UNIVERSIDAD AUTNOMA DEL ESTADO DE MXICO FACULTAD DE QUMICA QUMICO FARMACUTICO BILOGO LABORATORIO DE BIOFARMACIA REPORTE DE LA PRCTICA NO.

1 VALIDACIN DE UN MTODO BIONALTICO

INTEGRANTES: LILIAN GALINDO GMEZ YUNUEN GAMA DOMINGUEZ EDUARDO GMEZ RUIZ MARIAN JERUSALEN SANCHEZ VEGA EQUIPO: GRUPO: 82

1/MARZO/2013

PRCTICA NO. 1: VALIDACIN DE UN MTODO BIONALTICO OBJETIVO Validar un mtodo espectrofotomtrico, mediante la concentracin de salicilatos existentes en la orina. HIPTESIS El mtodo bionaltico que utilizaremos para la determinacin de salicilatos en orina, cumple con los requisitos. MARCO TERICO La validacin de un mtodo es un requisito importante en la prctica de los anlisis qumicos. Sin embargo, se suele considerar a la validacin de un mtodo como algo que solamente se puede hacer en colaboracin con otros laboratorios y en consecuencia, no se hace. Mtodo bionaltico: conjunto de todos los procedimientos involucrados en la obtencin, tratamiento, almacenamiento y anlisis de muestras (especmenes) biolgicas para la determinacin cuantitativa de una sustancia en una matriz biolgicas determinada. Validacin de mtodos bionalticos: establecimiento de la evidencia documentada de que un mtodo bionaltico es lo suficientemente fiable para la obtencin de resultados precisos y exactos dentro de las especificaciones de calidad establecidas previamente. La validacin de los mtodos se realiza cuando: *La medicin analtica es importante (costo, salud, remediacin) *Por la obligacin profesional del analista: el cliente espera confiar en los resultados informados y generalmente los cuestiona cuando aparece algn conflicto. *Se desarrolla un nuevo mtodo *Se revisa un mtodo ya establecido para mejorar o extender a uno nuevo Los diferentes parmetros que se miden para saber cual es el desempeo de los trabajadores son: Linealidad: denominada normalmente como curva patrn o curva de calibracin. La linealidad del mtodo es su capacidad para obtener (dentro de cierto intervalo) resultados que son directamente proporcionales a la concentracin en la muestra de la sustancia que se pretende analizar. Intervalo: el intervalo de un mtodo bioanaltico est definido por las concentraciones comprendidas entre los niveles de concentracin superior e inferior de la sustancia, en el cual se ha demostrado que el mtodo es preciso, exacto y lineal.

 Exactitud: capacidad de un mtodos para producir resultados lo ms prximos posibles a los valores que son aceptados convencionalmente como verdaderos o reales. Precisin: grado de dispersin de los resultados analticos a su valor medio. Es una medida de cun cerca estn los resultados unos de otros, generalmente se expresa por medidas como la desviacin estndar. Las dos medidas ms comunes son repetibilidad y reproducibilidad. Repetibilidad: da una idea del tipo de variabilidad que se puede esperar cuando el mtodo es desarrollado por un mismo analista en un mismo equipo a los largo de un periodo de tiempo corto. Ej., la variabilidad esperada entre los resultados cuando la muestra es analizada por duplicado. Limite de repetibilidad r: el cual le permite al analista decidir si es significativa la diferencia entre anlisis duplicados de una muestra, realizados en condiciones de repetibilidad. Reproducibilidad: la precisin ms grande esperada. Una muestra analizada por varios laboratorios. Formalmente, excluye la variacin respecto al tiempo. Lmite de reproducibilidad R: el cual le permite al analista decidir si es significativa la diferencia entre anlisis duplicados de una muestra, realizados en condiciones de reproducibilidad. La repetibilidad y la reproducibilidad, dependen de la concentracin del analito y en consecuencia, deberan determinarse para varias concentraciones.

Para evaluar la ejecucin de la validacin del mtodo en 1991 Lang y Bolton proporcionaron la primera estrategia global de validacin que aun se acepta y se compone de cuatro elementos: Calificacin del personal: antes de iniciar la validacin del mtodo, se efecta una pre-validacin por un analista primario. Esto provee al analista la oportunidad de obtener experiencia prctica con el mtodo ayudndole a identificar las condiciones crticas. En este punto se recomienda establecer el rango ptimo de la curva estndar y numero de calibradores, as como de optimizar el esquema de extraccin y recobro, para que los datos entren en los lmites de cuantificacin y para ayudarle a determinar si el procedimiento de extraccin es reproducible. Validacin prospectiva: este paso consta de cuatro ensayos analticos generados por dos analistas en dos das diferentes. Cada ensayo imita las condiciones analticas del estudio prospectivo y las expectaciones del tiempo de corrida. Esa estrategia ayuda al analista primario a desarrollar una rutina diaria usada durante el estudio y anticipar problemas potenciales en el ensayo. Estudio prospectivo: una vez que se ha determinado por las dos etapas anteriores que el mtodo cumple con los parmetros de validacin, se generarn curvas

estndar para determinar las concentraciones de frmaco en las muestras cada vez que se requiera. Anlisis estadsticos: el diseo estadstico permite revelar que los datos bioanalticos obtenidos a partir del mtodo son reproducibles y estn dentro de una rutina bsica.
Los salicilatos son frmacos con propiedades antiinflamatorias, analgsicas y antipirticas como resultado de la inhibicin de la enzima ciclooxigenasa (COX), que posibilita la sntesis de prostaglandinas y, mediadores de la inflamacin. Constituyen un grupo de compuestos derivados del cido saliclico. P. Trinder en 1954 desarroll un mtodo rpido para determinar la presencia de salicilatos en fluidos humanos empleando 1 ml (mililitro) de suero sanguneo. El mtodo se bas en la precipitacin de las protenas del suero al adicionar cloruro mercrico y luego nitrato frrico para crear un compuesto coloreado, midiendo posteriormente la absorbancia por espectrofotometra. La reaccin cuantitativa para la determinacin de salicilatos es por medio del mtodo de Trinder, este se puede aplicar a muestras como son orina, suero o plasma. **Mtodo de Trinder: precipita las protenas con HgCI2 y el color que aparece con el salicilato es acomplejado por el in Fe+3 como nitrato frrico. MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES Pipetas graduadas de 1, 2 y 5 ml. Pizeta y pauelos desechables Matraces volumtricos de 10 ml. Tubos de ensaye de 16x150 13x100 Espectrofotmetro Centrfuga Material biolgico: Orina. 1 L por equipo

REACTIVOS Agua destilada Reactivo de Trinder Salicilato de sodio

METODOLOGA

RESULTADOS EXPERIMENTALES Primer Anlisis de Exactitud y Precisin Datos del qumico: Lilian Galindo Gmez Datos de las tcnicas: Marian Jerusaln Snchez Vega/ Yunun Gama Domnguez Determinacin de la Longitud de onda a la cul se da una mxima absorbancia Se realizo un barrido entre 500 y 600 nm utilizando el blanco y la muestra de menor concentracin (Ver tabla 1) utilizando un equipo espectrofotomtrico con numero de serie 0249998, dando un resultado de 521nm. La cantidad de analito (Salicilato de sodio) pesada en la balanza analtica (nmero de serie 0327505) fue: Para la primera curva: 0.0036g (Ver tabla 1) Para la segunda curva: 0.0031g (Ver tabla 2)

Tabla 1. Absorbancias (medidas a 521nm) y concentraciones para la primera curva analtica Tubo 1 (Blanco=orina) 2 (5mL+1) 3 (4mL+1) 4 (3mL+1) 5 (2mL+1) Absorbancia 0.0 0.797 0.522 0. 428 0.314 Concentracin (mg/mL) 0.0 0.3 0.24 0.18 0.12

Grfica 1. Absorbancia vs concentracin. Primera curva analtica

Curva 1 Absorbancia vs Concentracin

1 0.8 Absorbancia 0.6 0.4 0.2 0 -0.2 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 Concentracin mg/mL

Tabla 2. Absorbancias (medidas a 521nm) y concentraciones para la primera curva analtica Tubo 1 (Blanco=orina) 2 (5mL+1) 3 (4mL+1) 4 (3mL+1) 5 (2mL+1) Absorbancia 0.0 0.419 0.321 0.249 0.163 Concentracin (mg/mL) 0.0 0.258 0.20 0.15 0.1

Grfica 1. Absorbancia vs concentracin. Segunda curva analtica

Curva 2 Absorbancia vs Concentracin

0.5 Absorbancia 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 0.05 0.1 0.15 Concentracin mg/mL 0.2 0.25 0.3

Tabla 3 Comparacin entre la curva 1 y la curva 2 por medio de mtodos estadsticos Curva 1 2.571 -0.025 0.067 0.966 0.933 0.21 31.9% Curva 2 1.60 0.004 0.058 0.999 0.998 0.177 32.76%

Pendiente Ordenada al origen Desviacin estndar r r2 Media C.V.

Interpretacin de las grficas y de los anlisis estadsticos para el primer anlisis:

Linealidad: Debido a que los valores de r y r2 para ambos casos son mayores que 0.9 se considera que el mtodo es lineal. Proporcionalidad: Debido a que los valores para la ordenada al origen son diferentes de cero, el mtodo se considera no proporcional; aunque es necesario confirmar con un anlisis estadstico de T de student (Ver tabla 7). Precisin y repetitividad: Debido a que los resultados determinados en ambos casos para el coeficiente de variacin son mayores de 3% no se puede considerar al mtodo como preciso, ni como repetitivo. Precisin y reproducibilidad: Ver tabla 8 para el contraste entre las curvas para el primer y el segundo anlisis.

Segundo anlisis de exactitud y precisin Datos del qumico: Angel Omar Vilchis Rito Datos del tcnico: Eduardo Gmez Ruiz Determinacin de la Longitud de onda a la cul se da una mxima absorbancia Se realizo un barrido entre 500 y 600 nm utilizando el blanco y la muestra de menor concentracin (Ver tabla 4) utilizando un equipo espectrofotomtrico con numero de serie 0257130, dando un resultado de 515nm. Nota: para unificar los valores de absorbancias a nivel grupal se acord medir las muestras a 520nm para ambas curvas La cantidad de analito (Salicilato de sodio) pesada en la balanza analtica (nmero de serie 0327505) fue: Para la primera curva: 0.0033g (Ver tabla 4) Para la segunda curva: 0.0033g (Ver tabla 5)

Tabla 4. Absorbancias (medidas a 520nm) y concentraciones para la primera curva analtica (Segundo anlisis) Tubo 1 (Blanco=orina) 2 (5mL+1) 3 (4mL+1) 4 (3mL+1) 5 (2mL+1) Absorbancia 0.0 0. 492 0.398 0.300 0.187 Concentracin (mg/mL) 0.0 0.275 0.22 0.165 0.11

Grfica 3. Absorbancia vs concentracin. Primera curva analtica (Segundo anlisis)

Curva 1 Absorbancia vs Concentracin

0.6 0.5 Absorbancia 0.4 0.3 0.2 0.1 0 -0.1 0 0.05 0.1 0.15 0.2 Concentracin mg/mL 0.25 0.3

Tabla 5. Absorbancias (medidas a 520nm) y concentraciones para la segunda curva analtica (segundo anlisis) Tubo 1 (Blanco=orina) 2 (5mL+1) 3 (4mL+1) 4 (3mL+1) 5 (2mL+1) Absorbancia 0.0 0.505 0.415 0.318 0.225 Concentracin (mg/mL) 0.0 0.275 0.22 0.165 0.11

Grfica 4. Absorbancia vs concentracin. Segunda curva analtica (Segundo anlisis)

Curva 2 Absorbancia vs Concentracin

0.6 0.5 Absorbancia 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 0.05 0.1 0.15 Concentracin mg/mL 0.2 0.25 0.3

Tabla 6 Comparacin entre la curva 1 y la curva 2 por medio de mtodos estadsticos (Segundo anlisis) Curva 1 1.841 -0.010 0.061 0.999 0.999 0.192 31.77% Curva 2 1.703 0.037 0.061 0.999 0.999 0.192 31.77%

Pendiente Ordenada al origen Desviacin estndar r r2 Media C.V.

Interpretacin de las grficas y de los anlisis estadsticos para el primer anlisis: Linealidad: Debido a que los valores de r y r2 para ambos casos son mayores que 0.9 se considera que el mtodo es lineal. Proporcionalidad: Debido a que los valores para la ordenada al origen son diferentes de cero, el mtodo se considera no proporcional; aunque es necesario confirmar con un anlisis estadstico de T de student (Ver tabla 7). Precisin y repetitividad: Debido a que los resultados determinados en ambos casos para el coeficiente de variacin son mayores de 3% no se puede considerar al mtodo como preciso, ni como repetitivo. Precisin y reproducibilidad: Ver tabla 8 para el contraste entre las curvas para el primer y el segundo anlisis.

Tabla 7 Confirmacin de la proporcionalidad de ambos procesos por medio de un anlisis estadstico de T de student. Se realizo el anlisis estadstico de T de student en Excel 2010 con los valores de ordena al origen de las cuatro curvas experimentales representativas para los dos anlisis realizados. Se hizo la prueba con una significancia del 0.05% (teniendo as un 95% de certeza en la interpretacin de nuestros resultados) obteniendo los siguientes datos:
Prueba t para medias de dos muestras emparejadas Media Varianza Observaciones Coeficiente de correlacin de Pearson Diferencia hipottica de las medias Grados de libertad Estadstico t P(T<=t) una cola Valor crtico de t (una cola) P(T<=t) dos colas Valor crtico de t (dos colas) Variable 1 -0.0105 0.0004205 2 1 0 1 -2.66666667 0.11420025 6.31375151 0.2284005 12.7062047 Variable 2 0.0135 0.0011045 2

Interpretacin del anlisis estadstico de t de student: Debido a que el valor estadstico de t es menor que el valor crtico de t podemos decir que hay evidencia suficiente para asegurar que el proceso si es proporcional para un porcentaje de confianza del 95%. Tabla 7 Determinacin de precisin y reproducibilidad, relacin entre ambos anlisis experimentales. Media Anlisis 1, curva 1 Anlisis 1, curva 2 Anlisis 2, curva 1 Anlisis 2, curva 2 Promedio total 0.21 0.177 0.192 0.192 0.192 Desviacin estndar 0.067 0.058 0.061 0.061 0.061 Coeficiente de variacin 31.9% 32.76% 31.77% 31.77% 32.05%

Interpretacin de los resultados: Debido a que el coeficiente de variacin de los datos es demasiado alto no podemos considerar al mtodo como preciso, ni como reproducible. CONCLUSIONES Una vez hechas las interpretaciones de los grficos y clculos de los parmetros matemticosestadsticos, se llego a la conclusin de que nuestro mtodo espectrofotomtrico para la determinacin de salicilatos en orina es lineal y proporcional, mientras que los analistas tienen un buen grado de exactitud durante una prueba individual (realizada en un nico da), ya que ambas grficas muestran un comportamiento semejante para ambos anlisis, efectuados cada uno por duplicado. Sin embargo una vez que se hacen los contrastes entre ambos anlisis, realizados de manera independiente (en das diferentes) se tienen resultados que determinan que el mtodo no puede ser considerado preciso, ni repetitivo, ni reproducible. Esto se puede deber a un error sistemtico, incluso propio de los analistas, es difcil hablar acerca del uso de equipos y materiales diferentes, ya que aunque fue el caso en la prctica; por concepto el grado de precisin y reproducibilidad se maneja por la concordancia entre determinaciones independientes realizadas bajo condiciones diferentes. Aunque los analistas cumplen con exactitud, y el mtodo fue evaluado como lineal y proporcional; no se puede validar el proceso del todo ya que es necesaria una mejora en la precisin; o bien repetir la validacin del mtodo para evaluar el grado de repetitividad de cada uno de los analistas identificando si hay una concordancia entre los resultados obtenidos para evaluar la posibilidad de establecer un margen de error interno.

CUESTIONARIO: Referencias: http://www.plataformadeoncologia.com/imagenes/Dra_%20Leal.pdf http://www.suelos.org.ar/adjuntos/validacion_metodos_analiticos.pdf http://www.bvsde.paho.org/bvstox/e/fulltext/marcha_toxicologica.pdf