DNA je vrlo dugaka molekula

Metode molekularne biologije I: Analiza DNA i genoma

haploidni genom ovjeka ima 3,164,700,000 parova baza 1 m (promjer jezgre je oko 10 m) zbog slaganja parova baza DNA je razmjerno kruta molekula

1013 stanica x 2 m = 182.000.000.000 km (610 puta do sunca i nazad)

Genetika informacija organizma sadrana je unutar genoma

Genom

ovjek ima oko 30.000 gena

ukupna DNA organizma

Gen

veliina genoma raste prema viim organizmima (bakterija - 3 Mpb; ovjek - 3000 Mpb)

virusi - jednolanana ili dvolanana DNA ili RNA svi stanini organizmi - dvolanana DNA

Pan troglodytes
30.000 gena 98% homologije

Mus musculus
30.000 gena 90% homologije

30.000 gena 85% homologije

Danio rerio

D. melanogaster
13.600 gena 36% homologije

Ekspresija gena

funkcionalna jedinica genoma odsjeak DNA koji kodira za polipeptidni lanac ili molekulu RNA nastanak genskog produkta

Sredinja dogma molekularne biologije

prijenos genske poruke: DNA RNA

PROTEIN

25.000 gena 26% homologije

A. thaliana

S. cerevisiae
6.275 gena 23% homologije

19.000 gena 21% homologije

C. elegans

4.800 gena 7% homologije

E. coli

U naelu se provode dva tipa analize DNA

1. Analiza slijeda
Identifikacija mutacija i polimorfizama (SNP) Dijagnosticiranje nasljednih bolesti Utvrivanje prisutnosti strane DNA Odreivanje slijeda nukleotida u nekoj DNA ...

Komplementarne molekule DNA i RNA povezuju se u otopini (hibridiziraju)

2. Analiza genske ekspresije

Poremeaji genske ekspresije u bolestima Utjecaj lijekova na gensku ekspresiju Ispitivanje funkcije pojedinih gena ...

Southern (DNA) blot analiza ispituje prisutnost odreenog slijeda nukleotida u DNA pomou specifine hibridizacije s DNA-sondom

Southern (blot) analizu uveo je Edwin Southern po kome je i nazvana.

Primjer southern blot analize

Postupak southern blot analize

1. Razgradnja DNA restrikcijskim ednonukleazama 2. razdvajanje molekula DNA elektroforezom u agaroznom gelu 3. razdvajanje niti DNA (denaturacija)
0.5 M NaOH pasivnom difuzijom ili elektroforetiki

4. prijenos DNA (blot) na nitroceluloznu membranu 5. fiksiranje DNA za membranu (temperatura, UV) 6. hibridizacija s obiljeenom sondom 7. detekcija
Stanina DNA pokidana EcoRI restrikcijskim enzimom i razdvojena elektroforezom u 0,7% agaroznom gelu (lijevo), southern blot analiza specifinog gena (desno)

Lanana reakcija polimeraze (PCR) revolucionalizirala je analizu DNA

Za provoenje lanane reakcije polimeraze potrebno je imati:

Izoliranu DNA Dvije specifine poetnice (engl. primer) Termostabilnu polimerazu (Taq) Smjesu 4 dNTP Mg2+ Odgovarajui pufer

Lananom reakcijom polimeraze moemo u svega nekoliko sati dobiti milijarde identinih kopija nekog ciljanog fragmenta DNA

Lanana reakcija polimeraze

Tijek lanane reakcije polimeraze

Ciklus 1 Ciklus 2

Denaturacija kalupa Sinteza DNA Vezanje poetnica

Multipleks PCR
istovremena analiza vie segmenata DNA u istom uzorku istovremeno se koristi vie parova poetnica
moraju imati sline optimalne temperature za vezanje (podjednaka duina i GC sastav)

Primjer multipleks-PCR analize

optimiranje je vrlo sloeno optimirane metode su vrlo informativne

jednoznana identifikacija ljudi, oinstva i sl.

Genetiki otisak prsta

Identifikacija PCR produkata

identifikacija na agaroznom gelu
neobiljeene poetnice detekcija etidij-bromidom ili slinom bojom razmjerno slaba osjetljivost i razluivanje jednostavna oprema

Lanana reakcija polimeraze u stvarnom vremenu

Real-time PCR kontinuirana analiza produkata lanane reakcije polimeraze omoguava pouzdanu kvantifikaciju
eliminira problem plato-faze kod kvantifikacije klasinim PCR metodama

identifikacija fluorescentnih produkata

poetnice obiljeene fluorescentnim biljezima vrlo pogodne za multipleks analize
do 16 razliitih analiza u jednoj reakciji

eliminira potrebu za analizom produkata skupa oprema ($50,000 - 100,000)

obian PCR je $5,000 - $10,000

odlino razluivanje i vrlo velika osjetljivost vrlo skupa i sloena oprema

razmjerno ograniena mogunost multipleksa

Princip lanane reakcije polimeraze u stvarnom vremenu (Taqman metoda)

unutarnja sonda ima vezanu fluorescentnu boju R i priguiva Q (quencher) fluorescira tek nakon razdvajanja R i Q unutarnju sondu razgrauje Taq polimeraza (53 egzonukleaza) koliina fuorescencije razmjerna je koliini PCR produkta primjena razliito obiljeenih unutarnjih sondi omoguava multipleks analizu

SYBR Green tehnologija

SYBR Green je boja koja fluorescira samo kad je vezana da dvolananu DNA

Oprema za lananu reakciju polimeraze u stvarnom vremenu

Kontinuirana analiza produkata omoguava pouzdanu kvantifikaciju

ABI PRISM 7700

Kvantifikacija s pomou Real-Time PCR

(relativna kvantifikacija)

Analiza genskog polimorfizma pomou lanane reakcije polimeraze u stvarnom vremenu

Poetnica iji slijed nije identian slijedu baza u genu (koja ima nesparenih baza) slabije e se vezati te e doi do njezine manje razgradnje i posljedino manjeg signala.

Polimorfizam konformacije jednolanane DNA

SSCP Engl. Single Strand Conformational

SSCP

Polymorphism

temelji se na injenici da jednolanane molekule DNA iste duljine, no razliite sekvence tijekom nedenaturirajue elektroforeze putuju razliitim brzinama
zbog stvaranja sekundarnih struktura koje ovise o slijedu nukleotida
Razlike u slijedu nukleotida uzrokuju razliitu elektroforetiku pokretljivost Postojanje vie od dvije vrpce upuuje na heterozigotni genotip (mutaciju)

Alel-specifine poetnice

Primjena analize slijeda u dijagnostici

prenatalna dijagnostika nasljedne bolesti
cistina fibroza

tumorski markeri i prognostiki faktori tipizacija mikroorganizama

E. coli humani papiloma virusi
Engl. Allele specific primers (primer extension assay) poetnice na 3 kraju odgovaraju jednom od alela do sinteze DNA i stvaranja PCR produta dolazi samo ukoliko je kalup potpuno komplementaran poetnici

utvrivanje identiteta i oinstva farmakogenomika

Kemijska struktura nukleinskih kiselina

ODREIVANJE SLIJEDA NUKLEOTIDA U DNA

DNA nema 2-OH skupinu

U strukturi DNA A se uvijek nalazi nasuprot T, a G nasuprot C

(Parovi baza prema Watsonu i Cricku)

Sangerova dideoksi metoda sekvenciranja DNA

Shematski prikaz sekvenciranja DNA Sangerovom dideoksi metodom

Sekvenciranje lananom reakcijom polimeraze (Cycle Sequencing)

Elektroferogram sekvenciranja DNA Sangerovom dideoksi metodom

U naelu se provode dva tipa analize DNA

1. Analiza sekvence
Identifikacija mutacija i polimorfizama (SNP) Dijagnosticiranje nasljednih bolesti Utvrivanje prisutnosti strane DNA Odreivanje slijeda nukleotida u nekoj DNA ...

2. Analiza genske ekspresije razdvajanje kapilarnom ili gel-elektroforezom dideoksi nukleotidi obiljeeni fluorescentnim bojama
Poremeaji genske ekspresije u bolestima Utjecaj lijekova na gensku ekspresiju Ispitivanje funkcije pojedinih gena ...

Northern (RNA) blot analiza

RNA

RT-PCR
za analizu molekula mRNA (ekspresije gena) prije lanane reakcije polimeraze mRNA se pretvara u DNA pomou reverzne transkriptaze
nastaje tzv. cDNA (komplementarna DNA)

Northern (blot) analiza nazvana je analogijom s southern blot analizom.

Kvantifikacija PCR produkata

usporedba s koamplificiranim standardom
-aktin ili GAPDH
smatra se da se njihova ekspresija ne mijenja s promjenom uvjeta u okolini omoguava samo relativnu usporedbu ekspresije ispitivanog i referentnog gena

Pouzdana kvantifikacija mogua je samo u podruju eksponencijalne amplifikacije

semikvantitativna metoda

kompetitivni RT-PCR

u reakciju se dodaje poznata koliina referentne DNA omoguava izraavanje rezultata u apsolutnim vrijednostima rezultat se izraava u odnosu na ukupnu DNA (RNA)

Lanana reakcija polimeraze u stvarnom vremenu je metoda izbora za kvantitativnu analizu DNA i RNA.

DNA-mikroip tehnologija

Podruja primjene DNA-mikroip tehnologije

otkrivanje novih gena dijagnostika otkrivanje novih lijekova
Farmakogenomika

toksikoloka istraivanja
Toksikogenomika
GeneChip Human Genome U133 Set
preko 1.000.000 oligonukleotida koji identificiraju 39.000 specifinih transkripata 33.000 gena

DNA-mikroip analiza ekspresije gena

Fluorescentna in situ hibridizacija (FISH)