V predavanje - OMB

Videli smo da je replikacija semikonzervativna i bidirekciona, da je replikativna viljuska asimetricna tj. da se replikacija odvija i na semidiskontinuiran nacin. To znaci da se jedan lanac sintetise u kontinuitetu i za njegovu sintezu je dovoljno da postoji samo jedan prajmer-ovo je tzv. vodeci lanac,a drugi lanac se sintetise diskontinuirano, u vidu Okazakijevih fragmenata (duzine nekoliko stotina nukleotida u eukariotskim,a 1000-2000 nukleotida u bakterijskim celijama). Ovi fragmenti se sintetisu svaki pocev od posebnog prajmera,a zatim se spajaju uz pomoc DNK ligaze. Sinteza oba lanca (i vodeceg,i onog koji zaostaje) se desava istovremeno i danas cemo videti kako se resava prostorni problem ove sinteze. Dakle,replikativna viljuska napreduje u jednom smeru,u istom tom smeru se sintetise vodeci lanac,a sinteza svakog Okazakijevog fragmenta,koja se odvija takodje u smeru 5-3, posto su matricni lanci DNK antiparalelni,desava se,u prostoru posmatrano,u smeru suprotnom od kretanja replikativne viljuske. To je upravo i razlog zasto se taj lanac sintetise u diskontinuitetu. U replikaciji,koja je veoma slozen proces,ucestvuje jako mnogo enzima,a mi cemo govoriti samo o najvaznijim enzimima replikacije i proteinima koji imaju kljucnu ulogu,da bismo,na kraju,videli kako izgleda kompletan mehanizam replikacije u bakterijskoj celiji. Prvi enzimi koje moramo da znamo su DNK polimeraze ( u bakterijkim celijama ima ih najmanje 3,verovatno i 5-6,a u eukariotskim nekih 15ak,a vrlo cesto se otkrivaju i nove DNK polimeraze). Verovatno da su one koje ucestvuju u replikaciji molekula DNK do sada vec otkrivene, a da te nove ucestvuju u nekim drugim procesima u celiji,uglavnom vezanim za reparaciju ostecenja u molekulima DNK. Nasi genomi su izlozeni delovanju razlicitih agenasa,koji mogu da imaju stetne posledice i ostavljaju ostecenja u molekulima DNK. Broj ovakvih ostecenja u nasim celijama je prilicno veliki,i kada bi se sva ta ostecenja na strukturi
1

DNK eksprimirala u vidu poremecaja neke celijske funkcije, onda bi to svakako bilo nespojivo sa zivotom. Zato postoje mnogobrojni i veoma slozeni mehanizmi za reparaciju tih ostecenja u molekulima DNK. Mnoge od humanih DNK polimeraza imaju ulogu u reparaciji (o ovim repair mehanizmima detaljnije na drugim kursevima). Prva otkrivena DNK polimeraza je nazvana DNK polimeraza 1 (1958. godine izolovao ju je Kornberg -dobitnik Nobelove nagrade). Za nju je karakteristicno da je to jedan polipeptidni lanac koji sadrzi 3 kataliticke aktivnosti. Jedna od tih katalitickih aktivnosti je polimerazna aktivnost u smeru 5-3 i sve otkrivene DNK polimeraze imaju polimeraznu aktivnost u ovom smeru,dakle katalizuju jedan isti tip reakcije. Nikada nije otkrivena nijedna DNK polimeraza koja katalizuje dodavanje novih nukleotida na 5__ kraju,i tu postoje neka objasnjenja o kojima cemo govoriti zasto to verovatno u toku evolucije nije bilo moguce,zasto ovaj mehanizam nije bio odrziv. Dakle,postoji 1 kataliticki centar sa polimeraznom aktivnoscu i 2 sa egzonukleaznom aktivnoscu. Jedan od egzonukleaznih centara ima aktivnost u smeru 3-5 , a drugi u 5-3 smeru. Znaci, DNK polimeraza moze da ugradjuje nukleotide u polinukleotidni lanac, a moze i da kao egzonukleaza iseca jedan po jedan nukleotid bilo sa 3 ili 5 kraja.
DNK POLIMERAZE
Ne razlikuje razli_ite dNTP Razlikuje dNTP od rNTP Zahteva prajmer Prima instrukcije od matrice Procesivna je (1s + 1 ms)

KF = AK 324-928; polimerazna + 35 egzonukleazna akt. Mali fragment = AK 1-323; 5 3 egzonukleazna akt.

Na ovoj slici vidimo sematski prikaz strukture Klenovog fragmenta DNK polimeraze 1. Ovaj fragment ima polimeraznu aktivnost i egzonukleaznu aktivnost u smeru 3-5. U ovoj strukturi nedostaje mali fragment enzima koji ima egzonukleaznu aktivnost u smeru 5-3. Struktura DNK polimeraze 1 bi se mogla opisati oblikom savijenog dlana,tako da razlikujemo palac,prste i dlan, a dvolancana zavojnica DNK se smesta u udubljenje dlana i biva obuhvacena enzimom. DNK polimeraza 1,a to vazi i za druge DNK polimeraze, NE RAZLIKUJE razlicite dNTP (dezoksinukleozid trifosfate). Ona sa potpuno jednakim afinitetom vezuje bilo koji od 4 supstrata (dATP,dGTP,dCTP,dTTP). Dakle,nije enzim taj koji sam odredjuje kojim redosledom ce nove nukleotide ugradjivati u polinukleotidni lanac,nego je u pitanju instrukcija koju enzim dobija od matricnog lanca DNK. Enzim nece imati nikakvu aktivnost u odsustvu matrice. Radi se o tzv. kinetickoj selekciji. Kada se novi nukleotid veze vodonicnim vezama sa nukleotidom koji sledi odmah iza prajmera,ako je nastali par ispravan tj. komplementaran (npr. na matrici A,a vezao se T), enzim prepoznaje geometriju tog baznog para,smesta ga u kataliticki

mali fragment obuhvata prvih 323 aminokiselina

centar i stimulise kataliticki proces tj. gradjenje fosfodiestarske veze je brz proces. Ako se veze nukleotid koji ne gradi komplementaran par sa nukleotidom u matrici, usporava se kataliticki proces i brza je disocijacija tog nukleotida nego formiranje fosfodiestarske veze. Znaci od 4 moguca nukleotida koji mogu da se vezu, fosfodiestarska veza se gradi samo ukoliko se H-vezama formirao komplementaran bazni par. Sam enzim ne prepoznaje A,G,T,C, ali je brzina katalitickog procesa ta koja odredjuje da li ce se fosfodiestarska veza formirati. Dakle ovaj proces se odvija po principu pokusaja i greske,kineticki je selektivan i ne zavisi od koncentracije ova 4 bazna para, koncentracija je slicna. Sve DNK polimeraze mogu da razlikuju dNTP (dezoksiribonukleozid trifosfate) i rNTP (ribonukleozid...). One ne vezuju rNTP,zato sto 2 OH grupa cini dovoljno veliku sternu smetnju za smestanje u kataliticki centar enzima(narusen princip kljuc-brava). DNK polimeraze zahtevaju prajmer i primaju instrukcije od matrice. Procesivnost je osobina enzima da ugradi odredjen broj nukleotida u kontinuitetu. Dakle,kada se jednom veze za matricni lanac da li ce svaki put kada ugradi novi nukleotid da disosuje,pa onda opet da se vezuje,sto bi bio jako nepovoljan i predugacak proces,jer sam proces vezivanja za matricni lanac traje dugo,oko 1 sec, a ugradnja 1 nukleotida 1 msec.( ugradi 1000 nukleotida za ono vreme za koje se veze). Sama DNK polimeraza 1 se ne odlikuje velikom procesivnoscu, moze da ugradi,mislim, oko nekoliko stotina nukleotida u kontinuitetu, i nasuprot prvobitnim verovanjima (pre nego sto su se otkrile druge DNK polimeraze) ona i nije enzim koji je zaduzen za replikaciju,vec vise ucestvuje u repair mehanizmima i uklanjanju prajmera i popravljanju praznina (gapova) koji nastaju njihovim uklanjanjem (dakle,ima ulogu na lancu koji zaostaje).

Enzim koji,zapravo,kod bakterija vrsi replikaciju i ima daleko vecu procesivnost (moze da ugradi nekoliko hiljada nukleotida u kontinuitetu) jeste DNK polimeraza 3 (DNK replikaza). Procesivnost ne treba mesati sa efikasnoscu enzima koja predstavlja broj nukleotida ugradjenih u jedinici vremena, brzinu tj. efikasnost katalitickog procesa.

Kada se vratimo na izgled Klenovog fragmenta,treba reci da se u oblsti dlana nalazi kataliticki centar za polimerizaciju i tu se desava prepoznavanje ispravnog baznog para,tj. ako je on ispravan dobro se uklapa u ovaj centar i kataliza je brza. Za katlizu je vazan i domen prstiju,koji je bitan i za zatvaranje baznog para koji je ispravan. U ovom domenu se nalazi jedan alfaheliks (O-helix) koji se pomeri za 40 ukoliko se H-vezama za matricni lanac veze ispravan nukleotid,poklopi taj bazni par,ucvrsti tu vezu sa matricnim lancem i zatim se brzim katalitickim procesom izgradi fosfodiestarska veza. U oblasti palca nemamo kataliticki centar,vec palac odrzava polozaj prajmera u odnosu na kataliticki centar i odrzavava vezu izmedju enzima i supstrata.
5

U oblasti dlana se nalazi i egzonukleazni kataliticki centar cija je aktivnost u smeru 3-5. Druga egzonukleazna aktivnost smera 5-3 je van Klenovog fragmenta,i nalazi se u malom fragmentu DNK polimeraze. Sematski prikazano,dvolancana zavojnica se nalazi izmedju palca,prstiju i dlana,i normalno se odigrava polimerizacija. Ali u celiji cesto dolazi do tautomernih prelaza,pa baze mogu da predju iz uobicajenog i pozeljnog keto oblika u enolni,ili iz amino u imino oblik. U ovakvim,tautomernim oblicima,baze formiraju drugacije, nekomplementarne bazne parove,i tako dolazi do gresaka u replikaciji. Ali svaka DNK polimeraza ima egzonukleaznu aktivnost u 3-5 smeru koja sluzi za ispravljanje ovih gresaka. Dakle,DNK polimeraze su enzimi koji ne samo da mogu da polimerizuju,nego mogu i da uklanjaju nukleotide svojom egzonukleaznom aktivnoscu,tako da ako dodje do greske,one prvo ispravljaju tu gresku,pa nastavljaju dalje polimerizaciju. Tako da je replikacija u pogledu vernosti,tacnosti,jedan veoma pouzdan proces,sto je logicno,jer se sve greske u replikaciji prenose na potomstvo. Stoga je bitnija tacnost replikacije,nego transkripcije i translacije. Ako se ugradi pogresan bazni par u novosintetisani lanac,tako da imamo situaciju da 3 OH kraj sada nije dobro sparen automatski se zaustavlja replikacija,jer DNK polimeraza trazi prajmer,a prajmer je ispravno sparen 3 OH kraj. Znaci tu mora da postoji neki ispravno sparen nukleotid, i H-vezama ispravno sparen 3 OH kraj,da bi na tu 3 OH grupu polimeraza dodala sledeci nukleotid. Ukoliko je doslo do tautomernog prelaza i narusio se 3 kraj, replikacija se zaustavlja. DNK polimeraza svojom 3-5 egzonukleaznom aktivnoscu uklanja taj pogresno spareni nukleotid,a zatim nastavlja polimerizaciju. Taj neispravno sparen kraj sklizne u kataliticki centar enzima sa egzonukleaznom aktivnoscu u oblasti dlana-editing mod,nakon cega se vraca u polimerizacioni mod kada moze da ugradi sledeci nukleotid na 3 OH kraj. Ovaj mehanizam se naziva proofreading, korekcioni mehanizam, tj.mehanizam za ispravljanje gresaka. Proofreading
6

mehanizam odmah uklanja greske,a posle replikacije moguce greske se ispravljaju repair mehanizmima,pa je sveukupno ucestalost greske u replikaciji 10 (1 od 10 milijardi baza ostane neispravna). Nas genom ima 3 milijardi baza,tako da mozemo da kazemo da ce se celija 3 puta deliti bez greske,a 4. put ce se desiti jedna greska,ali naravno ne mozemo na ovaj nacin da predvidimo redosled gresaka. Kod bakterije E.coli postoji DNK polimeraza 1, koja ima polimeraznu i 2 egzonukleazne aktivnosti, 3-5 aktivnost se koristi za proofreading mehanizam,a 5-3 polimerazna aktivnost koristi se za uklanjanje prajmera u sintezi lanca koji zaostaje. Ovaj lanac se sintetise tako sto DNK polimeraza dodaje 1 po 1 nukleotid na 3 OH kraj prajmera gradeci Okazakijeve fragmente, i kada dodje do 5 kraja drugog prajmera (sintetise ih enzim primaza,mestimicno, tako da ostane mesta za 1000-2000 nukleotida,odn. Okazakijeve fragmente izmedju) i zavrsi sintezu Okazakijevog fragmenta, ukljuci se enzim Rnaza H, koja razgradjuje RNK lance u hibridu sa DNK (prajmeri su oligoribonukleotidi). Ove hibridne segmente uklanja Rnaza H ,ali ona ne moze do kraja da ih ukloni,dodje do blizu granice 3 kraja prajmera i Okazaki fragmenta i tu je nemocna. Ovde DNK polimeraza 1 svojom 5-3 egzonukleaznom aktivnoscu uklanja taj prajmer do kraja, a polimeraznom aktivnoscu popunjava prazninu koja je time nastala. Zatim se ukljucuje DNK ligaza koja gradi fosfodiestarku vezu izmedju 3 kraja jednog, i 5 kraja drugog Okazakijevog fragmenta,i tako se uspostavlja kontinuitet lanca koji zaostaje. Dakle,uloga DNK polimeraze 1 u replikaciji kod bakterija je da svojom polimeraznom aktivnoscu popunjava rupe nastale uklanjanjem prajmera, svojom 3-5 egzonukleaznom aktivnoscu ispravlja greske tokom replikacije, a svojom 5-3 egznuk. aktivnoscu uklanja ostatke prajmera koje RNaza H nije uspela da ukloni. DNK polimeraza 2 bakterija ucestvuje u reper mehanizmima,

Pol 3 replikuje najveci deo bakterijskog hromozoma,za razliku od Pol 1,to je kompleksan enzim koji se sastoji iz vise subjedinica i koji ima daleko vecu procesivnost. Pol 4 i Pol 5 ucestvuju u reper mehanizmima. Kod eukariota,spisak DNK polimeraza je mnogo duzi,one uglavnom ucestvuju u reper mehanizmima, ali za replikaciju su znacajne DNK Pol koja zapocinje replikaciju i koja vezuje primaze (nalazi se s njom u komplexu), a Pol i Pol vrse replikaciju vodeceg lanca i lanca koji zaostaje. Pol ucestvuje u replikaciji mitohondrijske DNK, a ostale Pol imaju ulogu u reper mehanizmima. Bakterijska DNK polimeraza 3 je enzim koji se sastoji iz vise polipeptidnih lanaca (subjedinica) i sadrzi 2 jezgra enzima,koji svaki pojedinacno lici na Pol 1 tj. Klenov fragment (jer nijedna od subjedinica nema 5-3 egzonukleaznu aktivnost),sto ukazuje na njihovo zajednicko poreklo.

Pol 3 holoenzim Pored toga,ovde se nalazi -kompleks koji se sastoji od 5 proteina. 2 proteina vezuju svaki jedno jezgo enzima i plus intereaguju sa helikazama, 3 proteina cine tzv. clamp loader (utovarivac prstena). Konacno,postoji prsten koji se kod bakterija

cesto oznacava kao -subjedinica i ima ulogu da obezbedi procesivnost DNK Pol 3. Ova -subjedinica je jedan prilicno konzervisan protein prstenaste strukture koji postoji i kod eukariotskih DNK Pol (tu je dimer,kod kvasca i bakterija trimer). Taj prsten, sliding clamp, ima ulogu da obuhvati dvolancanu zavojnicu DNK i da omoguci da Pol ostane vezana za DNK, tako da se ceo Okazakijev fragment sintetise u kontinuitetu ili npr. ceo vodeci lanac. Ona time znacajno povecava procesivnost enzima koja je jako bitna da bi brzina replikacije bila zadovoljavajuca. Clamp loader,kompleks od 3 proteina, koji imaju ulogu da vezuju ovu -subjedinicu,sadrzi ATP vezivno mesto. Kada je ATP vezan za protein,onda dolazi do asocijacije prstena. ATP se hidrolizuje, jer clamp loader ima ATP-aznu aktivnost,ali ova aktivnost je spora,ona determinise vremenski tok dogadjaja,i prsten ostaje vezan dokle god postoji ATP,a kada se zavrsi hidroliza ATP-a, prsten disosuje. Znaci, dvolancana zavojnica je vezana za enzim sve dok ima ATP-a,a nakon hidrolize ATP-a,enzim se odvaja od matricnog lanca. Sto je sporija hidroliza,to je veca procesivnost enzima. Pored DNK polimeraza,enzimi koji imaju vrlo znacajnu ulogu I bez kojih replikacija ne bi mogla da se odvija su HELIKAZE. To su enzimi koji se obicno nalaze kao heksameri u obliku prstena u celiji. Kod bakterija se nazivaju DNK B proteini. Svaka subjedinica helikaze ima ATP vezujuce mesto,ona hidrolizuje ATP,koristeci energiju hidrolize za promenu konformacije. Zato helikaze nazivaju jos i masinama na ATP pogon,koje hodaju po DNK,jer menjajuci konformaciju,one se krecu duz jednolancane DNK, raskidajuci H-veze izmedju 2 lanca DNK,omogucavaju razdvajanje 2 lanca DNK. Helikaze imaju kljucnu ulogu u otvaranju replikativne viljuske. Vrlo su procesivne (kada se jednom vezu za DNK,otvaranje prstena I disocijacija je vrlo redak

u svakoj replikativnoj viljuski se nalazi jedan molekul helikaze

proces). Razlikuju se po svojoj polarnosti tj. postoje helikaze koje se krecu u 3-5 smeru i one koje se krecu u suprotnom. Aktivnost helikaza se u replikaciji modulise tj. inhibira ili stimulise u zavisnosti od toga da li je u kontaktu sa DNK polimerazom ili nije. To je mehanizam kojim se koordinise napredovanje replikativne viljuske sa brzinom replikacije. Dakle,ne postoji situacija da helikaza ide mnogo ispred DNK polimeraze,kao ni da DNK polimeraza mora da ceka helikazu. Ta dva enzima u bakterijskoj celiji su koordinisana,tako sto ostvaruju kontakt preko -proteina DNK polimeraze. Kada -protein ostvari kontakt sa helikazom, stimulise se njena aktivnost, ubrzano raskidanje H-veza i otvaranje dvolancane zavojnice,a kada se helikaza dovoljno odmakne da ovog kontakta nema usporava se njena aktivnost. Na ovaj nacin se koordinise brzina kretanja replikativne viljuske sa brzinom polimerizacije novog lanca.

SSB proteini (single-strand DNA-binding) su takodje bitni u replikaciji i vezuju se za jednolancanu DNK. Oni obicno prate helikazu,i cim ona razdvoji 2 lanca DNK, SSB proteini se vezuju za novonastale jednolancane molekule DNK, sprecavajuci njihovu reasocijaciju. Vezuju se kooperativno tj. vezivanje jednog olaksava vezivanje narednog proteina,tako da vrlo brzo pokrivaju

mogu se naci i pod starim nazivom HDP helix destabilizing proteins

10

citav segment radom helikaza nastale jednolancane DNK. Vezujuci se, oni pomalo izduzuju okosnicu DNK lanaca, tako da onemogucavaju reasocijaciju I uglavnom intereaguju elektrostaticki sa okosnicom DNK lan ca u kome postoje negativne fosfatne grupe. DNK topoizomeraze su jos jedna grupa proteina vaznih za replikaciju. Tenzija uvrtanja prilikom napredovanja replikativnih viljuski na bakterijskom hromozomu pretila bi da zaustavi replikaciju,ne bi mogli da razdvojimo 2 lanca DNK (moze se uporediti sa prstenom napravljenim od mornarskog kanapa,tj. 2 niti spiralno uvijene jedna oko druge). I na linearnim eukariotskim hromozomima bi se dogodilo isto,dolazi do formiranja supernavoja (kao telefonski kabl), a iako su molekuli linearni,oni se pakuju sa proteinima u serije petlji, i svaka petlja se u ovom slucaju moze posmatrati kao 1 cirkularni molekul DNK. Dakle,postoji problem tenzije uvrtanja koji preti da zaustavi replikaciju (i rekombinaciju, transkripciju, i reper mehanizme tj. sve procese koji su povezani sa otvaranjem dvolancane zavojnice) , jer svaki put kada se otvori dvolancana zavojnica DNK u duzini od 10 baznih parova, negde napred se napravi jedan supernavoj (10 baznih parova je jedan hod za 360). DNK je u svim celijama (i bakterijskim i eukariotskim) superspiralizovana, sto je veoma bitno sa aspekta funkcije,jer je uglavnom negativno superspiralizovana. Pozitivna superspiralizacija je u onom smeru u kome se formira supernavoj prilikom otvaranja dvolancane zavojnice (ovaj smer je uvek isti jer je dvolancana DNK desnogira) odredjeno po konvenciji. Zbog toga, umesto sto bi razdvajnje 2 lanca DNK bilo praceno formiranjem novog supernavoja,prakticno samo dolazi do relaksacije jednog negativnog supernavoja. Drugi znacaj superspiralizacije je u samom pakovanju DNK u celije (mora da bude gusto spakovana da bi uopste stala u jedro). Enzimi koji resavaju te topoloske probleme su DNK topoizomeraze. Postoje 2 tipa ovih enzima.

11

DNK topoizomeraze 1 koje funkcionisu kao reverzibilne endonukleaze. One mogu da raskinu fosfodiestarsku vezu negde u unutrasnjosti DNK lanca i zato su endonukleaze, a reverzibilne su jer nakon raskidanja one opet formiraju fosfodiestarsku vezu i to bez utroska energije.

DNK topoizomeraza 1 pravi prekid u jednom od 2 lanca, enzim ostaje vezan za jedan od krajeva estarskom vezom u kojoj je sadrzana kompletna energija hidrolize ove fosfodiestarske veze. Kroz taj prekid provuce segment drugog lanca i smanji mu linking broj(govori o tome koliko se puta jedan lanac obavija oko drugog). Dakle,kroz prekid u jednom lancu, DNK topoizomeraza 1 provuce segment drugog lanca i oslobodi ga za jedan navoj, onda enzim disosuje od DNK,a energija koja je bila sacuvana u vezi enzima i DNK koristi se za ponovnu izgradnju fosfodiestarske veze (ponovo se uspostavlja kontinuitet lanca,bez doddatne energije). Na ovaj nacin je DNK oslobodjena jednog pozitivnog supernavoja. Dakle, DNK topoizomeraze tipa 1, i u prokariotskim, i u eukariotskim celijama rade tako sto oslobadjaju DNK molekul tenzije uvrtanja, relaksirajuci pozitivne supernavoje.

12

Kod bakterija postoji jos jedan enzim,DNK topoizomeraza tipa 2, tj. DNK iraza.

Dvolancana DNK se namotava oko ovog enzima koji pravi prekid na oba lanca DNK,provuce segment dvolancane zavojnice kroz taj prekid i ponovo zatopi dvolancanu zavojnicu. Koristi energiju hidrolize ATP,znaci imamo utrosak energije pri ovom procesu. Ovaj enzim,u stvari, povecava negativnu superspiralizaciju, provlacenjem segmenta kroz prekid ziraza uvodi jedan negativni supernavoj u DNK. Zahvaljujuci zirazi,bakterijski hromozom je stalno u stanju negativne superspiralizacije. Aktivnost ovog enzima je u celiji kontrolisana i stepen neg. supersp. se odrzava na pozeljnom nivou. Znaci,ziraza uvodi negativne supernavoje, tako da kada otpocne replikacija, umesto da se na svakih 10 baznih parova formira jedan pozitivan supernavoj,zapravo dolazi samo do relaksacije jednog negativnog supernavoja. Eukarioti nemaju enzime koji bi bili pandan zirazi, njihove topoizomeraze tipa 2 takodje relaksiraju pozitivne supernavoje,a ne uvode negativne. Medjutim,eukariotske DNK jesu negativno superspiralizovane samim tim sto su namotaji DNK oko histonskih oktamera levogiri. Tu imamo negativnu superspiralizaciju vec u samoj strukturi nukleozoma. Struktura bakterijskog hromozoma je mnogo labavija nego struktura eukariotskog.

13

Znaci, DNK topoizomeraze imaju vaznu ulogu u odrzavanju topologije i omogucavanju napredovanja replikativne viljuske.

Mehanizam replikacije kod prokariota Ovaj proces (kao i transkripciju i translaciju) mozemo da podelimo u fazu inicijacije,elongacije i terminacije. Faza inicijacije,u kojoj proces zapocinje je vazna iz regulatornog aspekta, jer je kao i vecina drugih metabolickih procesa sinteza DNK, RNK i proteina uglavnom regulisana na nivou prvog koraka. Tu se donosi odluka da li se ce se proces odvijati ili ne, jer bi svaka kasnija odluka bila previse skupa, nepotrebno bi se trosila energija. Obicno je proces inicijacije najmanje proucen i najslozeniji. Kod bakterija postoji mesto na hromozomu na kome zapocinje replikacija (origin of replication)- oriC lokus. Ako detaljnije pogledamo strukturu oriC lokusa,mozemo da uocimo neke segmente gde se sekvence nukleotida ponavljaju. Imamo 4 segmenta u kojima se 9 sekvenca od 9 nukleotida ponavljaju na identican nacin,i imamo 3 segmenta u kojima postoje po 13 baznih parova koji se ponavljaju. Ovi ponovci od 9 baznih parova sluze za vezivanje jednog proteina tj.kompleksa- DnaA,koji ima znacajnu ulogu u inicijaciji replikacije i koji se za DNK vezuje kao kompleks od neki 30ak subjedinica, omotavajuci dvolancanu zavojnicu oko sebe. Protein DnaA ima vezujuce mesto za ATP,za svaku subjedinicu ovog proteina se vezuje ATP, i kada se formira ovaj inicijalni kompleks za replikaciju, tada se ovi segmenti od 13 baznih parova nalaze u blizini DnaA,a za njih je karakteristicno da su bogati AT baznim parovima. Znaci,to su lako topljivi segmenti,
regulacija replikacije je jako bitna, jer replikacija treba da se dogodi samo jednom u toku cel. ciklusa. U suprotnom, dolazi do poliploidije (umnozavanje cel. materijala). Moze i da nakon replikacije ne dodje do deobe,pa nastaju dzinovski,politeni hromozomi (hromatide ostaju sparene), npr. kod pljuvacnih zlezda drozofile.

14

tako da sad zapocne hidroliza ATP-a od strane proteina DnaA, a energija hidrolize se koristi za otvaranje replikativnog mehura u oblasti ovih ponovaka od 13 baznih parova. Sada imamo otvoreni kompleks,i za njega se vezuje helikaza, cije vezivanje pomaze protein DnaC. Svaki od monomera helikaze,koja je heksamer, za sebe ima vezan ATP. Za jedan lanac se veze jedna,a za drugi druga helikaza. Sada je ovo prepriming complex, koji je spreman da tu dodje primaza, da sintetise prajmere i da moze da zapocne replikacija. Ovim korakom zavrsava se inicijacija.

Inicijacija Helikaza dalje otvara replikativnu viljusku, pocinje sinteza prajmera, pocinje sinteza vodeceg lanca koji se sintetise u kontinuitetu i Okazakijevih fragmenata koji se sintetisu svaki od posebnog prajmera koje primaza mestimicno sintetise na matricnom lancu za lanac koji zaostaje. Replikacija napreduje. Ako sad posmatramo DNK polimerazu 3,ona je preko proteina povezana sa helikazom,vidimo da postoje 2 jezgra enzima,2 subjedinice,od kojih jedna sintetise vodeci lanac

15

(sintetise se u smeru kretanja replikativne viljuske), a druga lanac koji zaostaje (sintetise se u suprotnom smeru). I jedno i drugo jezgro moze da bude vezano sa -subjedinicom, koja disosuje ili asosuje u zavisnosti od toga da li je za clamp loader vezan ATP. Na slici imamo situaciju da otpocinje sinteza vodeceg lanca i imamo primazu koja sintetise prajmer (zeleno). Od prajmera zapocinje sinteza Okazakijevog fragmenta,a kada dodje do novog prajmera tj. zavrsi se sinteza Okazaki fragmenta, doci ce do hidrolize ATP i do disocijacije -subjedinice,otvorice se prsten i disosovati sa DNK.
Model TROMBON

U sledecem koraku se stvara petlja u kojoj ce se ovo jezgro enzima vezati za prethodni prajmer,ponovo ce se vezati ATP i prstenasta subjedinica ce asosovati i omoguciti sintezu novog Okazaki fragmenta. Kada se zavrsi ta sinteza,naravno, doci ce Rnaza H koja ce da ukloni prajmer i DNK polimeraza 1, i Pol 1 koja ce da popuni nastalu prazninu,kao i ligaza koja ce da poveze 2 Okazakijeva fragmenta. Dakle,oba lanca se sintetisu u smeru 5-3, a prostorno se problem resava upravo tako sto se lanac koji zaostaje sintetise iz
16

fragmenata, jer onda je moguce da se prave petlje koje omogucuju sintezu novog Okazakijevog fragmenta,a da se ne ometa kretanje enzima. Terminacija replikacije- ako bi se bakterijski hromozom posmatrao kao kruzni, terminacioni region bi bio negde naspram oriC regiona. U tom terminacionom regionu postoje neke sekvence nukleotida koje imaju ulogu ventila koji propustaju replikativnu viljusku samo u jednom pravcu. Znaci repl. viljuska koja se krece u pravcu kazaljke na satu prolazi prvo kroz sekvencu TerE, TerA, i dolazi u region gde vise ne moze da napreduje jer je zaustavlja sekvenca TerC. Ako bi se desilo da replikativna viljuska ipak tu nastavi, onda nailazi na rezervni ventil. Druga replikaciona viljuska, posto replikacija ide bidirekciono, napreduje u smeru suprotnom od smera kazaljke na satu,prolazi kroz sekvence TerF,TerB i TerC i zaustavlja se u istom regionu. Te sekvence koje onemogucavaju otvaranje replikativne viljuske u jednom od ova 2 pravca imaju ulogu da obezbede da se 2 replikativne viljuske, cak i ako se ne krecu potpuno podjednakom brzinom duz bakterijskog hromozoma,sretnu u tom regionu, i na taj nacin se prirodno zavrsava replikacija. Dva nova dvolancana DNK molekula (svaki se sastoji od jednog starog i jednog novog lanca) nadju se vezani kao karike u lancu,i sad je potrebna DNK iraza,koja napravi dvolancani prekid i razveze ova 2 molekula. Tako se zavrsava replikacija u interfazi celijske deobe.

17