RINGKASAN OPTIMASI FORMULA SEDIAAN SIRUP MUKOLITIK IN VITRO FRAKSI TERSTANDAR BUNGA KEMBANG SEPATU (Hibiscus rosa-sinensis L.

)
DISERTASI Untuk memenuhi sebagian persyaratan mencapai derajad Doktor (Dr.) pada program Doktor

Diajukan Oleh: MIMIEK MURRUKMIHADI 08/276481/SFA/00032

Kepada PROGRAM PASCASARJANA PROGRAM STUDI ILMU FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS GADJAH MADA YOGYAKARTA 2012

ABSTRACT Hibiscus Flower (Hibiscus rosa-sinensis L.) has been used traditionally against cough. It was potential as secretolytic agent, but a standardized syrup is still needed in order to obtain optimum pharmalogycal effect. The objective of this research was to obtain an optimum standardized fraction syrup formula of Hibiscus flower by Simplex Lattice Design Method, as well as to determine its in vitro mucolytic activity and stability both physically and chemically. Standardized fraction of Hibiscus flower was obtained by macerating the flower with petroleum ether, followed by 70% ethanol solution, and fracinationated with ethyl acetate. The fraction containing alkaloid was defined as standardized fraction. Optimalitation of the syrup containing standardized fraction obtained by Simplex Lattice Design software Design Expert method version 7.1. Marker compound (alkaloid) isolation of Hibiscus flower was done by Thin Layer Chromatrography (TLC), Vaccum Liquid Chromatography (VLC), Preparative Thin Layer Chromatrography (PTLC). The marker was then identified according to UV-Vis, IR, GCMS, and NMR data. The marker concentration was determined by KLT densitometer. The syrup obtained from optimation process was tested by in vitro for its mucolytic activity, and also tested for its physical and chemical properties, its resistence to microbial contamination as well as respondent tolerability. The result of the study shows that the marker obtained contains 4 compounds, identified as Glycine,N,N-dimethyl, methyl ester ; 2-propanamine,N,N-dimethyl ; 1,2-Ethane diamine ; N,N,-dimethyl Glycine while Glycine,N,N-dimethyl, methyl ester and 1,2-Ethane diamine are the major components (53.83 %, 30.96 %). The optimum formula was defined as glycerin (37.13%), sorbitol solution 70% (49.32%), CMC-Na 0.5% (13.54%). Physical response of the optimum formula from this study was comparable to the prediction especially on viscosity and pouring comfortability but not in taste and acidity. Syrup formula was less stabil in 4 weeks of storage viewed in the acidity and viscosity level. Standardized syrup showes in vitro mucolytic activity, and at 2.0% equal to acetylcystein syrup 0.1%. The presence of marker syrup was undetectable after storing at 27oC, 40 oC, 55 oC, and 70 oC for 4 weeks. Key word: hibiscus flower, optimation of syrup, standardized fraction, mucolytic, in vitro Pendahuluan Beberapa penyakit seperti bronkitis dan infeksi saluran nafas menghasilkan mukus (Ikawati, 2006). Peningkatan produksi mukus terjadi pada kondisi tersebut, dan mukus yang diproduksi sifatnya kental, sehingga hal ini berpengaruh pada

pernafasan. Secara fisiologis silia tidak mampu mengeluarkan mukus karena terlalu kental (Hitner and Nagle, 1999). Mukus kental dapat dikeluarkan melalui proses pengenceran. Bunga kembang sepatu (Hibiscus rosa-sinensis L.) termasuk salah satu obat tradisional yang dipakai masyarakat sebagai peluruh dahak atau pengencer mukus (Departemen Kesehatan, 1985). Banyak penelitian terhadap kembang sepatu, akan tetapi penelitian mengenai formulasi fraksi dari bunga kembang sepatu sebagai mukolitik secara in vitro belum ada. Penelitian yang telah dilakukan antara lain Ekstrak etanolik bunga kembang sepatu mampu menghambat pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis yang sensitif dan resisten (Ruban and Gajalakshmi, 2012). Ekstrak etanolik akar kembang sepatu mempunyai aktivitas sebagai antiimplantasi (Vasudeva and Sharma, 2008). Ekstrak petroleum eter, hidroalkohol, dan kloroform bunga kembang sepatu mampu menurunkan tekanan darah (Siddiqui et al., 2006). Gauthaman et al. (2006) melaporkan khasiat bunga kembang sepatu dalam meningkatkan senyawa antioksidan endogen miokardial, sehingga berefek kardioprotektif. Penggunaan bunga kembang sepatu secara langsung dinilai tidak praktis, efektif, dan acceptable. Penggunaan dalam bentuk fraksi terstandar bunga kembang sepatu dinilai lebih efektif, sehingga perlu diformulasikan dalam sediaan sirup. Senyawa penanda (marker) merupakan suatu senyawa yang dapat dijadikan untuk menilai jaminan kualitas fraksi sebagai zat aktif. Dengan demikian fraksi akan mempunyai kualitas yang konstan.

Sirup merupakan bentuk sediaan cair yang mempunyai nilai lebih antara lain dapat digunakan oleh hampir semua usia, cepat diabsorpsi, sehingga cepat menimbulkan efek. Fraksi mempunyai karakteristik rasa yang tidak enak dan mengandung bagian-bagian yang tidak larut. Bahan-bahan tambahan sangat diperlukan untuk membuat sediaan sirup yang acceptable dari fraksi bunga kembang sepatu. Gliserin ditambahkan sebagai kosolven untuk zat aktif yang sukar larut. Bagian fraksi yang sukar larut didispersikan dengan penambahan CMC Na. Rasa yang tidak enak dikurangi dengan penambahan sorbitol. Komposisi yang proporsional antara ketiga bahan tersebut perlu dicari untuk menghasilkan sirup yang acceptable. Simplex Lattice Designe (SLD) merupakan salah satu metoda yang sesuai untuk optimasi formula sirup fraksi dengan ketiga komponen tersebut (Bolton, 1996). Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian mengenai optimasi formula sediaan sirup mukolitik fraksi terstandar bunga kembang sepatu (Hibiscus rosa-sinensis L.). Adanya penelitian secara ilmiah tentang obat tradisional diharapkan mempercepat penerimaan oleh masyarakat luas dan kalangan medis sehingga dapat dipertanggungjawabkan secara ilmiah sekaligus membantu kelestariannya. Metodologi Penelian Bahan MSD), IR (Perkin Elmer Spectrum 100), NMR (Bruker Avance 400 NMR spectrometer Rheinstetten, Germany) dan KLT-densitometer (CAMAG TLC Scanner 3).

Jalan Penelitian 1. Determinasi tanaman 2. Pembuatan fraksi terstandar dengan cara maserasi dengan etanol 70% dan fraksinasi dengan etilasetat. 3. Isolasi senyawa penanda (alkaloid) dengan VLC dan KLTP dan penetapan kadar alkaloid dengan KLT-densitometri. 4. Identifikasi senyawa dengan spektrofotometer UV-Vis, IR, GC-MS dan NMR. Selanjutnya fraksi etanolik disebut sebagai fraksi terstandar. 5. Uji aktivitas mukolitik secara in vitro dengan menghitung penurunan viskositas mukus dengan larutan uji (larutan mukus dapar fosfat pH7 dan ekstrak etanolik, fraksi etanolik dan fraksi etilasetat) terhadap larutan mukus, dengan menggunakan viskometer Ostwald. 6. Optimasi sirup fraksi terstandar dengan mengkombinasikan gliserin, sorbitol dan CMC Na dengan menggunakan metode Simplex Lattice Design (SLD). 7. Uji sifat fisik sirup hasil optimasi. 8. Uji stabilitas kimiawi sirup hasil optimasi dengan menggunakan suhu 27, 40, 55, dan 700C. 9. Uji aktivitas mukolitik secara in vitro sirup hasil optimasi.

Analisa Data Data yang diperoleh (aktivitas mukolitik secara in vitro, sifat fisik sirup fraksi terstandar, aktivitas mukolitik secara in vitro) diuji dengan Anova dan t-tes dengan taraf kepercayaan 95%. Stabilitas kimia sirup dianalisa secara deskriptif. Hasil dan Pembahasan Setelah dicocokkan dengan acuan baku (Backer and Van den Brink, 1965), maka tanaman tersebut adalah Hibiscus rosa-sinensis L. Rendemen ekstrak yang didapat adalah sebanyak 32,09 %, kemudian rendemen fraksi etanolik sebesar 84,50% dan fraksi etilasetat sebesar 13,91 %. Ekstrak etanolik kadar 1,00, 1,25, dan 1,50% menunjukkan adanya aktivitas mukolitik secara in vitro, dan pada kadar 1,00% menunjukkan aktivitas mukolitik yang setara dengan aktivitas mukolitik asetilsistein 0,10%. Viskositas mukus dengan adanya fraksi etanolik dari ekstrak etanol bunga kembang sepatu menunjukkan adanya penurunan dibandingkan dengan kontrol negatif (lebih kecil), sehingga dapat diartikan bahwa fraksi etanolik dengan kadar 0,60, 0,80 dan 1,00% mempunyai aktivitas mukolitik secara in vitro. Setelah dianalisis dengan anova dan uji t LSD, maka didapatkan hasil bahwa viskositas dengan variasi kadar fraksi etanolik berbeda bermakna dengan kontrol negatif. Hal ini mempunyai arti bahwa fraksi etanolik dengan kadar 0,60, 0,80, dan 1,00% mempunyai aktivitas mukolitik dengan menurunkan mukus secara in vitro dan setara dengan kontrol positif (asetilsistein 0,10%). Hal ini menunjukkan bahwa fraksi etanolik lebih efektif dari pada ekstrak etanolik. Fraksi etilasetat 0,60, 0,80, dan 1,00% mempunyai viskositas yang lebih kecil daripada

kontrol negatif, artinya fraksi etilasetat pada kadar tersebut berefek sebagai mukolitik. Setelah diuji dengan anova dan diteruskan dengan uji t LSD hasilnya berbeda signifikan, sehingga dapat dikatakan bahwa secara in vitro fraksi etilasetat pada kadar tersebut dapat menurunkan viskositas mukus, walaupun tidak ada kadar fraksi etilasetat yang mempunyai viskositas yang tidak berbeda bermakna dengan kontrol positif (asetilsistein 0,10%) yang artinya secara in vitro fraksi etilasetat belum ada yang mempunyai aktivitas mukolitik yang setara dengan aktivitas mukolitik asetilsistein 0,10%. Gambar 1 (d) terlihat hasil pemisahan yang baik. Alkaloid terpisah dari senyawa lain serta terbentuk noda bulat panjang berwarna merah setelah disemprot dengan pereaksi Dragendorff. Noda terletak pada hRf 13. Penggunaan fase gerak etilasetat : metanol 1:5 menghasilkan noda yang lebih baik dibanding dengan fase gerak yang lain (Gambar 1a, 1b, 1c, 1e).
100

9 0

hRf

8 0 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 0

(a) (b) (c) (d) (e) Gambar 1. Hasil pemisahan dengan berbagai variasi fase gerak: (a) toluen : etilasetat : dietilamin (7 : 2: 1); (b) etilasetat : metanol (9 : 1); (c) etilasetat : metanol (1:1); (d) etil asetat : metanol (1:5); (e) etilasetat : metanol (1:9)

Fraksinasi dengan menggunakan metode Vacuum Liquid Chromatography (VLC) menghasilkan 7 fraksi dan fraksi 6 dan 7 yang mengandung alkaloid sebagai senyawa penanda dengan kadar sebanyak 0,35 0,03% yang ditentukan dengan KLT-densitometer. Isolat alkaloid teridentifikasi sebagai senyawa Glycine,N,N-dimethyl, methyl ester ; 2-propanamine,N,N-dimethyl ; 1,2-Ethane diamine ; dan N,N,dimethyl Glycine. Berdasarkan atas data GC-MS komponen terbesar adalah Glycine,N,N-dimethyl, methyl ester dan 1,2-Ethane diamine. Dalam penelitian ini belum dapat dilakukan uji aktivitas mukolitik pada senyawa alkaloid karena dalam isolat terdapat 4 senyawa. Dilihat dari strukturnya maka tidak ada yang mirip dengan asetilsistein, sehingga senyawa penanda dalam bunga kembang sepatu bukan merupakan senyawa yang berkhasiat. Formula optimum sirup ditentukan dengan data sifat fisik tujuh formula sirup pada minggu ke-0. Penentuan formula optimum dilakukan dengan metode Simplex Lattice Design dengan software Design Expert versi 7.1. Karakteristik sifat fisik sirup yang digunakan dalam penetapan formula optimum adalah viskositas, waktu tuang, tanggaanp responden, dan pH. Berdasarkan analisis dengan menggunakan software Design Expert versi 7.1 untuk memprediksi formula optimum sirup fraksi terstandar bunga kembang sepatu diperoleh dihasilkan superimposed dari contour plot respon viskositas, waktu tuang, derajat keasaman, dan tanggapan responden sirup fraksi terstandar bunga kembang sepatu seperti yang terlihat pada gambar 2. Superimposed yang diperoleh menunjukkan daerah yang berwarna kuning yang menunjukkan daerah

yang memberikan respon optimum. Pada daerah tersebut didapatkan satu prediksi formula optimum dengan nilai desirability sebesar 0,994 (gambar 2).

Gambar 2. Superimposed dari contour plot respon viskositas, waktu tuang, derajat keasaman, dan tanggapan responden sirup fraksi terstandar bunga kembang sepatu

Komposisi formula optimum yang diperoleh dari analisis menggunakan software Design Expert versi 7.1 adalah gliserin sebesar 37,13%; larutan sorbitol 70% sebesar 49,32%; dan mucilago CMC-Na 0,5% sebesar 13,54%, Prediksi respon yang diperoleh dari prediksi formula optimum yaitu viskositas sebesar 7,28 mPaS, waktu tuang sebesar 2,98 detik, pH sebesar 3,55, dan tanggapan responden sebesar 3,29. Prediksi respon yang diperoleh dari analisis menggunakan software Design Expert versi 7.1 selanjutnya dibandingkan dengan respon yang diperoleh pada percobaan. Formula optimal yang didapat dari software Design Expert dibuat dan dilakukan evaluasi sifat fisik untuk dibandingkan dengan sifat fisik formula

prediksi. Analisis yang digunakan adalah one sample t-test dengan taraf kepercayaan 95%. Berikut ini adalah hasil one sample t-test untuk viskositas, pH, dan waktu tuang, dan tanggapan responden formula optimal (tabel 1). Respon viskositas dan waktu tuang berbeda tidak bermakna antara

prediksi software Design Expert versi 7.1 dengan hasil percobaan, sedangkan respon pH dan tanggapan responden berbeda bermakna antara prediksi software Design Expert versi 7.1 dengan hasil percobaan.
Tabel 1. Hasil Uji One Sample T-test Formula Optimal Sirup Hasil Prediksi Software Dibandingkan dengan Hasil Percobaan

Respon Viskositas (mPas) pH waktu tuang (detik) Tanggapan responden

Nilai prediksi 7,27637 3,29053 2,97663 3,54694

Nilai percobaan 7,33 3,423 2,963 3,0625

Signifikansi 0,282 0,000 0,598 0,000

Keterangan Berbeda tidak bermakna Berbeda bermakna Berbeda tidak bermakna Berbeda bermakna

Formula optimum sirup fraksi terstandar bunga kembang sepatu, kemudian diuji aktivitas mukolitiknya secara in vitro dilihat dari penurunan viskositas sirup dalam larutan mukus dapar 20%. Hasilnya dapat dilihat dalam tabel 2 berikut.
Tabel 2. Aktivitas Mukolitik secara In Vitro (Viskositas) Sirup Fraksi Terstandar Bunga Kembang Sepatu Dengan Berbagai Konsentrasi

Formula D E F G H

Viskositas (mPaS.) (SD) 1,780,05 1,370,05 1,280,04 1,220,03 1,140,06

Keterangan : Formula D: sirup hasil optimasi

Formula E: sirup hasil optimasi dengan fraksi terstandar 1,20% Formula F: sirup hasil optimasi dengan fraksi terstandar 1,60% Formula G: sirup hasil optimasi dengan fraksi terstandar 2,00% Formula H: sirup hasil optimasi dengan asetilsistein 0,10%

Tabel 2 menunjukkan aktivitas mukolitik secara in vitro, dalam hal ini adalah viskositas sirup fraksi terstandar bunga Kembang Sepatu dengan konsentrasi 1,20%, 1,60%, dan 2,00% dibandingkan dengan aktivitas mukolitik sirup asetilsistein 0,10%. Semakin tinggi konsentrasi fraksi terstandar bunga Kembang Sepatu yang digunakan, semakin kecil viskositas sirup. Hal ini berarti bahwa semakin banyak fraksi terstandar yang digunakan maka aktivitas mukolitik secara in vitro semakin meningkat. Setelah diuji dengan t-tes dengan taraf kepercayaan 95 % maka hasilnya adalah sirup formula hasil optimasi yang mengandung fraksi terstandar kadar 1,20; 1,60; dan 2,00% mempunyai aktivitas mukolitik secara in vitro dengan kadar fraksi terstandar 2,00% mempunyai aktivitas mukolitik setara dengan aktivitas mukolitik sirup dengan asetilsistein 0,10% secara in vitro. Stabilitas sirup fraksi terstandar bunga kembang sepatu diketahui juga dengan menyimpan sirup pada suhu 270C, 400C, 550C, dan 700C selama 4 minggu. Keberadaan alkaloid setelah sirup fraksi terstandar bunga kembang sepatu disimpan dalam suhu 270C, 400C, 550C, dan 70 0C ditentukan dengan KLTdensitometer. Anlisis penentuan kadar digunakan metode KLT-densitometri, yaitu dengan melakukan scanning bercak pada 200 nm sehingga didapatkan suatu nilai hubungan antara AUC dengan kadar seri larutan baku sehingga diperoleh suatu persamaan regresi sebagai persamaan kurva baku Y = A+BX, untuk perhitungan

kuantitatif terhadap kadar senyawa dengan memasukkan nilai AUC yang didapat sebagai nilai Y, pada persamaan. Namun pada senyawa alkaloid dalam sediaan sirup fraksi ini tidak dapat ditentukan secara KLT-densitometri karena harga hRf senyawa penanda pada fraksi yang telah diformulasikan dalam sediaan sirup mengalami perubahan. Dilihat dari nilai hRf yang nampak, maka senyawa

penanda mengalami peningkatan polaritas. Hasilnya dapat dilihat dalam gambar 3, sehingga dapat dikatakan bahwa suhu berpengaruh pada keberadaan alkaloid, dengan naiknya suhu, alkaloid mengalami kerusakan. Suhu berpengaruh pada kecepatan reaksi. Semakin tinggi temperatur, maka semakin besar tetapan kecepatan suatu reaksi atau reaksi semakin cepat. Kenaikan suhu 100C dapat menyebabkan kenaikan kecepatan reaksi sebesar 5,5 kali (Yoshika and Stella, 2002), sehingga penyimpanan pada suhu yang tinggi menyebabkan kerusakan alkaloid. Kemungkinan lain bahwa adanya komponen sirup juga berpengaruh pada keberadaan alkaloid sebagai senyawa penanda yaitu karena kemungkinan terjadi interaksi sehingga tidak mempunyai hRf yang sama. Di dalam sirup terdapat asam tartrat yang merupakan asam lemah yang akan bereaksi dengan N dari alkaloid yang bersifat basa lemah sehingga menghasilkan garam lemah yang kelarutannya kecil, jadi tidak dapat terelusi dengan baik.

hRf
100

90 8 0 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 0

1 2 3 4 5 Kiri

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Kanan

Gambar 3. Hasil Penotolan Seluruh Sampel /sirup yang mengandung fraksi terstandar (kanan 6-25), larutan baku (kiri 1-5) dengan fase diam silika gel 60 F254 dan fase gerak etilasetat : metanol (1:5)

Kesimpulan 1. Fraksi terstandar bunga kembang sepatu (Hibiscus rosa-sinensis L.) dengan kadar 0,60, 0,80, dan 1,00% mempunyai aktivitas mukolitik dengan adanya penurunan nilai viskositas larutan mukus usus sapi secara in vitro dan mempunyai aktivitas mukolitik setara dengan aktivitas mukolitik asetilsistein 0,10%. 2. Fraksi fraksi terstandar bunga kembang sepatu mengandung senyawa alkaloid sebagai senyawa penanda yang merupakan alkaloid golongan alifatis yang mengandung gugus hidroksil, gugus amina, ikatan karbon rangkap dua dan ikatan karbon rangkap tiga. Senyawa alkaloid dengan kadar 0,35 0,03% dalam fraksi terstandar terdiri dari 4 senyawa, teridentifikasi sebagai

Glycine,N,N-dimethyl, methyl ester ; 2-propanamine,N,N-dimethyl ; 1,2Ethane diamine ; N,N,-dimethyl Glycine. Berdasarkan atas data GC-MS komponen terbesar adalah Glycine,N,N-dimethyl, methyl ester dan 1,2-Ethane diamine. 3. Komposisi formula optimum sirup fraksi terstandar bunga kembang sepatu adalah gliserin sebesar 37,13%; larutan sorbitol 70% sebesar 49,32%; dan mucilago CMC-Na 0,5% sebesar 13,54%. Formula optimum yang diperoleh mempunyai respon viskositas dan derajat keasaman yang berbeda dengan prediksi respon yang diberikan oleh software Design Expert versi 7.1, sedangkan untuk respon waktu tuang dan respon tanggapan responden menunjukkan hasil yang sama. Sirup fraksi terstandar bunga kembang sepatu kurang stabil selama 4 minggu penyimpanan ditinjau dari respon derajat keasaman dan waktu tuang. Setelah sirup fraksi terstandar disimpan selama 4 minggu pada suhu 270C, 400C, 550C, dan 700C, maka keberadaan alkaloid tidak bisa dideteksi dengan KLT-densitrometer. 4. Sirup fraksi terstandar dengan kadar 1,20; 1,60; dan 2,00% mempunyai aktivitas mukolitik secara in vitro dan sirup dengan kadar 2,00% mempunyai aktivitas mukolitik yang sama dengan aktivitas mukolitik sirup asetilsistein 0,10%. Daftar Acuan Backer, C. A., dan Van den Brink, B. R. C., 1965, Flora of Java (Spermatophytales Only), Vol. I, 3-6, 32-34, 41, 239-240, WoltrsNoordhoff, Groningen, The Netherlands.

Bolton, S., 1997, Pharmaceutical Statistics Practical and Clinical Application, 3rd Edition, 610-619, Marcel Dekker Inc., New York. Departemen Kesehatan, 1985, Tanaman Obat Indonesia, Jilid Pertama, 44, Jakarta, Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Gauthaman, K.K., Saleem, M.T.S., Thanislas, P.T., Prabhu, V.V., Krishnamoorthy, K.K., Devaraj, N.S., and Somasundaram, J.S., 2006, Cardioprotective Effect of the Hibiscus rosa sinensis Flowers in An Oxidative Stress Model of Myocardial Ischemic Reperfusion Injury in Rat, BMC Complementary and Alternative Medicine, 6, 32-39. Hitner, H. and Nagle, B., 1999, Basic Pharmacology, Fourth Edition, 409, Glencoe McGraw-Hill, New York. Ikawati, Z., 2006, Farmakoterapi Penyakit Sistem Pernafasan, Cetakan Pertama, 27, 29-30, 32, Laboratorium Farmakoterapi dan Farmasi Klinik Bagian Farmakologi dan Farmakoterapi Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Ruban, P. And Gajalakshmi, K., 2012, In Vitro Antibacterial Activity of Hibiscus rosa-sinensis Flower Extract Against Human Pathogens, Asian Pasific Journal of Tropical Biomedicine, 2, 5, p. 399-403. Siddiqui, A.A., Wani, S.M., Rajesh, R., and Alagarsamy, V., 2006, Phytochemical and Pharmacological Investigation of Flowers of Hibiscus rosa-sinensis Linn, Indian J. Pharm. Sci., 68 (1), 127-130. Vasudeva, N. and Sharma, S.K., 2008, Post-Coital Antifertility Activity of Hibiscus rosa-sinensis Linn. Roots, eCAM, 5 (1), 91-9. Yoshioka, S. and Stella, V.J., 2002, Stability of Drugs and Dosage Forms, 30-39, Kluwer Academic Publishers, New York.