentat de fina de carne i de oase, provenite de la carcasele de oi i capre, bolnave de BSE, insuficient prelucrate industrial, ndeosebi termic permind supravieuirea agentului contaminant. Se consider c SNC, intestinele, splina, esutul limfoid i ocular, precum i placenta, constituie sursele de contaminare cele mai active. n SuA, incidena a fost mai mare la vacile din fermele de lapte, comparativ cu cele din fermele de carne, deoarece administrarea finii de carne i oase, la prima categorie a fost fcut din primele luni de via, pe o perioad lung de timp. multiplicarea iniial a agentului infecios are loc n esutul limforeticular, dup care se rspndete n SNC pe cale nervoas. dup infectarea vieilor pe cale oral, agentul etiologic al BSE poate fi detectat n regiunea distal a ileonului (plcile Payer). Infectivitatea a fost demonstrat la rdcina ganglionului toracic dorsal la 32-40 de luni dup infecie i n ganglionul trigemen la 36-38 de luni (Constantin Vasiu, 2003). S-a dovedit experimental c prin acidifierea mediului, are loc
267

o modificare structural a PrPc, practic transformarea ntr-o structur monomeric, cu solubilitate ridicat, -PrP, bogat n structuri . Aceste experimente arat c legarea mai multor molecule de -PrP poate duce la apariia unei configuraii ireversibile, probabil baza acumulrii PrPsc n BSE. (Constantin Vasiu, 2003). n rile indemne de boal se impune respectarea urmtoarelor msuri de prevenire: 1. Supraveghere clinic i prin examene de laborator a bovinelor domestice, bovideelor exotice i cervideelor din mediul silvatic si din captivitate. 2. Interzicerea importului de animale i produse ale acestora din rile unde evolueaz boala. 3. Eliminarea din hrana rumegtoarelor a oricrui produs posibil contaminat. n rile n care boala evolueaz, msurile aplicate urmresc reducerea sau eliminarea surselor de infecie pentru animale i a riscului de expunere a oamenilor la mbolnvire prin consum de alimente de origine animal. Se interzice folosirea, n hrana bovinelor a finii de carne i oase. Animalele bolnave se sacrific i se distruc prin incinerare.
Tabelul 9.1 Situaia cazurilor de BSE (infecia bovin) i vCJd (infecia uman) raportate pn n septembrie 2009 (The National Creutzfeldt-Jakob disease Surveillance unit (NCJdSu), university of Edinburgh. february 2009) ar Austria Belgia Canada Republica Ceh danemarca Insula falkland finlanda frana Germania Grecia hong Kong Irlanda Israel cazuri BSE 5 133 15 28 14 1 1 900 312 1 2 1,353 1 268 cazuri vCJd 0 0 1 0 0 0 0 23 0 0 0 4 0

ar Italia Japonia liechtenstein luxembourg olanda oman Polonia Portugalia Arabia Saudit Slovacia Slovenia Spania Suedia Elveia Thailanda marea Britanie SuA Total

cazuri BSE 138 26 2 2 85 2 21 875 15 7 412 1 453 nu exist date 183,841 3 188,579

cazuri vCJd 1 1 0 1 3 0 0 2 1 0 0 5 0 0 2 167 3 214

9.2. Boala Creutzfeldt-Jakob (CJd, vCJd)

n martie 1996, a fost nregistrat o nou variant de CJd (nvCJd, vCJd) n SuA la un grup mic de oameni majoritatea fiind mai tineri dect vrsta semnalat la cazurile precedente. n mod normal CJd apare la oamenii cu vrsta peste 60 de ani, dar n SuA, vCJd atac indivizii cu vrste cuprinse ntre 15-40 de ani. S-a concluzionat c vCJd reprezint de fapt forma uman de BSE. Prin studii pe oareci s-a demonstrat c BSE i CJd sunt similare. ntre februarie 1994 i octombrie 1995 au fost depistate n SuA 10 persoane cu nvCJd, dintre care 8 au murit. majoritatea victimelor aveau sub 30 de ani. ntre anii 1995 i 1998 au fost depistate n SuA 32 de cazuri. n 2003, n Europa boala a produs 150 de victime. ntre 1991 i 1995 au fost nregistrate n SuA, 94 de decese, dintre care 9 au avut vrste sub 55 de ani. Peste 85% dintre pacienii cu CJd mor la aproximativ un an de la declanarea bolii. ntre 1991 i 1995 rata mortalitii anuale n SuA, datorat CJd a fost de 1,2/1.000.000 de oameni.
269

9.3. Boala cahectizant cronic (Chronic Wasting disease - CWd)

CWd este o boal prionic detectat pentru prima dat n 1967, n statul Colorado. A fost diagnosticat la cerbii slbatici i la elani n districtele Wyoming, Nebraska i n provincia Saskatchewan din Canada. Boala se pare c se transmite prin saliv i fecale. Se estimeaz c n zonele endemice sunt infectai ntre 4% i 6% dintre cerbi i 1% dintre elani. Simptomele primare la elani sunt emacierea musculaturii i salivaie permanent. n decembrie 2003, departamentul de agricultur din SuA a pus la punct un program prin care se interzice deplasarea cerbilor captivi i a elanilor ntre diferite state. Pentru detectarea agentului etiologic se folosesc dou teste postmortem din SNC.

270

Vacuole microscopice caracteristice pe o seciune dintr-un esut nervos afectat de prioni, cu aspect spongiform (www.aphis.usda.gov)

Imagine clasic cu vac bolnav de BSE. Se observ dificulti locomotorii datorate afeciunilor nervoase (www.aphis.usda.gov) 271

distribuia BSE. zonele verde nchis reprezint cazuri confirmate la om, iar cele verde deschis, zone n care au fost raportate cazuri umane.

Infarcte cerebeloase la un pacient cu vCJd. Seciuni adiacente cerebeloase, colorate imun pentru markerul neuronal al proteinei din neurofilament (A) i PrP (B) (h. Budka 2000). 272

Se remarc vacuole mici rotunde sau ovale grupate difuz sau focal n neuropil. Spectrul de intensitate crete de la fig. (A) - fr modificri, (B) - modificri moderate la (C) modificri pronunate. Coloraia hE. (h. Budka 2000).

vCJd cu plci florale vizibile (plci amiloide fibrilare nconjurate de vacuole spongiforme). Coloraia hE. h. Budka 2000 273

Bibliografie selectiv 1. Bovine Spongiform Encephalopaphy: An overview. Animal and Plant health Inspection Service, united States department of Agriculture. 2006. http://www.aphis. usda.gov/publications/animal_health/content/printable_version/BSEbrochure122006.pdf. 2. Bovine Spongiform Encephalopathy - mad Cow disease. fact Sheets. food Safety and Inspection Service. 2005. http://www.fsis.usda.gov/fact_Sheets/ Bovine_Spongiform_Encephalopathy_mad_Cow_disease/index.asp. 3. BSE cases - Italy 2001 - 2006. 2006. http://www.izsto.it/ceafoc_bse.htm. 4. BSE Cases in North America, by Year and Country of death, 1993-2008. Centers for disease Control and Prevention, department of health and human Services. 2008. http://www.cdc.gov/ncidod/dvrd/bse/images/bse_cases_namerica_2008.gif. 5. BSE in Belgium. 2006. http://home.hetnet.nl/~mad.cow/landen/Belgium.htm. 6. BSE in Greece. http://home.hetnet.nl/~mad.cow/landen/Greece.htm. 7. BSE Positive findings in the Czech Republic. State Veterinary Administration, ministry of Agriculture, Czech Republic. 2007. http://www.svscr.cz/files/bse/en_ mappositivefindingsbse.pdf. 8. BSE: disease control & eradication - Causes of BSE, department for Environment, food, and Rural Affairs, 2007. 9. Commonly Asked Questions About BSE in Products Regulated by fdAs Center for food Safety and Applied Nutrition (CfSAN). Center for food Safety and Applied Nutrition, food and drug Administration. 2005. http://vm.cfsan.fda.gov/~comm/ bsefaq.html. 10. Creutzfeldt-Jakob disease fact Sheet. National Institute of Neurological disorders and Stroke. 2008. http://www.ninds.nih.gov/disorders/cjd/detail_cjd.htm. 11. Israel: BSE testing according to source of cattle and age groups, 2002-2008. 2008. http://agri3.huji.ac.il/~yakobson/bse/bse_test.htm. 12. mad cow disease: Still a concern. mayoClinic.com. CNN. 2006. http://premium. edition.cnn.com/hEAlTh/library/Id/00012.html. 13. mad cow watch goes blind. uSA Today. 2006. http://www.usatoday.com/news/ opinion/editorials/2006-08-03-our-view_x.htm. 14. overzicht BSE-gevallen. ministerie van landbouw, Natuur en Voedselkwaliteit. 2008. http://www.minlnv.nl/portal/page?_pageid=116,1640440&_dad=portal&_ schema=PoRTAl&p_document_id=110016&p_node_id=1161644&p_ mode=BRoWSE. 15. Statistics. Trade library. u.S. meat Export federation. http://www.usmef.org/ Tradelibrary/Statistics.asp. 16. The BSE Inquiry, lord Phillips of Worth matravers, 2000. 274

17. The Current Status of BSE and scrapie in denmark. danish Veterinary and food Administration. 2007. http://www.uk.foedevarestyrelsen.dk 18. vybp7ro2oirh77lz4kacv72gwfhuv6gmt4g643hvuhg4t2wgmynpbco2zpem2ucte/ StatusreportonBSEandscrapieindenmarkmay20071. 19. Variant Creutzfeld-Jakob disease, Current data, 2009. The National CreutzfeldtJakob disease Surveillance unit (NCJdSu), university of Edinburgh. http://www. cjd.ed.ac.uk/vcjdworld.htm. 20. Almer, G., hainfellner, J. A., Brcke, T., Jellinger, K., Kleinert, R., Bayer, G., Windl, o., Kretzschmar, h. A., hill, A., Sidle, K., Collinge, J., and Budka, h. (1999): fatal familial insomnia: a new Austrian family. Brain 122, 5-16. 21. Belichenko, P. V., miklossy, J., Belser, B., Budka, h., and Celio, m. R. (1999): Early destruction of the extracellular matrix around parvalbumin-immunoreactive interneurons in Creutzfeldt-Jakob disease. Neurobiol dis 6, 269-279. 22. Bell, J. E., Gentleman, S. m., Ironside, J. W., mcCardle, l., lantos, P. l., doey, l., lowe, J., fergusson, J., luthert, P., mcQuaid, S., and Allen, I. V. (1997): Prion protein immunocytochemistry -- uK five centre consensus report. Neuropathol Appl Neurobiol 23, 26-35. 23. Brown, david, 2001. The recipe for disaster that killed 80 and left a 5bn bill. The daily Telegraph. http://www.telegraph.co.uk/news/uknews/1371964/Therecipe-for-disaster-that-killed-80-and-left-a-5bn-bill.html. Retrieved. 24. Budka, h. (1997a): The human prion diseases: from neuropathology to pathobiology and molecular genetics. final report of an Eu Concerted Action. Neuropathol Appl Neurobiol 23, 416-422. 25. Budka, h. (1997b): Transmissible spongiform encephalopathies (prion diseases), pp. 449-474. In J. h. Garcia (Ed.): Neuropathology. The diagnostic approach, mosby, St.louis. 26. Budka, h. (2000a): histopathology and immunohistochemistry of human transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). Arch Virol. 27. Budka, h. (2000b): Prions and transfusion medicine. Vox Sang 78 (suppl 2), 231238. 28. Budka, h., Aguzzi, A., Brown, P., Brucher, J.-m., Bugiani, o., Gullotta, f., haltia, m., hauw, J.-J., Ironside, J. W., Jellinger, K., Kretzschmar, h. A., lantos, P. l., masullo, C., Schlote, W., Tateishi, J., and Weller, R. o. (1995): Neuropathological diagnostic criteria for Creutzfeldt-Jakob disease (CJd) and other human spongiform encephalopathies (prion diseases). Brain Pathol 5, 459-466. 29. Chesebro, B. (1999): minireview: Prion protein and the transmissible spongiform encephalopathy diseases. Neuron 24, 503-506. 30. Colchester AC, Colchester NT 2005. The origin of bovine spongiform encephalopathy: the human prion disease hypothesis. lancet. 31. Colchester, A; Colchester, N 2006. origin of bovine spongiform encephalopathy 275

 Authors reply. The lancet (Elsevier). 32. Constantin Vasiu, 2003. Viroze i boli prionice la animale. Ed. Nereamia Napocae. 33. digesta Artis mulomedicinae, Publius flavius Vegetius Renatus Vol.1 - Executive Summary of the Report of the Inquiry 34. dorandeu, A., Wingertsmann, l., Chrtien, f., delisle, m.-B., Vital, C., Parchi, P., montagna, P., lugaresi, E., Ironside, J. W., Budka, h., Gambetti, P., and Gray, f. (1998): Neuronal apoptosis in fatal familial insomnia. Brain Pathol 8, 531-537. 35. Giaccone, G., Canciani, B., Puoti, G., Rossi, G., Goffredo, d., Iussich, S., fociani, P., Tagliavini, f., and Bugiani, o. (2000): Creutzfeldt-Jakob disease: Carnoys fixative improves the immunohistochemistry of the proteinase K-resistant prion protein. Brain Pathol 10, 31-37. 36. Groschup, m. h., Beekes, m., mcBride, P. A., hardt, m., hainfellner, J. A., and Budka, h. (1999): deposition of disease-associated prion protein involves the peripheral nervous system in experimental scrapie. Acta neuropathol 98, 453-457. 37. Guentchev, m., Groschup, m. h., Kordek, R., liberski, P. P., and Budka, h. (1998): Severe, early and selective loss of a subpopulation of GABAergic inhibitory neurons in experimental transmissible spongiform encephalopathies. Brain Pathol 8, 615623. 38. Guentchev, m., hainfellner, J.-A., Trabattoni, G. R., and Budka, h. (1997): distribution of parvalbumin positive neurons in brain correlates with hippocampal and temporal cortical pathology in Creutzfeldt-Jakob disease. J Neuropathol Exp Neurol 56, 1119-1124. 39. Guentchev, m., Voigtlnder, T., haberler, C., Groschup, m. h., and Budka, h. (2000): Evidence for oxidative stress in experimental prion disease. Neurobiol dis (in press) 7. 40. Guentchev, m., Wanschitz, J., Voigtlaender, T., flicker, h., and Budka, h. (1999): Selective neuronal vulnerability in human prion diseases. fatal familial insomnia differs from other types of prion diseases. Am J Pathol 155, 1453-1457. 41. hainfellner, J. A., and Budka, h. (1996): Immunomorphology of human prion diseases, pp. 75-80. In l. Court, and B. dodet (Eds): Transmissible Spongiform Encephalopathies: Prion diseases, Elsevier, Paris. 42. hainfellner, J. A., and Budka, h. (1999): disease associated prion protein may deposit in the peripheral nervous system in human transmissible spongiform encephalopathies. Acta Neuropathol 98, 458-460. 43. hainfellner, J. A., Brantner-Inthaler, S., Cervenakova, l., Brown, P., Kitamoto, T., Tateishi, J., diringer, h., liberski, P. P., Regele, h., feucht, m., mayr, N., Wessely, P., Summer, K., Seitelberger, f., and Budka, h. (1995): The original GerstmannStrussler-Scheinker family of Austria: divergent clinicopathological phenotypes but constant PrP genotype. Brain Pathol 5, 201-211. 44. hainfellner, J. A., Jellinger, K., diringer, h., Guentchev, m., Kleinert, R., Pilz, P., 276

45.

46.

47.

48.

49.

50.

51. 52.

53. 54.

55.

56.

maier, h., and Budka, h. (1996): Creutzfeldt-Jakob disease in Austria. J Neurol Neurosurg Psychiat 61, 139-142. harden, Blaine 2003. Supplements used in factory farming can spread disease. The Washington Post. http://archives.seattletimes.nwsource.com/cgi-bin/texis.cgi/ web/vortex/display?slug=madcowdairy28&date=20031228. hegyi, I., hainfellner, J. A., flicker, h., Ironside, J. W., hauw, J. J., Tateishi, J., haltia, m., Bugiani, o., Aguzzi, A., and Budka, h. (1997): Prion protein immunocytochemistry: reliable staining protocol, immunomorphology, and diagnostic pitfalls. Clin Neuropathol 16, 262-263. hill, A. f., Butterworth, R. J., Joiner, S., Jackson, G., Rossor, m. N., Thomas, d. J., frosh, A., Tolley, N., J E Bell, Spencer, m., King, A., Al-Sarraj, S., Ironside, J. W., lantos, P. l., and Collinge, J. (1999): Investigation of variant Creutzfeldt-Jakob disease and other human prion diseases with tonsil biopsy samples. lancet 353, 183-189. Kordek, R., hainfellner, J. A., liberski, P. P., and Budka, h. (1999): deposition of the prion protein (PrP) during the evolution of experimental Creutzfeldt-Jakob disease. Acta neuropathol 98, 597-602. Kretzschmar, h. A., Ironside, J. W., deArmond, S. J., and Tateishi, J. (1996): diagnostic criteria for sporadic Creutzfeldt-Jakob-disease. Arch Neurol 53, 913920. macKenzie, debora 2007. New twist in tale of BSEs beginnings. New Scientist http://www.newscientist.com/article/mg19325954.400-new-twist-in-tale-of-bsesbeginnings.html. mago, Chandrika; Sinha, Kounteya 2005. India dismisses lancets mad cow. The Times of India. http://timesofindia.indiatimes.com/articleshow/1218869.cms. Parchi, P., Giese, A., Capellari, S., Brown, P., Schulz-Schaeffer, W., Windl, o., zerr, I., Budka, h., Kopp, N., Piccardo, P., Poser, S., Rojiani, A., Streichemberger, N., Julien, J., Vital, C., Ghetti, B., Gambetti, P., and Kretzschmar, h. (1999): Classification of sporadic Creutzfeldt-Jakob disease based on molecular and phenotypic analysis of 300 subjects. Ann Neurol 46, 224-233. Pathogens and Contaminants. food Safety Research Information office. Nov. 2007. http://fsrio.nal.usda.gov/document_fsheet.php?product_id=169. Peck, Clint 2004. Reader Questions Poultry litter And downer Bans. organic Consumers Association. http://www.organicconsumers.org/madcow/cow110504. cfm. Phillips, Kyra; meserve, Jeanne 2001. fdA Not doing Enough to Prevent mad Cow disease?. organic Consumers Association. http://www.organicconsumers. org/madcow/cnn22602.cfm. Rampton, Sheldon; Stauber, John 2004. mad Cow uSA (1st ed.). monroe, maine: Common Courage Press. ISBN 978-1-56751-110-9. 277

57. Richt JA, hall Sm 2008. BSE case associated with prion protein gene mutation. PloS Pathogens. 58. Schulz-Schaeffer, W. J., Tschoke, S., Kranefuss, N., drose, W., hause-Reitner, d., Giese, A., Groschup, m. h., and Kretzschmar, h. A. (2000): The paraffin-embedded tissue blot detects PrP(Sc) early in the incubation time in prion diseases. Am J Pathol 156, 51-56. 59. Seltzer, molly 2008. meat Recalls to Name Retailers. Bloomberg News. The Washington Post. http://www.washingtonpost.com/wp-dyn/content/ article/2008/07/11/AR2008071102818.html. 60. Thompson, Geoff 2005. New theory traces mad cow disease to animal feed exported from India. The World Today (ABC). http://www.abc.net.au/worldtoday/ content/2005/s1453543.htm. 61. Valleron AJ, Boelle PY, Will R, Cesbron JY 2001. Estimation of epidemic size and incubation time based on age characteristics of vCJd in the united Kingdom. Science (New York, N.Y.) . 62. Van Everbroeck, B., Palsa, P., martina, J.-J., and Cras, P. (1999): Antigen retrieval in prion protein immunohistochemistry. J histochem Cytochem 47, 1465-1470. 63. Wanschitz, J., Klppel, S., Jarius, C., Birner, P., flicker, h., hainfellner, J. A., Gambetti, P., Guentchev, m., and Budka, h. (2000): Alteration of the serotonergic nervous system in fatal familial insomnia. Ann Neurol (in press). 64. Weiss, Rick 2007. Scientists Announce mad Cow Breakthrough. The Washington Post. http://www.washingtonpost.com/wp-dyn/content/article/2006/12/31/ AR2006123100672.html. 65. Who (1998): Global surveillance, diagnosis and therapy of human transmissible spongiform encephalopathies: report of a Who consultation. Geneva, Switzerland, 9-11 february 1998, pp. Who/EmC/zdI/98.9, Who, Geneva.

278