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MANUAL DE LABORATORIO MICROOBIOLOGIA INDUSTRIAL

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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA

MANUAL DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

BOGOTA, ENERO 2012

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PRCTICA No. 1 ELABORACIN DE JEREZ 1. INTRODUCCIN El VINO es un lquido que se obtiene por fermentacin espontnea del jugo de uva fresca, es espontnea porque en la misma uva se encuentra la levadura responsable de este proceso Saccharomyces cerevisiae. El mosto o jugo de uva es un lquido que contiene de 70 a 80% de agua; el 20% restante est constituido por glucosa, tartrato, cido de potasio, taninos, sustancias colorantes, sustancias minerales, etc. La fermentacin alcohlica corresponde a la reaccin qumica efectuada por las levaduras, en que el azcar presente en la uva es transformado en alcohol (etanol), liberndose dixido de carbono y energa en forma de calor. El vino es una bebida moderadamente alcohlica. Cuando las levaduras han transformado todo el azcar en alcohol, la fermentacin se termina. C 6 H 12 O 6 2 C 2 H 6 O + 2 CO 2 Durante la fermentacin alcohlica los azcares del mosto son transformados por las levaduras (Saccharomyces cerevisiae) en etanol y CO2, obtenindose el vino. Dentro de los vinos propiamente dichos, elaborados de uvas se distinguen cinco clases: vinos aperitivos, vinos rojos (tintos), blancos, de postre y espumosos. Los contenidos de alcohol de las cinco clases de vinos, son distintos, los vinos espumosos y los vinos de mesa tintos y blancos tienen del 10 al 14% de alcohol, los vinos aperitivos y de postre contienen alrededor del 20% de alcohol. Determinados trminos especiales se utilizan para describir vinos: Vinos Ordinarios, son los que no contienen dixido de carbono e incluyen los de mesa, aperitivo y postre. Vinos espumosos: son los que se hicieron espumosos durante una fermentacin secundaria en la botella o en la cuba o bien se carbonataron. Vinos secos, son los que no contienen azcar o si la hay, su concentracin es tan pequea que no resulta fcil apreciarla por la captacin gustativa. 2. OBJETIVO Elaborar un jerez a pequea escala, que permita observar los cambios ocurridos durante la elaboracin de este producto. 3. MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO 3.1 Cepas Saccharomyces cerevisiae (250 mL en caldo Saboreaud) 3.2 Medios de cultivo (por grupo de trabajo) Agar Agar (20 mL) (filtracin y clarificacion) Agua peptonada (3 tubos taparrosca 16 x 150, con 4,5 mL c/u) diluciones

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3.3 Reactivos (por grupo de trabajo) Colorantes de Gram Meta Bisulfito de sodio al 10% (10 mL) 3.4 Materiales (por grupo de trabajo) 2 libras de Uvas pasas Botella de vino para el envasado final (1) Cmara de NeuBauer (1) Colador (1) Embudo de vidrio estril (1) Lminas Laminilla Papel filtro de celulosa (3) Pipeta de 1 mL (1) Pipeta de 10 mL (1) Pipeta de 5 mL (2) Pipeta pasteur (1) Tubos Falcon 50 mL (10) 3.5 Equipos Centrfuga Microscopio 4. PROCEDIMIENTO 4.1 Estrujado de las uvas, inicio de la fermentacin Seleccione las uvas pasas de acuerdo a su estado de sanidad Lleve las uvas al recipiente de vidrio llenando aproximadamente 3/4 partes del recipiente y adicione agua hasta aproximadamente parte

Haga un coloracin de Gram y un recuento en cmara del inculo de Saccharomyces

cerevisiae y adicione a las uvas, de manera que por cada mL de jerez haya una concentracin de 108 clulas ( 2 %)

Adicione 5 mL de metabisulfito de sodio al 10% para evitar la contaminacin, mezcle y deje incubando durante 4 das. No cierre hermticamente el recipiente. 4.2 Evaluacin del crecimiento de la levadura

Pasados estos das, realice coloracin de Gram, con el fin de determinar la presencia de
la levadura, la cual debe estar en gemacin, si no encuentra una alta poblacin de levadura, adicione Saccharomyces cerevisiae, en una proporcin del 3% del volumen final contenido en el recipiente.

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No olvide cerrar muy bien el recipiente y de almacenarlo en un lugar seco. 4.3 Primer trasiego

A los quince das de llevado a cabo el proceso, filtre con las toallas desechables y vuelva

a dejar en proceso fermentativo. Realice un recuento en cmara de Neubauer con el fin de estimar la poblacin de levaduras.

Adicione de 10-15 mL de agar-agar. 4.4 Filtracin y clarificacin Haga una coloracin de Gram para verificar si la levadura ha finalizado la fermentacin.

Despus de un mes, filtre a travs del papel desechable y papel filtro, con el fin de
purificar y darle el brillo caracterstico al vino. Con la ayuda de una probeta, deposite su jerez en varios tubos falcon de 50ml, llenndolos con un volumen igual para todos (45 ml). Entregue los tubos a los monitores, quienes centrifugaran los tubos a 7000 RPM por 5 minutos con el fin de retirar slidos suspendidos, clulas muertas y partculas.

Una vez centrifugados, realice una filtracin por membrana de 0.45 micras, con el fin de clarificar y dar el brillo caracterstico al jerez. La filtracin se realiza con la ayuda de una bomba de succin, vasos para filtracin de membrana y filtros de 0.45 micras. (recuerde que solo debe filtrar el jerez por la membrana de 0.45 micras despus de haber centrifugado, pues si se realiza antes de centrifugar, los slidos suspendidos y partculas, obstruirn el filtro, impidiendo un alto rendimiento de este. Determine las caractersticas organolpticas del producto y envase. 5. RESULTADOS Complete los siguientes datos: Prueba Coloracin de Gram Recuento en cmara de Neubauer Inculo Da 4 Da 15 Da 30 Da 45 Da 60

6. DISCUSIN 7. CONCLUSIONES

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8. PREGUNTAS DE COMPLEMENTACIN 9. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

1. Describa, cmo es la accin antioxidante del anhidro sulfuroso en los vinos?


2. Defina que es la acidez voltil, y para que se determina? 3. Cules son los criterios de seleccin de cepas de levaduras con capacidad enolgica? 4. Que efectos se pueden producir en el vino, por un exceso en el aireado? 5. Nombre dos enzimas que se pueden emplear en vinos y cul es su funcin? 6. Enumere cinco propiedades del anhidro sulfuroso o metabisulfito?

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PRCTICA NO. 2 IDENTIFICACIN BIOQUMICA DE Saccharomyces spp 1. INTRODUCCIN La identificacin de levaduras, est relacionada fundamentalmente con su caracterizacin macroscpica y microscpica, donde es importante verificar la presencia de estructuras como las ascosporas. En el caso del gnero Saccharomyces es necesario determinar las caractersticas de asimilacin y fermentacin de diversos azcares, as como su capacidad de tolerancia al etanol y su reaccin frente a la urea. Entre los aspectos morfolgicos considerados, se encuentran el tamao y la forma de las clulas, el modo de reproduccin o capacidad de sedimentacin. Entre las caractersticas fisiolgicas, se encuentra el hecho de fermentacin de determinado carbohidrato y si puede utilizar o no determinadas fuentes de nitrgeno. 2. OBJETIVO Realizar el aislamiento de una levadura a partir del vino elaborado en el laboratorio y realizar su identificacin mediante pruebas bioqumicas. 3. MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO 3.1 Medios de cultivo (por grupo de trabajo)

Azcares: Lactosa, Fructosa, Arabinosa, Xilosa, Manitol, Arbutina, Sacarosa, Glucosa,


Maltosa. (Un tubo de 13 x 100 con 5 ml de cada azcar con campana de Durham) Agar Rosa de Bengala (1 caja) Agar OGY (1 caja) Etanol al 1% en caldo nutritivo (1 tubo) 3.2 Reactivos Colorantes de Gram Azul de lactofenol 3.3 Materiales (por grupo de trabajo) Gradilla Asa redonda 3.4 Equipos Microscopio Incubadora a 35C Incubadora a 25C 4. PROCEDIMIENTO

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Tome una asada del sobrenadante del vino y realice aislamiento en agar rosa de bengala
y agar OGY, lleve a incubar por 48 horas a 35C. Realice una descripcin macroscpica de las colonias, realice una coloracin de Gram y una preparacin en fresco con azul de lactofenol, observe si hay formacin de ascas.

Siembre cada uno de los azcares, deje de ltimo el etanol. Lleve a incubar a 25 oC por 3
das.

Lea las reacciones bioqumicas como asimilacin: si hay crecimiento (por turbidez y sin

cambio de pH); y fermentacin: si hay presencia de CO2, turbidez y cambio en el Compare las bioqumicas con la tabla, e identifique el microorganismo.

5. RESULTADOS 5.1 Descripcin macroscpica de las colonias de Saccharomyces

OGY

ROSA DE BENGALA

_________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _______________________________________________________________ 5.2 Descripcin microscpica Coloracin de Gram __________________________________________________ Azul de lactofenol ____________________________________________________ 5.3 Resultados azcares

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Saccharomyces cerevisiae Glucosa + Galactosa + Ribosa Arabinosa Sacarosa + Maltosa + Celobiosa Trehalosa + Lactosa Xilosa Rafinosa + Ramnosa +

Lactosa Fructosa Arbutina Maltosa Manitol Arabinosa Sacarosa Glucosa Xilosa Alcohol al 1% Microorganismo Identificado_____________________ 6. DISCUSIN 7. CONCLUSIONES 8. PREGUNTAS DE COMPLEMENTACIN 1. Explique, fundamentado en un artculo, dos tcnicas empleada para la identificacin de levaduras y su fundamento. 2. Porque algunos productores de vino no controlan el crecimiento de levaduras salvajes en el vino? 3. Que desventajas tiene el uso de pruebas bioqumicas como fermentacin de azcares en la identificacin de levaduras?

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4. Que diferencias existen entre usar el agar rosa de bengala y OGY para el
aislamiento de Levaduras 5. Defina que es un auxograma y zimograma y su finalidad?? 9. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

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PRCTICA NO. 3 IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS CONTAMINANTES DEL JEREZ 1. INTRODUCCIN El anlisis de las uvas y los vinos se realiza por diferentes razones, entre las que se destacan: la madurez, reduccin del avinagramiento y mejora del proceso. Algunas de las enfermedades del vino son causadas por microorganismos nocivos, perjudicando la calidad del vino, entre las que se encuentran: Flor del vino y avinagramiento producidos por produccin de cido actico, amargor generado por un aumento de la acidez, donde el vino adquiere un olor butrico y ptrido, el ahilado o grasa donde existen microorganismos que se rodean de una sustancia mucilaginosa, la dextrosa, que agrupa bacterias, generando un aspecto aceitoso al vino. Algunos de los anlisis que se deben realizar a un vino son: Caracterstica Microbiolgicos Especificaciones Determinacin de levaduras salvajes Botrytis Bacterias acticas Bacterias cido lcticas

2. OBJETIVOS Realizar el anlisis microbiolgico al vino realizado en el laboratorio. 3. MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO 3.1 Medios de cultivo (1 caja por grupo de trabajo)

Medio para el aislamiento de Zygosaccharomyces


A 600 ml de agua, adicionar 100 g de glucosa 10 g de triptona 10 g de extracto de levadura 25 g de agar Completar a 1L con agua, esterilizar Una vez autoclavado, enfriar el medio y aadir 10 ml de cido actico glacial. Medio Tenner-Vetsch modificado (Aislamiento de bacterias cido lcticas) Diluir 335 ml de zumo de tomate hasta 1.500 con agua destilada y filtrar. A 1 litro de la solucin anterior, aadir. 20 g de agar 20 g de triptona 5 g de peptona 5 g de extracto de levadura

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3 g de glucosa 2 g de lactosa 1 g de extracto de hgado 1ml de tween 80 al 5% Calentar en un bao de agua hirviendo hasta que se disuelva, ajustar el pH a 5,5; esterilizar en autoclave. Medio de carbonato clcico-etanol (Aislamiento de bacterias del cido actico) En un volumen adecuado de agua disolver 20 g de CaCO3 5 g de extracto de levadura 20 de agar 0.02 de verde de bromocresol Disolver manteniendo la solucin en una bao de agua hirviendo. Autoclavar. Agar WL adicionado de actidiona (Aislamiento de levaduras salvajes) 3.2 Reactivos Colorantes de Gram Azul de lactofenol Azul de metileno 3.3 Materiales (por grupo de trabajo) Asa redonda Lminas Laminillas Cmara de Neubauer 6 tubos taparrosca de 16 x 150 con 4,5 mL de agua peptonada al 0.1% 2 pipetas de 1 mL Capilares 3.4 Equipos Microscopio Incubadora a 25C Incubadora a 30C 4. PROCEDIMIENTO 4.1 Aislamiento de Zygosaccharomyces A partir del vino realizar aislamiento, llevar a incubar a 25 oC durante 6 das, revisar la formacin de ascas con forma de masa, para ello realizar coloracin con azul de lactofenol. Interpretacin:

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La presencia de ascas es indicador de la presencia de este microorganismo. 4.2 Aislamiento de levaduras salvajes Tomar una asada del vino y realizar el aislamiento en el agar WL, incubar a 25 oC durante 3 das. Interpretacin: Levaduras que fermenten son consideradas como contaminantes. 4.3 Aislamiento de bacterias cido lcticas. Tomar una asada del vino y sembrar por aislamiento, incubar a 30oC por 72 horas. Interpretacin: La aparicin de colonias blancas, es indicativo de la presencia de bacterias cido-lcticas. 4.4 Aislamiento de bacterias del cido actico. Realizar el aislamiento a partir del vino, incubar a 30oC por 72 h. Interpretacin: Las colonias presentan un aclaramiento alrededor por la neutralizacin del CaCO3 4.5 Recuento de levaduras, viabilidad y porcentaje de gemacin. Realizar recuento de levaduras del vino para ello haga diluciones de la muestra. Tome el ltimo tubo y adicione azul de metileno. Monte la cmara y haga el recuento de levadura en el cuadrante central. Haga los siguientes recuentos: Recuento total: Tome todas las levaduras y cuntelas Rto de viabilidad: sobre el recuento anterior determine aquellas que se vean azules como clulas muertas, cuntelas y saque el porcentaje. Porcentaje de gemacin: Sobre las clulas viables, cuente las levaduras que se encuentren en gemacin y determine el porcentaje de gemacin. Haga los clculos para expresar los resultados por mililitros. 5. RESULTADOS 5.1 Dibuje los resultados obtenidos en los diferentes aislamientos.

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5.2 Recuentos Rto total Rto de viabilidad % de gemacin

6. DISCUSIN 7. CONCLUSIONES 8. PREGUNTAS DE COMPLEMENTACIN 1. Explique el termino de levaduras Killer y cual es su mecanismo frente a otras levaduras? 2. Realice una lista de 5 contaminantes, bacterias, hongos y levaduras y su efecto en el vino? 3. Enumere tres medios de cultivo y su fundamento, empleados en el control de calidad de contaminantes del vino, empleados en a industria? 4. Porque la sulfitacin adems de emplearse, como inhibidor de flora acompaante en el proceso de elaboracin de jerez, es empleada, tambin como criterio de seleccin de cepas etanlicas? 5. Cuales son los principales contaminantes al inicio de la fermentacin del vino? 6. En que proceso de elaboracin del vino, cree usted, basado en artculos, son los puntos de mayor contaminacin y alteracin del proceso.

9. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

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PRCTICA NO. 4 ANLISIS FSICO-QUMICO DEL JEREZ 1. INTRODUCCIN A lo largo de la historia de la elaboracin del vino, las tcnicas analticas se han hecho cada vez ms importantes, el anlisis de las uvas y los vinos se realiza por diferentes razones, entre las que se destacan: la madurez, reduccin del avinagramiento y mejora del proceso. Los factores fsico-qumicos del vino tambin afectan el rendimiento y las funciones vitales de la levadura, a si como su respiracin, fermentacin y reproduccin, factores que dependen de la composicin qumica del mosto y del etanol formado; de la cantidad de azcares depende la velocidad de fermentacin, la presencia de alcohol (etanol) producido disminuye el crecimiento de la levadura y la acidez del vino puede reducir la eficiencia de fermentacin de azcares en la misma. Por esta razn es de vital importancia realizar los anlisis pertinentes al producto final. Los anlisis que se deben realizar a un vino incluyen: Caracterstica Slidos solubles Acidez Alcoholes Compuestos carbonilo Esteres Compuestos nitrogenados Compuestos fenlicos Adiciones qumicas 2. OBJETIVOS Realizar el anlisis fsico-qumico al vino realizado en el laboratorio. 3. MATERIALES Y REACTIVOS 3.1 Reactivos (por grupo de trabajo) Reactivo de yodo: disolver 1 g de yodo y 20 g de Yoduro de potasio en un Litro de agua desionizada. (1 mL) Etanol al 95% (2 mL) Pastillas clinitest (1) 3.2 Materiales (por grupo de trabajo) Gradilla (1) Tubo de 13 x 100 (1) Tubo de 16 x 150 (2) Pipeta de 1 ml (3) Especificaciones Azcar, extracto, glucosa y fructosa Total, voltil, pH, cidos individuales Etanol, metanol, aceites, fusel y glicerol Acetaldehdo, diacetilo Acetato de etilo, antranilato de metilo Amonaco, aminocidos, aminas, protenas Totales, fracciones fenlicas incluyendo antocianinas Acido srbico y benzoico

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Pipeta de 5 ml (1) Pipeta de 10 mL (1) 4. PROCEDIMIENTO 4.1 Polisacridos/pectinas Tomar 1 ml del vino y aadir 2 ml de etanol o HCL al 1%, mezclar y dejar en reposo durante 15 minutos. Interpretacin: La formacin de gel despus de varios minutos indica la presencia de pectina. 4.2 Prueba de almidn: (Para sidra) Aadir 1 ml de reactivo de yodo a 10 ml de zumo. Interpretacin: el color azul oscuro o violeta indica la presencia de almidn. 4.3 Azcares reductores: estimacin visual rpida Esta prueba es til al finalizar la fermentacin. Tomar 2 ml del vino filtrado y colocarlo en un tubo adicionar la pastilla de Clinitest, comparar por color con la escala. Esta prueba sirve como criterio de finalizacin de la fermentacin. 4.4 Prueba del alcoholmetro Introducir el alcoholmetro limpio y seco, dentro del jerez y soltar con un suave movimiento giratorio, dejar flotar libremente. Una vez que el alcoholmetro ha cesado en su movimiento vertical efectuar la lectura por debajo del menisco y horizontalmente a la superficie del destilado. NOTA: El destilado debe estar a 20C para que no exista error en la lectura. El alcoholmetro debe tomarse siempre por la extremidad superior del vstago y jams por el flotador, se debe lavar con alcohol puro y luego con ter, para extraer las materias grasas que pueden haberse adherido, y luego se seca con papel filtro. 4.5 Determinacin de la acidez total del Jerez. El vino es en realidad una disolucin cida diluida. Sin los cidos tendra un sabor muy inspido y su estabilidad sera mnima, llegando incluso a ser atacado por muchos microorganismos que produciran fermentaciones no deseables. Incluso el color sera muy pobre. En la bodega se debe conocer en todo momento la acidez del vino a fin de determinar la cantidad adecuada de dixido de azufre que se ha de aadir. La acidez total se define como la suma de los cidos en estado libre que existen en el vino y que sean valorables, cuando se realiza la neutralizacin hasta pH=7,0, por adicin de una disolucin alcalina. Generalmente es del orden de 5 g/l expresada en cido tartrico, o 3,25 g/l expresada en cido sulfrico. Los cidos que se valoran son de naturaleza orgnica, siendo los principales:

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cido cido cido cido cido

tartrico. mlico. lctico. ctrico. succnico.

La determinacin de la acidez total se realiza en la prctica en base a una valoracin cido-base, utilizando como reactivo valorante una base fuerte como es el hidrxido sdico (NaOH), y tomando como punto de equivalencia pH= 7,0. Para detectar dicho punto utilizaremos el indicador "azul de bromotimol", cuyo intervalo de viraje se encuentra comprendido entre los valores de pH (6,0-7,5) y la variacin es de color amarillo a azulverdoso. 4.5.1Material utilizado: - Bureta graduada y soporte. - Matraz erlenmeyer de 200 ml. Reactivos: - Disolucin de NaOH 0,1 N - Azul de bromotimol. 4.5.2 Tcnica: -En un erlenmeyes de 200 ml. se introducen 10 ml. de vino blanco exactamente medidos y se diluyen con 50 ml de agua destilada libre de anhdrido carbnico. -Se aaden unas gotas del indicador "azul de bromotimol", con lo que la muestra adquiere un color amarillo-verdoso (en caso de muestras con gran intensidad de color es muy probable que no se distingua por confundirse con el color del vino). -Con la bureta ya enrasada de disolucin de NaOH 0,1 N se empieza la valoracin aadiendo gota a gota el reactivo valorante al matraz que contiene la muestra, tratando de agitar para conseguir una mezcla lo ms intima entre el reactivo valorante y el vino. Seguiremos repitiendo el proceso hasta que el color de la muestra vire a verde-azulado, punto en el cual consideramos que se ha alcanzado el punto de equivalencia. En este momento se leern el volumen gastado de NaOH.

Clculos:

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Notas: Se pueden usar otros indicadores que tengan un intervalo de viraje prximo a pH=7,0, tales como el "rojo cresol" (pk=7,7). No obstante, el mejor seguimiento de la valoracin se puede hacer utilizando un pH-metro de precisin tomando medidas del valor del pH en cada momento con el fin de representar la curva de valoracin. En el vino, tambin existen otros cidos tales como el cido sulfuroso, -aadido en la vendimia y el cido carbnico originado en la fermentacin-. Mientras que el primero no influye apreciablemente en los resultados, el segundo s, llegando incluso a aumentarlos significativamente. Para evitar esta interferencia, se suele agitar el vino a temperatura ambiente, sometindole a vaco parcial hasta que cese el desprendimiento de anhdrico carbnico. Tambin se puede hervir el vino durante un minuto para conseguir el mismo resultado.

5. RESULTADOS 5.1 5.2 5.3 5.4 Prueba de pectina __________________ Prueba de almidn __________________ Azcares reductores _________________ Contenido de alcohol _________________

6. DISCUSIN

7. CONCLUSIONES

8. PREGUNTAS DE COMPLEMENTACIN 1. Investigue que otros anlisis a los vistos en clase se evalan en la produccin de vinos, y busque la norma AOAC, que explique el fundamento de la tcnica. 2. Que son los aceites fusell que se pueden producir durante la fermentacin y que efectos causan en el vino? 3. Haga un diagrama de todo el proceso de elaboracin de la champaa indicando, tipos de uva, microorganismo, proceso de fermentacin, clarificacin, gasificacin, embotellado y almacenamiento 4. Cmo se determina la presencia de lactatos en el vinos y que efectos producen. 5. Busque los parmetros fisico-quimicos que rigen para Colombia la calidad de los vinos.

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9. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

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PRCTICA No. 5 PODER LEUDANTE DE LA LEVADURA PANARIA 1. INTRODUCCIN Para la produccin de pan se utilizan cepas de Saccharomyces cerevisiae; esta levadura utiliza glucosa como fuente de carbono generando dixido de carbono, el cual causa el esponjamiento de la masa y la textura del producto final. Esta levadura debe tener unas caractersticas especiales para que se pueda utilizar en la produccin del pan: alta velocidad de crecimiento, buen rendimiento sobre el medio utilizado, buen poder de fermentacin para obtener una masa esponjosa y con buena contextura, tolerancia a inhibidores microbianos como el cido propinico, entre otras. 2. OBJETIVO Establecer el efecto de la levadura sobre la masa panaria. 3. MATERIALES 3.1 Cepas Suspensin de levadura (Saccharomyces cerevisiae): 10g de levadura + 120 ml de agua 28C en un erlermeyer. (preparar 500 mL de suspensin para todo el curso). 3.2 Materiales (por grupo de trabajo) Sacarosa (10 g) Harina de trigo (100 g) Vasos de precipitado de 250 mL o frascos de compota (4) Probetas de 250 mL (4) Pipeta de 10 mL (2) Esptula Varilla agitadora 3.3 Equipos Balanza Incubadora a 30C 4. PROCEDIMIENTO Numerar los vasos de precipitado (1-4) Aadir a cada uno 25 g de harina de trigo Aadir 3 gramos de sacarosa a los vasos # 1, 2 y 3 Al vaso #1: Aadir 22.5 ml de agua Al vaso #2: Aadir 15 ml de agua

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Pasar la suspensin de la levadura con la pipeta a los vasos de precipitado: Vaso #1: 7.5 ml Vaso #2: 15 ml Vaso #3: 30 ml Vaso #4: 30 ml Mezclar con una varilla de vidrio Numerar las probetas (1-4) Aadir la masa a las probetas correspondientes y colocarlas a 30C Esquema del procedimiento: 1

1 4 25g de harina 3g de sacarosa 22.5mL de agua 7,5mL suspensin 25g de harina 3g de sacarosa 15mL de agua 15mL de suspensin

2 25g de harina 25g de harina 3g de sacarosa 3g de sacarosa 7.5mL agua 30mL de suspensin 22.5 mL suspencin

Leer y anotar la altura de la masa en cada probeta en intervalos de 15 minutos durante 1:30 horas

5. RESULTADOS 5.1 Completar el siguiente cuadro: Tiempo (min) 0 15 30 45 60 75 90 Probeta 1 Probeta 2 Probeta 3 Probeta 4

5.2 Dibuje los resultados altura vs tiempo

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5.3 Discuta los resultados obtenidos, de acuerdo a su criterio cual de los 4 ensayos es el mejor, que razones lo llevan a concluir. 6. DISCUSIN 7. CONCLUSIONES 8. PREGUNTAS DE COMPLEMENTACIN 1. De que depende la elasticidad que debe tener la masa panaria? 2. De que dependen los grados de esponjamiento obtenidos en la masa panaria? 3. Cual es la protena presente en la harina de trigo importante en el proceso de fermentacin del pan, y que funcin cumple? 4. Que aditivos se pueden adicionar a la harina de trigo para mejorar la actividad de la levadura 5. Cuales son los productos metablicos en la fermentacin de la levadura en la elaboracin del pan que otorga los olores tpicos del pan en el momento de horneado 6. Qu es la masa madre y en qu casos se emplea? 7. Qu tipos de bacterias pueden actuar tambin en la fermentacin de la harina? 8. Porqu es tan importante la retencin de humedad en la masa panaria y qu relacin tiene con la levadura 9. Cmo se comporta la levadura en harinas como la de maz y centeno?

9. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

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PRCTICA NO. 6 ANLISIS FSICO-QUMICO DE LA LECHE CRUDA 1. INTRODUCCIN Los sistemas de control de calidad y gestin de riesgos han pasado de la comprobacin del producto final a la certificacin del proceso, con la introduccin, por ejemplo, de evaluaciones por anlisis de peligros en puntos crticos de control (HACCP). La FAO y otras instituciones han elaborado directrices y realizado programas de capacitacin en materia de normas y especificaciones para la leche y los lcteos; sobre normas sanitarias y fitosanitarias, y sobre los obstculos tcnicos al comercio, en el mbito del comercio internacional. Estas directrices y programas de capacitacin se han adaptado para el sector de los pequeos productores de lcteos. Dentro de los parmetros que se deben seguir para determinar la buena calidad fsicoqumica de la leche se encuentran: ausencia de sustancias tales como adulterantes, preservativos, sustancias txicas y residuos de drogas o medicamentos, tiempo de reduccin del azul de metileno, y ausencia de calostro, sangre u otros elementos extraos en suspensin. 2. OBJETIVO Realizar el anlisis fisicoqumico de una leche cruda. 3. MATERIALES Y REACTIVOS 3.1 Reactivos (por grupo de trabajo)

3.1.1 Prueba de alcohol Alcohol etlico 68% (2 mL) 3.1.2 Tiempo de reduccin del azul de metileno (2 mL de solucin de trabajo) Azul de metileno Solucin madre: colocar en un frasco estril de color mbar 2000 mL de agua destilada recientemente hervida por 10 minutos. Agregar 1.1 g de cloruro de azul de metileno, agitar hasta completa disolucin, enfriar y conservar la solucin colorante en un sitio oscuro y en refrigeracin. Preparar la solucin semanalmente. (Monitores: Se recomienda preparar mximo 100 ml de la solucin madre) Solucin de trabajo: en un frasco que contenga 90 mL de agua destilada estril, agregar 10 mL de la solucin madre. Preparar esta solucin diariamente. 3.1.3 Identificacin de harina y almidones Solucin de yodo yoduro de potasio (1 mL) Yodo: 1 g Yoduro de potasio: 2 g

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Agua destilada: 300 mL

3.1.4 Identificacin de cloruros Solucin acuosa de nitrato de plata 1.3415 g/L ( 5 mL) Solucin acuosa de cromato de potasio 10% (2 gotas) 3.1.5 Identificacin del formaldehdo Solucin acuosa de cloruro frrico al 1% recin preparado (3 gotas) Acido sulfrico densidad 1.82-1.8225 g/L (2 mL) Solucin diluida de formaldehdo: diluir una gota de solucin de formaldehdo del 38% en 100 mL de agua. (2 gotas) 3.1.6 Identificacin de hipocloritos-cloraminas-dixido de cloro Solucin de yoduro de potasio: disolver 7 g de yoduro de potasio en 100 mL de agua destilada. Preparar cuando se vaya a usar. (1,5 mL) Acido clorhdrico diluido: a 100 mL de HCL 38.5% agregar 200 mL de agua destilada. (4 mL) Solucin de almidn: hervir un gramo de almidn soluble en 100 mL de agua destilada. Enfriar antes de usar. (1 mL)
3.2 Materiales (por grupo de trabajo) Frasco gotero Gradilla Malla de asbesto Mechero Trpode Pipeta de 1 mL (1) Pipeta de 1 mL estril (1) Pipeta de 10 mL estril (1) Pipeta de 5 mL (5) Pipeta de 2 mL (3) Probeta de 250 mL (1) Termolactodensmetro (1) Tubo de 16 X 150 mL tapa rosca (6) Varilla de vidrio (1) Vaso de precipitado con hielo 3.3 Equipos Bao termostatado (37C) Bao termostatado (85C) 4. PROCEDIMIENTO 4.1 Prueba de alcohol Agitar bien la muestra de leche, tomar 2 mL de leche y colocarlos en el tubo, adicionar 2 mL de alcohol, mezclar.

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Interpretacin: Con leche normal la mezcla se desliza a lo largo de las paredes del tubo sin dejar rastros de grumos. Con leche cida por el contrario, se forman grumos espesos de casena precipitada. 4.2 Prueba de densidad a 15/15 con termolactodensmetro Agitar bien la muestra de leche, si la leche presenta separacin de la crema, esta se debe calentar por debajo de 38C, homogenizar, lleve la leche a una temperatura de 15C +/5. Agregue la leche a la probeta, evitando la formacin de espuma. Introduzca suavemente el termolactodensmetro mantenindola verticalmente y sostenindolo en su descenso hasta un punto cercano a su posicin de equilibrio. Provoque un ligero movimiento de rotacin. Evite el contacto del termolactodesmetro con las paredes de la probeta. Efecte la lectura despus de un minuto de sumergido el termolactodensmetro.

4.3 tcnica de clulas somticas Tomar 0.01ml de leche, previa agitacin de la muestra, colocar una pequea gota sobre una lmina, dejar secar en superficie horizontal a 40C, agregar la solucin de azul de metileno modificada y dejarla por 5 minutos, lavar escurrir y dejar secar a temperatura ambiente cubrir con la laminilla y observar con el objetivo de inmersin.
Recorrer el extendido contando los campos observados y el nmero de leucositos encontrados en cada uno de ellos. Esta operacin se debe llevar a cabo primero en lnea horizontal y luego en lnea vertical ( 10 campos horizontales y 10 campos verticales). Descartar los tres primeros campos en los extremos para evitar irregularidades de los bordes del frotis. Los leucocitos se observan como elementos celulares con citoplasma y ncleo estando este ltimo ms teido que el citoplasma. Los leucocitos destruidos en que se distingue ms del 50% de la clula deben contar y tambin cuando solo aparece el ncleo.

La expresin de resultados se hacecon la siguiente frmula

Nmero de leucocitos contados Nmero de leucocitos/ml=_____________________________ * factor del microscopio Nmero de campos contados 4.4 Adulterantes

4.4.1 Identificacin de harina y almidones

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Colocar en un tubo de ensayo 5 mL de muestra, hervir, enfriar en el agua con hielo y adicionar 1 mL de la solucin de yodo. Interpretacin: Positivo: color azul, indica presencia de almidn y harina Negativo: color amarillento

4.4.2 Identificacin de cloruros


Colocar en tubo de ensayo 5 mL de la solucin de nitrato de plata, agregar dos gotas de la solucin de cromato de potasio. Mezclar y adicionar 1 mL de leche, mezclar. Interpretacin: Si se produce una coloracin rojo ladrillo, la cantidad de cloruros en la leche expresada como cloruro de sodio es de 2.3 g/L, se produce inmediatamente una coloracin amarillo canario. En este caso la muestra es sospechosa de haber sido adicionada con cloruros, por lo tanto debe efectuarse la determinacin cuantitativa. 4.5 Conservantes

4.5.1 Identificacin del formaldehdo


Colocar 3 mL de leche en un tubo de ensayo, agregar 3 gotas de la solucin de cloruro frrico, agitar; por las paredes agregar con cuidado, sin que se mezcle con la leche, cido sulfrico en cantidad suficiente para que se forme una capa de 1-2 cm de espesor. Interpretacin: En presencia de formaldehdo aparecer un anillo de color violeta, cuando la concentracin de formaldehdo en la leche es alta, la prueba es menos sensible, para hacerla ms sensible se deben hacer diluciones de la muestra.

4.5.2 Identificacin de hipocloritos-cloraminas-dixido de cloro


Prueba 1 Colocar 5 mL de leche en un tubo de ensayo, agregar 1.5 mL de solucin de yoduro de potasio, mezclar bien por agitacin. Anotar el color de la leche. Prueba 2 Si no cambia el color de la leche, agregar 4 mL de HCL diluido, mezclar bien con una varilla de vidrio y observar el color de la cuajada. Prueba 3 Colocar luego el tubo de bao mara calentado previamente a 85C y dejar en reposos 10 minutos (durante este tiempo la cuajada sube a la superficie), enfriar rpidamente colocando el tubo en agua fra. Anotar el color de la cuajada y el lquido.

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Prueba 4 Agregar luego el lquido por debajo de la cuajada 0.5 a 1 mL de la solucin de almidn. Observar el color inmediatamente. Interpretacin: Concentraci n cloro disponible ppm Prueba 1 Prueba 2 Prueba 3 Prueba 4

1.000 Pardo amarillento Pardo amarillento Pardo amarillento

500 Amarillo intenso Amarillos intenso Amarillo intenso

200 Amarillo plido difuso Amarillo claro Amarillo

100 Amarillo Rojo violceo oscuro

40 Amarillo plido Rojo violceo

20 Amarillento Rojo violceo.

Azul violceo Azul violceo Azul violceo

5. RESULTADOS Prueba de alcohol:________________________________________________________ Prueba de densidad a 15/15 con termolactodensmetro__________________________ Tiempo de reduccin del azul de metileno:____________________________________ Identificacin de harina y almidones:_________________________________________ Identificacin de cloruros:__________________________________________________ Identificacin de formaldehdo:_____________________________________________ Identificacin de hipocloritos-cloraminas-dixido de cloro:________________________ Dictamen de la calidad de leche analizada _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________

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6. DISCUSIN 7. CONCLUSIONES 8. PREGUNTAS DE COMPLEMENTACIN 1. Cal es el fundamento de las prueba de la fosfatasa para evaluar el proceso de pasteurizacin? 2. Enumere cuatro enzimas que se encuentren naturalmente en la leche y como se pueden emplear en el control de la calidad de la leche? 3. Defina que es el punto isoelctrico de la leche 4. Explique la tcnica de cuantificacin de clulas somticas en la leche y porque se emplea como un criterio de calidad. 5. Describa en qu consiste el mtodo de estandarizacin de la grasa y para que se emplea? 6. Describa el mtodo de crioscopia empleado para medir la cantidad de agua presente en la leche. 7. Describa el porque en la leche se pueden encontrar micotoxinas y sustntelo con un articulo. 8. Explique la prueba de la lactofiltracin que se emplea en leches?

9. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

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PRCTICA NO. 7 PRUEBA DE ANTIBITICOS Y DETERMINACIN DE ACIDEZ (EXPRESADO COMO CIDO LCTICO) 1. INTRODUCCIN La leche utilizada como materia prima para obtener productos alimentarios, puede contener sustancias antibacterianas que inhiben y/o reducen la actividad de los cultivos iniciadores, lo que eventualmente, puede conducir a la obtencin de productos lcteos de escasa calidad y acarrear prdidas econmicas. Por tanto, es necesario que la leche utilizada para preparar los cultivos finales y la usada para la fabricacin de los diversos productos lcteos este exenta de agentes inhibidores. Los fermentos lcteos son generalmente el origen de la acidificacin debida a la transformacin de la lactosa en cido lctico. Si el fenmeno es espontneo se debe normalmente a Streptococcus lactis, que se desarrolla a temperatura ambiente. Cuando la acidez alcanza 35 a 40D, la casena flocula al someter la leche a ebullicin. A los 6070D, el fenmeno se produce a temperatura ambiente. Adems de los fermentos lacticos, otros microorganismos pueden producir la acidificacin de la leche: Coliformes, Enterococos, Estafilococos, Micrococos, etc. Determinar la acidez de la leche y establecer la presencia de antibiticos son pruebas fundamentales para dar inicio a la fermentacin de leches. Para la determinacin de la acidez pueden utilizarse dos mtodos diferentes, la titulacin con una base o pruebas con potencimetro (pH metro), el criterio para la seleccin del mtodo depende fundamentalmente del productor, sin embargo es claro que las pruebas de titulacin son cuantitativas, mientras que las pruebas con pH son cualitativas. En la determinacin de antibiticos se utiliza fundamentalmente pruebas qumicas que se basan en la bsqueda de penicilinas o pruebas biolgicas cuyo principio es el cultivo iniciador, por costos muchas empresas utilizan de rutina las biolgicas y las qumicas en control de hatos. 2. OBJETIVO Determinar la presencia de antibitico y la acidez de una leche cruda mediante titulacin. 3. MATERIALES Y REACTIVOS 3.1 Reactivos (por grupo de trabajo) Fenoftalena al 1% (3 gotas) Monitores: Disolver la fenolftalena en Etanol. Hidrxido de sodio al 0.1N (2 mL) Cultivo strter (2 mL) 3.2 Materiales Tubo de 16 x 150 estril (1)

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Pipeta de 10 ml (1) Pipeta pasteur (1) Pipeta de 10 ml estril (1) Pipeta de 2 ml estril (1) Bureta Vaso de precipitado o compota Soporte universal Nueces

3.3 Equipos Bao serolgico a 45oC 4. PROCEDIMIENTO 4.1 Prueba de acidez Tomar 9 ml de leche en un vaso de precipitado y adicionar 3-5 gotas de fenoftalena 1%, iniciar la titulacin con hidrxido de sodio 0.1N, lentamente, parar cuando la leche cambie a rosa plido, anotar los mL de NaOH gastados y realizar el siguiente clculo: ml de NaOH x 10 = Grados Thorner ml de NaOH 10 = % de cido lctico 4.2 Prueba de antibiticos Tomar 10 mL de leche y colocarlos en un tubo estril, adicionar 2 mL de cultivo starter, mezclar y llevar a incubar a 45oC, durante dos horas. Interpretacin: Si despus de la incubacin hay formacin de cogulo, no hay presencia de antibitico, si la leche continua lquida despus de dos horas de incubacin es presuntivo de la presencia de antibitico en la leche. 5. RESULTADOS 5.1 Prueba de acidez ml de NaOH gastados: __________ Grados Thorner: __________ % de cido lctico: __________ 5.2 Prueba de antibiticos Formacin de cogulo: Si ___ No ___

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Presencia de antibitico: Si ___ No ___ 6. DISCUSIN 7. CONCLUSIONES

8. PREGUNTAS DE COMPLEMENTACIN Porque motivo no esta permitido para conservar alimentos en general el uso de antibiticos? Cmo se puede evaluar la presencia de antibiticos en la eche con una metodologa diferente a la vista en laboratorio. Cuales son los principales inhibidores naturales de la leche cruda y explique brevemente? En la legislacin colombiana se prohbe el uso de aditivos tales como antibiticos? Explique cmo los detectara RAPIDAMENTE en una empresa lctea la presencia de antibiticos con un mtodo diferente al realizado en laboratorio?

9. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

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PRACTICA No. 8 ELABORACIN DE YOGURT 1. INTRODUCCIN El yogurt se puede obtener a partir de la leche de de todas las especies de animales y aunque la ms comn es la vaca, la cabra y la oveja, tambin se han utilizado leches de camella y bfala. Existen distintos tipos de yogurt, pero los ms importantes son los yogures firmes o consistentes y los yogures batidos. Para la fabricacin de este se utiliza leche entera o desnatada la cual debe almacenarse a temperatura adecuada y realizarle un tratamiento trmico equivalente a la pasteurizacin, debe ser libre de antibiticos e inhibidores y su acidez no debe ser superior a 0.16% de acido lctico, as mismo debe tener un 15% de slidos para mejorar la consistencia del yogurt i evitando la sinresis. El yogurt es un producto lcteo que se obtiene de la fermentacin de la lactosa de la leche por la adicin de un cultivo mixto de bacterias cido-lcticas (LAB) (S.salivarius var. thermophyllus y Lb. bulgaricus), en estos cultivos iniciadores la lactosa entra a la clula por medio de un sistema permeasa y a continuacin es hidrolizada a glucosa y galactosa por una galactosidasa, posteriormente la glucosa es metabolizada va glicolitica. 2. OBJETIVO Elaborar un yogurt y entender el fenmeno de fermentacin 3. MATERIALES Y REACTIVOS 3.1 Reactivos (por grupo de trabajo) NaOH 0.1 N (10 mL) Fenoftalena 1% (9 gotas) Colorantes de Gram Aceite de inmersin 3.2 Materiales (por grupo de trabajo) Malla de asbesto (1) Trpode (1) Soporte universal (1) Nueces (1) Cuchillo Cuchara Olla Vaso de precipitado de 50 mL (1) Bureta Lminas Cultivo iniciador (20 ml) Azcar (1 lb) Fruta (mora o fresa, limn) Bolsa de leche pasteurizada Recipiente de vidrio para la conserva

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Recipiente plstico para el yogurt Cultivo iniciador Pipeta de 10 mL (1) Pipeta pasteur (1)

3.3 Equipos Microscopio Incubadora a 45C 4. PROCEDIMIENTO 4.1 Elaboracin de la conserva

Haga una seleccin de las frutas, retire aquellas que estn daadas y lvelas con abundante agua. En el caso de la fresa crtela en rodajas, psela y anote el peso y colquelas en la olla, adicione limn (para evitar el pardeamiento enzimtico) y adicione azcar (unos 40 gramos), deje unos 5 minutos, esto permitir que la fruta libere agua. Coloque en la olla y adicione azcar (en una proporcin 3:1) (fruta:azcar), mezcle las materias primas y lleve al fuego. Mezcle constantemente para evitar que se pegue el producto. Lleve a ebullicin y determine el punto final mediante el ensayo de la lmina o la prueba de la cuchara. Apague la conserva e inmediatamente vierta en el frasco de conserva, tape y enfre rpidamente

4.2 Elaboracin del Yogurt

Tome la leche y realice la prueba de acidez, verificado el grado de acidez, adicione la leche en una olla e incorpore azcar en un porcentaje del 3%, mezcle y lleve a calentar a 45oC Adicione un inculo del 2% del cultivo iniciador y mezcle completamente Incube a 45oC durante 4 horas. Observe la consistencia a la hora 1, 2 y 4, determine la acidez a la hora 4 y haga coloracin de Gram Aparte realice una determinacin del grado de acidez del cultivo iniciador anote los resultados. Una vez terminada la fermentacin adicione la conserva y mezcle suavemente para evitar la sinresis. Enfre antes de tomar

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5. RESULTADOS Producto Leche inicial Inculo inicial Hora 4 ml NaOH % Acidez

Coloracin

de

Gram

del

producto

terminado:

_____________________________________

6. DISCUSIN 7. CONCLUSIONES 8. PREGUNTAS DE COMPLEMENTACIN 1. En la siguiente grfica se muestra el comportamiento de crecimiento de St. Thermophilus y Lb. Bulgaricus, que papel desempean estos microorganismos en la produccin de yogurt?. A quien se debe la produccin de acetaldehdo principalmente y qu efecto tiene sobre ste producto la relacin simbitica de estos dos microorganismos?

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2. Segn su composicin, como se clasifican los cultivos estrteres, explique cada uno de ellos.? 3. Cuales son los objetivos del tratamiento trmico en la realizacin del yogurt?

9. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

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PRCTICA No. 10

VALORACION DE LA FUERZA DEL CUAJO

1. INTRODUCCIN La coagulacin de la leche puede ser llevada a cabo por enzimas proteolticas de muy variado origen: bacterianas, fngicas, vegetales o animales. Muy pocas entre estas son compatibles con la tecnologa de quesos. El cuajo de ternera es el agente coagulante usado tradicionalmente y sirve como referencia a otros preparados. Este cuajo esta constituido principalmente por la proteasa acida quimosina y en menor proporcin por la pepsina. Otras proteasas utilizadas son las pepsinas bovinas y procinas, y las de origen fungico de Endothia parasiticus, Mucor pusillos o Mucor miehei(llamados cuajos microbianos). Mexclas de enzimas de diferentes origen son frecuentemente utilizadas. La quimosina es la mejor opcin para la elaboracin de quesos, ya que debido a su alta especificad permite obtener quesos con adecuada textura, buen sabor y altos rendimientos. La concentracin del cuajo, fuerza del cuajo o poder coagulante del cuajo, esta determinado por e numero de centmetros cbicos de leche que coagula un centmetro cubico de cuajo a una temperatura dada y tiempo determinado, de aqu se deriva que un cuajo normal sea aquel que a 35C de temperatura cuaja en 40 minutos 10000 litros de leche por cada litro de cuajo, o sea que, que tiene una fuerza de 1:10000. Este cuajo viene en forma liquida y es el mas usado; el cuajo en polvo puede venir en 1:100000 o 1:150000, es mas puro y conserva mejor su actividad; el cuajo de origen microbiano viene con una fuerza aproximada de 1:250000; por ultimo la fuerza del cuajo cristalizado es de 1:10000000.

2. OBJETIVO -Determinar la fuerza del cuajo que se utilizar en la elaboracin de quesos. -Determinar el tiempo de coagulacin de un sustrato de leche estndar, despus de adicionar un preparado enzimtico usado como un agente coagulante de la leche

3. MATERIALES Y REACTIVOS

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3.1 MATERIALES - Pipeta de 10 mL, 5mL, y de 1mL - Matraz de 125 250 mL - Balanza de precisin - Bao termostatado - Fiola de 100 Ml - 200 mL leche en polvo libre de inhibidores 3.2 REACTIVOS Agua para beber Cuajo en polvo y pastilla Cloruro de sodio o sal comn Cloruro de calcio (solucin)

4. MTODO Calentar 100 ml de leche a 35C en un bao mara. Aadir 10 ml de solucin de cloruro de calcio al 0.1 M Agregar 10 ml de solucin de cuajo que contengan 0.1 g de cuajo, reactivada con agua tibia y sal. Tomar el tiempo desde la adicin del cuajo hasta que se presente la coagulacin de la leche. Clculos para hallar la fuerza: F= Donde: K = cantidad de leche 2400 x K D x C D = tiempo de coagulacin (s) C = cantidad de cuajo (g)

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5. RESULTADOS - Calcular la fuerza de los dos tipos de cuajo. - Calcule cuantos gramos de cada cuajo se necesitan si se desea coagular 50 litros de leche

6. DISCUSIN

7. CONCLUSIONES 8. PREGUNTAS DE COMPLEMENTACIN Enumere tres factores fsicos que afecten la coagulacin? Que importancia tiene una alta concentracin de caseina alfa sobre la coagulacin? Enumere que microorganismos recombinantes se usan hoy en da para la produccin de la quimosina? Dibuje como la quimosina afecta la estructura de la casena?

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PRCTICA No. 9 ELABORACIN DE QUESO DOBLE-CREMA 1. INTRODUCCIN El queso es el producto fresco o madurado obtenido por drenaje (de liquido) tras la coagulacin de la leche, nata, leche desnatada o parcialmente desnatada, grasa de la leche o una combinacin de dichos ingredientes. Su clasificacin depende de diversos factores: segn su contenido de humedad se clasifica en duros, semiduros y blandos; segn el mtodo de coagulacin de la casena se clasifican en quesos al cuajo (enzimticos), queso de coagulacin lctica (cido lctico), queso de coagulacin de ambos mtodos; y segn al microorganismo utilizado en la maduracin y la textura del queso, se clasifican en quesos de ojos redondeados, granulares y quesos de textura cerrada. El queso doble-crema, es un queso artesanal propio de la sabana cundiboyacense, cuya principal caracterstica es la fermentacin de la leche cruda y la posterior coccin de la cuajada para obtener un queso hilado. Es utilizado en la elaboracin de diversos productos, para la elaboracin de este queso se utiliza la mezclas de leches crudas frescas y crudas cidas. 2. OBJETIVO Elaborar un queso crema, a partir de leches crudas cidas y crudas frescas 3. MATERIALES Y REACTIVOS 3.1 Reactivos (por grupo de trabajo) NaOH 0.1N (5 mL) Fenoftaleina al 1% (6 gotas) 3.2 Materiales (por grupo de trabajo) Leche cruda cida (1 litro) Leche cruda (2 litros) Enzima Sal Sartn de tefln Olla Colador Cucharas DE TEFLON Cuchillo Vaso de precipitado de 50 mL Soporte universal Nueces Trpode (1)

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Malla de asbesto (1) Bureta Termmetro Pipeta de 10 mL (2) Pipeta pasteur Tela de paal o gaza

6. PROCEDIMIENTO PARA APLICAR EL CUADRO DE PEARSON


Es un cuadro sencillo utilizado en las industria lctea para ajustar concentracin de grasa, ajustar acidez empleando un balance de sus componentes

Tome las dos leches y realice la titulacin Despus de la titulacin determine la cantidad de cada leche usada para obtener el porcentaje de 0.42% de cido lctico para ello utilice el cuadrado de Pearson. Ver el siguiente ejemplo:

1.12 %

0.28

0,42 % 0,14 % 0.7

En este caso por cada 280 ml de leche cida se deben adicionar 700 ml de leche fresca.

Mezcle las leches y lleve a calentar a 30oC, aparte disuelva un cuarto de pastilla de la
enzima en unos 50 ml de leche y adicione a la mezcla de la leche. Deje reposar por 2030 min, terminado el tiempo revise la cuajada para determinar si ya se puede realizar el corte. Introduzca un cuchillo dentro de la cuajada y si este sale limpio puede realizar la cuajada, para esto corte horizontal, vertical y trasnsversalmente con un mximo de grosor de 1 cm.

Terminado el proceso mezcle la cuajada y caliente lentamente a 37 oC durante 20 min


para acelerar el proceso de desuerado. Desuerado: pase la cuajada a travs de un colador, que tenga un cedazo, para separar el suero de la cuajada.

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Tome la cuajada, adicinele sal a un porcentaje del 1% y llvela nuevamente a la olla, adicione un poco de suero y caliente fuertemente, con la cuchara empiece a hilar el queso, retire el exceso de suero. Cuando el queso tenga la textura ideal (sin restos de suero), moldear 5. RESULTADOS Titulacin leche cida: ml gastados de NaOH: ________. % de cido lctico: _________ Titulacin leche fresca: ml gastados de NaOH: ________. % de cido lctico: _________ ml de leche cida a utilizar: ____________ ml de leche fresca a utilizar: ___________ Realice un anlisis de costos del queso teniendo como base el precio del litro de leche. 6. DISCUSIN

7. CONCLUSIONES 8. PREGUNTAS DE COMPLEMENTACIN 1. Como se emplea el cuadro de Pearson para establecer el contenido de grasa de una leche? Realice un ejemplo 2. Enumere y explique los principales factores fsicos de los que depende la maduracin del queso. 3. Los fermentos lcticos que normalmente se utilizan para la fabricacin de los diferentes quesos, pueden ser destruidos por un virus, llamado bacterifago o simplemente fago. Como ataca este fago y como se puede detectar? 4. Cmo la adicin de cloruro de calcio mejora la coagulacin del queso? 5. Descrina como pueden actuar benficamente las bacteriosinas sobre el queso?

9. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

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PRCTICA No. 11 SELECCIN DE CEPAS CON CAPACIDAD PROBITICA 1. INTRODUCCIN Actualmente se define como probiticos a microorganismos vivos que al ser ingeridos producen beneficios a la salud mas all de los nutrientes propios. Para su uso clnico los probiticos deben tener una serie de caractersticas como son: ser de origen humano, resistentes al cido y a la bilis, capaces de colonizar el tracto intestinal, producir sustancias antimicrobianas y poseer capacidad probitica demostrable. Su efecto benfico lo obtienen a partir de una mejor respuesta inmunitaria, mejor digestin de la lactosa, regulacin de la motilidad intestinal, influencia positiva sobre la carga microbiana intestinal y disminucin en la produccin de carcingenos. Los principales microorganismos utilizados como probiticos son bacterias como Lactobacillus acidophilus, L. plantarum, L. rhannosum, L. casei, L. reuteri, Bifidobacterium termophilus, B. bifidium, B. longum, B. infantis, Streptococcus lactis, S. cremoris, Propinobacterium sp, Enterococcus sp. y levaduras como Saccharomyces boulardii, S. cerevisiae y Candida utilis. 2. OBJETIVO Reconocer las principales caractersticas que debe cumplir una cepa para ser considerada como probitico. 3. MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO 3.1 Preparacion del tubo No 2 de la escala de Mac Farland (Monitores)

Cloruro de Bario (BaCl2) al 1% cido Sulfrico (H2SO4) al 1 %

A un tubo de 13x100 nm agregue 0.1ml de BaCl 2 y 4.9 ml de H2SO4 para tener un volumen final de 5ml. En un espectrofotmetro a una longitud de onda de 540nm compruebe la absorbancia que debe estar alrededor de 0.25-0.27 que equivale aproximadamente a 6x108 UFC/ml. 3.2 Cepas (por grupo de trabajo) Saccharomyves cerevisae var boulardii , en 10 ml de caldo YPG a 35C durante 12h (Tomado del banco de clulas del laboratorio de Biotecnologa aplicada.

Salmonella sp en 10 ml de caldo BHI o caldo nutritivo a 37C durante 12h. E. coli en 10 ml de caldo BHI o caldo nutritivo a 37C durante 12h. Sigella sp. en 10 ml de caldo BHI o caldo nutritivo a 37C durante 12h.

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3.3 Medios de cultivo (por grupo de trabajo) Maltosa, Xilosa, Galactosa, Arabinosa, Lactosa, Ramnosa, Rafinosa, Glucosa, Celobiosa, Melobiosa y Manitol preparados al 1% (p/v) en caldo nutritivo con rojo de fenol 0.1 % (p/v) como indicador de pH. (11 tubos 13 x 100 tapa rosca con 5ml). NOTA: Los carbohidratos deben ser esterilizados a 7lb de presin, durante 7 minutos. Caldo YPG adicionados concentraciones de sales biliares (desde 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5 y 4.0% (p/p)). (9 tubos 13x100 tapa rosca). Caldo YPG a pH 2, 3, 4, 5, 6 y 7 ajustado con HCl con una concentracin de 0.1N. (6 tubos 13x100 tapa rosca) Caldo YPG (3 tubos 13x100 con 5 ml) Agar BHI (3 cajas) 3.4 Reactivos (por grupo de trabajo) Solucin salina 0.85%(p/v) (4 tubos de 13 x 100 tapa rosca con 5ml) Colorantes de Gram. Azul de lactofenol Aceite de inmersin 3.5 Materiales (por grupo de trabajo) Pitillos de 1cm de longitud estriles (4) Lminas Pipetas de 1 ml estriles (4) Asa redonda y recta. Tubo No 2 de la escala de Mac. Farland 3.6 Equipos Microscopio 4. METODOLOGIA 4.1 Identificacin microscpica y bioqumica del microorganismo probitico

Prepare una suspensin del microorganismo a estudiar como probitico con una concentracin equivalente al tubo No. 2 de la escala de Mac Farland Haga coloracin de Gram y de azul de lactofenol a la suspensin para la identificacin microscpica. Siembre 1-2 asadas en cada una de los tubos que contiene los carbohidratos con el rojo de fenol e incube a 35 C durante 24 horas. La prueba positiva de asimilacin de azcares se interpreta por viraje de color (Rojo a Amarillo) del indicador de pH.

4.2 Tolerancia a pH

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Siembre 1-2 asadas en cada uno de los tubos de caldo YPG a diferentes pH e incube a 35C durante 24 horas. La prueba positiva de tolerancia a pH se interpreta por el crecimiento del microorganismo en cada pH. Realice coloracin de Gram para observar las levaduras y descartar contaminantes. 4.3 Tolerancia a temperaturas Siembre 1-2 asadas en cada uno de los tubos de caldo YPG e incube un tubo a 28C, otro a 35C, y otro a 42C durante 24 horas. La prueba positiva de tolerancia a temperaturas se interpreta por crecimiento del microorganismo en cada. Realice coloracin de Gram para observar las levaduras y descartar contaminantes. 4.4 Tolerancia a sales biliares Siembre 1-2 asadas en cada una de los tubos de caldo YPG con diferentes concentraciones de sales biliares e incube a 35C durante 24 horas. La prueba positiva se interpreta por crecimiento del microorganismo en cada concentracin de sales biliares. Realice coloracin de Gram para observar las levaduras y descartar contaminantes. 4.5 Enfrentamiento del microorganismo patgeno frente al microorganismo probitico (Ensayo de Ritter)

Prepare una suspensin de cada uno de los microorganismos patgenos a evaluar con una concentracin equivalente al tubo No 2 de la escala de Mac Farland Haga una siembra masiva de la suspensin que contiene el microorganismo patgeno en una caja con agar BHI Introduzca en el agar (hasta la mitad) los pitillos estriles, posteriormente inocule 0.1 ml con el cultivo del microorganismo probitico dentro del pitillo. Incube a 35-37C durante 24 horas. La prueba positiva se interpreta si pasado el periodo de incubacin se observa la formacin de halos de inhibicin alrededor del pitillo.

5. RESULTADOS:

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5.1 Identificacin microscpica Coloracin de Gram:______________________________________________ Coloracin de Azul de Lactofenol:____________________________________ 5.2 Pruebas de Tolerancia Complete la siguiente tabla anotando al frente de cada prueba si el resultado fue positivo o negativo.

Pruebas bioqumicas Maltosa _______ Xilosa ________ Galactosa ______ Arabinosa ______ Lactosa ________ Ramnosa ______ Rafinosa _______ Glucosa _______ Celobiosa ______ Melodiosa ______ Manitol _______

Tolerancia pH pH 2 ______ pH 3 ______ pH 4 ______ pH 5 ______ pH 6 ______ pH 7 ______

Tolerancia temperaturas 28C _______ 35C _______ 42C _______

Tolerancia sales biliares 0.5%_________ 1.0% _________ 1.5% _________ 2.0% _________ 2.5% _________ 3.0% _________ 3.5% _________ 4.0 % _________

6. DISCUSIN 7. CONCLUSIONES

8. PREGUNTAS DE COMPLEMENTACIN 1. Cul es el mecanismo de accin de un microorganismo probitico frente a microorganismos patgenos? 2. Cuales son las caractersticas que debe cumplir un microorganismo para ser considerado como probitico? 3. En qu consiste la microencapsulacin de probiticos y cules son sus ventajas. 4. Que otros tipos de pruebas se utilizan para la identificacin de microorganismo con capacidad probitica. (Soportar por medio de artculos).

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9. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

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PRACTICA No. 12 DESCRIPCIN DE ACTINOMYCETES 1. INTRODUCCIN Los Actinomycetes son bacterias que producen filamentos delgados, ramificados, desarrollndose en un micelio en todos los gneros del suelo, excepto l genero Actinomyces. Los Actinomyces se asemejan a los hongos por su micelio areo y con ramificaciones, por otra parte la morfologa y el tamao de las hifas, los conidios y los fragmentos individuales de las especies cuyo micelio sufre fragmentacin, son semejantes a estructuras que se observan en las bacterias, las colonias que se desarrollan sobre la superficie del agar tiene una consistencia firme y se adhieren fuertemente al sustrato, en algunos gneros la superficie es pulverulenta. Los actinos son habitantes de suelos clidos, son causantes del olor caracterstico de la tierra y degradan molculas complejas como plaguicidas. Producen una gran cantidad de metabolitos secundarios entre los que se encuentran: fitohormonas, antibiticos, antiparasitarios, herbicidas, antifungicos, enzimas (proteasas, amilasas e invertasas). Las condiciones de crecimiento in vitro son: temperatura entre 23c y 37c, pH entre 6.4 y 7.0, protena como fuente de carbono y minerales como potasio, fsforo y magnesio. 2. OBJETIVO Identificar las estructuras tpicas macroscpicas y microscpicas de los Actinomycetes, adems de su efecto antagnico frente a diferentes microorganismos. 3. MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO 3.1 Cepas (1 caja por lado de mesa) Actinomycetes Fusarium sp Bacillus sp Pseudomonas sp Staphylococcus aureus Escherichia coli 3.1 Medios de cultivo (por grupo de trabajo) Agar Nutritivo (1 caja) Agar ISP2 (1 caja) Agar Avena (3 cajas) Agar Avena (1 lmina) Agar Czapeck (1 caja) Agar PC (2 cajas) 3.2 Reactivos (por grupo de trabajo) Cristal Violeta Extracto crudo de Actynomicetes (0,2 mL)

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3.3 Materiales (por grupo de trabajo) Laminillas estriles Cinta pegante Pinzas Asas Aguja de diseccin Caja de petri estril (1) Pipeta de 1 mL estril (1) 3.4 Equipos Incubadora a 30C Microscopio 4. METODOLOGA 4.1 Visualizacin Microscpica

4.1.1 Montaje de laminilla


Siembre de forma masiva el Actinomycete que encuentra en su mesn en los agares, ISP2, Nutritivo y Czapeck. Tome 2 laminillas estriles con pinzas flameadas y colquelas en cada uno de los medios de cultivo introducindolas en los agares formando un ngulo de 45 Incube las cajas por 5 das a 30 C. Observe y anote los cambios en el crecimiento, pigmentacin y otras caractersticas macroscpicas que se presenten. Tome las laminillas manipulndolas con cuidado y colquelas sobre una lmina. Observe las laminillas al microscopio primero sin ningn tipo de tincin y luego utilice cristal violeta adicionndolo por un lado de la laminilla. Observe las caractersticas microscpicas

FIGURA 1. MONTAJE CON LAMINILLAS

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4.1.2 Montaje en lmina


Siembre de manera masiva el actinomycete sobre la lmina que contiene una capa delgada de agar avena Tome la lamina y colquela al microscopio Visualice con y sin cristal violeta

FIGURA 2. MONTAJE EN LMINA. 4.2 Antagonismo

4.2.1 Evaluacin del extracto crudo para bacterias


A partir del extracto crudo tome 0.1ml distribuya sobre una caja de agar PC (deje secar el extracto en la caja). En la caja de agar PC que contiene el extracto y en otro utilizada como control siembre por estra 4 bacterias. (Asegrese de marcar por el reverso de la caja en sitio de la siembra)

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FIGURA 3. EVALUACION DE EXTRACTO CRUDO PARA BACTERIAS

4.2.1 Evaluacin del extracto crudo para hongos


Tome dos cajas de agar avena y divdalas de modo que deje una franja central en la circunferencia de 3cm de ancho. A una de las cajas adicione 0.1 ml de extracto y homogenice en la zona marcada con el asa redonda. (Tenga cuidado de no salirse del rea de 3 cm) A la otra caja siembre en la zona de 3 cm el Actinomycete que se encuentra en su mesn.

En las dos cajas siembre por puncin a 1 cm de lado y lado de la zona de 3cm Fusarium
spp. Incubar a 30 C por 5 das

Lectura de resultados

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FIGURA 4. EVALUACION DE EXTRACTO CRUDO PARA HONGOS. 5. RESULTADOS 6. DISCUSIN 7. CONCLUSIONES 8. PREGUNTAS DE COMPLEMENTACIN Que agentes teraputicos han sido aislados de actinomicetos y cmo funcionan estos contra microorganismo patgenos? Busque un artculo cientfico acerca del aislamiento de antinomycetes para produccin de antimicrobianos, describa la metodologa utilizada? Que otras importancia biotecnolgicas y para qu son utilizados los actinomicetes aparte de ser productores de antimicrobianos? Cules son los componentes de la pared de los actinomycestos y en qu se diferencia con los hongos? Cmo se clasifican filogenticamente a los actinomycetes? Describa una tcnica diferente a la del laboratorio que se emplee para evaluar la produccin de antibiticos?

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9. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

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PRCTICA No 13 EVALUACIN DE MTODOS DE INACTIVACIN PARA LA PRODUCCIN DE UNA VACUNA TIPO BACTERIANA CONTRA Salmonella spp. 1. INTRODUCCIN La vacunacin consiste en la administracin de un microorganismo, una parte de l, o un producto derivado del mismo (antgenos inmunizantes), con el objeto de producir una respuesta inmunolgica similar a la de la infeccin natural, pero sin peligro para el vacunado. Se basa en la respuesta del sistema inmunitario a cualquier elemento extrao (antgeno) y en la memoria inmunolgica. Las vacunas en general, pueden ser administradas en forma simultnea, ya que no producen efectos distintos a los que se presentan si son aplicadas en forma separada. En algunos casos, la respuesta inmunitaria se ve potenciada en la aplicacin simultnea de vacunas. Tipos de vacunas: Microorganismos vivos atenuados Son preparaciones inmungenas de virus o bacterias vivos, que alterados de tal manera que no resultan agresivos como para provocar la enfermedad porque han perdido su virulencia, pero s generan una respuesta inmune importante. Ejemplos de ellas son las vacunas contra la polio (oral), fiebre amarilla, sarampin, rubola, parotiditis y tuberculosis (BCG). Microorganismos enteros inactivados Suspensiones de bacterias o virus muertos mediante la accin de calor o de desinfectantes como el fenol o formaldehdo. Como obviamente estos microorganismos muertos no se reproducen, se necesitan varias dosis (generalmente de alta concentracin) en diferentes perodos de tiempo, para inducir la inmunidad. A menudo requieren adyuvantes (sustancia que incorporadas a la vacuna acelera, prolonga o potencia la respuesta inmunognica) Toxoides Se obtienen a partir de toxinas bacterianas, un ejemplo de esto es la vacuna antitetnica generada a partir de la toxina de Clostridium tetani. 2. OBJETIVOS 2.1 2.2 Evaluar la eficacia de diferentes mtodos de inactivacin bacteriana Identificar los parmetros para seleccionar un mtodo de inactivacin en la produccin de una vacuna

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3. MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO 3.1 Cepas Salmonella spp. (una caja por lado de mesa) 3.2 Medios de Cultivo (por grupo de trabajo) Agar Mac Conkey (4 cajas) TSI (1 tubo) SIM (1 tubo) Citrato de Simmons (1 tubo) UREA (1 tubo) RM (1 tubo) VP (1 tubo) 3.3 Reactivos (por grupo de trabajo) Colorantes de Gram (un juego por mesa) Aceite de inmersin (un frasco por mesa) Formaldehdo al 37% (50 mL en total) Solucin salina estril (0.85%) (7 tubos de 13 x 100 con 5 mL) 3.4 Materiales (por grupo de trabajo) Tubo N2 de escala Mac Farland (uno por mesa) Beaker 100 mL (uno por mesa) Soportes (uno por mesa) Gradilla (1) Pipeta de 1 mL estril (2) Micropipeta de 0,1 mL estril (1) Asas 3.5 Equipos Microscopio Incubadora a 37C 4. PROCEDIMIENTO Verificar la pureza a la cepa mediante coloracin de Gram Realizar pruebas bioqumicas para identificacin de la cepa: TSI, SIM, Citrato. Preparar una suspensin del microorganismo patrn N 2 de Mac Farland en 7 tubos con 5ml de solucin salina estril. Adicionar formaldehdo al 37% a 3 tubos con la suspensin bacteriana, de manera que se obtengan diferentes concentraciones: 0,5%, 1%, 1.5%. Llevar a ebullicin 3 tubos con la suspensin bacteriana a diferentes tiempos: 1 min, 3 min, y 5 min.

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Realizar un control negativo sin formaldehdo ni ebullicin. Mtodo de inactivacin 0,5% Formaldehdo 1% 1,5% 1 min Crecimiento

3 min 5 min Control Negativo Sembrar nuevamente en el medio especfico para el microorganismo.

Temperatura

5. RESULTADOS 6. DISCUSIN 7. CONCLUSIONES

9. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

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PRCTICA No 14 INOCULACION VIRAL EN RATON 1. INTRODUCCIN Desde ratones a perros, los cerdos o las anguilas elctricas, una gran variedad de especies animales contribuyen cada ao a los descubrimientos mdicos que posibilitan que millones de seres humanos vivan cada ao. Con la investigacin sobre estos animales, los cientficos han descubierto curaciones y vacunas para un gran nmero de dolencias humanas y animales. La tendencia actual es a la disminucin del uso de animales de laboratorio, para esto se han desarrollado otras tecnologas como cultivo celular y modelos de computacin. Segn una encuesta realizada en Estados Unidos hubo una cada del 40% en el nmero de los animales usados entre 1968 y 1978, el uso del animal de laboratorio alcanz su mximo en 1970 y ha cado un 50% desde ese tiempo, las reducciones ms grandes afectaron al uso de perros y de gatos. Sin embargo no ha sido posible reemplazar el uso de modelos animales en todos los casos y los animales continan desempeando un papel importante en la investigacin biomdica. Las especies ms utilizadas son: Ratas, ratones y otros roedores: 85-90% Perros y gatos: menos de un 1% Primates no humanos: menos de 0,3%. Uno de los principales objetivos de los cientficos de animales de laboratorio es asegurar que los animales de la investigacin no se expongan a cualquier dolor o estrs innecesario. Mientras que el acta del bienestar animal regula especficamente la investigacin animal, la estadstica muestra que la mayora de los experimentos no son dolorosos a los animales. Segn el informe de 1997 de la secretaria de Agricultura de los E.E.UU., la mayora de la investigacin - 92% - no era dolorosa a los animales. En la mayora de los casos, 54%, los animales no fueron expuestos ni estuvieron implicados en ningn procedimiento doloroso. En el 38% de casos, los animales recibieron anestesia o

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analgsicos durante los procedimientos que habran podido implicar cierto dolor o estrs a los animales. En el 8% de los proyectos de investigacin, los anestsicos o las analgesias no fueron utilizados porque habran interferido con los resultados de la investigacin o de la prueba. Junto con ratas y otros roedores, los ratones son la especie ms utilizada en la investigacin mdica. Su talla pequea y bajo costo los hacen ideales para los experimentos de laboratorio. Adems, los cientficos pueden criar diversas lneas de ratones con deficiencias genticas naturales para alcanzar los modelos especficos de enfermedades humanas. La investigacin con los ratones ha ayudado a desarrollar vacunas contra la gripe, poliomielitis, fiebre amarilla y rabia.

Condiciones que se deben tener en cuenta para la utilizacin de ratones. 1. Periodo de adaptacin al ambiente del laboratorio: Si no han crecido en el laboratorio, deben adaptarse mnimo 3 das. 2. Condiciones biolgicas: La edad, la ausencia de infecciones, entre otros, son factores que deben tenerse en cuenta en el uso de animales de experimentacin. Vas de inoculacin El ratn posee muchos sitios de inoculacin como son, intradrmico, subcutneo, vas respiratorias, intracerebral, escarificacin, intravenosa, intraperitoneal e intramuscular. La escogencia de la mejor va depender del virus que se est utilizando. La cantidad de inoculo no ha de ser mayor de 0.03 ml ya que por su pequeo tamao podra causar la muerte del animal. 2. OBJETIVOS 2.1 2.2 2.3 Conocer la utilidad de los ratones en diagnstico e investigacin Identificar en el animal los sitios de inoculacin, recordando su distribucin anatmica. Determinar los cuidados y condiciones que se deben tener en cuenta en la manipulacin de ratones en el laboratorio.

3. MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO 3.1 Animales de Laboratorio (por grupo de trabajo) Ratones (2)

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3.2 Reactivos (por grupo de trabajo) Solucin salina 0,85% estril (2 tubo de 13 x 100 con 5 mL) Alcohol antisptico Colorantes Gram 3.3 Materiales (por grupo de trabajo) Jeringa de tuberculina con aguja 27 corta (3) Guantes y tapabocas Algodn 3.4 Equipos Balanzas

4. PROCEDIMIENTO 4.1 Pesar ratones Para observar que la inoculacin que se est realizando en el ratn de la manera adecuada y que no esta teniendo efectos adversos la sustancia inoculada, se deben marcar los ratones debidamente con cristal violeta y luego ser pesados antes de la inoculacin y despus de la inoculacin 4.2 Inmovilizacin del ratn Coloque el animal fuera de la jaula sobre una superficie rugosa, ubique sus dedos ndice y gordo sobre el cuello del animal, teniendo en cuenta de no presionar con mucha fuerza. Una vez el animal esta inmvil, con el dedo meique enrede la cola del ratn entre sus dedos. El ratn debe quedar sostenido por una sola de sus manos y completamente inmovilizado. Su otra mano debe quedar libre para ser utilizada en el proceso de inoculacin. 4.3. Inoculacin subcutnea Depositar al ratn sobre la rejilla permitindole agarrarse a ella con las patas delanteras y levantar la piel de la espalda con los dedos ndice y pulgar. Insertar la aguja en la base de la zona de piel que estamos sujetando manteniendo la aguja paralela al cuerpo del ratn para evitar inocular en capas inferiores a la piel. Aspirar ligeramente para asegurarnos de no haber penetrado en algn vaso sanguneo. Inyectar el volumen de muestra a una velocidad moderada.

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Retirar la aguja y presionar la piel en la zona de inyeccin para evitar que el fluido salga por el punto de piel perforada. Observar que no se produce sangrado. Debido a que la muestra se deposita en la zona subcutnea, y si sta se ha desarrollado correctamente, podremos observar la formacin de un abultamiento en el lugar de inyeccin que ir desapareciendo a medida que el fluido es dispersado

4.3. Inoculacin intraperitoneal (IP) Con el ratn correctamente inmovilizado (evitando cualquier movimiento durante el procedimiento) inclinarlo caudalmente y trazar una lnea imaginaria que cruce su abdomen transversalmente justo sobre sus rodillas La aguja deber ser insertada sobre esta lnea, en el lado derecho del animal y lo ms cercano posible a la lnea que divide longitudinalmente el abdomen (lnea roja). De esta manera disminuimos el riesgo de inyectar en ciego o vejiga urinaria. La aguja debe alcanzar una profundidad de aproximadamente medio centmetro (ratn) y debe insertarse con una inclinacin de unos 30 con respecto a la superficie del abdomen. Aspirar para asegurarse de que no se ha alcanzado ningn vaso sanguneo, ciego o vejiga urinaria. Si ningn fluido es aspirado, proceder a la inyeccin de la muestra. Retirar la aguja y presionar ligeramente la zona de inyeccin.

5. DISCUSIN

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6. CONCLUSIONES 7. PREGUNTAS DE COMPLEMENTACIN

9. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

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